Souris
prestations de services permettant l’obtention de modéles transgèniques murins, leur cryopréservations ainsi que leurs cryopréservations en recherche fondamentale et appliquée
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
6 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'activité relève d'une "prestation de services" de production de lignées transgéniques, de redérivation et de cryopréservation, avec injections d'hormones et microchirurgies sous anesthésie (vasectomie, transfert d'embryons). Le porteur indique que toutes les femelles donneuses sont tuées pour récupérer un maximum d'ovocytes et les mâles fertiles pour récupérer leur sperme, les mâles vasectomisés étant renouvelés deux fois par an. Il présente la congélation des lignées comme une application des 3R alors qu'elle sert d'abord à maintenir un stock de modèles pour les équipes clientes.
Objectifs
Le but de la redérivation sera de maintenir les lignées de souris sous un statut sanitaire acceptable. Dans notre établissement, beaucoup de souris (60% environ) sont immunodéprimées. Par conséquent, la présence de certains microorganismes mettrait en péril leurs bien être. La congélation des lignées des souris permet de répondre à la règle des 3R (réduction du nombre de souris) tout en protégeant ces lignées d’une dérive génétique, d’une contamination génétique ou d’une catastrophe naturelle. La modification du patrimoine génétique des souris permet de répondre à des problématiques diverses et variées (recherche fondamentale ou appliquée).
Bénéfices attendus
La redérivation de nos souris permet de garder des souris immunodéprimées au sein de notre service. La congélation de nos souris répond à la règle des 3R , c'est à dire réduire au maximum le nombre de souris. La transgénèse permet aux équipes de recherche d'obtenir des modèles de recherche.
Procédures
Certaines souris subiront 2 Injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, en sous cutané, réalisées en 5 secondes. Chaque chirurgie serat réalisée une fois, sous anesthésie générale. La souris reste sous anesthésie durant 40 minutes. La chirurgie dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de nos procédures, nous réalisons des microchirurgies sous anesthésie générale. Les effets indésirables pourraient être des infections. Nous devons également conserver des mâles stériles individualisés. Ce type d'hébergement est une source de stress.
Devenir
Toutes les femelles donneuses d'ovocytes sont mises à mort afin de récupérer un maximum d'ovocytes. Les mâles fertiles sont mis à mort afin de récupérer un maximum de sperme lors de la congélation de sperme.
Remplacement
Notre structure propose la redérivation, la congélation et la modification du patrimoine génétique de la souris. Chaque chercheur justifie l'utilisation de la souris comme modèle de recherche.
Réduction
Nous utilisant des hormones non néfastes (PMSG, hyperOva et hCG) pour la souris, permettant d'obtenir un nombre maximal d'ovocytes et d'embryons, et par conséquent de réduire le nombre de femelles utilisées. La congélation des lignées murines est une méthode permettant de réduire au maximum le nombre de souris et limiter au maximum le maintient d’animaux respirant aux phénotypes dommageables non utiles immédiatement à une recherche expérimentale. Le maximum de mâles vasectomisés sera de 280 animaux (28*2*5). Nous avons en permanence 28 males vasectomisés qui nous permet de détecter 10 femelles en œstrus (chiffre empirique), c'est à dire les mères porteuses. A l'âge de 4 mois, ils sont mis en accouplement avec les futures mères porteuses. On les garde jusqu'à l'âge de 9 mois car, passé cette date, ils sont peu actifs et le nombre de femelle pluggée chute dramatiquement. Par conséquent, on les renouvelle, 2 fois par an. Un maximum de 2100 mères porteuses seront utilisées au cours des 5 ans à venir. Pour les redérivations, on prévoit 30 projets par an, incluant un lot de 4 mères porteuses soit 30 * 4 *5 souris. Pour les projets "transgénèse", on prévoit 15 projets par an, nécessitant un maximum de 5 expérimentations incluant à chaque fois un lot de 4 mères porteuses soit : 15*5*4*5 mères porteuses soit (30*4*5) +(15*5*4*5) = 2100 mères porteuses.
Raffinement
Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale. Les yeux des animaux sont protégés du dessèchement par du collyre "OcryGel". Au cours de la chirurgie, réalisée sous loupe binoculaire, les animaux sont placés sur une table chauffante thermostatée à 28°C. Tous les animaux sont ensuite accueillis dans une cage, elle-même chauffée par un tapis. Le tapis chauffant est retiré après le réveil de tous les animaux. De plus, des analgésiques adaptées (métacam ou doliprane) sont introduit dans l'eau de boisson durant 3 jours après l'intervention. Les mâles individualisés reçoivent un enrichissement supplémentaire, un igloo en carton.
Choix des espèces
Notre structure met à disposition une prestation de redérivation des souris afin de maintenir un statut sanitaire à l'élevage des souris immunodéprimées. La congélation des souris transgéniques permettra de garder ces modèle sous la forme congelée et non respirante. La création de modèles murins transgéniques permettra d'obtenir des modèle pertinents pour des études en recherche fondamentale, ainsi qu'en recherche clinique. Les mâles subiront une vasectomie seront âgés entre 8 et 10 semaines. On les gardera au maximum 10 mois. Les femelles donneuses d'ovocytes seront âgées entre 4 et 6 semaines. On utilise des femelles prés pubères afin d'induit facilement un cycle hormonal en injectant les hormones appropriées. Les souris mises en accouplement auront au minimum 5 semaines. Les mères porteuses seront matures, âgées entre 2 et 9 mois.
