Souris
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèles génétiquement modifiés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.
Étude de l’induction d’une immunité entrainée chez le souriceau en comparasion de l’adulte.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Injectés par voie intrapéritonéale à une puis deux semaines de vie, éveillés et sous contention, des souriceaux reçoivent des immunostimulants censés installer une mémoire immunitaire innée, comparée à celle de souris adultes traitées de la même manière. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus, et le porteur prévoit 20 à 30 % de mises en reproduction en plus parce que le stress de certaines lignées "favorise le cannibalisme", les surnuméraires pouvant être "introduits dans un autre protocole". Des femelles, gestantes ou non, boivent une eau additionnée d'antibiotiques, et toute médication est proscrite pour ne pas fausser les mesures immunitaires. Sur l'injection, le porteur écrit qu'"aucune nuisances n'est observée", puis que "des douleurs légères peuvent être liées à l'injection intra-péritonéale", et juge "impossible d'anticiper" les effets indésirables des immunostimulants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de divers immunostimulants à induire une réponse immunitaire innée mémoire lorsqu’ils sont administrés en début de vie de l’animal. L’implication du microbiote intestinal sera également étudiée dans la modulation et la mise en place de l’immunité innée mémoire. La stimulation et la modulation des cellules de l’immunité innée en période néonatale pourraient permettre d’induire une réponse durable, avec une mise en place de la mémoire immunitaire innée pour favoriser le contrôle d’infections futures à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Les stratégies de contrôle pour lutter contre les infections sont parfois limitées et trop spécifiques d’un agent (ex : vaccin). L’idée ici est de proposer une nouvelle stratégie prophylactique qui cible l'hôte lui-même et plus spécifiquement son système immunitaire inné. Il repose sur l'utilisation d’immunostimulant favorisant la stimulation des récepteurs de l’immunité, et ainsi booster la réponse immunitaire innée pour mieux contrôler une infection zoonotique présente ou ultérieure (d’où les essais d’induction de mémoire innée).
Procédures
Les souriceaux seront soumis à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants : une fois à l’âge d’une semaine, puis à l’âge de deux semaines. Les souris adultes seront soumises à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants sur la période de 6-8 semaine à une semaine d’intervalle. Cette administration est réalisée sur animaux vigiles sous contention. Pour évaluer l’implication du microbiote intestinal, les souris adultes gestantes ou non recevront des antibiotiques dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Il est impossible d’anticiper, mais il est possible que des effets indésirables altérant l’état général de l‘animal puissent être remarqués avec certains immunostimulants. Concernant l’injection intra-péritonéale aucune nuisances n’est observée, en effet, nous utilisons des seringues adaptées (seringue insuline, 30G pour les souriceaux, et aiguille 29G pour les adultes), neamoins des douleurs légères peuvent être liées à l’injection intra-péritonéale.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par l’établissement). Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. L’étude de l’immunité innée mémoire s’effectuera dans différents organes. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation, les différents organes prélevés sur un même animal seront utilisés autant que possible pour réaliser différents types d’analyse. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes adaptés qui tiennent compte à la fois des traitements immunostimulants et de la répétition des expériences.
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis 2 fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra d’étudier et décrire très précisément les mécanismes d’induction des réponses immunitaires innées mémoires après l’administration d’immunostimulants. 1. Des souriceaux entre 0 jours et 3 semaines seront utilisés car c’est la fenêtre que nous souhaitons étudier pour l’induction de l’immunité innée mémoire. Des souris gestantes fourniront les souriceaux 2. Des adultes seront utilisés dans le cadre de l’étude de l’immunité innée mémoire, afin de comparer ces évènements entre la période néonatale (premières semaines de vie) et la période adulte (6-8 semaines).
Influence du système leptinergique sur la commande respiratoire chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Lors des administrations de leptine par le nez sous anesthésie, le point limite retenu pour les souris adultes est l'arrêt cardiorespiratoire, ces souris mutantes présentant un risque accru de troubles respiratoires mortels sous anesthésie. 211 souris porteuses de la mutation Phox2b, présentées comme reproduisant le syndrome d'Ondine, vont être utilisées dans des procédures classées sans réveil pour une partie et d'un niveau de souffrance modéré pour l'autre, toutes tuées. Les souriceaux de cinq jours au plus et les juvéniles de quinze jours au plus sont tués dès le début des procédures pour prélever une partie de leur système nerveux central, tandis que les adultes inhalent du solvant et de la leptine à 48 heures d'intervalle, ou en reçoivent par le nez sous isoflurane, avant des enregistrements en chambre de pléthysmographie et leur mise à mort. Le projet doit décrire l'action de la leptine sur la commande respiratoire, et le porteur en attend des données qui "devraient permettre de constituer un socle de connaissances" pour la prise en charge future des patients.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Dans le cadre de ces pathologies, des perturbations de la commande respiratoire sont observées en lien avec un dysfonctionnement de sa régulation. Ces syndromes englobent le syndrome d’Ondine. Cette pathologie survient dès la naissance. Son nom provient de la mythologie germanique. En effet une nymphe trompée par son conjoint lui jeta un sort l’obligeant à toujours penser à respirer. Un jour il s’endormit et cessa de respirer. Les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Les expérimentations réalisées chez des souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine permettront notamment de caractériser l’action de la leptine sur la commande respiratoire et d’étudier s’il est possible d’améliorer la respiration de ces souris. Les souris mutantes qui modélisent le syndrome d’Ondine feront l’objet de deux procédures expérimentales. La littérature indique que la leptine contribuerait au contrôle de la respiration. Une première procédure s’intéressera chez des souris nouveau-nées à l’action de la leptine sur la commande respiratoire ou sur des neurones de cette commande. Les approches utilisées iront de l’analyse de la commande respiratoire sur des préparations isolées de système nerveux central, à l’étude sur tranches de système nerveux central de l’activité des neurones modulant la commande respiratoire. Une deuxième procédure s’intéressera à l’action de la leptine sur la ventilation des souris adultes mutantes modèle du syndrome d’Ondine. La leptine sera administrée par nébulisation ou par injection intranasale. La ventilation sera ensuite enregistrée sur animal non contraint, vigile et de manière non invasive. Enfin, l’analyse des populations neuronales impliquées dans l’action de la leptine sera réalisée par des approches histologiques. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine peut moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre de constituer un socle de connaissances participant à la prise de décision quant à la prise en charge future de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine, est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie ou chémosensibilité au CO2/H+. Ces souris, à la naissance ne présentent pas de réponse à l’hypercapnie qui est partiellement restaurée chez les souris adultes. La stimulation des systèmes leptinergiques pourrait potentiellement i) améliorer la respiration de ces souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes et ii) restaurer une réponse à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et restaurer ou potentialiser cette réponse chez les souris adultes. De plus nous voulons décrypter quelles sont les cibles de la leptine au niveau de la commande centrale respiratoire et si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine peut moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre de constituer un socle de connaissances participant à la prise de décision quant à la prise en charge future de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Procédures
Les souris nouveau-nées ou juvéniles sont euthanasiées dès le début des procédures afin d'isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes utilisées, ne sont exposées à aucun prélèvement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales. Elles vont être exposées à la nébulisation de solvant et de leptine (10 minutes à chaque fois) avant la mesure des variables ventilatoires, 48h sépareront la nébulisation du solvant de la nébulisation de leptine. Les souris adultes de la procédure seront anesthésiées à l'isoflurane et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale du solvant ou de la leptine (volume 24 microlitres dans les 2 cas) sera réalisée. 48 heures sépareront les 2 anesthésies.
