Souris
Validation de nouveaux modèles de tumeur du tronc cérébral chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant réalisée au deuxième jour après la naissance, pour valider des modèles de tumeur pédiatrique aujourd'hui incurable. Le porteur ne décrit qu'"un stress physique léger" lié à la manipulation avant anesthésie, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs cerveaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue la complexité tumorale in vivo et juge cette souche de souris "impossible" à remplacer.
Objectifs
Avec un taux de survie proche de zéro, les tumeurs du tronc cérébral ou DIPG sont les cancers les plus mortels chez l’enfant. L’étude de cette tumeur, toujours fatale en 2022, nécessite la validation de nouveaux modèles tumoraux et l’analyse des mécanismes responsables de son apparition.
Bénéfices attendus
Démontrer qu’une ou plusieurs des trois nouvelles lignées de tumeur du tronc cérébral forment des tumeurs chez la souris et que ces lignées constituent de bons modèles pour étudier le développement de la tumeur et ultérieurement, pour tester des médicaments.
Procédures
Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues pour les animaux sont un stress physique léger dû à la manipulation de la cage et des animaux avant anesthésie générale.
Devenir
Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des cerveaux et leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris. Malgré tout, ces modèles pourraient ouvrir la voie au développement ultérieur de nouvelles approches ex vivo, notamment à l’aide d’organoïdes.
Réduction
Les effectifs des animaux utilisés sont déterminés et nos résultats sont analysés selon des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées aux animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. En ce qui concerne la manipulation des souris, celle-ci se fera en conditions stériles, sur tapis chauffant et sur des animaux sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
1. La souche de souris est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations d’hébergement. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale et la manipulation. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
Utilisation d’ARN interférants pour inhiber le facteur Willebrand in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'ARN interférents puis, sous anesthésie, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou un test de thrombose par extériorisation des vaisseaux intestinaux pendant une heure. Le porteur indique que ces tests ne sont pas compatibles avec un réveil et que la perte de sang serait trop importante pour une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas "l'intégralité" du processus de coagulation.
Objectifs
La maladie hémorragique génétique la plus fréquente est la maladie de Willebrand qui affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. Cette pathologie est causée par des mutations sur le gène qui produit le facteur Willebrand, une protéine impliquée dans la coagulation sanguine. La maladie de Willebrand est très hétérogène et est divisée en plusieurs types et sous-types. Le sous-type 2B par exemple est caractérisé par la présence d’un facteur Willebrand anormal. Même si les mutations responsables de la maladie de Willebrand 2B ne sont présentes que sur une des copies du gène du facteur Willebrand (chaque gène est en double chez tous les individus, un qui vient de la mère et un qui vient du père), la protéine anormale va aller empêcher la protéine normale de faire son travail. Si trop peu de facteur Willebrand ou un facteur Willebrand anormal conduit à des hémorragies, à l’inverse, une quantité trop importante de facteur Willebrand entraîne un risque de thrombose ou survenue de caillots sanguins dans les vaisseaux. Dans les deux cas, il serait donc très utile de pouvoir inhiber la production de facteur Willebrand à partir d’une des deux copies du gène : soit pour empêcher la protéine anormale d’être produite (dans le premier cas), soit pour diminuer la quantité totale de facteur Willebrand (dans le deuxième cas). La difficulté est d’aller cibler spécifiquement une des deux copies du gène sans affecter l’autre. C’est donc le but de ce projet qui va consister à utiliser des inhibiteurs de la production du facteur Willebrand à partir d’une seule copie du gène. Pour cela le croisement de souris de deux souches génétiques différentes va permettre d’obtenir des souris avec deux gènes légèrement différents (reproduisant la situation humaine où les gènes reçus de ses deux parents sont différents) et ce sont ces petites différences qui vont être exploitées pour développer des inhibiteurs spécifiques d’une des copies du gène et non pas des inhibiteurs qui aboliraient totalement la production de facteur Willebrand.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de montrer qu’il est possible de cibler une copie d’un gène directement chez un animal, ce qui important d’un point de vue preuve de concept bien au-delà de la maladie de Willebrand et 2) de déterminer si l’inhibition du gène anormal corrige les symptômes hémorragiques dans la maladie de Willebrand 2B. A long terme, le projet contribuera à renforcer l’idée de cibler le facteur Willebrand anormal dans la maladie de Willebrand dans le cadre d’une médecine personnalisée et éventuellement de réduire les quantités de facteur Willebrand chez les patients à fort risque de thrombose.