Formations universitaire et réglementaire pour la réalisation de procédures expérimentales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 420
1 540 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent contention, gavage, injections répétées par plusieurs voies et des prélèvements sous anesthésie (carotidien, intracardiaque, rétro-orbitaire, vésical), non pour produire des connaissances mais pour former des techniciens de laboratoire. Le porteur mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels et signale que des surcharges anesthésiques provoquent des arrêts cardio-respiratoires tuant un ou plusieurs animaux par session. Il présente les vidéos et modèles inertes comme une préparation, mais affirme qu'il reste "indispensable" que les étudiants pratiquent sur animaux vivants.
Objectifs
Depuis 2010, l’Europe fait reposer la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sur quatre points : l’agrément des établissements, le contrôle de leur origine, l’autorisation des projets et la formation des personnels. Notre formation universitaire a pour objectif de former des techniciens de laboratoire dans divers domaines de la biologie incluant le métier de technicien en expérimentation animale. Notre nouvelle offre de formation est basée sur une spécialisation dès le premier semestre, une approche par compétences et des mises en situation professionnelles. La formation des étudiants au métier de technicien de laboratoire en expérimentation animale a été particulièrement accentuée avec notamment l’intégration en tout début de la première année, de la formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures expérimentales chez les rongeurs. Notre formation universitaire dispense donc les cours théoriques réglementaires, des cours spécifiques sur les rongeurs et des visites d’animalerie. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux sont destinés à l’acquisition de deux compétences : l’observation et la quantification du comportement des souris et l’acquisition de différents gestes techniques de base chez le rat et la souris (contention, prélèvements, injections). Avant de commencer les travaux pratiques, l’utilisation de vidéos et de modèles animaux inertes est proposée aux étudiants afin de les mettre dans les meilleures conditions avant l’utilisation de l’animal. Cependant, pour une formation efficace, les étudiants doivent ensuite être confrontés à l’animal. La formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures est également dispensée au personnel extérieur à notre établissement. L’objectif est de former les étudiants à la réglementation et l’éthique en expérimentation animale, au bien-être animal et à l’acquisition des compétences techniques de bases afin de pouvoir les appliquer dans le monde professionnel dans les meilleures conditions possibles en veillant au respect des animaux.
Bénéfices attendus
La formation théorique et technique du personnel est l’un des piliers de la réglementation concernant l’expérimentation animale. Notre établissement forme des techniciens de laboratoires pouvant exercer dans le domaine de l’expérimentation animale. La formation réglementaire destinée aux personnes appliquant les procédures que notre établissement propose depuis presque 20 ans est maintenant intégrée au programme en tout début de cycle de notre nouvelle offre de formation. Cela permet aux étudiants d’être sensibilisés à la réglementation et à l’éthique (et d’obtenir l’attestation de formation) avant toute manipulation sur les animaux. Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale. Cela garantit des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. La formation est donc axée sur deux points essentiels : - l’observation du comportement des animaux pour déceler tout comportement anormal le plus rapidement possible. - l’acquisition de gestes techniques de base : l’approche de l’animal, la préhension, la contention et les techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes Ces séances sur l’animal sont dispensées par des enseignants expérimentés, fortement impliqués dans la pédagogie et particulièrement attentifs au bien-être des animaux.
Procédures
Sur animaux vigiles : préhension, contention, gavage et techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes : injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, à la veine de la queue, dans la veine mandibulaire. Quantification du comportement par différents tests comportementaux. Sur animaux anesthésiés : pose de cathéters, prélèvements carotidien, intracardiaque, au sinus rétro-orbitaire, dans la vessie.
Impact sur les animaux
Les séances d’observation n’induisent aucune nuisance chez l’animal. Les séances avec contention et gestes techniques avant anesthésie impliquent un stress chez l’animal. Ce stress est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur environnement une semaine avant les séances de travaux pratiques, l’apprentissage théorique de la réglementation et de l’éthique ainsi que l’utilisation de vidéos et de modèles inertes au préalable afin de préparer au mieux les étudiants aux manipulations. L’effet indésirable le plus fréquent est l’accident de surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire, particulièrement chez les souris. En premier lieu une réanimation est effectuée par un enseignant, il arrive cependant qu’un ou plusieurs animaux meurent lors de la session. Les procédures de cette saisine sont effectuées au moins depuis 2011. L’expérience des enseignants sur les différents anesthésiques, le suivi de l’anesthésie, la gestion de la douleur, les stratégies de réanimation et les erreurs des étudiants permettent de limiter fortement les accidents.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons qu’il est indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette nouvelle offre de formation sera fortement diminué par rapport au projet d’enseignement précédent. En effet, suite à l’utilisation de vidéos et au recentrage des procédures strictement nécessaires, nous passons de 9 à 6 procédures par rapport à l’ancienne saisine. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux ne concernent désormais que la moitié de la promotion (56 étudiants) contrairement à l’ancienne saisine pour laquelle certaines procédures concernaient l’ensemble de nos étudiants (112). Dans le projet d’enseignement précédent, il y avait 712 souris et 272 rats par an soit 3560 souris et 1360 rats sur 5 ans. Dans ce nouveau projet, nous proposons 224 souris et 84 rats par an soit 1120 souris et 420 rats sur 5 ans. Cela correspond à une réduction de 69 % du nombre de souris et de rats. Par ailleurs, certains lots de souris font l’objet de plusieurs séances de travaux pratiques (les souris de la procédure 1 auront en amont été utilisées pour une séance d’approche de l’animal et une séance de comportement général et seront utilisées en aval pour une séance de dissection). Enfin, il est à noter que certains organes seront prélevés après mise à mort des animaux pour être utilisés dans les travaux pratiques de biologie cellulaire, biochimie et biologie moléculaire.
