Souris

3 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un cancer colorectal par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux imageries par semaine pendant neuf semaines sous anesthésie, jusqu'à cinq traitements hebdomadaires pendant six semaines et des prélèvements sanguins en sous-mandibulaire sur animal vigile. Le porteur indique que les tumeurs sous-cutanées, coliques et péritonéales peuvent provoquer des difficultés de locomotion, des diarrhées et des occlusions intestinales. Il affirme que l'étude des tumeurs et métastases ne peut pas être modélisée in vitro et qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent.

Objectifs

Le cancer colorectal représente un défi majeur de santé publique en raison de sa gravité et de l’augmentation croissante des cas nouvellement diagnostiqués en France et à travers le monde. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certains patients ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer colorectal à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer colorectal : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale), injection par endoscopie (5-10min sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse Prélevement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL( en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g .

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau du colon et des viscères. Une difficulté de locomotion peut éventuellement s'installer lorsque la tumeur sous cutanée évolue et des diarrhées ou occlusions intestinales peuvent apparaître lors de l’évolution des tumeurs du colon ou des métastases péritonéales. La définition de points limites, le suivi quotidien, les pesées ainsi que la grille de scoring nous permettront d’anticiper toute douleur ou souffrance qui seraient induites. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés tests.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en oeuvre de l'imagerie (bioluminescence et échographie) permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en oeuvre sont non invasives et les actes réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d’un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l'utilisation d'antalgiques (paracétamol) la veille et 24h post opératoire et par l’administration d'anti inflammatoire (tolfédine) le jour et 24h post opératoire. Des grilles de scoring avec les points limites prédictifs seront mis en place et le personnel examinera les animaux quotidiennement afin d'anticiper la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par ponction intracardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant seize jours au maximum, des composés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, pour déterminer la dose maximale tolérée d'inhibiteurs de kinases. Le porteur annonce comme seul effet indésirable attendu une perte de poids, et prévoit la mise à mort de tout animal atteignant un point limite. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" parce que les tests in vitro ne prédisent pas la toxicité d'un organisme vivant.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine : maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à cribler des molécules organiques de masse moléculaire très faible (fragments) qui n’ont la plupart du temps qu’une faible affinité pour la cible compte tenu de leur taille. Le criblage va se faire contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Il va s’agir ensuite de combiner différents fragments identifiés et/ou de les faire évoluer en se basant sur la structure tridimensionnelle de la protéine cible considérée pour obtenir un candidat médicament de forte affinité et spécificité pour la cible étudiée. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture et la pharmacocinétique in vivo des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations sur la toxicité du composé test. Après avoir selectionné les molécules in vitro à travers des cribles biologiques pertinents, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée in vivo. En effet, le développement de tout nouveau composé thérapeutique nécessite l'évaluation du rapport bénéfice/risque entre les doses thérapeutiques efficaces, et les effets secondaires et les niveaux de toxicité potentiels, suceptibles de diminuer ou annuler les effets curatifs de nouvelles molécules. L'importance d'évaluer les propriétés toxiques des molécules candidates ne peut donc pas être sous évaluée. L'objectif du projet est de déterminer la gamme optimale de doses de la molécule ne générant pas d'effets indésirables chez la souris, ainsi que ses paramètres posologiques (dose et fréquence d’administration).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier la plage de dose utilisable d'une nouvelle molécule thérapeutique ciblée, c’est à dire ne générant aucun effet indésirable chez la souris. Ceci permettra d’optimiser sa posologie pour l’évaluation de son activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines, mais également d'ajuster la dose initiale utilisée lors des essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dûs au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer des composés test quotidiennement ou biquotidiennement pendant 16 jours maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée. Les animaux seront pesés quotidiennement.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule est une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Si ces tests sont nécessaires et permettent d'identifier les meilleures molécules candidates, ils ne permettent malheureusement pas de prédire la toxicité in vivo. Ces approches expérimentales ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au raffinement et à l'anticipation des points limites au cours du projet. Le suivi quotidien individuel des animaux par le biais de leur observation et pesées quotidiennes permettra de minimiser au mieux les nuisances induites par l’étude. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. En cas d'approche de ces critères des croquettes mouillées seront mises à disposition des animaux pour éviter d'atteindre les points limites.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant ces études de détermination de la dose maximale tolérée serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (notamment pour les études d’efficacité). Il est donc prévu d’utiliser la même souche pour ce projet et pour les études d’évaluation de l’efficacité afin d’éviter l’apparition d’une toxicité innatendue liée à la différence de souche lors de l’étude d’efficacité. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

