Souris
Caractérisation d’un modèle de souris pour l’hyperthermie d’effort
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles sont soumises à un exercice forcé sur tapis, à un test de sensibilité à la chaleur ou à l'anesthésique, avec mesures de température rectale sur animal vigile, pour déclencher des crises d'hyperthermie d'effort. Le porteur indique que ces crises provoquent des mouvements spasmodiques et des difficultés respiratoires, et que des stimulations sont appliquées pour maintenir la course, les animaux étant tués rapidement une fois la crise déclenchée. Il affirme que les causes de cette pathologie "ne peuvent être étudiées qu'in vivo" et vise un dépistage génétique chez les sportifs et les militaires.
Objectifs
Le coup de chaleur d’exercice ou hyperthermie d’effort est une maladie mortelle qui survient chez des sujets jeunes au cours d’une activité physique prolongée et intense. Il se caractérise par une élévation de la température corporelle (supérieure à 43 degrés celsius), un état neurologique allant de la confusion au coma, une contracture musculaire généralisée. Le décès des patients intervient si aucune prise en charge n'est réalisée en raison d’une défaillance multi-viscérale à la suite d'un emballement métabolique. Les patients sont cependant indemnes de tout symptôme en dehors de la crise. L’incidence des crises d’hyperthermie d'effort a longtemps été difficile à estimer, les populations à risque étant très spécifiques (militaires en situation de marche commando ou sportifs), bien que leurs conséquences puissent être fatales. L'augmentation des épreuves sportives de haute intensité pour des amateurs (marathons, ultra-trails…) a conduit à une augmentation des survenues de crises (jusqu’à 1 sur 1000 coureurs de marathon). La physiopathologie de l'hyperthermie d'effort est à ce jour très mal connue. Un projet de recherche antérieur a été réalisé sur les prédispositions génétiques à l’hyperthemie d'effort en étudiant une cohorte de soldats ayant fait un épisode d’hyperthermie d'effort lors d’exercices de marche commando. A l’issue d’une analyse génétique de 15 patients, quatre mutations ont été trouvées sur un même gène, chez quatre patients non apparentés, faisant ainsi de ce gène une cause génétique majeure de cette pathologie. Le but de ce projet est l’étude d’un modèle de souris portant une des mutations retrouvées chez les patients afin de valider l’implication de mutations de ce gène dans l’hyperthermie d'effort. Ce modèle de souris permettra également l’étude des mécanismes physiopathologiques de la maladie. Au final ce modèle permettra une meilleure détection et prise en charge des patients susceptibles d’être sujets à une crise d’hyperthemie d'effort.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de valider l’implication d’un nouveau gène dans l’hyperthermie d’effort et ainsi permettra d’avoir un moyen diagnostic par criblage génétique chez les athlètes, les militaires et de manière générale les populations d’actifs afin d’identifier les personnes ayant une prédisposition à développer des crises d’hyperthermie d'effort. Ce dépistage en amont permettrait d'éviter la survenue d'accident létal au cours d'un exercice intense. Enfin il permettra d’identifier les mécanismes physiopathologiques de cette maladie, ce qui ouvrira à plus long terme sur le développement d'approches thérapeutiques ou préventives.
Procédures
Les souris sont exposées à une seule des interventions suivantes : un exercice physique (durée 1 heure maximum), un test de sensibilité à l’anesthésique (durée une heure maximum), un test de sensibilité à la chaleur (durée 30 minutes maximum). Tous les animaux auront une à deux mesures de température rectale (durée de moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Des nuisances apparaissent lorsque les souris sont soumises à un exercice physique intense et prolongé, à une anesthésie, ou à une exposition prolongée à une température élevée, produisant l'apparition de crises d'hyperthermie. Ces nuisances sont de l'ordre du stress et de l'inconfort pendant la crise se manifestant par des mouvements altérés et spasmodiques et des difficultés respiratoires. Des nuisances telles de l'inconfort seront également présentes durant l’expérimentation car les souris seront soumises à des stimulations pour maintenir leur course sur le tapis. Un troisième inconfort est présent lors de la prise de température rectales sur les souris vigiles.
Devenir
Pour limiter la souffrance animale, les animaux seront mis à mort rapidement à l’issue du déclenchement de la crise d’hyperthermie. Par ailleurs, tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de préléver les tissus pour les analyses moléculaires et la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Il sera en effet nécessaire de préléver les tissus des animaux controles également afin de servir de controle pour les études moléculaires et d'identifier des marqueurs qui sont modifiés chez les animaux modèles mais pas chez les animaux controles.
Remplacement
L’objectif de ce projet est l’étude d’un modèle souris portant une des mutations retrouvées chez les patients ayant fait une crise d'hyperthermie d'effort. Cette mutation a été choisie sur les bases de données de la littérature, ainsi que d’analyses fonctionnelles sur système in-vitro (cellules) permettant de suggérer sa pathogénicité. Cependant les causes et conséquences physiologiques des crises d'hyperthemie d'effort ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, les études ne seront réalisées dans un première temps que sur des animaux porteurs d'une seule copie de la mutation, ce qui correspond exactement à la situation humaine, et sur un seul sexe. Si le phénotype n'est pas détectable, alors des animaux porteurs de deux copies du gène muté seront utilisés. Les femelles seront étudiées uniquement dans un second temps, en adaptant le nombre d'animaux selon les résultats obtenus sur les mâles.
Raffinement
Dans le but de réduire l’angoisse des animaux, des enrichissements seront placés dans les cages, ces dernières auront une taille adaptée au nombre d’animaux et seront régulièrement entretenues. Les animaux seront hébergés dans une pièce en conditions contrôlées. Les animaux seront manipulés de façon à limiter le stress. Les mesures de température effectuées par sonde rectale seront réalisées par des personnes compétentes afin de n’induire aucune douleur spécifique. Des point limites adaptés ont été mis en place afin de limiter la douleur éventuelle lié à notre projet.
Choix des espèces
Les techniques actuelles permettent facilement de reproduire les mutations à l’origine de maladie humaine sur un modèle murin. D’autre part, ce modèle est celui dont la physiologie se prête le mieux à l’exploration d’une pathologie déclenchée par l’exercice, en particulier par la proximité de ses structures musculaires et de son métabolisme avec l’humain. Les souris seront utilisées à partir de 2 mois en accord avec les études déjà réalisées dans la littérature sur des souris controles.
Etude de la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée du mélanome seule et associée à des inhibiteurs de checkpoints immunitaires
- Recherche appliquée
- Cancers
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voies intraveineuse, sous-cutanée, intra-tumorale et intra-péritonéale, portent une tumeur de mélanome et subissent une radiothérapie interne associée à des immunothérapies. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer perte de poids, nécrose ou infection de la tumeur, et qu'une étude de survie ne permet pas de garder les animaux en vie. Il conclut qu'un "modèle syngénique" est indispensable pour étudier la réponse immunitaire, ce qui "impose" selon lui le recours à la souris.