Raffinement
Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cela garantira des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal. Par ailleurs, un certain nombre de gestes sont réalisés sur animal anesthésié. Une antalgie est également proposée lorsque cela est nécessaire. Enfin, les animaux sont acclimatés une semaine dans l’animalerie avant toute utilisation. Ils sont hébergés, en groupe, en présence de tubes en carton, de buchettes en peuplier pour les rats et de papier kraft pour les souris pour enrichir l’environnement. Une surveillance quotidienne est assurée par l’ensemble du personnel concerné : technicienne, enseignants et enseignants-chercheurs.
Choix des espèces
Le rat sprague Dawley et la souris Swiss sont des animaux très utilisés en recherche. Par ailleurs, ces souches sont intéressantes pour leur faible agressivité permettant un apprentissage plus serein. Les animaux sont des mâles avec un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats. Les animaux ont un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats, pour une meilleure gestion de l’anesthésie.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des vésicules extracellulaires portant la molécule CD146 sous anesthésie gazeuse, subissent une mesure du temps de saignement à la queue, avant mise à mort pour prélever la moelle osseuse. Le porteur indique attendre un stress physique ou thermique et une douleur légère, et présente l'étude comme la vérification des effets indésirables d'une thérapie déjà jugée efficace contre l'athérosclérose. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors cible d'une thérapie sur l'organisme.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables d'une thérapie constituée de vésicules portant une molécule d'adhésion ; le CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice d'une nouvelle thérapie dans l'atherosclérose. : l'apport de CD146 sur les macrophages de la plaque d'athérosclérose par des vésicules extracellulaires. Nos études en cours montrent un effet significatif des ces vésicules dans la régréssion de la maladie athéromateuse. Les vésicules extracellulaires étant décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose. Ainsi, nous allons étudier l'effet de ces vésicules sur le phénotype inflammatoire des macrophages qui sont leurs cellules cibles privilégiées. Nous étudierons également le temps de saignement des modèles expérimentaux soumis à cette thérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athéroslérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration d'un médicament anti-inflammatoire tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Moduler l’expression des gènes dans le tissu adipeux des souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.
Procédures
La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.
Remplacement
Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.
Etude de l’efficacité d’un composé anti-obésité en développement chez la souris rendue obèse par une alimentation riche en graisse en thermoneutralité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime à 60 % de graisses puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour un composé par voie orale et subissent pesées, mises à jeun, prélèvements sanguins et test de tolérance au glucose, avant ponction cardiaque sous anesthésie et dislocation cervicale. Le porteur mène cette étude pour un laboratoire pharmaceutique client afin de confirmer qu'un composé réduit le poids et la prise alimentaire. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'un de ces composés induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant démarrage du traitement. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de proposer une solution thérapeutique pour les personnes atteintes d'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - une mise à jeûn de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 et D57 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une analyse de leur composition corporelle à D29 - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D57 [Mise à jeun pendant 16h, Prélèvements sanguins (2 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min aprés administration du glucose]. De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 16h), une analyse de la composition corporelle et une mise à jeun de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète de ce composé.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés avant la dislocation cervicale. Les animaux de la procédure 1 seront euthanasiés par surdose d’anesthésique puis par dislocation cervicale. L'autre partie des animaux seront anesthésiés, puis, une fois la ponction cardiaque réalisée, une dislocation cervicale sera réalisée avant tout prélèvement post mortem. Dans cette deuxième procédure, la ponction cardiaque n'est pas une méthode de mise à mort règlementaire. Toutefois, l'étude nécessite un volume important de sang pour des analyses ultérieures. Après la ponction cardiaque réalisée sous anesthésie, une deuxième méthode de mise à mort de l'animal (celle-ci règlementaire) par dislocation cervicale sera réalisée avant les prélèvements d'organes post mortem pour des analyses ultérieures. Enfin, en cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude du rôle du métabolisme et du transport du lactate dans le micro-environnement tumoral du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 3 120 individus étant classés en sévère. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques pour implanter virus et cellules de glioblastome, une résection tumorale, des cycles d'injections de témozolomide et de tamoxifène, ainsi que deux irradiations et des prélèvements sanguins réguliers. Le porteur indique que la tumeur cérébrale, la chirurgie et les traitements peuvent provoquer douleurs, perte de poids, désorientation et déséquilibre, la mise à mort intervenant à l'atteinte d'un point limite. Il reconnaît disposer de co-cultures et d'organoïdes mais les juge "simplistes" et affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour le microenvironnement tumoral.