2 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales par voies sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique, un marquage aux oreilles sous anesthésie, puis jusqu'à trente prélèvements sanguins et vaginaux étalés sur douze mois, pour tester vingt-cinq combinaisons d'ARN messager et d'immunostimulants contre le VIH. Le porteur indique que les prélèvements répétés peuvent provoquer des lésions irréversibles, oculaires ou de fibrose tissulaire, et que la mise à mort sert à prélever ganglions et rate. Il présente ce travail comme une étape "préliminaire" avant des modèles "plus pertinents" comme le lapin et le primate non humain, et affirme qu'un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet reste "nécessaire".

Objectifs

Malgré des années d'études et un large panel de thérapies contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), les scientifiques peinent à contrôler la propagation et l’échappement du virus. De nouvelles stratégies d’immunothérapies actives et passives voient le jour, comme avec l’utilisation d’anticorps ou la vaccination. La crise sanitaire liée au COVID-19 a mis en avant les vaccins à base d’acide ribonucléique messager (ARNm) et a largement démontré son efficacité comparée aux vaccins conventionnels. Sa facilité de production et d’optimisation permet à cette technologie de s’appliquer à diverses pathologies dont le VIH. Notre laboratoire souhaite combiner des ARNm spécifiques avec des médicaments (immunostimulant) capables de renforcer la réponse immunitaire. 5 ARNm et 5 médicaments ont déjà été validés ces dernières années au laboratoire dans des modèles n'utilisant pas d'animaux. Cependant, l'efficacité réelle de ces médicaments / combinaisons ne peut être observé que chez un organisme entier, possédant un système immunitaire complet et mature. Nous souhaitons donc tester nos différentes combinaisons (25 combinaisons au total) dans des modèles souris afin d'évaluer la valeur ajoutée de nos combinaisons sur le développement d'une forte réponse immunitaire et surtout au long terme. Afin d'obtenir des résultats concluants, nous passerons par plusieurs étapes pour évaluer : l'efficacité et la sécurité de nos médicaments et combinaisons, la dose optimale à injecter, la meilleure voie d'administration et le maintien de la réponse à cours, moyen et long terme.

Bénéfices attendus

Le développement d'une nouvelle prophylaxie par combinaison d'un vaccin ARNm avec un médicament immunostimulant permettrait d'améliorer la réponse spécifique dirigée contre le VIH capable : - D'être maintenue au long terme - D'activer les centres germinatifs (essentiels pour l'induction d'une réponse à large spectre et neutralisante) - D'induire une réponse au niveau des muqueuses (essentielles dans la réduction des risques de transmission du VIH).

Procédures

Lors de cette étude, nous injecterons des combinaisons de médicaments par différentes voies d'administration (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Chaque type d'administration dure moins de 30 secondes à 1 minute . Ces médicaments seront injectés à minima 1 fois, et au maximum 3 fois afin d'évaluer la réponse immunitaire à court (3 mois), moyen (6 mois) et long terme (12 mois). Afin d'identifier nos animaux, nous effectuerons des marquages aux oreilles sous anesthésie gazeuse qui est un acte qui dure quelques secondes au début de chaque étape. Nous effectuerons également de multiples prélèvements sanguins et vaginaux. Ces prélèvements seront fait toutes les 2 semaines (3-6 prélèvements à minima pour les études à court terme, jusqu'à 30 prélèvements étalés sur 12 mois pour les études à long terme). Cette acte dure 1 minute maximum par souris.

Impact sur les animaux

Un inconfort léger est attendu lors du marquage au oreille pour une durée de quelques minutes. Un inconfort léger est attendu lors de l'administration des vaccins (pour les 2 voies : intramusculaire, sous-cutanée) pour une durée de quelques minutes. L'administration par voie intradermique est un geste plus douloureux, induisant un inconfort modéré. Un suivi post-injection sera réalisé pour mettre en évidence une fièvre chez l'animal. Les prélèvements peuvent entrainer un inconfort modéré, notamment à cause de la contention qui peut entrainer un stress et les prélèvements répétés pouvant induire des lésions irréversibles (lésions oculaires, fibrose tissulaire, ...). Pour pallier à cet inconfort, nous effectuerons tous nos prélèvements sous anesthésie gazeuse et nous alternerons les sites de prélèvement afin de minimiser le risque de lésion irréversible.