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Les souris recevront une injection intraveineuse unique pour leur administrer les inhibiteurs de la production du facteur Willebrand. Quatre jours après cette injection, les souris seront anesthésiées et tout le reste de la procédure se déroulera pendant cette anesthésie. Pour toutes les souris, une prise de sang sera alors effectuée afin de mesurer divers paramètres biologiques. A la suite de la prise de sang un groupe de souris sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 10 minutes. Pour un autre groupe de souris, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans les vaisseaux intestinaux à l’aide d’un microscope. Ceci impliquera l’injection intra-veineuse d’un marqueur fluorescent sur les souris anesthésiées puis le test de thrombose sur une durée de 60 minutes, le tout sous anesthésie. Au terme des 10 minutes (pour le test de saignement) ou des 60 minutes (pour le test de thrombose), l’animal toujours sous anesthésie sera euthanasié par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse qui a lieu 4 jours avant les tests. La seconde partie de la procédure se fait entièrement sous anesthésie/analgésie chimique et sera sans réveil.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Les tests de thrombose impliquent d’extérioriser des vaisseaux intestinaux ce qui n’est pas compatible avec un réveil éventuel. Pour le test de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. La mise au point et le développement des inhibiteurs a été conduit dans des modèles cellulaires afin qu’un seul d’entre eux soit testé sur des animaux. D’autre part, s’il s’avère après les premiers essais que le nombre d’animaux par groupe peut être réduit, nous adapterons les groupes suivants.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. D'autre part, nous appliquerons de manière stricte les points limites définis spécifiquement pour le projet.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui reproduit le pathologie étudiée (maladie de Willebrand 2B). Ce modèle a d’ores et déjà montré sa pertinence en tant que modèle de la pathologie humaine. Pour ce qui concerne les tests de saignement, des souris adultes jeunes (8 semaines environ) des deux sexes seront utilisées. En ce qui concerne le groupe de souris qui sera évalué dans le modèle de thrombose, des souris des deux sexes seront utilisées à un âge entre 3 et 4 semaines. Le modèle de thrombose ne peut être réalisé que sur des souris très jeunes car sinon le tissu adipeux autour des vaisseaux intestinaux empêche leur bonne visualisation sous microscope.
Étude des mécanismes de néphropathies et de lésions musculaires de la drépanocytose chez la souris et approche thérapeutique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.
Objectifs
La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter
Bénéfices attendus
Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.
Procédures
Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.
Devenir
Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.
Raffinement
Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Implication du PEDF (Pigment Epithelial Derived Factor) sur la vascularisation osseuse et les ostéoprogéniteurs dans la formation osseuse chez la souris adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de tériparatide pendant trois semaines, une chirurgie mettant le tibia à nu pour y appliquer une sonde laser sous anesthésie sans réveil, un passage au micro-scanner et une injection de nanobilles par voie rétro-orbitaire. Le porteur situe l'intérêt dans une meilleure compréhension, "sur le long terme", des traitements de l'ostéoporose, alors que le prélèvement des os après la mort est immédiat. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro la moelle osseuse, jugée trop complexe.
Objectifs
Avec l'âge, on constate une diminution de la formation osseuse qui peut entraîner des maladies osseuses comme l'ostéoporose qui se caractérise par une fragilisation de l'os qui induit une augmentation du risque de chute et donc de fracture. Différents traitements contre cette maladie existent comme l'injection intermittente de tériparatide (fragment de l'hormone para-tyroïdienne) qui stimule la formation osseuse. Il a été montré récemment que le tériparatide stimule l'expression de gènes impliqués dans l'inhibition de l'angiogénèse (formation des vaisseaux sanguins) comme le PEDF (Pigment Epithelial-Derived Factor) par les ostéoblastes. Il semble donc avoir un lien entre la formation osseuse et la vascularisation et que cette relation serait médiée par le PEDF. Ce projet consiste donc à évaluer l'effet du tériparatide sur la formation osseuse dans un modèle de souris déficiente en PEDF (KO PEDF). Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et de mieux appréhender les mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et de leur migration vers les surfaces osseuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et leur migration vers les surfaces osseuses. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre le mode d’action de certains traitements contre les maladies osseuses comme l’ostéoporose.