Objectifs
Au cours de ce projet préclinique évaluant différents schémas d’associations de la radiothérapie interne vectorisée (RIV) par le radioligand de la mélanine avec des inhibiteurs de checkpoints immunitaires (ICI), nous chercherons à déterminer quelle séquence de traitement (concomitant ou séquentiel) et quelles modalités (1 ou plusieurs injections de RIV) donnent les meilleurs résultats en terme de survie, de croissance tumorale et de synergie, dans des modèle in vivo de mélanome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compléter nos connaissances sur les modifications de laréponse immunitaire antitumorale induite par la RIV et de déterminer la meilleure séquence thérapeutique d’association de la RIV avec l’immunothérapie pour le mélanome métastatique.
Procédures
Sur animal vigile : - Injection intraveineuse veine caudale (1 à 3 injections par animal en fonction des études, 1 minute par injection) Sur animal anesthésié - Injection sous-cutanée (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-tumorale (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-péritonéale (4 injections par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur, difficulté de mobilisation).
Devenir
Les procédures prévus pour ces études (prélèvement des tumeurs, étude de survie) ne permettent pas de maintenir les animaux en vie à la fin de la procédure.
Remplacement
Les études de l’impact d’un traitement ou d’une combinaison de traitements sur le système immunitaire requièrent des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Notamment, la mise au point de nouvelles stratégies de combinaisons de traitements anticancéreux demande des études précliniques sur des modèles animaux. Les immunothérapies anticancéreuses requièrent de plus la présence du système immunitaire, imposant donc le recours à un modèle syngénique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Dans la procédure 1, des groupes contrôle communs à différents modèles ont également été prévus. De plus, la procédure 2 permet également de réduire le nombre d’animaux en ne testant qu’une seule hypothèse en procédure 3. Le nombre total d’animaux est de 736 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers. Un modèle syngénique est indispensable pour étudier in vivo une réponse immunitaire. Les animaux utilisés seront des adultes de 4-5 semaines ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liées à la puberté.
Impact des fongicides sur l’établissement de l’unité neurovasculaire au cours du développement cérébral
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
3 678 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, 2 400 subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et les géniteurs comme leur descendance sont exposés à des fongicides via l'eau de boisson jusqu'à des stades allant de 5 à 60 jours. Le porteur relie ce travail à la hausse des troubles du spectre autistique, mais situe les retombées thérapeutiques dans l'espoir d'identifier de nouvelles cibles, alors que les prélèvements de cerveaux, eux, sont certains. Sur le remplacement, il affirme que le modèle murin est "essentiel" et qu'"il n'existe pas non plus d'autres modèles" pour répondre à ses questions.
Objectifs
Depuis quelques années, une augmentation du risque du trouble du spectre de l'autisme (TSA) est retrouvée chez les enfants. Si la plupart des gènes responsables du TSA sont identifiés, l'implication de la composante environnementale reste peu étudiée. Pourtant les femmes enceintes et qui allaitent consomment quotidiennement des pesticides (dont font partie les fongicides); et les effets d'une expostion prénatale à ces produits sur le neurodéveloppement restent à déterminer. La recrudescence de cas de TSA pose la question de l'impact de ces fongicides dans la prédisposition au TSA et le développement cérébral. Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de neurones mais également de cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers permettent la communication entre le sang et les neurones. La majorité des études sur le TSA se focalisent sur les neurones, cependant le rôle des astrocytes et de leur interface avec les vaisseaux sanguins cérébraux sont importants et largement méconnus. C'est pourquoi notre étude portera sur ces deux composantes. La prévalence au TSA, ainsi que les symptômes, se trouvent être différents entre les femmes et les hommes. Nous réaliserons donc cette étude dans des modèles murins chez les deux sexes, afin d’évaluer l’impact des fongicides dans le développement cérébral selon le sexe. Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral et plus particulièrement sur la composante vasculaire et gliale grâce à des techniques de biologie moléculaire et biochimique (PCR, western-blot, RNA Seq) et des techniques d’imageries (microscopie confocale, à feuille de lumière). Pour cette étude un nombre total de 3678 animaux.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral de souriceaux nouveau-nés sains et prédisposés génétiquement aux TSA, dans l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter au plus tôt contre les malformations cérébrales induites par les pesticides, même à faibles doses.
Procédures
Trois interventions seront utilisés dans ce projet. 1) Injection sous-cutanée chez des nouveau-nés de 1 jour et dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 600 animaux. 2) Perfusion intracardiaque : réalisée sous anesthésie générale est sans réveil. Cette procédure dure 20 minutes maximum entre l'induction (anesthésique/analgésie) et la perfusion. Nombre d'animaux concernés : 2400 animaux. 3) Exposition aux fongicides des géniteurs et de leur descendance : exposition via l'eau de boisson. Cette procédure dure 4 mois pour les femelles génitrices, 2 mois pour les mâles géniteurs. Nombres d'animaux concernés : 198 animaux. Pour la descendance, les animaux sont exposés jusqu'au stade de devéloppement d'étude souhaité (5, 15, 30 ou 60 jours). Nombre d'animaux concernés : 3000 animaux.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (injection de tamoxifen) qui peuvent entraîner des effets modérés (irritation au site d'injection). Les lots d'animaux traités avec les fongicides seront exposés à des doses retrouvées dans l'eau potable et autorisées par l'UE (directive 80-778-EEC) et considérées comme non nuisibles pour la santé. Le but de notre étude est de déterminer les effets nocifs qui peuvent découler de cette exposition.
Devenir
Les animaux utilisés pour les accouplements seront mis à mort par lorsque qu'ils seront trop âgés pour continuer la reproduction. Les animaux utilisés pour les différentes études (histologiques, biochimiques, transcriptomiques, de contractilité des vaisseaux) seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. En raison de l’ignorance de l’impact des fongicides sur la fertilité, le nombre de couple reproducteur a été volontairement surestimé par rapport à une situation sans fongicide, mais qu’il sera revu autant que possible à la baisse. Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus du mix kétamine/xylazine, de la buprénorphine est injectée aux animaux subissant une thoracotomie ‘perfusion intracardiaque). Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Pour les accouplements, les animaux seront utilisés à partir de P60. Pour répondre aux différentes problématiques posées dans ce projet, les animaux exposés in utero/post-natal aux fongicides, seront utilisés à 5 stades de développement : P3, P7, P21, P60 et P120.