Impact sur les animaux
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine présentent une absence à la naissance de la réponse à l’hypercapnie. Les données de la littérature indiquent une restauration partielle de la réponse respiratoire à l’hypercapnie à l’âge adulte. Nos données non publiées à ce jour font de plus état d’une hypoventilation en normocapnie. Malgré ces atteintes respiratoires, nous n’avons pas observé de différence dans la masse des souris quel que soit l’âge. De plus, la mortalité périnatale est identique chez les souris mutantes et leurs congénères sauvages. Les données de la littérature sur ces souris mutantes mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie. Ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie.
Devenir
Les souris nouveau-nées utilisées sont toutes euthanasiées dès le début de la procédure pour les prélèvements de préparations permettant l'enregistrement ex vivo de la respiration. Les souris nouveau-nées et juvéniles utilisées sont toutes euthanasiées dès le début de la procédure afin de prélever des tranches de bulbe rachidien comportant la commande centrale respiratoire permettant d'enregistrer les neurones de cette commande. Les souris adultes seront toutes euthanasiées à la fin des enregistrements et le tissu nerveux central sera prélevé post mortem.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèle ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence de la leptine sur la commande centrale respiratoire de souris nouveau-nées ou nécessitent de conserver ex vivo un réseau de neurones vivant et fonctionnel et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par la leptine ne peut être réalisée que sur des souris adultes vivantes.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 211. L’expérimentation s’appuie sur la comparaison de variables physiologiques entre deux lots ou entre deux conditions dans un même lot. Le nombre d’animaux par groupe a établi que des groupes de 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes Phox2b sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie se traduit par la disparition des épisodes de tachypnées et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de leptine ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20% de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de leptine ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle murin : souris portant la mutation Phox2b de manière constitutive ou souris dont la mutation Phox2b est restreinte au noyau rétrotrapezoide impliqué dans la chémosensibilité au CO2. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur les souris Phox2b mutées : étude de l’influence sur commande centrale respiratoire ex vivo de la leptine ; étude sur des tranches de tissu des changements des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la respiration par pléthysmographie de l’influence de la leptine appliquée in vivo par nébulisation ou par administration intranasale. -nouveau-né de 5 jours maximum pour l’étude de la commande respiratoire générée par des préparations ex vivo de système nerveux central. Ce stade de développement est imposé par l’approche méthodologique ; Ces préparations génèrent une activité rythmique. Au-delà de 5 jours de vie postnatale, elles ne génèrent plus cette activité du fait de la maturation du système nerveux. -juvénile de 15 jours maximum pour l’étude des modifications des propriétés électriques des neurones impliqués dans la chémosensibilité au CO2. Ces travaux dépassant l’âge de 12 jours postnataux apporteront des informations importantes pour comprendre comment les souris mutantes exprimant la mutation Phox2b dans une structure clé de la chémosensibilité au CO2 récupèrent partiellement une sensibilité à l’hypercapnie. -adulte à partir de 2 mois, les souris auront récupérées 40% de la réponse à l’hypercanpnie. Nous pourrons combiner l’enregistrement de la ventilation par pléthysmographie à l’exposition par inhalation à la leptine.
Le rôle des plaquettes dans la formation des anévrysmes intracrâniens
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 179 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune subit deux opérations de cinquante minutes, cinq prises de sang, dix jours de séances où elle est maintenue immobile pour mesurer sa pression artérielle, trois échographies et deux IRM. La première opération consiste à ligaturer la carotide gauche et l'artère rénale droite, la seconde à injecter une molécule dans le cerveau et à poser sous la peau du dos un dispositif qui élève la pression artérielle, afin de provoquer en 23 jours des anévrismes intracrâniens. Une partie des souris appartient à des lignées génétiquement modifiées dont les plaquettes sont privées de certaines molécules. Le porteur prévoit environ 10 % de décès à chacune des deux chirurgies, et les souris dont l'anévrisme se rompt, avec hémorragie et signes neurologiques, sont tuées dès la rupture identifiée, les autres à la fin du protocole. Le gain reste au conditionnel : si des antiplaquettaires empêchaient ces anévrismes, "le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent", écrit le porteur.
Objectifs
Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance)
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.
Devenir
Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.
Création d’une plateforme préclinique d’étude des malformations caverneuses cérébrales sporadiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des malformations caverneuses cérébrales, elles reçoivent une injection intracrânienne à la naissance puis un traitement pendant trente jours, et le porteur indique qu'elles développeront crises convulsives et déficits moteurs. À l'issue des procédures, elles sont tuées pour évaluer les malformations et la réponse aux traitements. Le porteur présente les retombées au conditionnel, ce projet "pourrait" jeter les bases d'un essai clinique de l'Alpelisib chez l'humain.