Procédures
Injection sous-cutanée journalière de tériparatide à 100 µg/Kg ou solution saline pendant 3 semaines. La perfusion sanguine osseuse se fait in vivo par technique LASER Doppler développée par notre laboratoire. Elle se fait sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane), placés sur une couverture thermique avec une sonde rectale rétro-contrôlant leur température corporelle. Une incision cutanée est effectuée sur la face antérieure du tibia sous loupe grossissante. Le muscle tibial antérieur est récliné pour mettre à nu la face antéro interne du tibia. La sonde Laser est alors placée au contact de l’os. La patte est immobilisée dans une boule d’alginate pour empêcher tout mouvement. La mesure se fait sur 3 zones : au métaphyse haute, métaphyse basse et diaphyse pendant 30s et sont répétées 4 fois. La pression artérielle est mesurée avant et après la perfusion pour s’assurer de la stabilité hémodynamique de la souris. L’analyse par micro-tomodensitométrie de la masse et architecture osseuse se fait in vivo sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Pour analyser de façon longitudinale l’évolution des paramètres osseux, une mesure est réalisée à l’inclusion et 3 semaines après l’injection quotidienne de tériparatide ou de solution saline. Les animaux sont préalablement anesthésiés puis immobilisés par bandes adhésives sur un support et placés à l’intérieur du scanner pour faire la mesure. Celle-ci se fait par émission de rayons X par une source qui tourne à 360° autour de l’échantillon, ce qui permet de faire une reconstruction 3D des structures minéralisées. La mesure dure 20min. L’injection de nanobilles fluorescentes se fait par voie retro orbitaire chez l’animal anesthésié. Les billes sont en suspension dans une solution aqueuse. Les souris sont sacrifiées après l’injection des billes.
Impact sur les animaux
L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tetracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe legère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Devenir
Mise à mort car il faut prélever les os des pattes pour pouvoir analyser les paramètres osseux par istomorphométrie et faire des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, il faut au total 72 souris KO-PEDF et 112 souris sauvages (Roche et al 2013). Les souris de chaque génotype seront séparées en 2 groupes : 1 traité par tériparatide pendant 3 semaines (n=36) et un groupe contrôle traité par solution saline (n=36) sauf 40 sauvages utilisées pour les mises au point. - n=40 souris sauvages seront utilisées pour la mise au point de la technique de tri cellulaire et la mesure de la perméabilité vasculaire. Dix souris seront utilisées pour la mise au point du tri cellulaire. Trente souris seront utilisées pour la mise au point de la mesure de perméabilité. Sur chaque groupe : - 10 souris auront leur perfusion sanguine mesurée par LASER Doppler sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Afin de réduire le nombre de souris, les os de ces souris sont, après mise a mort, utilisés pour mesurer les paramètres osseux par histomorphométrie et pour l’immunohistochimie. - n=9 seront utilisées, à cause de la grande variabilité interindividuelle, pour l’analyse de transcriptome par Nanostring. - n=8 seront utilisées pour l’étude ex vivo de la migration des cellules LepR+. L’étude sera d’abord faite uniquement sur des souris sauvages pour vérifier la faisabilité de l’expérience. - n=9 seront utilisées pour l’analyse de la perméabilité vasculaire médullaire par injection de nanobilles fluorescentes.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris. Une surveillance adaptée (observation des animaux) permettra de limiter au maximum la souffrance. L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tétracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe légère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la micro vascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués, ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène du PEDF a été invalidé. Le mutant KO-PEDF chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. On utilise des souris adultes de 4 mois car on cherche à évaluer l’implication du PEDF dans un os mature.
Exploration de la pression arterielle chez la souris in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, une large part étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections et des mesures de pression artérielle par brassard à la queue, et 530 d'entre elles portent un modèle de sclérose latérale amyotrophique entraînant une paralysie progressive des membres. Le porteur indique adapter les cages avec des tétines allongées pour les animaux affaiblis, et affirme qu'"il n'existe pas de modèle de remplacement" pour cette maladie. Il présente les retombées thérapeutiques au conditionnel et à terme, alors que la mise à mort des animaux est certaine.
Objectifs
L'ensemble des grandes fonctions de notre organisme (digestion, respiration, régulations cardiovasculaires...) est sous le contrôle du système nerveux autonome. Celui-ci se divise en deux grandes branches : le système nerveux autonome sympathique (SNAS) et le système nerveux autonome parasympathique. Nous menons actuellement au laboratoire deux projets de recherche qui utilisent la même procédure expérimentale afin de savoir (1) si certains neurones thoraciques de la moelle épinière qui présentent des propriétés de senseur chimique font partie du SNAS et (2) si lors de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le SNAS est altéré et contribue à la physiopathologie de cette maladie. Afin de répondre à nos questions, nous regarderons l'effet de molécules, connues pour activer le SNAS, sur la pression artérielle. Celle-ci sera mesurée au niveau de la queue chez l'animal avec un système de brassard comme utilisé chez l’homme. Deux types de modèles murins seront utilisés dont un est un modèle murin de la SLA qui récapitule la maladie humaine (dégénérescence progressive des motoneurones entrainant progressivement une paralysie). Nous faisons l'hypothèse que les modifications génétiques portées par les souris modifient le fonctionnement du SNAS et que sa stimulation induira des effets différents entre souris sauvages et génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'un nouvel axe de recherche développé depuis deux ans au laboratoire qui vise à comprendre l'organisation et le fonctionnement du SNAS en situations physiologique et physiopathologique. Dans le contexte de la SLA, les données sur le SNAS sont parcellaires. Des données récentes montrent que le SNAS exerce un contrôle extrêmement puissant à tous les étages de la communication entre motoneurones et muscles. Nous espérons donc que cette étude permettra de démontrer l'implication du SANS dans la SLA et donc potentiellement à terme de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle encore aujourd'hui aucun traitement même partiel n'existe.