Objectifs
Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus commune et agressive chez l’adulte. Les patients atteints de GB subissent généralement une résection chirurgicale pour éliminer autant que possible la tumeur cérébrale. Après la chirurgie, dans le but d’éliminer les cellules cancéreuses restantes, une radiothérapie et une chimiothérapie sont administrées aux patients. Malheureusement, ce traitement standard actuel n'empêche pas la tumeur de récidiver. Même après élimination de la majorité de la masse tumorale, quelques cellules restantes se multiplient et se régénèrent dans une autre partie du cerveau où la chirurgie n'est plus possible. Le métabolisme cellulaire, qui permet de fournir de l’énergie aux cellules, a un impact significatif dans la progression du cancer, ainsi que dans la résistance thérapeutique des tumeurs. Cibler le métabolisme représente donc une stratégie pour éliminer les cellules cancéreuses. Notre objectif est de comprendre les échanges métaboliques entre les cellules du GB et les cellules du micro-environnement. En utilisant des modèles animaux dont certains types cellulaires (neurones, cellules immunitaires) sont dépourvus de gènes impliqués dans le métabolisme, nous étudierons l’impact du métabolisme des cellules du micro-environnement dans la croissance et l’invasion tumorale. Nous appliquerons également le protocole standard utilisé pour les patients atteints de GB (résection, rayonnements ionisants et chimiothérapie) pour évaluer le bénéfice de combiner le traitement actuel avec l’inhibition du métabolisme dans le micro-environnement tumoral.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra i) de mieux comprendre le rôle du métabolisme dans le micro-environnement tumoral et son impact sur la progression tumorale et l’invasion ; ii) de caractériser les échanges métaboliques entre les cellules du glioblastome et leur micro-environnement ; iii) d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, notre étude pourra offrir la possibilité de mettre en place, couplée au traitement actuel standard utilisé pour traiter le glioblastome, de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant le métabolisme des cellules tumorales, mais également celui des cellules du micro-environnement, afin de freiner la progression tumorale et l’invasion des tumeurs de glioblastome dans des zones où la chirurgie n’est plus possible, et par conséquent d’améliorer la survie des patients.
Procédures
- Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des virus. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des cellules de glioblastome. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à une résection tumorale. Cette chirurgie dure 30 minutes et sera réalisé une fois. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Témozolomide chaque jour pendant 5 jours, après 2 jours de repos un nouveau cycle de 5 jours de traitement sera réalisé. Les cycles de traitement seront répétés sur une durée de 28 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Tamoxifène chaque jour pendant 5 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des rayonnements ionisants 2 fois à 4 jours d'intervalle. Cela dure 5 minutes par souris. - Les souris seront soumises à des prises de sang chaque 15 jours. Cela dure 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'irradiation et le Témozolomide peuvent induire des symptômes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Une perte de poids peut être observé après irradiations. Une perte de la pigmentation peut également être observé après l’irradiation, les poils des souris C57BL/6 peuvent devenir gris après l’irradiation. Une irritation au point d’injection peut être observé après le traitement de TMZ par IP. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des stéréotaxies (injection des cellules de glioblastome, résection tumorale et injection des virus). Le développement de tumeurs cérébrales, l’injection du virus ainsi que la résection peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre).
Devenir
Suite à la génération des mignées de souris KO, les animaux seront utilisés pour l'implantation de cellules de glioblastome pour analyser leur survie et la tumorigenèse. Tous les animaux seront mis à mort dès l'atteinte d'un point limite.
Remplacement
Nous avons isolé des cellules de glioblastome de type souche à partir de tumeurs de différents patients. Nous avons obtenu des données robustes en utilisant ces modèles in vitro pour supporter l’hypothèse que le lactate a un rôle clé dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Nous souhaitons maintenant connaître son rôle dans le micro environnement. Nous avons établi des cultures de neurones corticaux de souris et nous les avons mises en co-culture avec des cellules de glioblastome isolées de patients, pour étudier le rôle des neurones dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Ce modèle de co-culture nous a permis de voir que les neurones favorisaient la prolifération cellulaire et l’invasion des cellules de glioblastome. Cependant, ce modèle est très simpliste et ne reflète pas la complexité du cerveau et de son micro environnement. Bien que des modèles d’organoïdes soient développés, ces modèles ne sont également pas parfaits. En effet, les composants immunitaires dans les cultures organoïdes qui ne peuvent être maintenus que pendant une courte période. Le manque de cellules endothéliales et de système vasculaire tumoral est également un problème majeur qui limite l'utilité des organoïdes des tumeurs cérébrales, car le système microvasculaire est un composant majeur de l'environnement tumoral, ce qui peut affecter la croissance des cellules tumorales et l'effet immunitaire antitumoral. Il est donc nécessaire que nous passions maintenant à un modèle in vivo, pour étudier le rôle du lactate dans le micro environnement tumoral du glioblastome.
Réduction
Une manip pilote avec un petit groupe d'animaux est tout d'abord réalisé pour définir les meilleures conditions d’implantation (coordonnées stéréotaxiques) pour l’injection des virus. Nous avons mis en place des stratégies pour réduire le nombre de souris en utilisant le même groupe de souris pour obtenir plusieurs résultats. Par exemple, l'imagerie bioluminescente est une méthode non invasive qui nous permet suivre la progression de la tumeur dans le temps tandis que les mêmes souris peuvent être maintenues pour générer les courbes de survie ou bien pour les analyses immunohistochimiques. Le même groupe de souris sera utilisé pour évaluer la survie et pour les prélèvements sanguins pour analyser les métabolites présents dans le sang.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d’un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre d’explorer, de jouer et de ronger. Ces cages offrent aux animaux un espace important pour se redresser. Les chirugies (implantation des cellules, virus et résection) se déroulent sur animaux anesthésiés. Les animaux sont placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Des analgésiques sont donnés avant la chirurgie. L'incision de la peau de la tête se fait suite à une anesthésie locale. Les animaux ont du gel ophtalmique avant la chirurgie afin de réduire la sécheresse oculaire. Une injection de saline est réalisée pour éviter une déshydratation de l’animal. En cas de perte de poids par rapport au poids initial, du nursing sera mis place. Postopération (résection), un analgésique est administré 2 fois par jours pendant les 72h suivant l’opération. Du geldiet est déposé dans le fond de la cage pour prévenir de la perte de poids. Pour le suivi de la croissance tumorale, les souris seront anesthésiées pour mesurer la bioluminescence. Du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Les souris sont réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Lors de la session d’IR, du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Une injection de saline est réalisée en sous-cutané pour éviter une déshydratation de l’animal. Du geldiet est mis dans le fond de la cage pour palier au possible perte de poids suite aux IR. Une irritation au point d’injection peut être observé après les injections IP (TMZ, Tamoxifène) répétées. Les souris sont massées au niveau du point d’injection. Suite à la prise de sang, une injection de saline est réalisée. Les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter l’apparition d’éventuels effets secondaires. Des points limites sont définis.