Objectifs
Des mutations de PIK3CA ont récemment été découvertes dans 39% des cavernomes sporadiques et un premier modèle souris génétiquement modifié de cavernome muté PIK3CA a été publié. Des mutations de MAP3K3 ont également été mises en évidence dans 44% des cavernomes sporadiques sans réalisation de modèle souris associé. Le présent projet propose la réalisation d'un modèle souris génétiquement modifié de cavernome muté MAP3K3 et l'utilisation dans un essai pré-clinique des deux modèles sus-cités.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de formation des cavernomes sporadiques, confirmer le rôle central de PIK3CA et jeter les bases d'un essai clinique chez l'homme pour l'Alpelisib, offrant ainsi un traitement à des patients parfois en impasse thérapeutique.
Procédures
Les animaux porteurs de cavernomes seront détectés par IRM puis seront soumis à des injections intra-crâniennes néo-natales (1 injection par animal) et à un traitement par voie orale (7 animaux) ou par voie intra-péritonéale (7 animaux), tous deux durant 30 jours. La durée procédures sera de 30 minutes par animal pour les IRM et de 1 minute par animal pour les gavages.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des symptômes cliniques liés à la présence de cavernomes, notamment des crises convulsives et/ou des déficits moteurs, et seront donc étroitement surveillés pour limiter la souffrance à l'apparition des premiers symptômes. Il n'existe pas d'effet indésirable rapporté chez la souris pour les traitements proposés dans notre projet, qui ont déjà fait l'object d'essais pré-cliniques chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'ensemble des procédures afin de pouvoir évaluer la survenue de malformations dans les nouveaux modèles souris décrits et d'évaluer la réponse morphologique des malformations vasculaires aux différents traitements dans le cadre de l'essai pré-clinique.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de cavernomes avec un aussi grand niveau de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris que nous avons déjà réalisés. La souris reste donc l'espèce les plus appropriée pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au maximum (nombre total: 160)pour nous permettre de générer des résultats solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs.
Raffinement
Les procédures d'injection intra-crânienne ont été adaptées pour diminuer le stress et la douleur en réduisant notamment au maximum le temps d’exposition au stress en limitant le nombre d'injections par animal au minimum. Les procédures seront stoppées en cas de stress ou douleur non contrôlé, non traitée.Les animaux auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum et disposeront d'enrichissements. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l'animal, une anesthésie étant pratiquée quand cela est nécessaire. Les points limite sont définis. Les animaux seront suivis par un personnel compétent au sein d'un milieu enrichi.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de déterminer avec précision la capacité de MAP3K3 à initier ou promouvoir la formation des cavernomes, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de cavernomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de la naissance à l'âge de 12 mois de manière similaire aux précédents modèles de cavernomes publiés par l'équipe.
Evaluation de la fonctionnalité et de la stabilité de substituts de peau greffés chez la souris Nude
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
600 souris Nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, une plaie cutanée est créée puis recouverte d'un substitut de peau issu de cellules souches embryonnaires humaines, et chaque souris est ensuite isolée en cage individuelle de deux semaines à six mois pour éviter l'arrachage du greffon. Le porteur reconnaît que cet isolement prolongé est une source de stress par privation de contacts sociaux. Il décrit un objectif de production, sécuriser le lancement de lots cliniques de substituts cutanés, les souris étant tuées à quatre échéances pour analyser les greffes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés développés selon différentes méthodes de fabrication, en utilisant des banques de cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une matrice biologique, amplifiées et différenciées. Trois milieux de culture différents sont utilisés, qualifiés dans des tests in vitro de reconstruction épidermique, pour produire ces produits de thérapie innovante dans de nouveaux dispositifs médicaux afin d’obtenir des substituts cutanés de plus grande taille que dans des plaques de culture commerciale et en évaluant la stabilité des unités thérapeutiques produites au cours du temps, selon les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Un maximum de 30 substituts cutanés ainsi préparés selon différentes conditions expérimentales et sélectionnés sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront greffés chez la souris Nude pour éviter un rejet. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes où donneur et receveur sont la même personne, sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes où donneur et receveur sont de même espèce ou d'espèces différentes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau mais avec de forts risques de rejet, douleurs, infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules souches embryonnaires humaines sont produits par ingénierie tissulaire. Ils sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour la réalisation des greffes de substituts cutanés. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sera effectué avant la réalisation de la greffe de substitut cutané à cet emplacement. Un traitement analgésique des souris Nude greffées sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées et elles seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation. Un suivi quotidien des souris greffées sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané. La durée de cet hébergement en cage individuelle sera variable, de 2 semaines à 6 mois pour la durée la plus longue.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long, passant par différentes phases, inflammation, néovascularisation, épithélialisation et surtout remodelage. La peau néoformée à partir d’un substitut cutané est une peau très fragile jusqu’à la finalisation du remodelage qui peut nécessiter plusieurs semaines voire plusieurs mois pour être finalisé. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voire au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 600 souris Nude greffées seront mises à mort à 4 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après, avec 5 souris par temps de prélèvement, afin de réaliser un ensemble d'analyses sur les prélèvements cutanés qui seront effectués.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de vaisseaux sanguins, régénération de la surface cutanée…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes et selon les recommandations internationales en vigueur. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée avec l'utilisation d'analgésique. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Une grille de score sera mise en place avec l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel conduisant si nécessaire à la mise à mort des animaux dans des conditions éthiques afin d'arrêter toute souffrance. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et la souris Nude est une souris avec un système immunitaire très rudimentaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger telle que des substituts cutanés préparés à partir de cellules embryonnaires humaines. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Evaluation de l’activité protéolytique et de l’imunogénicité d’une IgG-degrading enzyme (IdeS) à demi-vie augmentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à six injections intraveineuses sous anesthésie et trois à quatre prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut léser l'œil, pour évaluer l'immunogénicité d'une protéase modifiée destinée à éliminer des anticorps chez l'humain. À l'issue, elles sont tuées pour prélever le sérum et les organes lymphoïdes. Le porteur annonce peu d'effets indésirables au motif que la protéase agit peu sur les anticorps de souris, et renvoie le bénéfice clinique à de futurs médicaments.