Procédures
1320 animaux recevront une à deux injections sous anesthésie générale sans autre procédure invasive. 50 mâles seront utilisés comme reproducteurs mais euthanasiés avant tous développement de signes cliniques liés à la maladie.
Impact sur les animaux
530 animaux présenteront un phénotype dommageable similaire aux symptômes de la SLA (sclérose latéral amyotrophique) avec diminution de la motricité des membres postérieurs. L'ensemble des animaux (1370) subiront une mise en contention, 2 à 3 injections sous cutanées, une anesthésie sans réveil ainsi que des mesures de pression artérielle répétées au niveau de la queue
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès la fin des manipulations.
Remplacement
Il n'existe pas de modéle de remplacement pour aborder la physiologie et la physiopathologie du système nerveux et de la maladie étudiée (SLA ou Sclérose Latérale Amyotrophique)
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous proposons d'injecter deux molécules d'interet par animal. Il n'est neanmoins pas possible d'augmenter le nombre de ces injections afin de limiter les effets croisés entre composés actifs. Le nombre d'animaux par lots à été déterminé grâce à un logiciel de statistiques en estimant qu'une différence est significative à partir de 5mmHg entre les groupes. Les analyses seront faites avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le système de mesure de pression artérielle externe permet de n'être absolument pas invasif puisqu'il consiste en la pose d'un ballonnet sur la queue, similaire à ce qui est utilisé sur les bras des patients humains lors de consultations médicales. Les animaux présentant un phénotype dommageable seront suivis quotidiennement avec une grille de scoring validée. Des dispositifs d'adaptation de la vie des animaux commençant à présenter des faiblesses au niveau des membres seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité.
Choix des espèces
La souris est un modele le dont le genome est parfaitement connu. Le choix de l'espece souris est motivé par la présence de modeles genetiquement modifiés extremement pertinents pour les questions scientifiques posées. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les souris présentant un déficit d'un gène codant pour un canal calcique seront utilisées lorsqu'elle auront entre 8 et 10 semaines (l'expression visible de l'absence du canal ne changeant pas avec l'âge) . Les souris présentant la maladie SLA (sclérose latéral amyotrophique) seront analysées à différents stades de la maladie et donc à différents âges (pré et postsymptomatiques): 21 jours, 40 jours, 60 jours, 75 jours, 90 jours, 105 jours et 110 jours d'âge).
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur un modèle de carcinogenèse prostatique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Des souris ont l'abdomen ouvert pour que leur prostate soit exposée à une torche à plasma froid ou à un simple jet d'hélium, puis vivent sept jours avant d'être tuées pour l'analyse du tissu traité. 96 souris transgéniques, privées du gène suppresseur de tumeur PTEN et atteintes d'un cancer de la prostate, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour préparer l'emploi de la torche lors des ablations de la prostate chez des patients. Le porteur attend des effets indésirables "plutôt mineures", et écrit aussi que ce traitement "reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir". Les souris sont hébergées en cage individuelle, ce que le résumé range sous un "enrichissement renforcé".
Objectifs
Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).
Procédures
Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.
Remplacement
La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.
Réduction
Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.
Raffinement
Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.
Choix des espèces
Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).
Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Selon leur groupe, des souris subissent une ligature des deux veines jugulaires, reçoivent des vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou portent un cathéter intracrânien pendant douze à quatorze jours, seules en cage, avec une injection par jour pendant six jours. 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour l'étude de leur cerveau et de la dure-mère, certaines au terme d'une mesure de pression intracrânienne menée sans réveil. Un régime gras rend une partie d'entre elles obèses pendant quatre à dix semaines, d'autres restent isolées jusqu'à 31 jours en cage d'activité locomotrice, pour tenter de reproduire l'hypertension intracrânienne idiopathique, maladie de la femme jeune en surpoids que l'équipe étudie aussi par IRM chez des patients. Les tests comportementaux, répartis sur deux jours et demi, ne sont pas nommés, et le porteur reconnaît que l'isolement des souris porteuses d'un cathéter "peut occasionner une souffrance de l'animal et des troubles du comportement".
