Souris
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèle pharmacologique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.
Impact sur les animaux
Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.
Développement d’un vecteur AAV de thérapie génique plus efficace dans le cadre du traitement de l’hémophilie B.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, génétiquement modifiée pour être hémophile, saigne spontanément, et toutes reçoivent une injection de vecteur viral puis jusqu'à douze prélèvements de sang par sectionnement du bout de la queue. Le projet cherche à mettre au point des vecteurs AAV plus efficaces contre l'hémophilie B et d'autres maladies du foie. Le porteur affirme qu'après un tri sur cultures de cellules il faut mesurer l'efficacité sur un "organisme entier" capable de réagir au traitement.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie génétique due à un déficit du facteur de coagulation IX (FIX). L’incidence est de 1 à 2 cas pour 25 000 naissances. Elle est causée par des mutations du gène F9, qui se trouve sur le chromosome X. La fabrication de la protéine appelée facteur IX de la coagulation va être endommagée. Chez une personne saine, cette protéine est produite dans le foie et va être relachée dans la circulation sanguine. Elle joue un rôle essentiel dans le système de la coagulation: elle permet de former des caillots sanguins en réponse à une blessure. Quand le gène F9 est muté, la quantité de facteur de coagulation IX est réduite dans la circulation sanguine, ce qui empêche la coagulation normale du sang et provoque des épisodes de saignements excessifs. Actuellement, le traitement principal est un traitement de substitution qui consiste à administrer par voie intraveineuse des concentrés de FIX purifiés ou du FIX recombinant. Cependant ces traitements ont plusieurs inconvénients tels que les infusions répétées par intraveineuse. Le but de ce projet est de développer des outils plus performants lors de traitement par thérapie génique AAV de maladies hépatiques, telles que l'hémophilie B. Pour cela, on veut développer des capsides AAV (« boite de transport du médicament ») et des promoteurs (permet l’expression du médicament dans un tissus particulier) spécifiques du foie ce qui nous permettra d'augmenter la stabilité du gène médicament au cours du temps et ainsi éviter les problèmes de réaction immunitaire. Pour se faire, nous avons réalisé des modifications de capsides AAV, pour augmenter la spécificité du vecteur pour les cellules du foie. Parallèlement, nous allons tester différents promoteurs pour définir ceux qui permettent une efficacité supérieure à notre contrôle. Grâce à cela, nous réaliserons des combinaisons pour essayer de rendre synergiques les effets. Le but final étant de trouver un candidat thérapeutique qui permet une expression à long terme de notre gène médicament dans un contexte de maladie hépatique, comme l'Hémophilie B, mais adaptable à d'autres maladies hépatiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet et de développer de nouveaux outils de traitement des maladies hépatiques. Ces outils permettront au traitement d’être plus efficace, plus stable, moins et moins couteux. Ces outils développés seront directement applicables pour améliorer le traitement de l’hémophilie, déjà existant.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection de vecteurs AAV en début de protocole, puis à différents prélèvements de sang hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) ou mensuels (M1 à M12).
Impact sur les animaux
Nuisances souris WT : 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois, clip tail. Nuisances souris KO : Souris au phénotype dommageable (saignement), 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois pour l'étude à court terme ou 12 prélèvements sanguins (de M1 à M12) pour l'étude à long terme, clip tail. Pour les deux phénotypes : Stress au moment de l'injection ou des prélèvements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le foie pour les analyses.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l'utilisation du modèle animal, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste de candidats (vecteurs viraux AAV) grâce à l'utilisation de culture cellulaire de foie humain. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (par exemple, à cause de la réponse immunitaire) et également mesurer son efficacité de traitement sur une maladie hépatique.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 612 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (486 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
Les souris hémophiles présentent une activité de coagulation réduite conduisant à des hémorragies spontanées dans les tissus du coussinet plantaire et des hémorragies sous-cutanées. Ce modèle de souris hémophile est très proche de la maladie humaine. Les souris malades sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes, car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris adultes seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
Détermination de la dose maximum tolérée de composés pharmacologiques, candidats-médicaments, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des candidats-médicaments de 1 à 35 jours consécutifs, jusqu'à deux fois par jour, pour déterminer la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité. Le porteur décrit des effets possibles comme des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aiguës et une perte de poids, qui servent justement à repérer le seuil de tolérance. Il conclut à l'absence de modèle alternatif assez intégré et qualifie le recours au modèle animal d'"incontournable".
Objectifs
Le progrès de ces dernières années, dans le domaine de compréhension des pathologies humaines, a ouvert la voie sur d’autres stratégies thérapeutiques, qui peut avoir un impact important dans l’amélioration de prise en charge des patients. Avant de tester l'efficacité des candidats médicaments dans les modèles animaux de pathologies humaines (exemple : maladies inflammatoires, maladie neurodégénératives, infections virale) nous souhaitons déterminer la dose maximum tolérée par la souris. Notre objectif est de déterminer la dose maximum toléré par la souris, sans aucun effet secondaire, pour l’animal, pour que par la suite, les études d’efficacité, puissent se faire de manière optimum.
Bénéfices attendus
Le bénéfice porte sur la santé humaine (la mise au point des traitements plus efficace). Et le déroulement suit le même « schéma » qu’une étude clinique chez l’homme. C’est-à-dire une phase 1 pour déterminer la dose maximum toléré par les individus avant de commencer une étude d’efficacité (phase 2).