Objectifs
Une protéase nommée IgG-degrading enzyme ou IdeS est produite par la bactérie Streptococcus pyogenes afin d'échapper au système immunitaire de l’hôte. Cette protéase digère les anticorps de type Immunoglobulines G chez l’homme, le lapin ou les primates non-humains, mais n’a pas ou peu d’actions sur les Immunoglobulines G de souris. Plusieurs groupes de recherche ont montré que la protéase IdeS peut être utilisée dans des modèles précliniques de maladies autoimmunes ou chez certains patients, pour éliminer, de manière transitoire, les anticorps de type IgG pathologiques. Cependant, l’utilisation de cette protéase chez l’homme se heurte à deux problèmes: sa courte durée de vie dans l’organisme avec une demi-vie de 3-5 heures et son immunogénicité, c’est-à-dire sa capacité à induire des anticorps neutralisant. Pour cette raison, l’utilisation de la protéase IdeS comme traitement chronique n’est actuellement pas possible chez l’homme. Les objectifs de ce projet sont de générer des protéases IdeS ayant une durée de vie prolongée dans l’organisme, et d’évaluer l’immunogénicité de ces protéases à demi-vie augmentée chez la souris. L’avantage d’une étude d’immunogénicité chez la souris réside dans le fait que les Immunoglobulines G murines sont peu ou pas digérées par l’IdeS ; Ceci devrait donc permettre d’étudier en détail le mécanisme d’action des IgG murines anti-IdeS, et notamment leur capacité à neutraliser l’activité de la protéase IdeS, sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS.
Bénéfices attendus
L'intérêt de l'utilisation de la protéase IgG-degrading enzyme a été démontré afin de lutter contre certaines maladies auto-immunes (Purpura thrombocytopénique, arthrite rhumatoïde), contre le rejet de greffe ou encore afin d'améliorer l'efficacité de la thérapie génique utilisant des vecteurs rétroviraux. L'utilisation de cette enzyme en clinique se heurte toutefois à sa courte demi-vie et à son immunogénicité. La validation préclinique de nouvelles protéases IgG-degrading enzyme recombinantes à durée d’action optimisée ouvrira la voie à la préparation de nouveaux médicaments plus efficaces. Ceci devrait ainsi permettre de réduire les fréquences d’injection de la molécule aux patients et de réduire les doses de molécules injectées, ce qui devrait diminuer la probabilité de développer des réponses immunitaires neutralisantes.
Procédures
Les animaux subiront 1 à 6 injections intraveineuse. Ces interventions (injection) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et ne durent que 10 à 20 secondes. Ils subiront également 3 à 4 prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, les animaux subiront en plus des gestes cités précedemment 1 injection intrapéritonéale en tout début de procédure. Cette injection nécessite 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal.
Impact sur les animaux
Les risques de lésions au niveau de l'œil existent du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité. Par ailleurs, les lots d’animaux seront divisés en 2 afin de limiter le nombre de prélèvements par animaux. Il n'y a pas d'effets indésirables particuliers attendus suite à l'injection d'IdeS car celle ci est peu active sur les IgG murines (pas de risque d'infection) et nous validerons l'absence d'endotoxine avant injection (pas de risque d'inflammation). L'injection unique d'IVIg par voie intra-péritonale ne présente pas non plus d'effet indésirables attendus.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés. Le sérum et les organes lymphoïdes secondaires seront collectés pour l'évaluation de la réponse immunitaire anti IdeS ou pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment le catabolisme de l’IdeS et l’induction d’une réponse immunitaire anti-IdeS). Toutefois, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.
Réduction
Le nombre de répétition des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Nous prévoyons d'utiliser pour ce projet un nombre maximum de 345 souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Les lésions au niveau de l'œil sont possibles du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité car nous maîtrisons ce geste et nous alternerons l'œil concerné. Différents groupes seront par ailleurs constitués afin de réduire le nombre de prélèvements par animal. Des points limites ont été définis, les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce qui permette d’avoir un nombre suffisant d’individus de même âge et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables. Par ailleurs, les IgG de souris étant peu sensibles à l’action protéolytique d’IdeS, cela nous permettra d’étudier plus aisément l'immunogénicité des variants de l'IdeS et la capacité des IgG murines anti-Ides (si présentes) à neutraliser l’activité d’IdeS sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.
Identification de nouveaux composés à visée thérapeutique dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation entraînant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent une injection intra-oculaire d'un composé à tester sous anesthésie, puis des examens du fond d'œil, une tomographie et un électrorétinogramme, avant d'être tuées au CO2 et par dislocation cervicale pour prélever les yeux. Le porteur signale que les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires. Il présente le travail comme une preuve de concept dont le passage en clinique reste renvoyé au conditionnel.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés ayant un effet neuroprotecteur sur la dégénérescence des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante. La finalité étant le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies rétiniennes héréditaires, pouvant bénéficier au plus grand nombre de patients possibles.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’un ou plusieurs composés sur notre modèle de rétinite pigmentaire autosomale récessive. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique ce/ces composé(s) à visée thérapeutique pour des maladies héréditaires rétiniennes induisant une dégénérescence des photorécepteurs, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.
Procédures
- Injection intra-oculaire : tous les animaux de l’étude (1296) recevront une injection intra-oculaire (injection sous-rétinienne ou intravitréenne) de la thérapeutique à évaluer ; néanmoins l’injection est rapide (5 à 10 minutes) et se fera sous anesthésie générale. - Fond d’œil : suite à l’injection sous-rétinienne, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est très rapide (2 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude (1296) seront soumis à cet examen. - Tomographie à cohérence optique (OCT) : l’OCT permet de visualiser la structure anatomique de la rétine. L’acquisition d’images dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris. - Electrorétinogramme (ERG) : l’ERG permet d’évaluer la fonction de la rétine en conditions photopique et scotopique. L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront sacrifiés par inhalation de CO2 et dislocation cervicale afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs AAV et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés (12 souris/groupe x 108 groupes = 1296 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.
Raffinement
- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent, notamment pour les procédures courtes comme les injections sous-rétiniennes, les injections intravitréennes, les fonds d’œil et les OCT. Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intra-oculaires et les ERG. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéales/sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’ERG), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux commerciaux observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.
Choix des espèces
Le modèle murin transgénique utilisé dans ce projet reproduit la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, la mutation induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Ces souris présentent une dégénération sévère des photorécepteurs dès l’âge de 3 semaines et une quasi absence totale de photorécepteurs vers 2 mois. Le but de cette étude étant de tester l’effet neuroprotecteur de nouveaux composés thérapeutiques au cours de la dégénérescence rétinienne, l’intervention thérapeutique interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 7 jours, 14 jours ou un mois.