Développement d’un modèle de défaillance hépatique et multiorganes chez la souris cirrhotique. Application à l’évaluation de molécules dans cette pathologie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent pendant dix semaines des injections d'un composé toxique pour le foie, puis un empoisonnement à l'acétaminophène associé à une inflammation, pour développer un modèle de défaillance hépatique aiguë et y tester des médicaments. Le porteur indique s'attendre à des animaux "en état de choc et de détresse cardio-respiratoire", certains devant être mis à mort par anticipation. Il revendique de reproduire une gravité "sévère" tout en maintenant les animaux dans un état jugé acceptable, et affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut remplacer cette évaluation.
Objectifs
Développer un modèle pertinent pour tester des médicaments destinés aux soins des patients lors de décompensation aigue de la cirrhose du foie, ce besoin clinique n’est pas satisfait aujourd’hui. Le malade chronique du foie (origine alcoolique ou non, virale ou médicamenteuse) peut sous l’effet d’un agent déclenchant décompenser, le fragile équilibre qui préservait une fonction à ses organes majeurs est rompu. Une cascade d'événements tels que septicémie, ou défaillance multiviscérale peut entrainer la mort. Un modèle expérimental qui imite l'évolution de la décompensation cirrhotique est crucial pour la découverte de traitements pour ces patients. L’installation et évolution de cette maladie sont lente chez l’homme, elles résultent d’une agression et d’un stress continu des cellules hépatiques, auquel vient subitement s’ajouter un événement aigu qui précite la décompensation. La modèle CALPS reproduit chez la souris rapidement cet enchainement d’évènement, il associe une agression lente du foie par un agent toxique pour le foie, puis un stress oxydatif puissant et une inflammation massive. • C : CCl4 : le tetrachlorure de carbone est toxique pour le foie son métabolisme produit des radicaux libres, oxydants et toxiques pour les cellules du foie. • A : l’Acétaminophène (Doliprane) peut produire s’il est ingéré massivement un stress oxydatif violent qui peut engendrer la mort par empoisonnement. • LPS : le LipoPolySaccharide un constituant de la paroi de bactéries déclenche la réaction inflammatoire défense contre l’infection. L’administration régulière prolongée du CCl4 pendant 10 semaines produit l’altération de la fonction hépatique. L’empoisonnement à l’acétaminophène associé à une inflammation massive déclenche la défaillance aigue, et une rupture progressive des fonctions des organes (foie, reins, atteinte cardio-respiratoire, troubles de l’hémostase, et troubles centraux) qui se manifeste par des augmentations de biomarqueurs spécifiques (enzyme hépatiques, cytokines, ionogrammes, paramètres hématologiques), cela pouvant entrainer la mort. Ce modèle expérimental permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments par les dosages des biomarqueurs. C’est le défi que nous nous fixons.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible. Aujourd’hui on va adresser les traitements qui vont agir sur la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme)
Procédures
Au cours des procédures expérimentales décrites dans ce dossier, nous ne procéderons qu'à 3 gestes techniques différents : 1/ l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 2 fois par semaine pendant la première phase de 10 semaines d'induction de la fibrose. Les volumes injectés seront de 2mL/kg dans un véhicule gras (huile) , soit 20 injections IP 2/ l'administration de composé par voie orale à l'aide de sonde d'intubation orogastrique. Leur durée n'excèdera pas 14 jours à raison d'un gavage quotidien de 10ml/Kg à l'aide d'un véhicule aqueurx et physiologique, soit 14 gavages. 3/ ou à la place de l'administration orale : l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 1 fois par jour pendant la phase de 14 jours max d'évaluation des composé à tester . Les volumes injectés seront de 10mL/kg dans un véhicule aqueux. Soit 14 injection IP 4/ le prélèvement sanguin intermédiaire ou terminal. Dans les 2 cas ils seront pratiqués sous anesthésie générale à l'isoflurane. Cahque animal ne subira qu'un seul prélèvement sanguin intermédiaire d'un volume maximal de 150µL de sang total. Le prélèvement terminal sera lui plus abondant (vol max) , mais l'animal ne sera pas réveillé avant se mise à mort.
Impact sur les animaux
L’ACLF représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris présente lors de l’induction de l’ACLF des signes clini ques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global».
Réduction
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires simples et complexes de type organoïdes, ce qui permet d’ajouter un filtre pour n’engager des études in vivo qu’avec les produits les plus pertinents et prometteurs.
Raffinement
L'ACLF qui par définition est chez l'homme une pathologie qui entraine le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle d'étude expérimental est lui aussi sévère, la précipitation de la décompensation est subite, nous avons établi des grilles de scoring et une surveillance accrue des animaux de manière à ne pas conserver un animal qui aurait atteint les points d'arrêt anticipés.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les animaux seront des jeunes adultes matures qui seront immunocompétents
Effet du microbiote intestinal sur l’inflammation pancréatique aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins et fécaux, une inoculation orale de microbiote et des injections répétées déclenchant une pancréatite, pour vérifier qu'en l'absence de microbiote intestinal l'inflammation du pancréas est atténuée. Le porteur indique que l'induction de pancréatite ne provoque qu'une légère perte de poids transitoire et un stress de courte durée. Il affirme que ces effets systémiques ne peuvent être reproduits in vitro, faute notamment de lignées cellulaires spécifiques du pancréas.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l'une des tumeurs humaines les plus mortelles : moins de 5% des patients survivent plus de 5 ans. Il est crucial de comprendre comment les facteurs environnementaux (non génétiques) contribuent au développement de cette maladie, car cela nous permettrait d'agir sur les facteurs modifiables pour prévenir son développement. L’inflammation du pancréas appelé pancréatite est un facteur de risque pour le développement du cancer du pancréas. Une meilleure compréhension des dysfonctionnements engendrés par la pancréatite pourrait aider à diminuer le risque de la tumeur. Au cours de la dernière décennie, le microbiote intestinal est apparu comme un modulateur de la maladie pancréatique. Récemment, nous avons exploré l'effet du microbiote intestinal sur le développement de l'inflammation pancréatique basale (niveau normal de l’inflammation) ou de la pancréatite (état pathologique ; niveau important de l’inflammation). Les expériences antérieures indiquent que l'élimination du microbiote intestinal par l'utilisation d'antibiotiques à large spectre est protectrice contre la pancréatite. Ces résultats sont cliniquement importants car : i) la pancréatite est l'un des principaux facteurs de risque de développement du cancer du pancréas, ii) ils suggèrent la possibilité de moduler la maladie pancréatique en modifiant le microbiote intestinal, une stratégie qui peut être appliquée à l'homme. Malgré la pertinence de ces résultats, les observations faites avec des souris traitées aux antibiotiques doivent être validées chez des souris axéniques (exemptes de tous microorganismes). L'objectif principal de ce projet est de vérifier qu'en l'absence de microbiote intestinal, les souris présentent une atténuation de la pancréatite.