Procédures
Dans ce projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : administration du candidat médicament (dure quelques secondes). L'administration intraveinuese se fera sous anesthésie (dure environ 30 à 40 min). Le composé pharmacologique testé pourra être administré de 1 à 35 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour selon le protocole et l’objectif de l’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris, sont principalement le stress causé lors de la préhension et les administrations répétées des composés pharmacologiques. Les candidats médicaments sont administrés aux animaux selon différentes voies d’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse peuvent entrainer une inflammation et induration au niveau de site d’injection. De même, nous ne pouvons exclure un risque de fausse route lors de l’administration des composés par voie orale. D’autre part, bien que tous les candidats médicaments auront été sélectionnées pour leur innocuité lors des analyses in-vitro, des effets indésirables peuvent survenir tel que des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aigues, une perte de poids… qui sauront être mise en évidence lors de ces études de tolérances.
Devenir
Tous les souris de ce projet seront mis à mort afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour les analyses ultérieurs.
Remplacement
Du fait de l’absence de modèles alternatifs suffisamment intégré et complexe pour permettre d’évaluer la biodisponibilité d’une molécule, qui met en jeu les mécanismes d’absorption, de distribution, de dégradation, de transport et d’élimination des composés susceptibles d’affecter l’activité des molécules, l’emploi de modèle animal est incontournable.
Réduction
Seuls les molécules présentant le meilleur rapport efficacité/innocuité in vitro seront étudiées chez la souris. De plus avant de démarrer le protocole avec les souris, nous faisons une série de vérification pour être sûr que le produit administré présente le profil pour être administré à l'animal. Si le produit ne répond pas à ces attentes il ne sera pas étudié. Nous faisons une étude avec 5 souris par groupe ce qui est suffisant pour évaluer la dose maximale tolérée par la souris pour les futures études d'efficacité des candidats médicaments. En effet nos études antérieures ont montré que 5 souris par groupe est suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux candidats-médicaments et ainsi nous permettre d’identifier la dose maximum tolérée chez la souris.
Raffinement
Durant l'étude, nous portons une attention particulière au bien-être de l'animal. Ils sont hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état générale des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de choix pour étudier la tolérance de composé pharmaceutique d'autant plus que des études d'efficacité vont être poursuivis sur des souris. En effet, efficacité de plusieurs médicaments aujourd'hui sur le marché ont été évalués grâce à ces modèles chez la souris. Les souris auront 5 semaines minimum. Les animaux doivent être adulte, afin d'avoir un système immunitaire, et métabolique fonctionnel.
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie au cou, l'induction d'un caillot dans l'artère carotide par électrolyse de la paroi du vaisseau, puis 40 minutes d'imagerie de fluorescence. Le porteur teste si un anticorps ciblant les plaquettes empêche la formation d'un thrombus occlusif, dans la perspective d'un futur essai clinique. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Un nouvel agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique. Nous avons récemment observé que cet agent entraine une désagrégation d’un thrombus plaquettaire non occlusif. Ce projet vise à déterminer si cet agent est également capable de prévenir la formation d’un thrombus occlusif dans l’artère carotide chez la souris. Cette étude pourrait suggérer qu'un tel agent soit particulièrement efficace pour traiter la thrombose artérielle occlusive et ainsi justifier l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme et pour de nouvelles indications thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement l'agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité anti-thrombotique lors d’un essai clinique en prévention d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral). Nous souhaitons poursuivre l’étude de l’effet de cet agent dans le cas cette fois ci de thrombus occlusif plus sévère pour proposer de nouvelles indications. •Dans un deuxième temps si les résultats sont encourageant, une étude clinique pourra être envisagée sur des patients souffrant d’un thrombus occlusif.
Procédures
L’ensemble de la procédure expérimentale est réalisée sous anesthésie générale plus anestésie locale de la peau au moment de l’incision et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : • Une anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale de la peau. • Une injection d’un mélange d’un anticorps anti-fibrine couplé à un fluorochrome d'un marqueur fluorecent des plaquettes • Tonte de la face ventrale du cou et nettoyage de la peau • Induction du thrombus par electrolyse à la paroi externe du vaisseau • Imagerie par macroscopie de fluorescence pendant 40 min
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du cou de la souris sera réalisée sous anesthésie générale et anesthésie locale au moment de l’incision de la peau. A l’issu de l’expérience, les animaux anesthésiés seront mis à mort.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Les groupes expérimentaux seront comparés en utilisant des tests statistiques pertinents permettant d’évaluer le potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humain chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Etude du rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs prostatiques.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène pour inactiver un gène, des gavages répétés de vitamine D, et une partie est castrée, avec amputation d'une phalange pour l'identification. Le projet étudie le rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs de la prostate et la résistance à la chimiothérapie, les retombées pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la formation des lésions précancéreuses et conclut que l'expérimentation in vivo est "nécessaire".