Evaluation d’une approche par traitement de thérapie génique utilisant un vecteur recombinant adéno-associé (rAAV) pour la polykystose rénale.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
506 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer une polykystose rénale, elles reçoivent un vecteur de thérapie génique par injection oculaire, intrapéritonéale puis directement dans le rein, avec prélèvements sanguins mensuels et IRM sous anesthésie, avant une mise à mort à vingt semaines pour prélever les organes. Le porteur indique qu'en cas de succès la recherche se poursuivra sur un "modèle félin", soit des chats. Il affirme l'usage de la souris "indispensable" pour évaluer l'effet à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
La polykystose rénale autosomique dominante représente l’une des principales causes de l’insuffisance rénale d’origine génétique et touche plus d’une naissance sur 400 -1000 et approximativement 13 millions de personnes dans le monde entier. La polykystose rénale est caractérisée par le développement bilatéral de kystes rénaux qui augmentent progressivement la masse de l'organe et conduit à la perte de la fonction rénale. L'insuffisance rénale chronique est la complication sévère la plus fréquente. Notre projet porte sur le développement d'une approche par thérapie génique pour traiter cette maladie. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. En particulier, le sérotype AAV9 est décrit dans la littérature pour le ciblage des reins et du foie entre autre. Pour cela, notre choix s'est porté sur l'utilisation d'AAV9 pour le traitement de la polykystose rénale. Des études ont mis en évidence l'importance de l'adénosine monophosphate cyclique dans la croissance des kystes rénaux. La protéine kinase A est le majeur effecteur de dans la croissance des kystes rénaux. Notre stratégie est d'évaluer l'effet d'un vecteur portant le gène modifié de la protéine kinase A au stade précoce de la formation des kystes. Nous utiliserons les vecteurs AAV pour introduire le gène humain modifié de la protéine kinase A dans un modèle murin de polykystose rénale dans le but de bloquer partiellement la voie de la protéine kinase A.
Bénéfices attendus
Notre but est de développer une étude preuve de concept de thérapie génique pour la polykystose rénale. Notre but est de d’examiner l’effet du vecteur thérapeutique sur le nombre, la taille, et le développement des kystes. Si notre approche thérapeutique est efficace nous poursuivrons notre recherche sur de plus gros animaux (modèle félin)
Procédures
Injection du vecteur : - 1 fois par animal à J10 post-natal pour l'injection rétro-orbitale ou intrapéritonéale (durée 3 min), - et à l'âge de 4-6 semaines pour l'injection rénale (durée 45 min) . - Prélèvement sanguin: 1 fois par mois à partir du sevrage sous anesthésie. - Imagerie par résonance magnétique : 1 fois par animal, sous anesthésie, durée : 1 heure
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au site d’injection. Il existe également un léger risque d'hémorragie ou d'infection du site chirurgical, mais si l'un ou l'autre de ces phénomènes se produit, les animaux seront immédiatement euthanasiés et ne devraient donc pas ressentir ces effets pendant une longue période. L'anesthésie peut provoquer une légère gêne mais aucun autre effet indésirable n'est attendu.Les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au site d’injection. Il existe également un léger risque d'hémorragie ou d'infection du site chirurgical, mais si l'un ou l'autre de ces phénomènes se produit, les animaux seront immédiatement euthanasiés et ne devraient donc pas ressentir ces effets pendant une longue période. L'anesthésie peut provoquer une légère gêne mais aucun autre effet indésirable n'est attendu. Chez le patient la présence de kystes reste longtemps indolore et imperceptible jusqu’à ce que le volume kystique devienne important et qu’il entraine une pesanteur et une douleur diffuse dans le flanc, le dos ou l’abdomen. Notre stratégie est d’évaluer notre thérapie au stade précoce cde la formation des kystes, lorsqu’ils ne présentent pas d’inconfort pour la souris.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques.
Remplacement
La complexité du rein et de la polykystose rénale rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais, les constructions génétiques utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. L'utilisation d'un modèle murin est indispensable afin d’évaluer l’efficacité des vecteurs pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Des calculs statistiques ont été effectués sur la base des résultats d'études similaires dans ce domaine. Dans la mesure du possible, les organes obtenus des souris seront conservés et stockés pour des tests ultérieurs, ce qui permettra de maximiser les données obtenues de chaque animal. Le nombre de souris nécessaires à cette étude est réduit en enregistrant autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris, sans compromettre le bien-être des animaux.
Raffinement
Pour l'administration des vecteurs thérapeutiques, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure et validés par le vétérinaire. Les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie par isoflurane. Notre stratégie est d'évaluer l'efficacité d'un vecteur thérapeutiqque sur la formation des kystes rénaux au stade précode de la formation des kystes, lorsqu'ils ne présentent pas encore d'inconfort pour la souris. Néanmoins un suivi de la fonction rénale sera mis en place chez les souris susceptibles de développer la maladie. Les prélèvements bi-mensuels d'urine permettront de suivre l'évolution de la concentration de l'AMPc, la créatinine et les taux urinaires d'azote uréique. Une observation quotidiennne des animaux, des pesées hebdomadaires et l'application de critères d'arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique son bien connues. L’utilisation est justifiée par l’existence d’un modèle de souris transgéniques portant une délétion du gène Pkd1 et reproduisant des aspects cliniques de la polykystose rénale. L’apparition des premiers kystes rénaux est détectée entre 8 à 10 semaines d’âge. A l'âge de 20 semaines, 100% des souris malades non traitées seront porteuses de kystes rénaux. Nous euthanasierons les souris d'intérêt et leurs contrôles à l'âge de 20 semaines. Cela va permettre de mesurer l'effet thérapeutique du vecteur, et sa stabilité dans le temps.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs doses de vecteurs AAV, avec un nouveau procédé de manufacturing, dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles développent de quatre à douze mois une perte de poids et des défauts moteurs et cognitifs, après une injection stéréotaxique dans le cerveau (striatum) sous anesthésie de 70 minutes. À douze mois, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien puis de sang précède la mise à mort et les analyses post-mortem. Le porteur teste des doses d'un vecteur de thérapie génique en vue d'un futur essai clinique et affirme que le recours aux modèles animaux est "essentiel", faute de culture cellulaire reproduisant l'architecture du cerveau.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Le but principal est de tester l’efficacité du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, dans le cadre du futur essai clinique.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un virus adéno-associés (AAV) exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin plus progressif pour la MH, en injectant un lot qui sera utilisé pour les recherches préclinique et clinique car à même d’être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Ce modèle reproduit assez fidèlement l’évolution de la maladie par rapport à ce qui se passe chez l’homme.