Bénéfices attendus
Ces expériences contribueront à notre compréhension de la manière dont le microbiote intestinal module l'un des principaux facteurs de risque de développement du cancer du pancréas : la pancréatite. Ces expériences sont très importantes d'un point de vue clinique, car elles nous offrent la possibilité d'agir sur un facteur potentiellement modifiable chez l'homme pour prévenir les maladies du pancréas.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue avant et après l'induction de la pancréatite, et utilisés pour réaliser des analyses biochimiques afin d'estimer la gravité de la pancréatite. Le volume de sang prélevé sera inférieur à 100 µl. Une partie des animaux auront une unique inoculation par voie orale d’un microbiote complexe. Il y aura des prélèvements fécaux avant l’induction de la pancréatite. 2-3 pellets par souris seront prélevés. Les pellets fécaux sont émis spontanément par les souris lorsqu’elles sont prises en main. Les souris subiront également des injections qui seront au nombre de 7 (une par heure) pendant une ou deux journée (non consécutives) en fonction des procédures.
Impact sur les animaux
Les procédures d'induction de pancréatite aiguë légère et aiguë modérée ne provoquent pas de signes cliniques ou comportementaux indicatifs de douleur, sauf une légère perte de poids transitoire (pendant un à deux jours). Les gavages et les injections entrainent un léger stress de courte durée (moins d’une minute). Les prélèvements de sang provoquent un léger stress dû à la boite de contention et au prélèvement lui-même mais il est de courte durée (2-3 minutes).
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Il s’agit de la méthode de mise à mort la plus rapide afin d’éviter l’autodigestion du pancréas (moins de 1 minute). Nous prélèverons le pancréas, l’intestin, le foie et la rate.
Remplacement
L'effet du microbiote intestinal sur l'inflammation pancréatique est probablement médié par des effets systémiques (par exemple, par le système immunitaire) qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Par conséquent, ces expériences doivent être effectuées sur des souris vivantes. De plus, l'absence de lignées cellulaires spécifiques du pancréas rend difficile la réalisation d'expériences in vitro.
Réduction
Le nombre de souris choisi est basé sur des expériences antérieures réalisées chez des souris dans lesquelles le microbiote intestinal a été appauvri par l'utilisation d'antibiotiques à large spectre, lesquelles sont comparables aux souris axéniques. Ces expériences nous ont permis de conclure que 10 souris par groupe est un nombre suffisant pour détecter des différences statistiquement significatives entre les groupes, si elles existent. Les résultats biochimiques et histologiques seront analysés à l'aide de tests statistiques. Des mesures correctives seront appliquées si un des points limites est atteint.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identiques (3-4 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation à Les souris recevront à volonté un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Il y aura une observation quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (change de cages, etc…). Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début de procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les gavages, les injections intrapéritonéales, les prélèvements sanguins et les mises à mort seront effectués par une personne expérimentée. Les souris seront observées pendant 5 minutes après la réalisation de chaque injection, prélèvement sanguin et gavage pour vérifier que leur comportement est normal. Une observation individuelle sera effectuée deux fois par jour (matin et soir) à partir du moment de l'induction de la pancréatite. Il y aura également un suivi du poids des souris après l’induction de la pancréatite. Des points limites ont été mis en place. S’ils sont atteints alors la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
La plupart des modèles expérimentaux de pancréatite ou modèles génétiques de cancer du pancréas ont été établis chez le rongeur, la souris étant le principal modèle animal utilisé pour étudier la pathologie pancréatique. Par ailleurs, la majorité des études publiées au cours des dernières années sur la relation entre le microbiote intestinal et la pathologie pancréatique ont été réalisées chez la souris. Ces expériences font partie d'un projet plus vaste, dans lequel l'utilisation de modèles génétiques de souris prédomine. Par conséquent, l'utilisation de souris pour réaliser ces expériences est nécessaire pour garantir l'intégration des résultats. Les groupes de souris conventionnalisées seront utilisés à partir de l’âge de 3 semaines pour l’installation du microbiote. Ensuite Lles inductions des pancréatites pour tous les groupes se feront entre l’âge de 7 et 12 semaines afin de les comparer aux résultats du projet antérieur.
Habituation de souris diabétiques à la consommation de matrices alimentaires
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réutilisées d'un précédent projet, elles sont mises à jeun quelques heures puis placées de façon répétée en cage individuelle, pour les habituer à consommer des matrices alimentaires devant recevoir un actif régulant la glycémie. Le porteur indique que le jeûne et l'isolement répété peuvent générer un stress, et que ces souris sont mises à mort faute d'autre projet prévu. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer le choix et l'intégration de la nourriture par un être vivant.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’habituer des souris diabétiques à la consommation de différentes matrices alimentaires dans lesquelles il est envisagé d’incorporer un actif breveté et commercialisé, un dérivé de lait, permettant de réguler la glycémie en réduisant de manière significative la glycémie postprandiale (après un repas) pour les personnes en pré-diabète. Il faut cependant s’assurer au préalable que les souris consomment ces matrices alimentaires sans présence de l’actif, le plus rapidement possible, nécessitant une habituation à cette consommation d’un aliment différent de leur régime habituel pour lever la réticence et/ou le rejet à manger un aliment nouveau (néophobie alimentaire). Cette habituation sera effectuée en 2 phases successives : au cours de la 1ère phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées directement dans la cage des souris pendant plusieurs jours, en leur laissant accès à leur régime habituel et sans mise à jeun préalable, puis au cours de la 2ème phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées dans une cage d’isolement dans laquelle les souris seront mises individuellement après une période de mise à jeun préalable pour qu’elles s’habituent à consommer les matrices alimentaires qui leur seront proposées, le plus rapidement possible, pendant également plusieurs jours. Pour réaliser ce projet, nous réutiliserons des souris diabétiques issues d’un autre projet autorisé (validité toujours en cours) au cours duquel les souris auront été soumises à une procédure expérimentale de classe modérée, et après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 projets.