Choix des espèces
Des souris immuno compétentes recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine murine. Ce modèle nous permet d’étudier le rôle du micro-environnement dans le développement tumoral. Des souris immunodéprimées recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine humaine. Ces souris permettent d'implanter des cellules humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. Le laboratoire a une grande expérience d'implantation de cellules de glioblastome dans ces modèles et nous avons l'habitude du développement du glioblastome dans ces souris. Les tumeurs se développent de manière très reproductible dans ces modèles, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences. De plus, ces modèles sont idéaux d'un point de vue préclinique, car nous reproduisons grâce aux cellules de type souche des caractéristiques complexes observées chez les patients humains. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour les injections de cellules tumorales pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les KO seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons donc des souris de 5 à 7 semaines pour l'injection de tamoxifène. Les KO Mct2 dans les neurones seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons des souris de 5 à 7 semaines pour l'implantation des virus. Le délai de 2 semaines entre ces 2 procédures (injection de tamoxifène ou de virus) et l'implantation des cellules de glioblastome, a été choisi pour permettre de laisser le temps au KO de se faire dans les cellules, et aux souris de récupérer de ces procédures avant la chirurgie.
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au modéré, 128 individus étant menés sans réveil. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 intestinal, elles reçoivent par gavage des agonistes et de l'huile après une mise à jeun de douze heures, avant prélèvement sanguin sous anesthésie et mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur cherche à établir le rôle du CD36 intestinal dans l'obésité et présente ce récepteur comme une éventuelle cible thérapeutique. Il affirme le remplacement "impossible" au motif que l'étude met en jeu plusieurs organes.
Objectifs
L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour tester une contraception sans hormone, des femelles reçoivent dans le vagin un ovule chargé de lyral, une molécule odorante censée perturber l'orientation des spermatozoïdes, avant d'être mises à l'accouplement. 640 souris Swiss CD1, choisies parce que leurs portées dépassent souvent dix souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une même femelle pouvant recevoir l'ovule jusqu'à trois fois, tenue dans la paume une trentaine de secondes. Le lyral étant allergisant, les souris sont observées chaque jour pendant deux à trois semaines, et celles qui feraient une réaction allergique seraient retirées de l'expérience et mises à mort par dislocation cervicale ou au CO2. Après chaque accouplement, les adultes retournent dans le pool pour d'autres accouplements et les souriceaux nés sont mis à mort immédiatement, sans que le résumé dise ce que deviennent les adultes à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Par ailleurs il a été montré que le bourgeonal, l’un des ligands de hOR 17-4, OR exprimé à la surface des spermatozoïdes humains modifiait in vitro le chimiotactisme de ceux-ci. En parallèle, il a été montré que le récepteur olfactif MOR23 était présent à la surface des spermatozoïdes de souris et que le lyral modifiait lui aussi in vitro le leur chimiotactisme Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide à 0.04% (40 microlitres, 10-5 M) dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris SWISS CD1, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif (test de Fischer), nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement alors que la souris sera maintenue dans la paume de l'expérimentateur pendant un temps n'excédant pas 30 secondes pour limiter le stress. Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience et euthanasiées par dislocation cervicale ou par inhalation de CO2 à l'aide d'une chambre d'euthanasie. Par ailleurs, rappelons que les ovules fournis par NextPharma sont de qualité pharmaceutique, fabriqués avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris seront utilisées dès qu'elles sont en âge de se reproduire. Les mâles sont sexuellement matures dès l'âge de 8 semaines et les femelles dès l'âge de 6 semaines.
Diabète gestationnel et épigénétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras obésogène, toutes subissant des tests métaboliques hebdomadaires avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins répétés à la queue, un bolus d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur cherche à établir que le diabète gestationnel modifie par voie épigénétique l'expression des gènes hypothalamiques de la descendance, prédisposant à l'obésité. Il affirme que ces mécanismes multi-organes ne peuvent être reproduits qu'avec la souris, jugée "indispensable" faute d'échantillons humains.