Procédures
A partir de 4 mois d’age, les animaux développeront un phénotype dommageable jusqu’à 12 mois soit 10 mois. Ces souris reproduisent de maniere très progressive et fidèle, les atteintes pathologiques de la maladie d’Huntington, c’est-à-dire un perte de poids, des défauts moteurs et cognitifs. Les animaux seront soumis à 2 mois d’age à une injection stéréotaxique sous anésthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'adminstration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux seront soumis a tests comportementaux des 5 mois d’age. A 12 mois d’age, un prélèvement de liquide cephalo-rachdien suivi de sang sera effectue avant euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mecanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal.
Devenir
Lors de l’élevage de la lignée dommageable, les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et 3 semaines à 6 mois après les injections (délivrance du gene thérapeutique) suivi de l’analyse comportemtal jusqu’à l’euthanasie. Des prélèvements et analyses sont nécessaires en post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle de souris pour la maladie de Huntingtonles souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (198) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique , et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6 h après l’acte chirurgical une injection d’analgesique est realisee pour éviter tout inconfrot de l’anima. 24 h après une deuxième injection d’analgesique est realisee. 4h/5h après cette injection les anaimaux seront observes par l’experimentateur et il sera verifie qu’aucun signe de douleur est detecte. Si besoin, une injection d’analgesique est realisee pour evoter tout inconfort e l’animal. Le protocole d’analgesie post-operatoire a été decide avec l’accord veterinaire clinicien.
Choix des espèces
L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider son expression , qui a été produit avec un nouveau procédé de fabrication/qualité, dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle murin de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris agée de 4 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.
Elevage en insectarium de lignées de moustiques tropicaux et européens, transmetteurs potentiels de virus.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées jusqu'à une fois par semaine pendant quarante minutes, elles sont posées par deux sur des cages de moustiques pour servir de repas sanguin vivant destiné à maintenir six populations de moustiques en élevage. Le porteur décrit une réaction immunitaire à la salive des insectes et une anémie liée aux piqûres, surveillées par une pesée hebdomadaire. Il qualifie l'usage des souris de "gold standard" et affirme que les poches de sang ne produisent pas d'œufs en quantité et qualité acceptables.
Objectifs
Afin de pouvoir étudier la capacité de transmission de virus par différentes populations de moustiques, nous devons pouvoir maintenir en élevage ces insectes sur plusieurs générations. L’obtention d’œufs de moustiques et le développement ultérieur de ces œufs en larves, puis en nymphes et ensuite en adultes repose sur le prélèvement régulier de sang de mammifères par les moustiques femelles adultes (hématophages). La prise d’un repas sanguin leur est indispensable pour pouvoir pondre leurs œufs. Un moustique femelle prélève environ de deux à quatre microlitres de sang. Après un délai de 48 à 72 h, la femelle pond une cinquantaine d’œufs. Ces œufs peuvent ou ne peuvent pas, selon les espèces, être conservés un certain temps à sec avant d’être mis à éclore pour générer de nouveaux adultes.
Bénéfices attendus
Tous les projets de recherche de notre unité ont pour base l’étude de la capacité de certaines populations de moustiques à s’infecter, ou non, et transmettre des virus pathogènes pour l’homme ou des animaux. La compréhension de ces systèmes permet d’évaluer et d’anticiper la survenue d’épidémie. Notre époque, avec les dérèglements climatiques, la pollution, les déforestations, l’utilisations de pesticides et d’insecticides, entrainent des modifications qui impactent fortement les insectes et augmentent les risques d’émergence de virus. L’utilisation des souris comme source de sang pour les moustiques est un « gold standard » pour produire suffisamment d’œufs qui seront destinés aux études des systèmes vectoriels. En effet, chaque combinaison moustique-virus varie selon l’origine géographique de la population de moustiques et du génotype/sérotype de virus. La connaissance de l’efficacité de chaque combinaison est importante pour mesurer le risque épidémique. Même si une espèce de moustique a une distribution très large englobant la ceinture tropicale et parfois tempérée, chaque population géographique peut présenter une réceptivité différente vis à vis d’un même virus. De façon similaire, un virus existe sous forme de différents sérotypes et génotypes et tous ne présentent pas la même efficacité à infecter une même espèce de moustique. Donc la combinaison moustique-virus est unique. En général, les moustiques à l’origine des épidémies sont minoritaires (moins de 15% des 3500 espèces de moustiques) mais sont omniprésents dans l’environnement urbain. Ces moustiques sont des espèces invasives fortement adaptés à l’homme et qui voyagent avec l’homme et les marchandises. Ils ont la propriété de pouvoir se reproduire en cage et se nourrir en captivité sur animaux dont les souris. Ces caractéristiques ont permis des avancées majeures dans la connaissance des maladies vectorielles affectant la santé de l’homme (dengue, chikungunya, fièvre jaune et Zika) et de ce fait, il a été possible d’élaborer des stratégies de contrôle efficace.
Procédures
Les souris seront anesthésiées au maximum une fois/semaine pendant 40 min par injection d’un mélange de Xylazine + Ketamine, puis seront placés sur des cages de moustiques d’élevage pendant 30 min. Une injection de solution de chlorure de sodium 0,9% sera pratiquée après chaque anesthésie.