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent. Les traitements actuellement utilisé en clinique inhibent les voies de signalisation et/ou la production d'androgènes et sont couplés à la chimiothérapie (i.e. docetaxel). Ces traitements induisent des resistances, ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine de nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la la progression des tumeurs et dans la resistance aux traitements est donc requise afin de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. La forme active de la vitamine D ((calcitriol, VitD) est une hormone qui joue un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie calcique, et dont les effets sont relayés par son récepteur VDR. La vitD possède des activités anticancéreuses, et des données cliniques indiquent que des patients avec des tumeurs prostatiques et déficients en vitamine D ont une espérance de vie inférieure à ceux ayant des niveaux de vitamine D suffisants. De plus, nos récents résultats indiquent que la vitamine D permet de lever les résistances au Docetaxel, la chimiothérapie classiquement utilisé en clinique. Ces résultats indiquent que les voies de signalisation de la vitamine D jouent un rôle clé dans l'évolution de la pathologie et la résistance aux traitements, mais les mécanismes restent mal connus. En tirant profit du modèle murin récapitulant la pathologie humaine, les objectifs de ce projet sont: de générer et caractériser des souris ayant une inactivation de VDR dans les cellules épithéliales prostatiques et de déterminer l'effet de la vitamine D sur l'efficacité de chimiothérapies de type alcaloide.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des voies de signalisation de la vitamine D dans cette évolution ainsi que de déterminer son rôle dans la résistance aux traitements actuels.
Procédures
Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène (15 sec par administration) réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) afin d'inactiver le gène. Certains animaux seront gavés (15 administrations, 15 sec par administration) et d'autres recevront une administration intra-péritonéale supplémentaire (15 sec par administration) . Parmis ces lots, certaines souris seront castrées (5-10 min par souris) ou subiront la même anesthésie et incision, mais sans enlever les organes (5-10 min par souris) . Les souris qui seront utilisées pour les analyses de cytométries en flux seront traitées avec un marqueur permettant de déterminer la prolifération des cellules (2 injections intrapéritonéales , 15 sec par administration). Une prise de sang juste avant la mise à mort sera réalisée (15 sec par souris).
Impact sur les animaux
Les injections par voie intra-péritonéale pour inactiver les gènes ou administrer du docetaxel, et les administrations par gavage seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries et n'induiront aucune nuissance. L'orchidectomie est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorées mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 4960 souris maximum.
Raffinement
L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Pour l'identification, le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte et ne compromettra pas la préhension fine del’animal. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Après injection par voie intra-péritonéale en alternée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestes (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. En pré-opératoire, une analgésie en injection intrapéritonéale est faite avant l’anesthésie des souris. En post-opératoire, une analgésie est réalisée. Nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. Lors des gavages succesifs avec la vitamine D, de la nourriture en gel sera proposée pour éviter une diminution de l'alimentation suite à l'irritation de l'oeosophage.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Enfin, les activités de la vitamine D chez la souris sont similaires à celles chez l'homme. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront un fond génétique enrichi C57BL/6. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 17 mois après la naissance, la prostate n'étant mature qu'après puberté. Les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.
Rôle de la chimiokine CCL5 dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique chez la souris: implications physiopathologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 opérées puis tuées sans réveil. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras de trois mois, elles reçoivent une canule implantée dans le cerveau et une mini-pompe sous-cutanée pendant trois mois, puis subissent 96 prélèvements de sang chacune au fil de tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate. Le porteur étudie le rôle d'une molécule pro-inflammatoire, la CCL5, dans la dérégulation de la glycémie par l'hypothalamus, en vue de cibles médicamenteuses renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que seul un modèle in vivo chez "l'animal entier" permet de comprendre ce phénomène et conclut à l'utilisation de la souris.
Objectifs
L’obésité associé au diabète de type 2 (DT2) représente un problème majeur de santé publique dans la mesure où 11% de la population mondiale est obèse et 300 millions de personnes sont affectés par un DT2 selon l’« International Diabetes Federation ». 80% des personnes développant un DT2 sont obèses soulignant ainsi un lien étroit entre les 2 pathologies et, de fait, l’insulino-résistance est une caractéristique commune de l’obésité et du DT2. Ce lien étroit entre l’obésité et le DT2 nous incite à identifier les mécanismes fondamentaux couplant le contrôle de la balance énergétique et la régulation de la glycémie. De récentes études scientifiques suggèrent que l'inflammation favorise le développement de l'obésité et de l'hyperglycémie chronique caractérisant le diabète de type 2. Notre projet a pour objectif d'étudier les effets d'une substance pro-inflammatoire (CCL5) sur le développement de l'obésité et du DT2 au niveau d'une région bien précise du cerveau, l'hypothalamus qui contrôle le métabolisme énergétique et glucidique.
Bénéfices attendus
Si le contrôle de la glycémie par le cerveau reste un domaine de recherche encore peu exploré et mal compris, il ouvre de larges perspectives thérapeutiques. En effet, le système gluco-régulateur de l’hypothalamus pourrait intervenir à hauteur de 50% dans le maintien de l’homéostasie glucidique. Il semble donc probable que des dysfonctionnements de la régulation centrale de la glycémie participent au développement du diabète. L'identification de nouvelles molécules pouvant induire un dysfonctionnement du contrôle de la glycémie par le cerveau devrait permettre d’ouvrir de nouvelles voies pour le développement de médicaments anti-diabétiques et d’améliorer le traitement de cette pathologie.