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de **696 souris non transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**
Impact sur les animaux
Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.
Réduction
Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). **A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 (n=36) dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux.** Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. **Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé.** Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de **696 souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.
Raffinement
A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.
Etablissement de modèles orthotopiques et métastatiques de sarcomes. Efficacité et synergie de thérapies ciblées et de chimiothérapies standards dans ces modèles.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules humaines de sarcome dans un muscle ou dans une veine, des souris immunodéficientes développent une tumeur retirée par chirurgie quand elle atteint 1 000 millimètres cubes, afin de prolonger leur survie le temps de suivre l'apparition des métastases. L'opération peut entraîner une perte de poids et de mobilité pendant une semaine environ, et les métastases pulmonaires peuvent gêner la respiration. Les souris reçoivent des traitements par gavage ou par injection, et certaines subissent cinq irradiations par semaine pendant quatre semaines sur leurs métastases. Au total, 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin des traitements ou à l'atteinte d'un point limite, et leurs organes métastasés sont prélevés.
Objectifs
Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents) qui touchent environ 4000 personnes par an en France. Malgré une chirurgie bien conduite suivie de traitements par chimiothérapies ou radiothérapies, plus de 40 pourcent des patients développent des métastases. A ce stade métastatique, peu de médicaments sont efficaces et les progrès depuis les 20 dernières années sont faibles avec une médiane de survie globale qui est passée de 12 à 18 mois seulement. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies permettant de cibler les processus metastatiques afin d’améliorer significativement les chances de survie des patients. Notre équipe est localisée dans un centre de référence dans le traitement de ce cancer rare, ce qui nous offre la possibilité d'obtenir des tumeurs de patients et ainsi de pouvoir développer des lignées cellulaires et des modèles de souris xénogreffées avec ces tumeurs. A partir de ces modèles, nous avons mis en place une plateforme préclinique qui nous permet d’étudier les effets biologiques et pharmacologiques de nouveaux médicaments en développement. Ces nouveaux composés sont dans un 1er temps testés in vitro sur des cellules en culture et dans la mesure où ils sont concluants, ils sont testés sur des souris de laboratoire préalablement implantées avec des tumeurs de patients quand cela est possible ou des cellules cancéreuses. Cependant, ces modèles sont limités par le fait qu’ils ne font pas de métastases dans la souris du fait de l’injection des cellules en sous-cutanée. Nous souhaiterions développer de nouveaux modèles afin d’optimiser l’apparition de métastases, soit en injectant les cellules directement dans la circulation sanguine, soit en les injectant dans leur organe d’origine pour bénéficier d’un microenvironnement propice. Une fois ces modèles établis, nous testerons l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber ces processus métastatiques.
Bénéfices attendus
Les modèles de sarcomes des tissus mous métastatiques sont quasiment inexistants, or plus de 40% des patients développent des métastases. Il est donc primordial de trouver de nouveaux médicaments ciblant ces processus. Ce projet permettra d’avoir des modèles plus proches de la réalité du patient et de reproduire les processus métastatiques afin de trouver de nouvelles molécules les inhibant. Ces expérimentations s'inscrivent donc dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous.
Procédures
- greffes de cellules humaines en intramusculaire ou intraveineuse (une fois, durée 2min par souris) - Exerese de la tumeur primaire (une fois, durée 5min par souris) - Traitements medicamenteux par gavages / injections intrapéritonéales ou intraveineuses (durée et nombre de fois différents en fonction du traitement > une demande spécifique à chaque traitement sera soumise à la structure en charge du bien-etre animal) - Irradiations des metastases (radiothérapie) (durée 4 semaines à raison de 5 irradiations par semaine)
Impact sur les animaux
La procédure de xenogreffes en intramusculaire pourra provoquer un inconfort léger et diminuer la mobilité des souris. Lorsque que la tumeur primaire atteint une taille de 1000mm3, la souris sera opérée afin d’enlever la tumeur primaire et ainsi prolonger sa survie tout en permettant un suivi plus long de l’apparition des métastases. Cette chirurgie pourra provoquer une perte de poids ainsi qu'une perte de mobilité pendant 1 semaine environ. Dans le cas de métastases pulmonaires, des problèmes respiratoires peuvent survenir. En ce qui concerne l'administration des traitements, les gestes sont réalisés par du personnels expérimentés maitrisant ces injections. Ces gestes sont donc réalisés rapidement et n’entrainent que peu de stress chez l’animal. Cependant, pour les injections intraveineuses, des œdèmes éventuels et nécroses à la queue sont possible ; pour les gavages: cas de fausse route possible ; pour les injections intrapéritonéales: peu de stress
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des traitements, quand les tumeurs primaires atteignent 1000mm3 ou lorsqu’un point limite est atteint. Les souris sont euthanasiées puis leurs organes métastasés sont prélevés pour analyses.