Objectifs
Notre corps est optimisé pour stocker tout apport énergétique qui dépasse les besoins de l'organisme. En effet, l’évolution a permis aux humains de traverser des périodes de famine. Cependant, ce mode de fonctionnement n’est pas compatible avec notre style de vie sédentaire d'aujourd'hui. Il en résulte l'émergence de la pandémie d'obésité et de diabète, qui survient de plus en plus fréquemment dès l'enfance et l'adolescence. Bien que des études de génétique humaine à grande échelle aient été menées avec succès, l'héritabilité de traits aussi complexes reste difficile à déterminer. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent que la suralimentation dans des conditions telles que le diabète gestationnel (DG), peut entrainer un métabolisme altéré à travers les générations. Ces mécanismes impliquent des changements héréditaires dans l'expression des gènes qui se produisent plutôt par le biais d'une régulation épigénétique altérée. Les études chez l’animal suggèrent que le stress nutritionnel affecte le développement de l'hypothalamus et prédispose la descendance à l'obésité. En effet, l'hypothalamus orchestre un ensemble complexe de processus pour réguler l'apport et la dépense énergétiques. Par conséquent, l'hyperphagie et la réduction de la satiété représentent des caractéristiques précoces chez les enfants sujets à l'obésité. Cependant, une analyse complète du profil épigénétique de l'hypothalamus dans le contexte du DG fait largement défaut jusqu'à présent. Ainsi, nous cherchons à mettre en évidence que le DG a un impact sur l'expression des gènes hypothalamiques par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène tout au long de la vie.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Nous supposons que le DG a un impact sur l'expression des gènes de l'hypothalamus par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène qui dure toute la vie. Les données récentes du laboratoire avec lequel nous collaborons pour ce projet suggèrent l'existence d'un nouveau code épigénétique qui pourrait jouer un rôle majeur dans la différenciation cellulaire et le développement de maladies. Ainsi, nous sommes convaincus que ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de la suralimentation sur la prédisposition au diabète.
Procédures
168 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Par ailleurs, tous les animaux (336) seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le test de tolérance au glucose nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Parrallèlement, 4x 40μL de sang sont prélevés (durée 1min) à l'aide d'un capillaire pour mesurer l'insulinémie par le même site de prélèvement. Le test de sensibilité à l'insuline nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le traitement hormonal nécessite 2 injection IP ( durée 10 sec)
Impact sur les animaux
Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène, le traitement hormonal pour favoriser la reproduction et le test de tolérance au glucose peuvent créer un inconfort chez les souris. La sensibilité à l'insuline nécessite l'injection d'un bolus d'insuline qui peut entrainer une hypoglycémie chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur tissus seront prélevés pour determiner le profil épigénétique.
Remplacement
La nature transitoire du diabète gestationnel (la maladie n'existe que pendant la grossesse), la rareté des échantillons de tissus humain post mortem, la cause du décès... etc rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. De plus, la disponibilité des échantillons humains est limitée au sang, au cordon ombilical. Pour ces raisons, les modèles animaux constituent une alternative indispensable pour étudier ces mécanismes.
Réduction
Nous utiliserons un total de 336 animaux. Le nombre d’animaux testé dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.
Raffinement
Les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Le recours aux analgésiques et anesthésiques sera systématique pour éviter toute souffrance ou douleur chez l'animal.
Choix des espèces
L'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, pancréas (ilots de Langerhans) , muscles, tissus adipeux, intestin, cerveau) . Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Le modèle murin ne peut donc pas être remplacé dans notre cas. De plus, la nature transitoire du DG et la rareté des échantillons de tissus en dehors du sang et du cordon ombilical rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. Les animaux seront soumis à une diète riche en gras dès l'âge de 5 semaines, âge idéal pour permettre une prise de poids suffisante.
Traitements ciblant EZH2 dans l’initiation et le développement de la leucémie aiguë promyélocytaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 170 individus étant classés en sévère. Elles reçoivent une irradiation sublétale aux rayons X, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis des traitements par acide rétinoïque et épidrogues, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que la leucémie et les traitements peuvent entraîner perte de poids et dégradation de l'état, et fixe un point limite à 20 % de cellules leucémiques circulantes. Il reconnaît avoir déjà montré in vitro l'effet de l'association testée, mais affirme que le microenvironnement médullaire rend le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
Une proportion rare de leucémies aiguës promyélocytaires (APL) présente un réarrangement chromosomique entraînant la juxtaposition des gènes RARA (récepteur de l’acide rétinoïque alpha) et PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein), avec production d’une oncoprotéine hybride à l’origine du développement de la maladie. Dans ce cas particulier de fusion PLZF-RARA, le traitement conventionnel par l’acide rétinoïque (ATRA, qui permet une rémission dans les autres types d’APL) se heurte à une résistance des cellules leucémiques et une rechute chez les patients. Nos travaux précédents ont mis en évidence dans une lignée de leucémie myéloïde aiguë une nouvelle interaction au mécanisme original entre PLZF et EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), un facteur responsable de la réduction d'activité de nombreux gènes. Or, l'implication d'EZH2 dans le développement d'hémopathies malignes a été mise en évidence dans de nombreuses études et EZH2 est une cible thérapeutique pour laquelle des inhibiteurs sont actuellement en développement. Nous souhaiterions donc nous intéresser au rôle de cette interaction entre PLZF et EZH2 dans l'initiation et le développement de l'APL exprimant la fusion PLZF-RARA. Nous avons obtenu des résultats préliminaires in vitro encourageants, montrant que l'inhibition d'EZH2 était associée à une moindre capacité de prolifération dans une lignée cellulaire exprimant PLZF-RARA. Nous souhaitons donc tester maintenant l’effet d'inhibiteurs d'EZH2 (épidrogues) sur le développement tumoral d'APL PLZF-RARA traitées à l'acide rétinoïque (ATRA, traitement conventionnel des APL), afin de déterminer si l'association d'une épidrogue au traitement conventionnel permet de contourner la résistance et de réduire la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu'il révèle de nouvelles pistes pour déterminer si l'association de différentes épidrogues au traitement classique par l'acide rétinoïque permet de contourner les résistances et de réduire la progression tumorale des APL.