Procédures
Cette étude sera réalisée sur des souris soumises à un régime standard et à un régime riche en lipide de 3 mois qui les rend obèses et diabétiques. Une puce électronique de traçabilité sera injectée dans l’espace sous-cutané interscapulaire après anesthésie. Les animaux seront hébergés à température (22°C) et humidité constantes et exposés à un cycle de 12h-12h lumière/obscurité. Les souris auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Dans le cas de la procédure 2, les animaux subiront la pause d'une canule en intracérébroventriculaire ainsi que d'une mini-pompe osmotique en sous-cutané (cette opération prend environ 30 mins) qui seront implantés pour une durée de 3 mois. Les souris seront ensuite laissées au repos pendant 2 semaines avant qu'elles soient soumises à la batterie de tests physiologiques. Chaque souris de chaque lot sera soumise successivement à l'ensemble des tests physiologiques afin de réduire le nombre d’animaux impliqués dans le projet. Au cours de chaque test, des prélévements da sang seront effectués à partir de la queue des animaux. Pour l'ensemble des tests (glycémie de base, test de tolérance au glucose, test de tolérance à l'insuline, test de tolérance au pyruvate et test de sécrétion d'insulie), chaque souris subira 96 prélèvements de sang. Chaque test comprendra 22 prélèvements (sauf pour le test de sécrétion d'insuline qui ne comprendra que 6 prélèvements) et la souris aura une période de récupération d'une semaine entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par la chimiokine CCL5 ou par l'antagoniste du récepteur CCR5 n'entraine que très peu d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures menées par d'autres équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. De même, les injections ip de glucose, insuline, pyruvate sont utiliées en routine par de nombreuses équipes de recherche et par nous-même, et aucun effet indésirable n'est constaté pour ces substances aux doses administrées. Enfin, les actes chirurgicaux décrits dans cette DAP sont eux aussi réalisés en routine au sein de notre équipe et aucun effet indésirable sur le comportement et la santé de l'animal n'a été constaté sur la longueur du protocole expérimental.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront euthanasiées à l'issue du protocole expérimental. De même, les animaux prévus pour des prélévements d'organes seront euthanasiées.
Remplacement
Au cours de ce projet, les effets de la molécule pro-inflammatoire CCL5 seront tout d'abord évalués in vitro sur une lignée de cellules neuronales hypothalamiques, la lignée mHypoA-59, ce qui nous permettra d'excure certaines hypothèses de travail et ainsi réduire sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés pour les tests physiologiques qui ne peuventêtre réalisés que chez l'animal entier.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, l'ensemble des 5 tests physiologique prévus pour évaluer l'homéostasie glucidique sera réalisé successivement sur une même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d'une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précedent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur (pose des puces de traçabilité, incision, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront en pré-opératoire et à 6-8 h puis 12-16 h post-opératoire un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Pour ce projet, des souris mâles âgées de 10 semaines en début d'expérimentation seront utilisées car c'est la physiologie adulte qui sera étudiée. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de la chimiokine CCL5 dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec les données obtenues chez l’homme. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes.
Fibrose pulmonaire : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée ou par irradiation sous anesthésie, puis des composés à tester sont administrés par de multiples voies. Le porteur annonce une perte de poids de 15 à 20 % et des difficultés respiratoires, et prévoit une trachéotomie sous anesthésie profonde juste avant la mise à mort pour mesurer la mécanique pulmonaire. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire l'efficacité, ce qui justifierait le recours au rongeur.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de fibrose pulmonaire. La fibrose est la conséquence de l’activation chronique des fibroblastes et myofibroblastes qui se mettent à produire en permanence du tissu cicatriciel (dépôts de collagène, élastine, fibronectine). Dans les poumons, l’apparition de ce tissu cicatriciel s'accompagne ou est précédée d’une phase inflammatoire. La fibrose pulmonaire cause une perte d’élasticité du poumon et une insuffisance respiratoire chronique. Il n'existe pas de médicament éliminant la fibrose pulmonaire, les traitements disponibles ralentissent uniquement la progression de la maladie. La bléomycine (agent anti-cancéreux utilisé chez l’homme) est connue pour se concentrer dans les poumons, avec comme effet secondaire délétère le développement chez le patient d’une fibrose pulmonaire. Chez le rongeur, instillée par voie intratrachéale sous anesthésie générale ou par voie sous-cutanée via une mini-pompe la bléomycine induit une fibrose pulmonaire semblable à celle observée chez l’homme. Celle-ci atteint son maximum entre 3 et 4 semaines, puis se résout spontanément 6 à 8 semaines après exposition. La fibrose pulmonaire peut aussi être induite consécutivement à une radiothérapie anti-cancéreuse du poumon. C’est un effet secondaire sévère connu chez le patient car les rayons entraînent une destruction des tissus cancéreux mais aussi des tissus sains, avec une très forte inflammation et une cicatrisation anarchique. Le développement de la fibrose pulmonaire induit par la radiation est plus lent à se mettre en place, et dépend de la dose et de la fréquence des rayons. Ce projet reproduira chez le rongeur la pathologie pulmonaire fibrotique telle qu’elle est observée chez l’homme, et permettra l’évaluation de composés anti-fibrotiques. L’efficacité des composés testés sera déterminée par la mesure de marqueurs circulants et pulmonaires (TGFβ, dépôts de collagène, hydroxyproline…) ou encore par l’évaluation de l’évolution de la pathologie par imagerie. Les composés chimiques ou biologiques qui seront évalués dans ce projet auront au préalable été sélectionnés sur des critères de puissance et d’efficacité in vitro. En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique par exemple par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose pulmonaire. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
La fibrose pulmonaire sera induite sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit par administration intra trachéale unique ou sous cutanée (à l’aide d’une minipompe osmotique pendant 28 jours) de Bléomycine soit par exposition à des radiations (unique). Ces deux procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). La phase in vivo pourra durer jusqu’à 35 jours pour la fibrose induite par la bléomycine et jusqu’à 15 semaines pour les radiations. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. Des mesures de saturation en oxygène, sur animal anesthésié ou vigile, pourront être effectuées au cours des procédures. Les mesures vigiles impliquent que les animaux soient placés en hébergement individuel environ 1 heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, lavages broncho-alvéolaires. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous attendons une perte de poids chez les animaux, de l’ordre de 15 à 20%, du fait de l’inflammation générée. Par ailleurs, nous attendons des signes de difficultés respiratoires.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Chez la souris, dans le modèle Bléomycine, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (dosage hydroxyproline). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse histologique et dosage TGFb actif ou total). Par ailleurs, étant donné que certains animaux ne répondent pas à la procédure d’induction, 5 animaux supplémentaires par groupe seront systématiquement intégrés. La même stratégie sera appliquée lors de la mise en place du modèle induit par la radiation chez la souris.