Devenir

A la fin de chaque procédure, nos animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse. Cette mise à mort est nécessaire afin de récupérer des organes clés impliqués dans le développement et le maintien d'une bonne réponse immunitaire (comme l'analyse des cellules retrouvées dans le ganglion lymphatique, la rate, ...). Ces analyses sont primordiales dans la compréhension des voies induites par nos candidats vaccins. Les résultats obtenus nous permettront d'adapter notre stratégie thérapeutique/prophylactique afin d'optimiser nos vaccins eux-mêmes ou encore d'optimiser les schémas d'injection.

Remplacement

Les études vaccinales nécessitent d’effectuer des analyses préliminaires sur le modèle murin avant de passer sur des modèles plus pertinents tels que le lapin et le primate non humain. Des études préliminaires d’efficacité et de toxicité ont été effectuées sur des modèles in vitro pertinent. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité d’une réponse immunitaire humorale et cellulaire, impliquant généralement une multitude de cellules et d’organes. Dans ce sens, un modèle vivant, dynamique et doté d’un système immunitaire complet favorisera la compréhension des mécanismes sous-jacent liés à l’efficacité vaccinale dirigée contre le virus de l’immunodéficience humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué pour chaque étape représente un essai pour lequel toutes les combinaisons se révèleraient efficaces. Le nombre d’animaux maximum à utiliser dépendra donc du nombre de candidats vaccins ayant été validé lors de la première étape. En fonction de ces succès, nous adapterons nos expériences afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux à utiliser, notamment par les groupes contrôles négatifs, identiques pour chaque candidats vaccins. Le nombre d’animaux choisi par groupe permet de lisser la variabilité entre individu existant dans les études immunologiques et nécessitant a minima 7 souris pour les groupes essais. Nous évaluerons et déterminerons les groupes d'intérêt afin de minimiser au maximum le nombre de souris utilisé au cours de toutes les étapes.

Raffinement

Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement (en collectivité), des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton, dôme de cellulose et/ou tube rouge transparent). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance en cas d’altération du comportement et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. Dans le cas où nous observons une fièvre ou une douleur, nous mettrons en place un traitement par analgésique ou anti-pyrétique et surveillerons l'animal sur les 48h.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant un système immunitaire complet et reflétant au mieux les réponses que nous pouvons retrouver chez d'autres animaux dont l'homme. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin, notamment dirigé contre le VIH qui nécessite une réponse variée afin de contrôler le virus. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature. Des souris plus âgées pourraient biaiser nos analyses due au dysfonctionnement causé par la vieillesse des souris.

33 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une craniotomie puis une injection stéréotaxique dans le thalamus, avant deux semaines de surveillance, pour valider la diffusion d'un virus thérapeutique. Le porteur prévoit une couverture analgésique et une mise à mort en cas de perte de 20 % du poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative expérimentale à ce modèle murin.

Objectifs

Le but du projet est de définir la propagation d'un virus à visée thérapeutique ainsi que son intégration dans les cellules cibles du système nerveux central. Pour cela, nous allons procéder à trois étapes. La première consistera à valider les coordonnées d'injection d'un colorant dans une zone du cerveau de Souris, le Thalamus. Cela nous permettra de nous assurer de la validité et de la reproductibilité du geste technique. Une fois cette étape validée, nous procéderons à l'injection du virus de type adénovirus. Celui-ci s'incorporera dans les cellules du tissu cible et déclenchera l'expression d'une protéine fluorescente que nous pourrons ensuite analyser par histologie. Nous ciblons dans cette étude le thalamus qui n'a jusqu'à présent jamais été ciblé dans notre institut, mais nous maitrisons cette voie d'injection pour d'autres structures. Par ailleurs, ce virus a déjà fait l'objet d'injections dans d'autres structures mais son intégration n'était pas satisfaisante étant donné les populations de cellules atteintes qui ne correspondaient pas au type cellulaire efficace pour permettre l'expression du code génétique véhiculé par ce virus. Finalement, si ces étapes sont validées, nous utiliserons le virus candidat médicament dans une dernière étude afin de valider l'expression du matériel génétique apporté par le virus.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de poursuivre le développement d'un virus candidat médicament dont le but est de traiter les pathologies d'origine génétique du système nerveux central, dans les populations neuronales. Nous prévoyons en effet ensuite d'appliquer le vecteur thérapeutique sur des lignées de souris porteuses d'une mutation génétique, modèles d'une pathologie humaine (Syndrome de l'X fragile). Ce projet consiste donc à une des étapes indispensables du développement d'un candidat médicament.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés durant environ 60 minutes avec une mélange injecté par voie intra-péritonéale. Pour éviter toute douleur durant l'injection cérébrale, un injection sous-cutané d'antalgique sera aussi pratiquée (le geste dure quelques secondes et la couverture antalgique plusieurs heures).

