Souris
Suivi IRM d’une thérapie anti-cancéreuse utilisant des alkoxyamines (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
573 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de tumeurs implantées dans un autre établissement, elles sont suivies par IRM sous anesthésie une à deux fois par semaine avec injection répétée d'un agent de contraste, pour mesurer l'efficacité d'un anticancéreux. Le porteur précise que les nuisances viennent surtout de l'anesthésie répétée et que les souris sont gardées vivantes jusqu'à la fin du suivi avant d'être tuées dans l'établissement d'origine. Il qualifie l'usage d'animaux vivants d'"indispensable", le système immunitaire étant requis pour l'action du traitement.
Objectifs
L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d’imagerie extrêmement avantageuse car elle permet d’obtenir des images avec de forts contrastes entre les organes, sans application d’ondes ionisantes, donc de pleine innocuité. Elle est la méthode de référence pour la détection de tumeurs. Elle permet de suivre l’efficacité de traitements anti-cancéreux. A la lumière d' éléments récents sur la libération prononcée d'enzymes, il est apparu pertinent de les cibler dans le cadre d'un traitement contre le cancer. Pour cela, nous allons développer des substrats clivables par les enzymes tumorales pour tuer plus spécifiquement les cellules cancéreuses qu’une drogue de chimiothérapie classique. Ainsi l'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité thérapeutique des alkoxyamines par IRM.
Bénéfices attendus
L'IRM permet d'imager les souris à différents temps au cours du traitement tout en limitant le nombre d'animaux. Ainsi, l'efficacité potentielle des alkoxyamines pourra être détectée au plus tôt.
Procédures
L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 1h. Les 573 animaux seront injectés 1 à 2 fois par semaine avec un agent de contraste IRM, le temps du suivi des tumeurs et métastases.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles proviennent de la chute de température, de la déshydratation, de la sécheresse oculaire et d’un potentiel arrêt respiratoire lors de l’anesthésie générale, ainsi que de l’injection de l’agent de contraste IRM.
Devenir
Les animaux sont inclus dans une autre DAP dans un autre établissement pour la 1e partie de ce projet. Dans la 2e partie du projet détaillée ici, nous souhaitons déterminer si le nouvel agent anti-cancéreux permet de réduire la croissance tumorale ou empécher la formation de métastases. Ainsi un suivi longitudinal est nécessaire. Ils seront ici uniquement imagés par IRM et donc gardés en vie jusqu'à la fin de l'étude pour être euthanasiés dans l’autre EU.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique des alkoxyamines sur des tumeurs, dont le micro-environnement inclut des neutrophiles qui libèrent l'élastase (substrat des alkoxyamines). Ainsi, le système immunitaire est particulièrement nécessaire pour leur efficacité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées (et seront réalisées) en amont, pour étudier l'effet des alkoxyamines sur chacune des cellules cancéreuses en culture. L'imagerie par IRM permet d'imager l'animal plusieurs fois pour évaluer un traitement sans avoir recours à des euthanasies à différents temps au cours du traitement pour réaliser de l'histologie. Ceci permet aussi de limiter le nombre d'animaux.
Raffinement
L'utilisation d'anesthésies gazeuses par isoflurane, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les procédures permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Une réhydratation sera pratiquée via une injection sous-cutanée de glucose 5% à chaque fin de session IRM. Pendant les sessions IRM, une sonde rectale sera utilisée pour réguler la température interne des animaux, grâce à une circulation d’eau chaude. L’agent de contraste injecté est fréquemment utilisé en clinique, et sera injecté dans les animaux à une dose 5 fois inférieure à celle humaine.
Choix des espèces
Nos IRM sont equipées d'antennes adaptées pour l'imagerie du rat et de la souris. L'utilisation de la souris nous permet de développer de nombreux modèles tumoraux. Les animaux seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 10 semaines) car nous souhaitons mimer le développement d'un cancer chez l'homme adulte.
Optimisation du modèle expérimental murin syngénique sur souris A/J (mus musculus) pour l’utilisation d’anticorps à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers pédiatriques.
- Recherche appliquée
- Cancers
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de neuroblastome qui provoque des métastases au foie, puis des injections d'anticorps et des prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle destiné à tester de futurs traitements de cancers pédiatriques. Le porteur indique que les animaux non traités développent des effets liés à la croissance des tumeurs, et que toutes les souris sont tuées pour prélever le foie. Il présente ce modèle comme "indispensable et non substituable", un test in vitro existant ne reproduisant pas le système immunitaire entier.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle animal permettant de tester dans l’avenir des anticorps thérapeutique anti- O-Acétyl GD2. Cette possibilité de combiner les anticorps ou d’utiliser des anticorps bispécifiques (qui seront utilisés suite à cette optimisation de modèle) ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Dans ce modèle, les animaux reçoivent une greffe d’une lignée de neuroblastome murin par voie intraveineuse ce qui conduit à obtenir des métastases hépatiques (tumeur) et sont ensuite traités avec les anticorps thérapeutiques. Ainsi dans ce projet, nous testerons différentes voies et le nombre d’administrations de nos anticorps permettant ainsi de limiter le stress des animaux et par conséquent de diminuer les variations expérimentales induites, tout en conservant l’efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme de ce projet est d’améliorer le modèle sur lequel nous avons démontré l’efficacité de nos anticorps, de façon à limiter le stress des animaux pour une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison des traitements pour nos futurs projets. Sur le long terme, nous utiliserons ce modèle (via d’autres demandes d’autorisation de projet) pour tester de nouveaux traitements et démontrer leur efficacité. Ces nouvelles biothérapies (anticorps bispécifiques ou combinaison d’anticorps) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.