Impact sur les animaux
Les souris sont anesthésiées avant d’être positionnées sur les cages d’insectes dans l’insectarium à 25 ou 28°C, selon l’espèce. La piqure par les femelles de moustiques engendre une légère réaction immunitaire due au contact de la salive injectée par l’insecte au moment de la prise de sang. Il n’y a pas de démangeaison cutanée constatée. A son réveil, les souris ne se grattent pas et ont un comportement normal. L’anémie due au prélèvement du sang (2 à 4 µL / moustique) est prise en compte en limitant le temps de contact et donc le nombre de piqure. Une pesée hebdomadaire des animaux, au moment du change, permet de détecter une éventuelle perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les moustiques femelles étant hématophages, il est impossible de les maintenir en élevage sans avoir recours à du sang. Le sang apporte les substances nutritives indispensables à la fabrication des œufs. Dans la nature, les sources de sang sont des vertébrés (oiseaux, mammifères ou humains) avec lesquels les moustiques cohabitent. Au sein du laboratoire, les sources de sang les plus biologiquement pertinentes sont les souris ou les lapins de laboratoire. Dans le présent projet visant à maintenir des populations de moustiques sains en élevage, les souris de laboratoire ont été identifiées comme des sources régulières de sang. Le recours à l’animal est nécessaire car l’utilisation d’autres sources de sang (poche de sang, globules rouges lyophilisés) ne permet pas la production d’œufs de qualité et en quantité acceptables pour les infections réalisées ultérieurement.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulement du projet tient compte : - des six espèces de moustiques de différentes origines à maintenir en élevage ; - des nuisances occasionnées par les piqures des moustiques femelles (anémie, réaction immunitaire à la salive) et par des anesthésies répétées. Dix cages de six souris femelles IOPS maintenues et renouvelées quatre fois/an est selon notre expérience la quantité minimale d’animaux pour un préjudice moindre. Il faut toujours mettre deux souris anesthésiées sur une cage pour laisser le « choix » de l’animal aux femelles (préférences d’attractivité) et diminuer le nombre de piqure par animal. Il y a en moyenne toujours 6 à 8 populations de moustiques en élevage. Un lot de six souris ne sera anesthésié qu’une fois par semaine. La présence de six lots permet un temps de récupération indispensable au bien-être des animaux.
Raffinement
Les souris sont déposées sur les cages une fois anesthésiées, toujours par deux, quel que soit la taille de la cage et le nombre de moustiques femelles, pendant un temps de contact variable, allant de cinq minutes à quinze minutes. Le temps de contact est décidé en fonction du nombre d’insectes par cage, de leur âge et de leur espèce (comportement de piqûre différent). Nos connaissances en entomologie nous permettent d’apprécier ces différents paramètres. Un même binôme de souris peut être déposé successivement sur deux cages au plus, soit trente minutes d’exposition maximum. La pommade Ocry-gel, un produit de soin oculaire destiné à la lubrification des yeux des animaux sera appliquée aux yeux des souris anesthésiées. Un volume de 0,15 mL d’une solution de chlorure de sodium à 0,9% sera injecté en sous cutané pour prévenir la baisse volumique. Ensuite, les souris sont placées dans une cage posée sur un tapis chauffant, avant leur réveil pour compenser la baisse de température de l’animal due à l’anesthésie. Les souris réveillées sont ensuite remises dans leurs cages. Il n’a jamais été observé de démangeaison chez les rongeurs mais l’application d’une crème apaisante type Quotane 0,5% sur les régions exposées sera faite si nécessaire,. Les animaux (marquage par traits sur la queue) seront pesés chaque semaine, au moment de leur change, afin de détecter une éventuelle perte de poids signe de mauvaise santé. Les cages d’hébergement sont pourvues d’enrichissement, avec eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Le choix des souris est justifié par leur facilité d’approvisionnement, leur qualité sanitaire, l’absence de démangeaison (aucune observation de grattage des parties exposées) après piqûre par les moustiques, leur petite taille qui rend possible : - leur stabulation en nombre suffisant ; - leur mise en contact des insectes sur les cages. Les femelles sont âgées de 4 à 5 semaines et ont un poids de 20/22g à leur arrivée. Après la période d’acclimatation elles atteignent 30g, poids à partir duquel on peut les anesthésier et les présenter aux moustiques.
Etude des effets de la caféine sur le connectome cérébral dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris génétiquement modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont exposées à la caféine in utero ou à l'âge adulte, puis suivies pendant douze mois par IRM sous anesthésie, tests comportementaux (labyrinthe surélevé, reconnaissance d'objets), frottis vaginaux et prélèvements sanguins, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme des atteintes possibles comme des blessures entre mâles après rasage du flanc et une défaillance cardio-respiratoire sous anesthésie. Il affirme le recours à l'animal "incontournable" et sans "alternative", et renvoie l'application chez l'humain au long terme.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer, plus fréquente cause de démence est responsable d’une morbidité et mortalité importante avec un impact économique majeur sur le système de santé. Les patients ayant la maladie présentent une altération du connectome cérébral qui est la cartographie de l’ensemble des connexions existant entre les différentes aires du cerveau, et généralement établie à partir de méthodes d’IRM. A ce jour, il n’existe pas de traitement préventif. De récents travaux chez la souris suggèrent qu’une exposition anténatale à la caféine constituerait un facteur de risque dans l’apparition précoce des déficits cognitifs. En revanche, administrée quotidiennement à de faibles doses à l’âge adulte, la caféine pourrait retarder ou réduire le risque d’apparition des déficits cognitifs. Notre objectif est d’étudier les effets de la caféine sur la connectivité cérébrale dans la maladie d’Alzheimer et de vérifier si les éventuels changements de connectivité sont corrélés aux performances cognitives. Afin de comprendre l’impact de la caféine sur le cerveau dans la maladie d’Alzheimer, nous caractériserons pendant 12 mois l’évolution des connectomes structural et fonctionnel chez des souris mâles et femelles génétiquement modiées de type Alzheimer. Les souris seront exposées à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte (dès 3 mois). Elles seront suivies par IRM fonctionnelle à l’état de repos et imagerie du tenseur de diffusion sous anesthésie générale légère et sédation. Nous comparerons les connectomes de ces souris à ceux de souris contrôles grâce à une approche classique de traitement des données d’IRM fonctionnelle de repos. Des études comportementales précéderont les explorations IRM. Elles permettront d’établir d’éventuelles corrélations entre modifications du connectome et performance cognitive sous les effets de la maladie et de la caféine. Une approche personnalisée se fera grâce à la plateforme neuroinformatique « The Virtual Mouse Brain ». Le connectome fonctionnel de chaque souris sera prédit à partir du connectome structural acquis en imagerie du tenseur de diffusion et comparé au connectome fonctionnel obtenu expérimentalement par IRM fonctionnelle de repos. Cela permettra, si les prédictions sont avérées, de prédire l’évolution de la maladie d’Alzheimer et l’efficacité des thérapies. L’approche par virtualisation permettra d’optimiser la plateforme sur le modèle étudié et de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans des études futures.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur un modèle animal d’Alzheimer. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie (IRM) transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. Ce travail investigue l’effet de la caféine sur la connectivité cérébrale et fournira des informations détaillées sur le développement de la pathologie dans le modèle expérimental étudié et éventuellement sa régression avec le traitement à la caféine. Nous nous attendons à identifier des biomarqueurs prédictifs de la détérioration, régression ou amélioration de la maladie d’Alzheimer. L’approche par virtualisation du cerveau de chaque souris grâce à la plateforme neuroinformatique nous permettra d’effectuer des prédictions du connectome fonctionnel pour chaque temps donné, ce qui sera vérifié expérimentalement au travers des acquisitions d'IRM fonctionnelle à l'état de repos qui seront effectuées et de l’évaluation cognitive de chaque animal. Ceci pourra à long terme être utilisé chez l’homme étant donné que la plateforme a été initialement développée chez l’homme. On pourra alors prédire en fonction du stade de prise en charge de la maladie d’Alzheimer, son évolution ainsi que l’impact des thérapies mises en œuvre.