Raffinement
Pour la mesure de saturation sur animal vigile, afin de limiter le stress lié à l’hébergement individuel durant la mesure, les animaux seront maintenus en contact visuel avec leurs congénères via une paroi transparente. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. • Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux, tel que la thoracotomie, seront réalisés sous anesthésie profonde (Isoflurane, Kétamine/Xylazine) avec analgésie 30min avant la chirurgie (Buprénorphine). Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Le fait de ne pas sacrifier l’animal qui a atteint le point limite doit être argumenté et justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
LLa souris mâle C57BL/6J sera privilégiée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine car ce modèle est bien décrit et documenté dans la littérature avec cette souche et sexe en particulier. La souris femelle C57BL/6J sera utilisée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la radiation, car ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur ces souches et les femelles sont plus sensibles à la radiation que les mâles. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et les radiations sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Etude de la fonction de Kat2b et autres mécanismes moléculaires dans le développement de la Fibrose Hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Cinq jours en cage métabolique, des tests métaboliques de quatre heures toutes les deux semaines, des injections d'insuline et de pyruvate dans l'abdomen et une prise de sang derrière l'œil sous anesthésie en fin de protocole : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie. Les régimes et traitements imposés altèrent le fonctionnement du foie, avec un risque de fibrose et de troubles digestifs, afin d'évaluer le rôle du gène KAT2B dans l'identité des cellules hépatiques. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer ce gène dans le foie. Le porteur affirme qu'il est "impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro", et annonce adosser au projet le développement d'organoïdes de foie humain censés fournir "un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle".
Objectifs
Notre projet vise à définir le gène de la lysine acetyl transferase 2B (KAT2B) comme un gardien de l'identité des hépatocytes et une cible pharmacologique pour contrecarrer la perte d'identité et de fonction hépatocytaire caractérisant les foies gravement lésés.
Bénéfices attendus
Le contrôle et le rétablissement de l’identité hépatocytaire émergent comme des voies thérapeutiques potentielles dans les formes graves d’atteinte à la fonction du foie. En identifiant un acteur pouvant être ciblé pharmacologiquement dans ce but, notre projet fera passer un cap permettant d’envisager plus sérieusement cette approche thérapeutique. D’autre part, en y adossant le développement d’organoïdes de foie humain, ce projet contribuera à fournir un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle.
Procédures
La totalité des souris sera soumise à différentes régimes ou traitements (6 protocoles de traitements ou régime) associés à des tests métaboliques et cages métaboliques (5 jours) afin de mesurer l'éfficacité des traitements provoquant la dysfonction hépatique et le rôle de nos gènes d'inéterets ou molécules pharmacologiques dans la physiopathologie hépatique. Ces tests métaboliques seront réalisés tous les 2 semaines sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pendant une durée de 4 heures. La totalité des souris sera soumise à un prélèvement sanguin à la veine caudale lors des tests de tolérance au glucose afin de determiner l'insulinémie et la glycémie. La totalité des souris sera soumise à une injection intra péritonéale d'insuline et de pyruvate. Un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire d'une durée de 3 minutes sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane à l'issu des protocoles expérimentaux. Nous utiliserons 60 souris de chaque génotype (wt/ko) pour les 5 procédures, traitées ou non avec l'activateur pharmacologique.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable qui pourrait être attendu sur les animaux est l'apparition d'un stress en lien avec la manipulation des animaux. Le développement d'une fibrose du foie pourra également générer des effets indésirables, notamment des troubles digestifs.
Devenir
A l'issu des protocoles, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie générale de l'animal. Des dissections des échantillons biologiques seront réalisées pour mener les études histologiques, moléculaires et épigénétiques.
Remplacement
Nos objectifs sont de mieux comprendre la physiopathologie de stéatose hépatique. Pour cela, la validation chez l'animal est une obligation pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et physiopathologiques à l'origine de CETTE maladie. Nous devons donc utiliser des souris génétiquement modifiées pour identifier certains gènes intervenant dans le dévelopement de cette maladie. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier vivant pour reproduire la physiopathologie complexe de la stéatose hépatique, car cette maladie fait intervenir plusieurs types cellulaires dans le foie mais également d'autres organes comme l'intestin. Il est donc impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux, une étude statiistique (utilisation du logiciel gpower pour definir le nombre d'animaux necessaires) est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de générer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés (glycémie, poids, ...).
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée reste le meilleur modèle pour étudier l'effet d'un gène sur le développement d'une maladie. Nous utiliserons donc des souris invalidées pour notre gène d’intéret spécifiquement au niveau hépatique. Ces souris seront soumises à différents traitements régimes afin de mimer le développement d’une maladie du foie. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines (pesant entre 20 et 30g) possédant un système digestif et immunologique mature, permettant l'étude d'un système physiologique digestif optimal.