Remplacement
Ces expérimentations s'inscrivent dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous. Nous avons étudié les effets biologiques et pharmacologiques de nombreuses nouvelles molécules en développement sur des lignées de sarcomes in vitro. Nous souhaitons dorénavant étendre ces études à un modèle plus complet qu’est le petit animal. En effet, l’oncogenèse et plus particulièrement l’apparition de métastases sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel avant de pouvoir réaliser les essais chez l'homme.
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale des cellules greffées sera suivie tout au long des expériences ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés, le but étant d'obtenir des données significatives d'efficacité du médicament. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, utilisation de tapis chauffant et d'ocrygel, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).
Choix des espèces
Le but du projet étant de valider l’efficacité de nouvelles thérapies ciblées afin d'utiliser ces médicaments en clinique chez l'homme, il faut nécessairement un modèle de mammifères pour extrapoler les résultats. Nous avons donc choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes. Ce sont des modèles très immunodéprimés (ne possédant que très peu de système immunitaire) particulièrement adaptés à l'implantation de cellules tumorales. Animaux âgés de 8-12 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur.
Validation de l’immunogénicité et la durabilité des réponses immunitaires systémiques et muqueuses d’un candidat vaccin nasal anti- SARS-CoV2 en modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une identification par poinçon à l'oreille, entre trois et dix prises de sang dans la veine faciale, des instillations nasales et des injections intramusculaires sous anesthésie, pour tester un candidat vaccin nasal contre le SARS-CoV-2. Le porteur décrit des gestes "indolores" et sans effet secondaire noté, avant la mise à mort pour prélever la rate et le poumon. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution restituant "fidèlement" la régulation immunologique visée.
Objectifs
Le coronavirus SARS-CoV2 est une menace pour la santé mondiale et la disponibilité d'un vaccin efficace induisant une réponse immunitaire spécifique, forte et durable contre ce pathogène est nécessaire. Un vaccin efficace contre le SARS-CoV2 doit générer et maintenir une réponse à la fois humorale et cellulaire au niveau systémique et sur les surfaces muqueuses, portes d'entrée et site de multiplication initial du virus. Le présent projet repose sur le développement d’un vaccin protéique, associé à un excipient (confidentiel) et administré par voie nasale. Le pouvoir immunogène de ce candidat vaccin a été validé précédemment notamment en termes de réponse humorale. Les études de protection ont confirmé la capacité de notre vaccin à protéger les souris contre une infection avec le SARS-CoV2 (survie, maintien du poids et réduction des signes cliniques).
Bénéfices attendus
Le développement de ce vaccin nasal anti-SARS-CoV2, capable d’induire des réponses immunitaires au niveau des compartiments muqueux, constitue une voie de recherche prometteuse en complément des autres approches vaccinales actuelles. Ce vaccin, contrairement aux vaccins actuels, pourrait agir au niveau de la porte d’entrée du virus pour permettre d’enrayer la contamination virale en évitant la propagation de l’infection. Ce projet permet de décortiquer les mécanismes immunologiques impliqués dans la protection contre le SARS-CoV2. Par rapport au schéma vaccinal actuel (par voie intramusculaire), ce projet permet également d’avoir les arguments nécessaires pour justifier l’intérêt d’un rappel nasal notamment avec l’induction de la réponse muqueuse, l’amélioration de la réponse immunitaire systémique ainsi que la durabilité de la réponse immunitaire muqueuse induite.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à : - Une identification individuelle par poinçon à l'oreille (moins d'une minute / animal). - Entre 3 et 10 prises de sang espacées de 14 jours dans la veine faciale (environ 15 secondes / animal). - Deux instillations nasales espacées de 3 semaines (environ 15 secondes / animal). Les animaux anesthésiés seront soumis à : - Deux injections intramusculaires espacées de 3 semaines (2 minutes / animal).