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront une injection stéréotaxique. Celle-ci se réalise sous anesthésie par voie intra-péritonéale et dure environ 1 heure. Durant ce geste, une craniotomie est réalisée suivie d'une injection dans le cerveau. Trente minutes avant l'injection du virus, les animaux recevront une injection de buprénorphine (10 secondes). La zone est ensuite nettoyée et suturée. Les animaux seront ensuite surveillés durant deux semaines puis mis à mort.

Devenir

Tous les animaux doivent être analysés au niveau histologique, ce qui nécessite leur mise à mort.

Remplacement

ce projet s'inscrit dans la mise en place d'un candidat médicament chez l'Homme dont le modèle d'étude principal est une lignée de souris génétiquement modifiées. Il n'existe actuellement pas d'alternative expérimentale.

Réduction

Les effectifs dans les groupes expérimentaux sont réduits mais suffisants pour les analyses histologique ou génétiques planifiées. Il n'est pas possible de les réduire sans impacter la robustesse de l'analyse finale.

Raffinement

Les injections seront effectuées sous anesthésie (Kétamine/Xylazine) avec une couverture antalgique (Buprénorphine)), les animaux maintenus à température à l'aide d'un matelas chauffant et une surveillance étroite post-injection du site d'injection et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance. Un suivi de poids sera mis en place pour les protocoles étalés sur 2 semaines afin de mettre en évidence une baisse de l'état général des animaux le cas échéant. En cas d'une baisse de 20% du poids initial sur une semaine, les animaux seraient euthanasiés immédiatement pour éviter toute souffrance.Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance aux animaux.

Choix des espèces

La souris constitue le meilleur modèle d'étude car il existe une lignée Fmr1 KO qui est un bon modèle d'étude de la pathologie ciblée (syndrome de l'X fragile) Les animaux seront agés de 5-6 semaines, correspondant au stade cible pour l'étude de la pathologie dans le projet utilisant les animaux génétiquement modifiés.

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.

Âgés de deux jours, des souriceaux sont anesthésiés par refroidissement sur la glace, reçoivent dans le cerveau une injection de vecteur viral ou de solution saline, puis retrouvent leur mère au réveil. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau. Le porteur attend des pertes lors des injections et des rejets de portée par les mères, et injecte des souriceaux dont le génotype reste inconnu à ce stade, pour tester une thérapie génique sur une lignée porteuse d'une mutation à l'origine d'une forme familiale sévère de SLA. Le comportement moteur doit révéler l'effet du traitement, avec un minimum de 18 souris pour "le test comportemental", sans que le résumé précise lequel.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

4 200 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et environ 200 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un candidat médicament par différentes voies, parfois sous chirurgie, puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des ponctions de liquide céphalorachidien, pour mesurer la pharmacocinétique de molécules en développement. Le porteur indique que les effets indésirables des produits ne sont pas prévisibles au départ et seront gérés au cas par cas. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico n'existent pas ou ne suffisent pas, sans autre justification.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif principal d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule (pharmacocinétique). Pour cela, au cours de chaque étude, des prélèvements sanguins répétés et/ou un prélèvement de liquide céphalorachidien (LCR) sont réalisés chez l’animal vigile ou transitoirement anesthésié après l’administration par différentes voies du candidat-médicament comparé ou non à une autre molécule. Ces prélèvements sont utilisés pour mesurer dans le temps la concentration du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents autres marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 30 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés et/ou de LCR (Liquide Céphalo Rachidien). Concernant les prélèvements, les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Dans ce projet, les administrations nécessitant une chirurgie est composée d'un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d'un suivi post-opératoire adapté, ce qui permet de limiter au maximum l'impact négatif sur l'animal. Après récupération, les animaux seront maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Les animaux seront généralement mis à mort à la suite de l’étude pour la réalisation de prélèvements terminaux (sang, tissus). En l’absence de prélèvements terminaux, certains animaux pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés et après l’avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique qui sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : - le recours à des procédures les moins invasives possibles - le suivi d’éventuel signes cliniques - la recherche des points limites - le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire - la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse .

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’étude de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir du produit testé lorsque ces rongeurs sont utilisés au cours du développement préclinique de ce produit. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.