Criblage de vecteurs AAV chez la souris C57BL/6 : comparaison entre administration intracérébrale et une approche moins invasif, l’ administration intraveineuse.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
218 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent soit une injection dans le cerveau après craniotomie sous anesthésie de 70 minutes, soit une injection rétro-orbitaire, pour comparer ces deux voies d'administration de vecteurs de thérapie génique. Le porteur nomme des atteintes possibles comme un saignement lors de la craniotomie, un risque d'exophtalmie et d'infection oculaire après l'injection rétro-orbitaire, et une perte de poids. Les souris sont tuées quatre semaines après pour des analyses, cette étude servant à valider les vecteurs chez des souris saines avant emploi sur des modèles de maladie.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Cet ADN peut être délivré de différentes manières. L’injection intracérébrale est l’approche de référence pour de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous souhaiterions tester l’efficacité d’une approche moins invasive qu’est l’injection intraveineuse. Ceci dans le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet permettrait d’opter pour un mode d’administration de notre produit le moins invasif possible pour l’appliquer chez l’homme et plus précisément chez les patients atteins de la maladie neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 semaine d’âge soit : -à une injection stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 70 min), -ou à une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée de 5 min), Dans les deux cas l’animal est endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (tests de performance motrice et activité locomotrice), les semaines 5, 6 et 7 et 1 jour de repos sera laissé entre ces deux tests. Un des tests de performance de la motricité est réalisé en 3 sessions pendant 3 jours consécutifs et dure 5 minutes maximum par session. Le test de l’activité locomotrice dure 10 minutes par animaux. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie avec animal endormi et immédiatement après les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux. Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal existe également. Un risque d’infection oculaire et d’hématome peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitales. Une perte de poids dû à l’injection de vecteur viraux pourrait être observée, (5 à 7%) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des vecteurs utilisées soient déjà été évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. Un risque d’hématome (exophtalmie), au niveau de l’IV peut survenir car l’injection est réalisée en rétro-orbitaire.
Devenir
Les souris seront euthanasiées 4 semaines après les injections (temps d'expression des vecteurs viraux étudiés) - pour les differentes études biocellulaires et biomoléculaires.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle murin de la maladie de Huntington est bien caractérisé. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (218) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring (fournie en annexe ) est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes de vecteur virauxs modifiés et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un vecteur viral exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Nous commencerons donc par valider dans la présente demande nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. En effet à ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH ou MA permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études de comparabilité et d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau.
Etude du rôle de TBK1 dans les cellules microgliales sur la dégénérescence et la régénérescence des motoneurones dans des modèles murins de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées au stade symptomatique de la maladie, à cinq mois, ou à son stade terminal, à six mois, 114 souris d'une lignée transgénique de SLA sont d'ici là pesées et soumises chaque semaine à un test de force musculaire. Au total, 174 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs organes. Les 60 autres, issues d'une seconde lignée, subissent sous anesthésie une lésion du nerf sciatique à quatre ou douze mois, puis une mesure quotidienne de l'écartement des doigts pour suivre la paralysie de la patte, avant leur mise à mort une semaine ou un mois plus tard. Le porteur dit avoir obtenu des résultats "prometteurs" sur des cultures de cellules immunitaires du cerveau, et affirme que pour étudier leurs interactions avec les motoneurones "un modèle in vivo est crucial".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Les formes génétiques de SLA sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Cependant, la plupart des mutations dans les gènes impliqués dans la SLA induisent plutôt un gain-de-fonction-toxique inconnu - difficile à étudier. Recemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA. Les mutations dans ce gène induisent une perte de la protéine, un phénomène plus facilement étudiable. Ce gène est impliquée dans la dégradation des protéines et la réponse immunitaire. Comme il a déjà été montré que les cellules immunitaires étaient impliquées dans la SLA, nous étudions plus spécifiquement le rôle de ce gène dans les cellules immunitaires du cerveau. Nous cherchons à savoir si des cellules immunitaires déficientes en ce gène produisent une réponse altérées à un stress des neurones, et si elles améliore ou au contraire altèrent les problèmes moteurs associés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intêret, un gène dont la mutation peut causer la SLA, dans les cellules immunitaires du cerveau. Si nous montrons que la perte de ce gène dans ces cellules est toxique, cela contribuerait à expliquer pourquoi des mutations dans ce gène peut causer la SLA. Si nous montrons au contraire que ces cellules immunitaires sans ce gène sont bénéfiques pour les neurones, cela pourrait en faire une cible thérapeutique pour ralentir le cours de la maladie chez tous les patients atteints de SLA.
Procédures
• 114 souris d'une première lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront uniquement un suivi par pesée et test de la mesure de la force musculaire (2 minutes par souris) une fois par semaine. • La totalité de ces 114 souris seront euthanasiés au stade symptomatique (à 5 mois) ou terminale (à 6 mois) pour prélèvement des organes. Deux méthodes d’euthanasie distinctes seront utilisées, nécessaire pour l’analyse des differents types d'échantillons. • 60 souris d'une deuxième lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront une chirurgie sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, à 4 mois (jeune), ou à 12 mois (agées). Elles recevront une analgésie 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant la chirurgie et les sutures seront désinfectées (5 min par souris). Tous les jours, on évaluera la paralysie de la patte par mesure de l’écartement entre les doigts de la patte (2 min par souris). • La totalité de ces 60 souris seront euthanasiés 1 semaine ou 1 mois après lésion du nerf, pour prélèvement des organes d'intéret. • TOTAL - interventions sur 174 souris.