Impact sur les animaux
Notre candidat vaccin nasal a été préalablement administré aux souris et aucun effet secondaire n’a été noté. L’immunisation nasale est un geste indolore réalisé à l’aide d’une micropipette et le stress induit ne dure pas plus que 15 secondes. L’immunisation intramusculaire est réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l’acte 2 minutes). Un effet local transitoire de type inflammation légère au site d’injection peut être observé. Les animaux sont surveillés au réveil et suivis quotidiennement. Le vaccin Pfizer a largement été utilisé chez les souris et aucun effet secondaire n’est documenté. La prise de sang est un acte de classe légère, la douleur est limitée à la piqure d’une aiguille et le stress de l’animal ne dure pas plus de 15 secondes.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude afin d’étudier la réponse immunitaire induite. La rate et le poumon sont prélevés afin d’analyser respectivement la réponse immunitaire systémique et muqueuse.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation immunologique complexe permettant la validation de notre stratégie vaccinale.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et nos données préliminaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec la réglementation française et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé. Tout type de médication pouvant interférer avec l’étude de la réponse immunitaire est proscrit.
Choix des espèces
La souris, très proche de l’espèce humaine sur le plan immunologique, est le modèle idéal pour l’étude de la réponse immunitaire. Les outils immunologiques permettant d’étudier cette dernière sont disponibles. Le modèle BALB/c, utilisé dans des expériences précédentes, a permis de confirmer l’immunogénicité de notre candidat vaccin notamment en termes de réponse humorale neutralisante. Cependant, ce modèle reste limité pour l’étude de la réponse cellulaire mémoire. Le modèle C57BL/6 est le plus adapté pour répondre à l’ensemble des problématiques de ce projet mais dans un premier temps, il est nécessaire de confirmer l’immunogénicité de notre vaccin dans ce modèle en comparaison avec le modèle BALB/c. Adulte. Il n’y a pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours de la stéatohépatite non alcoolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à un régime déficient en méthionine et choline qui déclenche une maladie chronique du foie, avec prises de sang et injection intra-péritonéale, la perte de poids servant de point limite. Le porteur indique surveiller le dos voûté et le poil négligé, et affirme utiliser un nombre "minimum mais nécessaire" d'animaux. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" car les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont associées au syndrome métabolique (surpoids, diabète, obésité, hypertension…). Le spectre de ces complications hépatiques va d’une stéatose simple (foie gras), à la stéatohépatite, puis à la fibrose, voire la cirrhose et au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation hépatique chronique à bas bruit joue un rôle crucial dans le développement des maladies dans cet organe. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à un stress microbien, métabolique et aux signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans le tissu adipeux et l’intestin. Ces organes participent au développement et à l'évolution des complications hépatiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine exprimée à la surface des cellules immunitaires et qui régule leur fonctions, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation. Chez les patients atteints d’une maladie chronique du foie, l’expression hépatique de CD44 est augmentée en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de ces complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle dans ces maladies. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. De plus, leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage (température, hygrométrie), d’hébergement (présence de tige en coton et d'igloo dans les cages), et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou CD8, dans un contexte de complications hépatiques. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces maladies qui actuellement de disposent pas de traitements pharmacologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum pouvant durer jusqu'à 1min (en fin de régime et en fin de procédure). Une injection intra-péritonéale sera également effectuée en fin de régime. Cette injection durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Au cours de ce projet, le principal effet indésirable est la perte de poids chez l’animal. Les animaux seront donc surveillés trois fois par semaine. Si des signes de souffrances (dos voûté, poil non-entretenu, indifférence du milieu extérieur…) s’ajoutent à la perte de poids, l’animal sera sacrifié pour limiter toute souffrance inutile.
Devenir
A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur organes. Ces organes sont ensuite utilisés afin de réaliser des analyses de biologie moléculaire et cellulaire indispensables pour notre étude.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel, ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites afin de confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour cette unique procédure, les souris seront mises sous régime déficient en méthionine et choline à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g. Les régimes déficients en méthionine et choline (MCDD) induisent un développement rapide des complications hépatiques. Cependant cette déficience en méthionine et choline induit une perte de poids qui nécessite l’utilisation de souris plus âgées (donc avec un poids plus élevé).