Bénéfices attendus
Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose dans le sang (hyperglycémie). Dans le cas du diabète de type 2 (90% des cas de diabète), ce phénomène provoqué par une perturbation du métabolisme glucidique apparaît progressivement et insidieusement. En France, en 2019, près de 4 millions de personnes étaient identifiées diabétiques par l'assurance maladie et prenaient un traitement médicamenteux pour leur diabète (soit 5,3% de la population). A cela, s’ajoutent les personnes diabétiques qui s’ignorent. Cette prévalence ne cesse d’augmenter en France, particulièrement chez les hommes, les jeunes (80 ans). Les personnes diabétiques doivent s’astreindre à un régime spécial, avec notamment un contrôle voire la limitation très stricte de la prise d’aliments sucrés, ce qui peut impacter leur moral. Elles vivent parfois des problèmes de santé mentale comme la dépression, l’anxiété et les troubles de l’alimentation, voire ce qui est maintenant appelé l’épuisement diabétique qui est une des complications psychologiques les plus graves de la maladie. Les personnes qui en sont atteintes ressentent une profonde impuissance et un désespoir intense. Les industriels des secteurs pharmaceutiques et agroalimentaires cherchent donc des molécules et ingrédients pouvant agir sur la limitation du passage dans le sang des sucres ingérés lors des repas. Cette étude préliminaire est donc la base d’un projet consistant à développer des aliments fonctionnels pouvant être consommés par toutes les personnes y compris et surtout les personnes diabétiques. Permettre en effet aux personnes diabétiques de consommer à nouveau yaourts, céréales, chocolat ou barres nutritionnelles lors d’activités physiques leur redonnerait un confort de vie plus important et limiterait la survenue de pathologies associées telles que celles décrites précédemment.
Procédures
Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sera réalisé sur les 40 souris diabétiques nécessaires à la réalisation de ce projet. Elles seront mises à jeun pendant quelques heures puis placées en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, ce qui pourra engendrer un stress. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des souris pendant quelques heures ainsi que le placement en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, pourra engendrer un stress pour les souris. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 souris diabétiques db/db nécessaires à la réalisation de ce projet, réutilisées d’un autre projet autorisé, seront mises à mort à l’issue des expérimentations, aucun autre projet n’étant envisagé sur ce lot de souris.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo mimant l’alimentation, c’est à dire le choix et l’intégration de la nourriture par un être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre de souris diabétiques minimum nécessaire et suffisant issues d’une expérimentation précédente, après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 études, afin d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base d’études précédentes réalisées chez le rat suivant le même protocole expérimental d’habituation qui sera suivi.
Raffinement
Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 2 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications du comportement des animaux sont observées (cachexie, vocalises, convulsions…), celles-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des feuilles de papier absorbant seront placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
La souris diabétique est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser cette étude dans le cadre d’un projet visant à développer des aliments fonctionnels pour les personnes diabétiques. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur cette pathologie Les animaux seront des souris diabétiques âgées de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur le diabète
Les lipides bioactifs peuvent-ils réduire l’obésité et améliorer l’insulinorésistance ?
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en graisses et en sucres, elles subissent sept prélèvements sanguins à la queue, un test de tolérance à l'insuline et des mesures répétées en tube de contention, pour évaluer l'effet de lipides bioactifs sur l'obésité. Le porteur indique que les tests peuvent stresser les animaux et qu'un isolement de quarante-huit heures est imposé pour l'analyse du métabolisme. Il justifie l'usage de la souris par le fait que ces lipides sont destinés à l'alimentation humaine et qu'il est donc "judicieux" de les tester dans l'alimentation d'un modèle animal.
Objectifs
Les lipides bioactifs sont présents en faible quantité dans les plantes, chez certains microorganismes et chez les animaux, en particulier le poisson. Les trois effets biologiques majeurs des lipides bioactifs sont : antioxydant, antimicrobien et anti-inflammatoire. Des études plus spécifiques sur les effets santé ont été menées ces dernières années et montrent qu'ils pourraient aussi impacter le métabolisme des lipides, l’insulinorésistance et le diabète, les maladies cardiovasculaires, voire certaines maladies neurodégénératives. Ces composés bioactifs de notre alimentation pourraient donc avoir des effets bénéfiques potentiels contre les problèmes métaboliques associés à une alimentation de type occidental. Ce projet concerne l'étude des effets curatifs d'une forme particulière de lipides bioactifs sur des souris obèses et fait suite à notre projet précédent qui a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques lors d'un traitement préventif.
Bénéfices attendus
Les travaux de la littérature suggèrent que les lipides bioactifs possèdent un fort potentiel pour la santé dans le domaine de l’obésité et des désordres métaboliques associés. La forme que nous allons utiliser n'a pas encore été testée en dehors de notre laboratoire. Nous avons déjà pu mettre en évidence des effets bénéfiques dans le cadre d'un traitement préventif de l'obésité et nous souhaitons vérifier ces effets dans le cadre d'un traitement curatif. Notre hypothèse est que ces lipides bioactifs peuvent réduire l’obésité des souris sous régime enrichie en gras et en sucres et peuvent réduire la résistance à l’insuline et améliorer les troubles métaboliques associés. Ils pourraient être utilisés en alimentation humaine.
Procédures
Nous pratiquerons au total 7 prélèvements sanguins sur animaux vigiles par ponction à la queue (30 secondes par prélèvement). Nous respecterons les recommandations en terme de volumes et de temps de récupération car nous prélèverons moins de 7.5% du volume sanguin total en une semaine. Les animaux recevront deux injections intrapéritonéales (5 secondes par injection), une de solution d’insuline pour le test de tolérance à l’insuline, l’autre d’anesthésique au moment de l’euthanasie. Pour la mesure de composition corporelle hebdomadaire par IRM, l’animal sera mis en tube de contention 2 min, en tout 5 fois. Pour la mesure de motricité, l’animal sera déposé sur un cylindre en rotation 3 fois 5 minutes avec 20 minutes de repos entre chaque séance.
Impact sur les animaux
Les souris obèses recevront un régime riche en graisse et en sucre (type fast-food). Cet état est comparable aux personnes souffrant d'obésité. Les animaux pourront être stressés pendant les différents test non invasifs. Ils seront isolés pendant 48 heures pour l'analyse du métabolisme respiratoire.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de sang et de tissus qui nous permettront de caractériser les effets métabolique et musculaire de notre lipide bioactif.
Remplacement
Les lipides bioactifs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir, ralentir ou soigner le développement de l'obésité et des dommages associés chez l'Homme. Il est donc judicieux de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal.
Réduction
Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats obtenus par notre laboratoire et d’analyses statistiques pour définir le nombre minimal nécessaire. L'objectif étant d'utiliser ces lipides bio-actifs en alimentation humaine, nous les allons tester chez des mâles et des femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 2 pour mieux contrôler tout comportement d’agressivité et de bagarres chez les mâles. La nourriture sera changée tous les 2 à 3 jours afin d'éviter une perte d'appétence (rance). Les animaux seront manipulés avec un tunnel afin d'éviter la préhension par la queue et pour les habituer au test de composition corporelle qui est aussi réalisé dans un tunnel de contention. Pour les différents tests les animaux seront habitués au prélable au nouvel environnement et nous aplliquerons des points limites préalablement définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère pertinent pour les études du métabolisme. Nous pouvons obtenir des animaux mimant le syndrome métabolique humain. Les animaux seront âgés de 21 semaines à réception et de 6 mois pour l'euthanasie. D'après les données de notre fournisseur, ces adultes seront "obèses". Nous pourrons ainsi vérifier un effet curatif de nos traitements.