Impact sur les animaux
Modèle SLA: Le modèle souris transgénique de SLA est un modèle à phénotype dommageable. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêqret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter améliorer le phénotype. Lésion du nerf sciatique chez la souris: Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera pris en charge. Il y aura aussi une diminution (transitoirement) de leur mobilité, nous leur proposerons donc de la nourriture directement dans la cage sous forme de bouillie. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter la vitesse de la régénérescence.
Devenir
Tous les animaux dans les deux procédures sont utilisées à la fin de la procedures pour des analyses (histologique ou durée de la maladie) - et donc euthanasiées.
Remplacement
Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocol, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion de notre gène d'intêret, pour tester si elles répondent différemment que les cellules microgliales contrôles - à un stimulus inflammatoire. Nos résultats étant prometteurs, nous avons donc décidé de passer à des expériences plus complexes, in vivo. Comme notre question concerne les intéractions entre les motoneurones et les cellules immunitaires, un modèle in vivo est crucial. Des intérations aussi complexes seraient difficiles à modéliser en culture.
Réduction
Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour l'étude de l'effet sur les souris SLA, le modele de la maladie humaine avec phenotype dommageable, nous avons besoin de 20 souris par génotype. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique dans les souris SLA - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la SLA. Pour l'analyse des organes à deux differentes stades de la maladie, on a besoin 6 souris par génotype (nombre minimal de souris nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). Le nombre d'animaux utilisés pour cette premiere partie est de 114. Pour l'étude de la lésion du nerf sciatique, nous utilisons une lignée transgénique avec modification de notre gène d'interet, mais sans phenotype dommageable. Nous aurons besoin de 5 souris/génotype pour s’assurer une analyse finale robuste (nombre minimal nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). L'analyse doit être fait à 2 stades différentes: pendant la régénérescence, et après régénérescence complète, pour déterminer les effets sur la vitesse et l'éfficacité. Et à 2 âges differentes, jeune et agé, pour déterminer l'effet du vieillissement sur la capacite regenerative du nerf. Le nombre d'animaux utilisés pour cette deuxième partie est de 60. Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 174.
Raffinement
Pour la stimulation environnementale (enrichissement), nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage) et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Pour les souris SLA, les souris montrant des signes de paralysie sont surveillées quotidiennement par un expérimentateur. Un mélange de poudre de nourriture et d'eau est proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une deshydratation et une dénutrition. Un soin particulier est apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Proche du stade terminal, les souris sont surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours. Pour la lésion du nerf sciatique, nous allons léser un seul nerf sciatique pour éviter que la souris ne soit trop paralysée durant la première semaine après la chirurgie. Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera bien pris en charge, pré- et post- opératoire par des analgésiques. Durant la première semaine après la chirurgie, nous ajoutons de la nourriture en poudre avec de l’eau directement dans la cage, car le membre opéré est partiellement paralysé. Comme nous n’utiliserons que des mâles, après la chirurgie ces mâles sont hébergés en isolement ou par maximum trois, jusqu’à la fin de la procédure, pour éviter que des bagarres ne dommagent les sutures. Pour les deux procédures, des points limites sont définis : les souris doivent impérativement être euthanasiées si elles les atteignent.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère (pour l'étude, souris SLA), mais aussi dans un système nerveux périphérique à la jonction entre motoneurone et muscule de membres éloignés (pour l'etude, lésion du nerf sciatique). Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Nous avons une grande expérience avec les souris, et les deux modèles (SLA et lésion du nerf sciatique) sont mieux établis chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Dans un premier temps: l'étude de l'effet sur le phénotype des souris SLA et étude histologique du stade terminale. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers 6 mois. Pour l'étude histologique du stade symptomatique avant le stade terminal, les souris sont utilisées at 5 mois (quand la perte de pois atteigne 10%). Dans un deuxieme temps: l'étude du nerf sciatique dans les souris avec modification du gène d'intêret : la chirurgie est faite au stade adulte/jeune à 4 mois, et au stade adulte/agée à 12 mois - suivi de 1 mois (pour étudier la régénérescence complète/efficacité) ou 1 semaine (pour étudier la vitesse de la régénérescence).
Mise en place du test de charge calcique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de vitamine D pendant trois jours puis une charge calcique, subissent un jeûne pouvant atteindre 18 heures et un isolement en cage métabolique, avant une prise de sang terminale. Le porteur reconnaît que les gavages peuvent irriter l'œsophage et que le jeûne et l'isolement sont sources de stress. L'objectif est de "mettre en place" un test de charge calcique chez la souris, les animaux étant ensuite tués pour analyser les tissus.
Objectifs
L'homéostasie calcique est un réseau finement régulé impliquant de nombreux organes (i.e. glandes parathyroides, intestin, rein, os). Dans de nombreuses pathologies, dont beaucoup sont encore idiopathiques, les patients pédiatriques ou adultes présentent des hypercalcémies et des hypercalciuries. Ces patients partagent un tableau clinique similaire : des niveaux circulants de vitamine D élevés et ceux d'hormone parathyroidienne effondré. L'ensemble de ces résultats indiquent que bien que la cause ne soit pas toujours connue, les symptômes sont liés à une augmentation des niveaux de vitamine D. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole de charge calcique chez la souris sauvage pour déterminer les niveaux de calcium urinaire, et de déterminer les effets de bolus de vitamine D sur ce paramètre.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se basent sur la mise au point d'un paramètre clinique pertinent pour déterminer les effets de mutations chez la souris et également l'effet de nouvelles options thérapeutiques. Les résultats obtenus permettront d'améliorer l'évaluation clinique des hyperabsorptions calciques et des hypercalciuries et d'ameliorer le diagnostique et la prise en charge clinique des patients.