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation sub-léthale réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 2 minutes. La greffe de cellules leucémiques qui s'ensuit par injection intraveineuse est réalisée sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles l'injection des cellules, effectuée en quelques secondes, est réalisée. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par des injections intrapéritonéales nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation sub-léthale et une greffe de cellules leucémiques par injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par injections intrapéritonéales. Le développement de la maladie et les traitements étant susceptibles d’entraîner une perte de poids et une dégradation de leur état, les animaux seront soumis à une observation quotidienne et à des évaluations à l'aide de la grille de score, permettant de prévenir les effets délétères et gérer la douleur. Nous serons vigilants sur l’altération du bon fonctionnement des cellules sanguines de l'animal qui pourrait survenir du fait du développement de la leucémie, et notamment une possible baisse de l’hématocrite. C'est pourquoi nous réaliserons un suivi précoce et prédictif grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire de notre laboratoire, en quantifiant la proportion de cellules leucémiques dans le sang. Cette mesure nous permet, grâce à notre expérience de ce modèle, de fixer un point limite de 20% de cellules leucémiques circulantes afin de rester en-deçà de l'apparition d'une formule sanguine anormale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de prélever les moelles qui seront regreffées et utilisées pour réaliser les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus de régulation de l’hématopoïèse pathologique, l'hématopoîèse étant définie comme le processus de production de toutes les cellules sanguines dans la moelle osseuse. Cette régulation implique des mécanismes intrinsèques aux cellules, mais aussi une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux de la moelle osseuse (facteurs extrinsèques). Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et leur microenvironnement. Il est donc nécessaire de replacer la cellule dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, nous avons pu récemment utiliser des modèles in vitro pour montrer les effets bénéfiques de l’association d'une épidrogue avec l’acide rétinoïque sur les cellules leucémiques. Nous souhaitons donc tester l'hypothèse d'un bénéfice de cette association in vivo, aux doses recommandées dans la littérature.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules hématopoïétiques par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous nous baserons sur les résultats obtenus in vitro afin d'optimiser les combinaisons de drogues à tester et nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre projet nécessitera 200 souris NSG, permettant d'évaluer l'action potentiellement bénéfique d'une association d'épidrogues au traitement conventionnel par l'ATRA. Le nombre d’animaux a été optimisé grâce à notre expérience du modèle : nous avons ajusté le nombre d'animaux au minimum requis pour l'obtention du nombre de cellules suffisantes pour réaliser les analyses moléculaires, et permettant également d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment la détermination de la quantité de cellules leucémiques dans le sang par des mesures en cytométrie d'un rapporteur permettant de distinguer l'origine des cellules (celllules leucémiques PLZF-RARA ou cellules sanguines des souris NSG). Les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, notamment pathologique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, agées de 7 à 10 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures, et qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe des cellules leucémiques.
Exploration de stratégies thérapeutiques pour restaurer la fonction synaptique et les comportements cognitifs dans un modèle de souris du syndrome de l’X fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un traitement pharmacologique quotidien par gavage ou injection intrapéritonéale, et pour certaines une chirurgie d'implantation cérébrale suivie de cinq semaines en cage individuelle. Le porteur indique que les injections, la contention, les tests comportementaux, la chirurgie et l'isolement social provoquent douleurs et stress, et mentionne deux tests d'évaluation des déficits cognitifs sans préciser lesquels. Il affirme qu'aucune alternative in silico ou en culture cellulaire ne convient et que l'animal doit rester "intact" pour étudier la mémoire.
Objectifs
Le syndrome de l'X fragile (SXF) est la forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire (Prévalence 1:4000 chez les hommes et 1:7000 chez les femmes) et cette maladie reste malheureusement sans traitement efficace à ce jour. La majorité des patients atteints présentent une déficience intellectuelle associée à des troubles de l'apprentissage, de l'attention, et dans un quart des cas à des troubles du spectre autistique. Ce syndrome résulte de mutations du gène FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) qui entraine soit l’absence d’expression de la protéine correspondante, FMRP, ou bien l’expression d’une forme non fonctionnelle de celle-ci. La modification de cette protéine chez la souris conduit à des effets similaires à ceux observés dans les cerveaux de patients atteints de SXF. Deux mécanismes ont déjà été montrés comme dérégulés chez ces souris génétiquement modifiés et comme étant à l’origine des anomalies de communication entre neurones observées chez ces animaux. Ces mécanismes représentent donc des cibles très intéressantes pouvant être utilisées à des fins thérapeutiques. Les travaux que nous souhaitons mener sur ce model vise à cibler ces mécanismes dans la perspective de développer des solutions thérapeutiques innovantes pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées et des agents pharmacologiques actifs sur les mécanismes d’intérêt. Nous évaluerons leurs efficacités pour restaurer la communication neuronale par des taches comportementales et des mesures d’activité neuronale in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer l'efficacité de traitements pharmacologiques afin de corriger les défauts physiologiques et les comportements identifiés sur le modèle murin de syndrome de l’X Fragile. La validation d’un ou plusieurs de ces traitements permettra de proposer des pistes de traitements pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile (SXF) .