Etude des effets de nouvelles molécules dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
9 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'injection d'un composé dans le cerveau, puis des injections quotidiennes de molécules à tester et des tests comportementaux, dont un test d'évitement passif fondé sur un choc électrique aux pattes, pour évaluer des molécules contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que les injections génèrent du stress et que la mémoire est évaluée par la perception de ce choc électrique. Il affirme que les modèles murins sont "indispensables", seuls recours in vivo autre que l'humain à présenter les symptômes de la maladie.
Objectifs
Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie complexe, les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant un seul mécanisme pathologique de la MA ne sera pas suffisant. Nous cherchons donc à identifier de nouvelles molécules à fort potentiel neuroprotecteur. Nous développons également des molécules hydrides, composés de deux entités ciblants des combinaisons de cibles. Il est donc primordial de tester ces molécules sur un modèle in vivo de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement innovant. Pour cela un modèle pharmacologique de souris Alzheimer sera utilisé pour injecter pendant 7 jours les molécules seules ou en combinaison, puis le statut mnésique des animaux sera évalué grâce à des tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur un modèle aigu prédictif de la MA, avant de plus longue expérimentations sur un modèle transgénique, pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules de nouvelle génération active seule ou en combinaison pour une action modifiant de façon durable le décours de la maladie.
Procédures
Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'injection du composé dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du composé. Ensuite durant 1-7 jours les animaux recevront une injection dans l'abdomen des molécules à tester. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
La chirurgie sous anesthésie est peu invasive. Cette procédure sera suivie par une ou plusieurs injections systémiques dans l'abdomen, ce qui pourra engendrer du stress chez l'animal. Par ailleurs, le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'un choc électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.
Réduction
Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite . Les animaux sont testés sur différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire sur chaque animal. Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.
Choix des espèces
Le modèle souris permet de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et le modèle permet d'obtenir des données préliminaires transférables aux modèles transgéniques murins. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que la toxicité induite par le composé est la plus marquée, que l'injection dans le cerveau est la plus simple à faire et que les déficits comportementaux et altérations biochimiques ont été caractérisés.
Génération d’hybridomes pour des applications de recherche, de détection et de diagnostic.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes et des prélèvements sanguins, et une partie subit l'injection de cellules d'hybridome déclenchant la formation d'un liquide abdominal, pour produire des anticorps monoclonaux destinés à des tests de diagnostic. Le porteur indique que l'accumulation de ce liquide provoque une douleur abdominale durant cinq à six jours. Il affirme que l'immunisation des souris reste "indispensable" à court terme, les méthodes in vitro ne produisant pas de réponses immunitaires suffisantes.
Objectifs
Le projet vise à la génération et à la production d’anticorps monoclonaux de souris dirigés contre différentes cibles antigéniques dans le cadre de multiples programmes de recherche. Ces anticorps reconnaissent très spécifiquement des antigènes, marqueurs d’agents étrangers à un organisme. La finalité de la majorité des anticorps générés dans ce projet est le développement de tests de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines reliés à des problématiques de maladies infectieuses émergentes ou ré émergentes (ex : Ebola, ZIKA, SARS-CoV2, Variole du singe, etc…) et d’intérêt dans le domaine de la maitrise et la détection des risques biologiques. Les tests développés sont pour l’essentiel des tests rapides antigéniques » (ex : test antigénique COVID19) qui utilisent les anticorps monoclonaux pour permettre la détection spécifique des agents pathogènes (ex : bactéries, virus ou toxines. Les anticorps monoclonaux sont utilisés depuis plusieurs décennies dans ce type d’application, néanmoins de nouveaux tests rapides de diagnostic et de détection doivent régulièrement être mis au point pour suivre les émergences des maladies infectieuses, de différentes pathologies, pour la bio sécurité et la bio sureté. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont la génération de nouveaux anticorps monoclonaux, permettant la mise au point de tests de diagnostic ou de détection de maladies infectieuses émergentes ou ré-émergentes. Dans les exemples récents nous pouvons notamment citer les tests rapides antigéniques rapides et autotests pour la COVID19. L’obtention d’anticorps monoclonaux permet également de développer des tests de diagnostic de différentes pathologies et aussi pour la détection environnementale d’agents biologiques (bactéries, virus et toxines) dans le cadre de la lutte contre les menaces biologiques. Ce projet participe à la lutte contre ces menaces au sens large et permet de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des Autorités de santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes avec une seringue pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois. Les animaux seront soumis à 3 ou 4 prises de sang (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois. Certains animaux seront soumis à une injection d’une substance immunostimulante et de cellules hybridomes (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) déclenchant la formation d’un liquide abdominal dont le prélèvement est réalisé après euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Douleur au point d’injection induite par l’injection de substances non pathogènes destinées à immuniser les animaux contre un antigène. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur abdominale induite par l’injection d’une substance immunostimulante. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur induite par l’accumulation d’un liquide abdominal. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de 5 à 6 jours.
Devenir
Tous les animaux inclus dans une procédure sont euthanasiés en accord avec les protocoles scientifiques publiés pour la génération et la production d’hybridomes et d’anticorps monoclonaux de souris.
Remplacement
Le développement d’hybridomes à des fins diagnostiques ou de détection nécessite l’immunisation d’animaux afin d’obtenir les lymphocytes immuno-stimulés par l’antigène. Le niveau d’immunisation recherché correspond à un état d’hyper immunisation. Les méthodes d’immunisation in vitro avec des lymphocytes naïfs ne permettent pas aujourd’hui d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes. Les autres technologies basées sur l’utilisation, notamment, de phages ne permettent pas la génération de réactifs de qualité suffisante pour permettre la mise au point de tests diagnostiques répondant aux spécifications attendues par les autorités de santé. Dans une vision moyen terme, le laboratoire souhaite débuter des études visant à mettre au point des organoïdes en culture permettant la maturation de lymphocytes, avec l’objectif dans plusieurs années, de pouvoir obtenir des réponses immunitaires in vitro de haute affinité. Dans l’immédiat l’immunisation des souris reste indispensable. Le criblage et la caractérisation des anticorps produits par l'ensemble des hybridomes générés ne peut se faire en parallèle qu'avec une méthode de production identique pour chaque anticorps. Il est impossible dans le cadre de ce criblage d'optimiser les conditions de culture cellualire et l’adaptation à un milieu de culture spécifique pour permettre une production in vitro de ces hybridomes. Nous avons besoin à ce niveau d’une garantie de résultats. En dehors de ces circonstances, des méthodes de production in vitro en bioréacteur sont réalisées pour les productions massiques d’anticorps.