Procédures
Exposition à la caféine des reproducteurs, des embryons, des fœtus via le cordon ombilical et des petits de la portée via le lait maternel : les parents reproducteurs seront exposés à la caféine par l’eau de boisson deux semaines avant l’accouplement. Les reproductrices seront exposées à la caféine durant toute la gestation et par conséquent, les embryons et les fœtus in utero. Après la mise-bas, les petits seront exposés jusqu’au 15ème jour postnatal par la prise du lait maternel. Exposition à la caféine à l’âge adulte : Un groupe de souris sera exposé à la caféine par l’eau de boisson après 3 mois de vie et de manière chronique jusqu’à 12 mois. Tests comportementaux : Le comportement sera étudié sur des animaux contrôles, exposés à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte. Chaque animal sera soumis à 2 tests différents avec des intervalles de récupération entre les tests. Le test du labyrinthe en croix surélevé dure en moyenne 5 min. Le test de substitution et de reconnaissance d’objets dure 35 minutes en moyenne par animal. Chaque test sera réalisé 4 fois sur un même animal (3, 6, 9 et 12 mois). Prélèvement vaginal : Le frottis vaginal sera réalisé sur des souris vigiles. Chaque femelle de l’étude aura 4 frottis au total sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). Les cellules seront prélevées en quelques secondes par lavage vaginal dans l’eau stérile contenue dans une fine pipette. Prélèvement sanguin : Il sera réalisé en quelques secondes sur des souris anesthésiées en vue de l’IRM. Chaque souris de l’étude aura 4 prélèvements sanguins au total au niveau de la veine saphène latérale ou de la veine submandibulaire sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). IRM : Les animaux seront explorés sous anesthésie générale légère et sédation. La durée de l’examen sera d’environ 1h30. Les animaux contrôles et les animaux exposés à la caféine in utero ou à l’âge adulte (dès 3mois) subiront 4 examens au total sur une période de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois).
Impact sur les animaux
Les souris traitées à la caféine peuvent présenter une baisse de la consommation de l’eau de boisson les deux premiers jours d’exposition. Les souris exposées à la caféine in utero par le biais de leurs mères peuvent avoir un poids plus faible à la naissance que les contrôles. Cependant, à l’âge adulte, leur poids n’est plus différent de celui des souris naïves. L’exposition in utero à la caféine a un effet délétère sur le cerveau. Les animaux seront soumis à 2 tests comportementaux différents et pourraient être plus anxieux lors du second test réalisé le lendemain du premier. L’effet indésirable lors des frottis vaginaux est de provoquer une stimulation induisant une pseudo-gestation. Bien que ce risque soit mineur chez les souris à l’inverse des rates, nous avons envisagé les dispositions permettant de minimiser cette éventualité (utilisation d’une micropipette et espacement des prélèvements de 3 mois). Les animaux seront aussi examinés par IRM tous les 3 mois (m3 à m12). A chaque IRM, ils seront rasés au niveau du flanc droit sur les faces dorsale et ventrale afin de faciliter le monitoring de la saturation en oxygène pendant l’examen. Ce geste est indispensable pour avoir des valeurs fiables sur les souris de notre étude car l’oxymètre étant associé à un capteur infrarouge, son pouvoir absorbant est atténué par leur pelage noir. Cependant, du fait du dos rasé, les souris mâles peuvent se blesser plus facilement lors des luttes entre congénères. Ils seront alors surveillés et nettoyés avec de la vétédine au besoin. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Après la dernière IRM, les descendants des triades seront soumis à une perfusion intracardiaque en vue de prélèvements destinés à des analyses neuroanatomiques et immunihistochimiques. Les reproducteurs seront mis à mort à 12 mois du fait de leur âge et parce qu’ils ne seront plus réutilisés pour générer des colonies à la fin de l’étude.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de la connectivité cérébrale au cours de la vie nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative. De nombreuses études montrent que les dynamiques cérébrales globales sont analogues chez les mammifères, et le modèle de souris Alzheimer qui sera utilisé est très pertinent pour apporter de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux et mieux appréhender cette maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives en IRM permettant le suivi longitudinal d’un même animal. Nous ne disposons pas de données préliminaires sur l’effet de la caféine sur les métriques IRM dans notre modèle de souris Alzheimer. Il ne nous est donc pas possible d’utiliser de tests statistiques pour évaluer la taille des groupes. En tenant compte des aléas possibles dans la mise en œuvre du projet et sur la base de notre expérience en IRM préclinique, nous avons donc réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique.
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Un délai d'acclimatation minimum de 10 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés lors de l’arrivée des animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés en vue de l’IRM. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie légère avec sédation afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitoring physiologique continu avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les études comportementales seront effectuées sous la conduite d’un opérateur expérimenté et les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle animal de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est considéré comme pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine (lésions de type plaques amyloïdes, neuroinflammation, propagation de protéines tau et déficits cognitifs). Nous utiliserons des reproducteurs âgés de 6 à 8 semaines, exposés ou non à la caféine. Les descendants seront soit : exposés à la caféine in utero et pendant les 15 premiers jours de vie par le lait maternel ; soit non exposés pendant la gestation mais exposés de manière chronique à la caféine à l’âge adulte (de 3 à 12 mois) ; soit, jamais exposés à la caféine au cours de leur vie. Les différentes interventions se feront tous les 3 mois sur les souris adultes (à partir de 3 mois jusqu’à 12 mois). Cette étude permettra d’étudier les modifications induites par la maladie, la caféine et le vieillissement sur le connectome cérébral.