Procédures
1 administration par jour de vitamine D par gavage (15 sec par administration) pendant 3 jours, puis une administration unique par gavage de solution calcique, et une prise de sang terminale (30 sec). Une mise à jeun de 18H maximum et une mise en cage métabolique pendant 4H.
Impact sur les animaux
D'après nos travaux précédents, le régime de vitamine D administré n'induit pas de nuisances ni de souffrance aux animaux. L'expérience de charge calcique est classiquement réalisée chez les jeunes enfants chez l'humain, et aucun effet indésirable n'a été rapporté. Les gavages réalisés peuvent induire une irritation de l'oesophage et l'isolement dans les cages métaboliques ainsi que le jeun peuvent entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour étudier les effets sur les tissus.
Remplacement
L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. Aucune méthode alternative n'est disponible en raison de la compléxicité de ce réseau qui ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.
Réduction
L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux est le nombre d'animaux optimal afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales, dans des cages agrémentées avec un nid. Si une souris présente des difficultés pour se nourrir suite à une irritation de l'oesophage induite par les gavages, de la nourriture en gelée sera placée dans le fond de la cage. Les autres points limites sont un pelage terne ou hérissé, un ecoulement lacrymal, l'immobilité, ou une baisse de la température corporelle. Dans ce cas, des mesures appropriées seront prises en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes fins régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leurs similitudes avec ceux chez l'Homme. Le diagnostique de ce type de pathologie peut se faire soit chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Ainsi la moitié des animaux sera utilisé à l'age de 5-6 semaines, l'équivalent du jeune enfant, et entre 12-15 semaines l'équivalent du jeune adulte.
Potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Charcot, elles développent une paralysie progressive et sont suivies jusqu'au point limite, fixé à l'incapacité de se retourner en quinze secondes ou une perte de poids dépassant 15 %. Certaines reçoivent un transfert de lymphocytes T régulateurs par voie intraveineuse, d'autres un prélèvement intracardiaque après injection létale. Le porteur revendique une approche de thérapie cellulaire à amener "au plus proche de la clinique".
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie du motoneurone adulte qui se caractérise pas une paralysie progressive. Bien que les neurones moteurs soient sélectivement atteints dans la maladie, le système immunitaire se retrouvent également impliqué dans cette maladie. En effet, des lymphocytes T dits régulateurs (Treg), une population de globules blancs dont la fonction est de supprimer les réponses immunitaires potentiellement dangereuses, voient leur nombre et leur propriétés régulatrices fortement diminuées chez les patients et les souris. L’hypothèse de départ est que les altérations métaboliques présentes dans la maladie de Charcot contribuent au dysfonctionnement des lymphocytes T régulateurs dont la fonction est directement gouvernée par l’environnement métabolique. Notre projet consiste donc à étudier le métabolisme des lymphocytes T régulateurs dans la maladie et d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une correction métabolique de ces cellules dans un modèle de maladie de Charcot.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour vocation d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. En ciblant l'interaction entre système nerveux et système immunitaire, notre objectif est d'amener le plus proche possible de la clinique une approche de thérapie cellulaire compatible avec les contraintes cliniques.
Procédures
L’étude du métabolisme implique des prélèvements intra-cardiaques suite à une injection léthale d’un mélange anesthésique/analgésique chimique sur des animaux modèles de la maladie de Charcot avec un phénotype dommageable. Un total de 54 animaux avec phénotype dommageable seront soumis à ce prélèvement sanguin. Le prélèvement prend moins de 5 min par animal. L’étude de l’effet thérapeutique d’un transfert de lymphocytes régulateurs d’origine différente dans des souris modèles de la maladie de Charcot comprend une injection de cellulaire en intra-veineuse sur un total de 192 souris à phénotype dommageable. 4 souris à phénotype dommageables serviront de souris donneuses de lymphocytes qui seront modifiés in vitro avant réimplantation. 72 souris qui ont été transfusées seront incluses dans une étude comportementale qui débute à l’âge de 60 j jusqu’à son incapacité à effectuer le test moteur, et qui atteint donc le point limite. Chaque test moteur est non-invasif et non-contraignant prend entre 20 sec et 5 min par souris. Un total de 168 souris seront utilisées pour une étude de cytométrie et d’histologie. Ces souris recevront une injection terminal d’un mélange anesthésique/analgésique chimique pour ensuite être soumis à un prélèvement sanguin ou une perfusion intra-cardiaque pour préparation à l’histologie. L’anesthésie profonde et très rapide, la manipulation prend moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Le modèle de maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie de Charcot ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.
Devenir
Les souris porteuses de la mutation causant la SLA ont une espérance de vie limitée. L'ensembles animaux seront euthanasiés selon les critères d'interuption définis préalablement
Remplacement
Le modèle murin de la maladie de Charcot que nous utilisons mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine. Un effort est réalisé pour minimiser et optimiser le nombre d’animaux. Cependant, la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèle de la maladie.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement enrichi. Cet environnement permet d’améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une grille de suivi est scrupuleusement suivie avec une définition claire des points limites. Les souris sont euthanasiées par injection d’une dose léthale d’anesthésique chimique (kétamine) en combinaison avec un analgésique (xylazine).
Choix des espèces
Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.