Réduction
Les études statistiques ne sont pas adaptables à ce type de projet. Les résultats sont évalués par rapport au nombre d’hybridomes attendus et au nombre d’anticorps estimés à produire. Cette estimation tient compte de notre expérience passée dans ce type de projet et du constat que dans le projet précédent, nous avons utilisé moins de 30% de ce que nous avions estimé à priori. Quoi qu’il en soit, tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, notamment pour le degré sévère.
Raffinement
Les prise de sang seront réalisées après anesthésie des animaux. Les animaux seront hébergés à 4 par cage avec cycle diurne-nocturne de 12 heures. L’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel sous la supervision permanente du responsable du bien-être animal. L’hébergement animal est organisé en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Si un des points limites établis est proche d’être atteint, l’animal pourra être euthanasié afin de lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont un choix obligatoire car les cellules de myélome (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules) employées pour fusionner les lymphocytes sont des cellules de souris. Différentes souches de souris pourront être utilisées en fonction des antigènes injectés car elles peuvent avoir un répertoire immunologique différent qui peut modifier le niveau de réponse immunitaire. Ces choix seront faits selon les données bibliographiques et l’expérience passée du laboratoire. Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires. Jeunes adultes (6 à 8 semaines). Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires.
Cytosquelette et autophagie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une injection unique dans l'abdomen, pour un traitement pharmacologique ou une anesthésie, afin d'étudier le rôle de modifications des microtubules dans l'autophagie. Le porteur décrit une procédure principale peu invasive et une surveillance du stress limitée à environ une heure d'expérience. Il affirme que l'utilisation d'organismes vivants est "nécessaire" pour examiner les conséquences de l'altération de l'autophagie sur l'anatomie cérébrale et cardiaque.
Objectifs
L'autophagie est un mécanisme de protection des cellules qui joue un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Le dysfonctionnement de l'autophagie est à l'origine de maladies graves, telles que la neurodégénérescence, le cancer et les maladies cardiaques. Les microtubules sont des fibres du cytosquelette qui ont des fonctions polyvalentes dans les cellules, notamment pour l'autophagie. En utilisant plusieurs modèles de souris établis, ce projet vise à comprendre si certaines modifications chimiques des microtubules pourraient jouer un rôle important dans les processus d'autophagie.
Bénéfices attendus
Des données récentes révèlent des défauts du cytosquelette dans la maladie d'Alzheimer et certaines maladies cardiaques. En conduisant à l'accumulation d'agrégats toxiques dans les cellules, les anomalies du cytosquelette de microtubules pourraient accélérer la progression de la maladie. Ce projet devrait permettre de préciser les liens entre microtubules et autophagie, et également d'identifier des cibles pour tenter d'améliorer l'autophagie et la fonction neuronale et/ou cardiaque. Le projet vise ainsi une meilleure compréhension d'un mécanisme biologique fondamental mais aussi l'évaluation d'un nouveau concept thérapeutique.
Procédures
Les animaux vigiles ne subiront qu'une seule injection dans l'abdomen pour un traitement pharmacologique ou pour une anesthésie (30 sec).
Impact sur les animaux
Injection dans l'abdomen. Anesthésie profonde et sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis à mort au cours des procédures pour prélèvements d'organes et étude des anatomies cérébrales et cardiaques.
Remplacement
Ce projet a pour but d’étudier les conséquences de défauts du cytosquelette sur l’autophagie in vivo. L’utilisation d’organismes vivants est nécessaire pour examiner les conséquences de l’altération de l’autophagie sur la structure et l’anatomie cérébrales et cardiaques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.
Raffinement
Bien que la procédure principale soit classée en classe légère et que l’expérience mesurant l’activité autophagique des souris ne dure qu’une heure environ, l’état de santé et de stress des souris sera surveillé tout au long de l’expérience. Les animaux sont hébergés et regroupés suivant leur sexe et filiation dans des cages contenant un enrichissement composé de divers objets dédiés spécifiquement aux souris. Lorsque les animaux seront transportés depuis d'autres structures, ils seront également regroupés suivant leur sexe et filiation et nous prévoirons un temps d'habituation d'une semaine minimum dans les nouveaux locaux.
Choix des espèces
La souris est un mammifère génétiquement modifiable et son anatomie et sa physiologie de la souris sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. L'élevage de souris ainsi que les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. De plus, les modèles génétiquement modifiés d'intérêt pour cette étude existent déjà. Les animaux seront utilisés à 10, 30 et plus de 52 semaines pour évaluer si l’autophagie évolue au cours de la vie de la souris, en particulier lors de son vieillissement.
Etude de l’hétérogénéité du cancer colorectal dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales, des traitements répétés et un suivi de la tumeur par imagerie sous anesthésie, pour tester des chimiothérapies adaptées aux sous-types de cancer colorectal. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte d'appétit et de poids, et que toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses sont tuées pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier l'évolution dynamique du cancer colorectal, les molécules ayant déjà été sélectionnées in vitro.
Objectifs
Les cancers colorectaux (CCR) font partis des cancers les plus fréquents en France avec 43336 nouveaux cas en 2018 et représentent la deuxième cause de mort par cancer avec 17117 décès. Ils peuvent être classés selon un consensus de quatre sous-types moléculaires. Un de ces sous-types est notoirement résistant aux interventions thérapeutiques, comme démontré par des études précliniques et des observations cliniques rétrospectives. En se basant sur ce constat, nous avons réalisé des criblages pour identifier les médicaments qui agissent sélectivement sur de telles cellules. Nous avons donc démontré dans des expériences in vitro que 2 molécules sont particulièrement efficaces contre une lignée cellulaire humaine du sous-type résistant mais pas contre une lignée cellulaire non résistante. Nous souhaitons donc confirmer ces résultats in vivo afin de pouvoir par la suite trouver les schémas de chimiothérapie les plus adaptés en fonction des CMS.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des chimiothérapies adaptées aux différents sous-types moléculaires spécifiques du cancer colorectal. Les résultats ont donc le potentiel d'améliorer les méthodes de traitement de certains cancers colorectaux.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules tumorales par animal. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min 2-3 fois par semaine pour mesurer la croissance tumorale. Les traitements se font sous anesthésie local par injection. une fois tous les 2 jours. L’injection prend 1 min. Une fois par semaine,la croissance tumorale et l’apparition de métastases sera suivi avec la machine d'imagerie en bioluminsescence : sous anesthésie générale (durée maximum 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à : - Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, avec croissance tumorale limitée - L’injection de traitements - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvent entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.