Effet de molécules inhibitrices d’épissage et du complexe spliceosome/histone désacétylase (HDAC) dans des modèles PDX pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des traitements par voie orale et par injections répétées pendant quinze jours, sur des modèles de cancers pédiatriques dérivés de patients. Le porteur situe les retombées dans l'objectif "final" d'augmenter la survie des patients, alors que le prélèvement des tumeurs et des organes après la mort des animaux est immédiat. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement tumoral et conclut que le modèle in vivo reste "indispensable".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : i) D’évaluer l’impact des inhibiteurs d’épissage connus ii) Et des nouvelles molécules duales inhibitrices du complexe spliceosome et et histone désacétylase comme immunomodulatrices sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé plusieurs molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine du neuroblastome (8 molécules), d’ostéosarcome (8 molécules), et de rhabdomyosarcome (8 molécules). Dans une première étape nous testerons ces molécules sur des modèles de tumeurs sous cutané ectopique dans des souris immunocompétentes afin de sélectionner les molécules efficaces et les voies d’injections des molécules. Ceci nous permettra d’utiliser un nombre minimal de souris dans ce projet de modèles PDX. Pour cela, nous utiliserons les méthodes et modèles expérimentaux suivants : i) Des souris NSG qui serviront de modèles de souris PDX. Pour cela des biopsies de patients seront utilisés. Nous utiliserons deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes
Bénéfices attendus
Les résultats du projet démontreront si le spliceosome peut être une cible thérapeutique dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique de nos molécules et de mieux comprendre les mécanismes liés à ces molécules. Afin de modéliser ces modèles tumoraux pédiatriques, nous utiliserons des modèles dérivés des patients (PDX) dont deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes
Procédures
Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale..
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l'injection des cellules tumorales. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement
Développement d’un modèle souris d’infection au virus du Nil occidental (West Nile virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus du Nil occidental via une injection dans le coussinet plantaire, puis reçoivent chaque jour des candidats médicaments avant prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection provoque un affaiblissement des membres postérieurs, une posture voûtée et une perte de poids, et qu'environ 30 % des souris meurent en dix à douze jours. Il présente le projet comme une prestation de service destinée à "répondre aux attentes de différents clients" et revendique un modèle "indispensable" faute d'alternative in vitro.
Objectifs
L'infection par le virus du Nil occidental (VNO) est une zoonose transmise par les moustiques qui est endémo-épidémique en Europe. Le virus se transmet entre les oiseaux par la piqûre de moustiques infectés et, accessoirement, les humains et d'autres mammifères peuvent être infectés. Environ 80 % des infections au VNO chez les humains sont asymptomatiques. La fièvre du Nil occidental (WNF) est la présentation clinique la plus courante. Les personnes âgées et immunodéprimées sont plus à risque de développer la maladie neuroinvasive du Nil occidental (WNND). Actuellement, les vaccins homologués ne sont pas encore prêts pour un usage humain, et le traitement est pour la plupart non spécifique et de soutien. Le développement d'un modèle de souris pour tester l'efficacité de médicaments anti-viraux ou vaccins permettra de contribuer à acquérir des données précliniques indispensables au développement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de souris pour étudier la physiopathologie de l'infection humaine par le virus du Nil occidental (VNO) peut contribuer à acquérir des connaissances concernant la cinétique de la réponse immunitaire et des voies spécifiques responsables du contrôle de l'infection par le VNO et de la clairance virale. Ce modèle préclinique in vivo permettra de tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments anti-viraux. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes. La demande d'un modèle préclinique prédictif est forte tant dans les domaines de recherche académique que dans les sociétés pharmaceutiques qui développent les molécules anti-infectieuses de demain, mais se heurte à une offre limitée.
Procédures
Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le virus par injection dans le coussinet plantaire d'une patte arrière et l’administration de candidats médicaments sera réalisée tous les jours pendant maximum 12 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
Chez la souris, l'infection au WNV induit les signes cliniques habituels d'une maladie infectieuse : affaiblissement des membres postérieurs, posture voûtée, poil rugueux ou non soigné, activité réduite, respiration difficile, perte de poids et la mort dans 30% des cas. La cinétique de l'infection et des signes cliniques doit être établie pour chaque souche de virus car celle-ci varie considérablement d'un virus à un autre. 30% des souris infectées succombent à l'infection dans les 10–12 jours après l'infection, selon la dose d'inoculum.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les différents prélèvements. Il n’y a pas de possibilité de remplacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Faciles à travailler, les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre estimé est 200 animaux / an. Le nombre d'étude variera en fonction de la demande client. En fonction de la diversité et du nombre des paramètres biologiques à analyser entre 8 et 15 souris seront nécessaires par groupe. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 40, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules à tester, doses différentes de la molécule testée).
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid et une bûchette en bois, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Afin de palier l'inconfort occasionné par l'injection dans le coussinet plantaire, des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage afin de favoriser la prise alimentaire Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring (en annexe) permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Une infection systémique par le VNO est pratiquée chez de jeunes souris adultes (âgées de 6 à 10 semaines)