Procédures
Dans ce projet, les 540 animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par voie orale pour une durée variable en fonction de la molécule, soit par injection dans le péritoine pour une durée de 8 jours maximum - 140 de ces animaux recevront juste un traitement pharmaceutique -260 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront deux tests comportementaux afin d’évaluer les défauts cognitifs. Ces 2 tests nécessitent que les animaux soient isolés respectivement 15 et 8 jours afin de limiter les interactions stressantes pouvant influencer sur les performances de mémoire. -140 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront une chirurgie implantatoire afin d’enregistrer l’activité neuronale lors d’un test comportemental de mémoire. Les animaux seront hébergés en cage individuel pour une durée de 5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. L’ensemble des animaux seront sacrifiés en présence d’analgésique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont : Des douleurs avec les piqûres en injection dans le péritoine Du stress physique lié à des contentions et aux tests de comportement Des douleurs, et stress liés aux lésions des chirurgies, Du stress lié au restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux est sacrifié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'electrophysiologie in vitro ou des études histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonction cérébrale complexe étant à la base du codage de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques et de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitifs et sensoriels sont traités exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre d’animaux, il sera réalisé différents tests comportementaux successifs et de gravité croissante sur les mêmes cohortes. Pour les expériences comportements, nous utiliserons 20 souris / traitement. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux. Pour les enregistrements d’activité neuronale in vitro et in vivo au cours du comportement, le nombre de 10 souris / traitement nous permettra d’enregistrer un nombre de neurones conséquent afin de pouvoir collecter un ensemble important de données.
Raffinement
Pour les expériences in vitro, les souris seront maintenues en groupes sociaux tout le long de la procédure. Pour les expériences in vivo, les animaux seront placés en cage individuelle pour des périodes de 8 à 10 jours lors de chaque tache comportementale. Les animaux subissant une chirurgie implantatoire seront placés en cage individuelles pour une période de 4 à 5 semaines. Lorsque l’animal est placé en cage individuelle, la cage est enrichie avec un tunnel et une maison en papier mâché pour favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues aux congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin », qui renseigne les soins prodigués et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. La chirurgie implantatoire est réalisée sous anesthésie gazeuse avec un contrôle de la respiration et de l’absence de reflex tout le long du protocole. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutané en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, nous réalisons une injection d'une double dose d'analgésique, et d'un euthanasiant. L'absence de reflexe est vérifié afin de contrôler la profondeur de l'anesthésie.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. L’homologue murin du gène FMR1 humain a été manipulé pour générer des modèles animaux présentant des phénotypes similaires à ceux observés chez les patients X-fragiles notamment au niveau de la morphologie neuronale et de l’apprentissage, ce qui en font des modèles de choix pour l’étude de la pathologie. Les données de la littérature démontrent clairement que les mutations du gène FMR1 sont responsables du syndrome de l’X fragile chez l’homme et que ces mêmes mutations chez la souris ont des effets moléculaires, morpho-fonctionnels et comportementaux similaires à ceux observés chez les patients X fragiles. Nos modèles souris X fragiles sont donc d’excellents modèles précliniques pour évaluer le potentiel thérapeutique de traitements pharmacologiques ciblant les défauts relevés chez nos souris. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines et jusqu’à 4 mois d’âge.
Etude de l’engramme d’une mémoire de type post-traumatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 480 individus étant classés en sévère. Elles subissent un conditionnement par deux chocs électriques aux pattes censé induire une mémoire de type post-traumatique, complété par des injections intrapéritonéales, avant analyse du cerveau. Le porteur décrit un modèle comportemental de mémoire traumatique développé par l'équipe, sans détailler les autres tests employés au-delà de ce conditionnement. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation et qu'une espèce "suffisamment proche" de l'humain est requise pour extrapoler les résultats.
Objectifs
Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des trait cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un stress intense, est une altération de la mémoire associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. Cette mémoire est définie comme maladaptative, en opposition à une mémoire émotionnelle normale qui est considérée comme adaptative. Le but de ce projet est de définir en quoi ces deux types de mémoire diffèrent. Pour ce faire, nous étudierons le réseau cérébral recruté dans ces deux types de mémoires à la fois lors de l’encodage de l’événement et lors de son rappel.
Bénéfices attendus
En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.
Procédures
Les animaux sont soumis à des procédures comportementales entainant un stress chez l'animal permettant de mimer une mémoire de type post-traumatique ainsi qu'à des injections intra-péritonéales.
Impact sur les animaux
Une telle investigation implique l’utilisation d’un modèle permettant de distinguer et de comparer après un épisode de stress le développement d’une forme de mémoire émotionnelle normale et d’une mémoire de type traumatique. Le modèle de mémoire traumatique développé au sein de l’équipe permet précisément une telle comparaison. Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés l'application de deux chocs élèctriques légers au niveau des pattes. Cette nuisance entraine une classe de sévérité sévère.
Devenir
Toutes les souris des procédures 1 et 2 seront mises à mort après les procédures comportementales afin d'analyser l'activité du cerveau.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif de 528 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit, en cage collective, sauf dans la semaine qui précède l'étude comportementale où elles seront placées en cage individuelle . Dans toutes les cages l'environnement sera enrichi ( bio-tunel et carrés de cellulose) . Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié . Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h.
Choix des espèces
La souris adulte (8 à 12 semaines): -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte : pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet d'accéder au niveau cellulaire grace à des procédures histologiques simples et d'immunohistochimie