Devenir
Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. Des prélèvements post-mortem d'organes et de tumeurs pour analyse seront également effectués.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour étudier l’évolution dynamique du cancer colorectal et trouver des chimiothérapies adaptées. Les traitements ont déjà été testés et sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses caractéristiques dérivées de patients.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de 10 souris (avec un maximum de 210 animaux) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les échantillons obtenus seront partagés avec des collaborateurs.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un élevage social (mais maximum 5 par cage, exclusion des souris agressives), animaux hébergés au calme. Les manipulations, injections et l’euthanasie seront réalisées à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en technique et de suivi microbiologique et vétérinaire. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Étude du rôle de la carbamylation sur l’agrégation plaquettaire, l’hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
195 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Sous anesthésie, elles subissent un prélèvement de sang dans la veine cave, une mesure du temps de saignement à la queue, puis une lésion thrombotique de la carotide provoquée par un patch de perchlorure de fer, pour étudier l'effet de la carbamylation du collagène sur la thrombose. Le porteur indique que les animaux, anesthésiés puis mis à mort par dislocation cervicale, ne présenteraient aucune douleur. Il affirme qu'aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer le temps de saignement, la thrombose étant un phénomène "complexe, multifactoriel, multicellulaire".
Objectifs
Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, d'ici à 2030, une personne sur six dans le monde aura 60 ans ou plus. Cet allongement de la durée de vie engendre une explosion des maladies chroniques telles que les affections cardiovasculaires. Du point de vue biologique, le vieillissement est le produit de l’accumulation d’un vaste éventail de dommages moléculaires et cellulaires au fil du temps. Au niveau vasculaire, le vieillissement conduit à des modifications des constituants des vaisseaux, dont le collagène. Le collagène voit ses propriétés structurales et fonctionnelles altérées en partie à cause de modifications chimiques appelées réactions de carbamylation. Ces réactions de carbamylation sont également amplifiées lors de l'insuffisance rénale chronique, pathologie conduisant à des complications thrombotiques mais aussi hémorragiques. Ce projet a donc pour but d'étudier les effets de la carbamylation du collagène sur les fonctions des plaquettes sanguines dans l'hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet d'expérimentation animale permettra de déterminer quels sont les impacts de la carbamylation du collagène et/ou des plaquettes sur l'agrégation plaquettaire, l'hémostase et la thrombose artérielle grâce à l'utilisation de modèles animaux parfaitement maîtrisés par le laboratoire porteur du projet et ayant fait l'objet de validations antérieures par le comité d'éthique. En d'autres termes, les résultats de ce projet permettront de déterminer si la carbamylation du collagène, qui survient au cours du vieillissement physiologique et qui est amplifiée lors de l'IRC, constitue un facteur de risque d'évènements cardiovasculaires (thrombose, hémorragie) chez les patients insuffisants rénaux, dont le taux de mortalité dû aux maladies cardiovasculaires chez les personnes dialysées est de 10 à 30 fois plus élevé que dans la population générale. Il permettra également de déterminer si la carbamylation des plaquettes affecte leur capacité à agréger.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à un prélèvement sanguin au niveau de la veine cave inférieure. Pour la deuxième procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une mesure de temps de saignement mesuré au niveau de la queue. Pour la troisième procédure, les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une lésion thrombotique par application d'un patch de perchlorure de fer au niveau de l'artère carotide afin de suivre la formation du thrombus en temps réel par vidéo-microscopie intra-vitale. Au préalable, une injection de rhodamine 6G sera réalisée afin de rendre les plaquettes des animaux fluroescentes.
Impact sur les animaux
Pas de nuisances, effets indésirables, ou critère prévisible de douleur dans la mesure où les animaux seront sous anesthésie générale (100 mg/kg kétamine, 10 mg/kg xylazine) durant les manipulations, puis sacrifiés en fin de protocole (pas de réveil). Par ailleurs, le modèle basé sur l'ajout de cyanate de sodium (jusqu'à 15 mM) dans l'eau de boisson des souris a déjà été validé et utilisé précédemment dans d'autres projets de l'équipe. Les souris recevant ce traitement n'ont jamais montré quelconque signe de souffrance ou effet secondaire.
Devenir
Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales à la fin des expérimentations.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans la continuité d'une étude réalisée ex vivo à partir de plaquettes humaines ayant montré que la carbamylation du collagène augmente l'adhésion des plaquettes en condition statique alors qu'elle la diminue fortement en condition dynamique de cisaillement artériel en lien avec une diminution de la capacité du collagène carbamylé à lier le facteur von Willebrand plasmatique. Ce projet vise donc à valider les effets de la carbamylation dans les processus d'hémostase et/ou de thrombose in vivo chez la souris. La formation de thrombose artérielle est un phénomène complexe, multifactoriel, multicellulaire, qui nécessite l'utilisation de modèles intégrés. Par ailleurs, aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer l'effet d'une substance ou d'une alimentation (ici riche en cyanate de sodium) sur le prolongement du temps de saignement. Enfin, les récepteurs présents à la surface des plaquettes pouvant différer entre l'homme et la souris (exemple des récepteurs à la thrombine PAR1 et PAR4 exprimés chez l'homme et PAR3 et PAR4 exprimés chez la souris), il convient de débuter ce projet par des mesures d'agrégation plaquettaire avant de considérer les études de mesure du temps de saignement et de thrombose artérielle.
Réduction
L’étude considérée dans son intégralité est susceptible de concerner un nombre maximal de 195 souris C57BL/6 mâles, répartis en trois groupes : souris alimentées pendant 12 semaines avec 1 mM NaCl (groupe 1, contrôle), souris alimentées pendant 12 semaines avec 1 mM NaCNO (groupe 2), souris alimentées pendant 8 semaines avec 1 mM NaCNO puis pendant 4 semaines avec 1 mM NaCl (groupe 3). L'arrêt de l'alimentation en cyanate de sodium pendant 4 semaines permet la clairance totale du cyanate et des produits de carbamylation plasmatiques. Ainsi, seules les protéines tissulaires, et notamment vasculaires, restent carbamylées. Dans un premier temps, un nombre limité de 4 souris par condition expérimentale sera considéré pour une étude préliminaire qui permettra de juger de la nécessité de poursuivre l’expérimentation. Cette étude servira également à déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat statistiquement significatif avec un nombre maximal considéré de 10 à 15 souris par condition expérimentale. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sera réalisée grâce au logiciel G-power et l’analyse statistique de la significativité sera réalisée en utilisant le test U de Mann-Whitney dans sa configuration bidirectionnelle
Raffinement
Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages de 30 cm x 40 cm à raison de 5 souris par cage au maximum. En cas d'affrontement entre les animaux, le nombre de souris par cage sera réduit en conséquence. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 10 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de l'expérience (jusqu'à la mise à mort), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est la souris (Mus musculus). Il s'agit du modèle de référence pour l'étude du temps de saignement et de la thrombose artérielle et l'évaluation des propriétés anti-thrombotiques de composés. Par ailleurs, l'animalerie est agréée pour l’espèce souris. Des souris mâles seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond au stade adulte (avant 12 mois chez la souris).