Procédures
Pesée des animaux (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection des traitements (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, soit 21 minutes au total). Prélévement de sang (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacune, soit 8 minutes au total).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse et intrapéritonéale). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités avec des anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des foies pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps.
Remplacement
Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cible à la cellule effectrice. Nous avons réalisé ces tests sur l’anticorps notifié dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cependant, ce test est loin de remplacer le système immunitaire dans son ensemble. Les immunothérapies impliquent le système immunitaire de l’hôte. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.
Réduction
Dans ce projet, nos effectifs sont determinés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de crème anesthesiante sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps
Impact d’une exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides sur l’apparition de la maladie de Parkinson et du diabète de type 2 en modèles murins, et étude des liens entre ces deux pathologies
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.
Objectifs
Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.
Procédures
Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.
Impact sur les animaux
L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.
Remplacement
L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.
Réduction
Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.
Raffinement
Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.
Analyse de la réponse immunitaire innée mise en place lors d’infections respiratoires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou le pneumocoque par voie nasale sous sédation, à des doses conçues pour reproduire une infection sévère qui, non contrôlée, entraîne la mort des animaux en quelques jours. Le porteur indique que les souris perdant 25 % de leur poids ou devenues léthargiques sont tuées, et que toutes sont euthanasiées pour prélever poumons et rate. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la réponse immunitaire d'un "organisme entier".
Objectifs
Les pathologies respiratoires ont un impact médical et socio-économique très important. L’organisation mondiale de la santé classe ainsi les pneumonies et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) parmi les dix principales causes de décès au niveau mondial. En particulier, les infections respiratoires représentent plus de 2 millions de décès par an. Ces chiffres soulignent la limite des traitements anti-infectieux actuels, comme l’absence de traitement efficace sur la plupart des virus respiratoires ainsi que la résistance aux antibiotiques des bactéries qui atteint désormais des proportions dangereuses dans toutes les régions du monde. Par exemple, l’efficacité du vaccin contre le virus influenza a été démontrée depuis de nombreuses années mais les perpétuelles mutations de ce virus obligent une nouvelle vaccination chaque année. Ainsi, le virus de la grippe provoque toujours des épidémies saisonnières avec une forte morbidité et plus occasionnellement des pandémies de grande envergure. Un autre exemple est la recrudescence de pneumonies dues à la bactérie Streptococcus pneumoniae. L’immunité innée joue un rôle clé dans la réponse de l’hôte contre le pneumocoque permettant le confinement de l’infection et la destruction de la bactérie. Néanmoins, dans certains cas, le système immunitaire peut être dépassé aboutissant à une pneumonie, une méningite et/ou une septicémie. Bien que des traitements aient été développés (vaccins polysaccharidiques multivalents, antibiotiques), les pneumonies à pneumocoques restent à très forts risques de mortalité. Ainsi, les infections respiratoires ne sont actuellement en aucun cas sous contrôle. Ces données soulignent donc le besoin urgent de développer une recherche innovante visant à mieux comprendre la physiopathologie des pathologies respiratoires. Les progrès dans les années à venir devront venir de la découverte de nouvelles cibles et/ou de molécules anti-infectieuses mais également par une régulation des réponses immunitaires de l’hôte. Cette dernière approche présentant l’avantage de ne pas cibler directement l’agent infectieux et donc de s’affranchir des problèmes de variabilité des pathogènes décrits ci-dessus. L’objectif des projets de recherche que nous développons est ainsi de caractériser le rôle et les mécanismes d’activation des cellules du système immunitaire inné au cours des infections pulmonaires afin de permettre le développement de molécules immunomodulatrices ciblant ces cellules.
Bénéfices attendus
Comme décrit précédemment, d’autant plus souligné par la récente pandémie lié au pathogène respiratoire SARS-COV2, les pathologies respiratoires infectieuses sont une préoccupation majeure mondiale. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc essentielles pour améliorer le pronostic vital des personnes infectées. Une des pistes est de pouvoir optimiser notre système de défense, mais cela nécessite une meilleure connaissance de ce dernier. Dans ce contexte, notre objectif vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections respiratoires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire suite à des infections d’origine virale et microbienne. Plus particulièrement, nous travaillons sur des populations de cellules découvertes récemment et résidentes dans le poumon. Cette localisation leur permet de s’activer très rapidement lors de l’arrivée d’un pathogène dans le tissu pulmonaire. Une meilleure connaissance de ces cellules pourrait permettre de 1) comprendre des différences de susceptibilité de certains patients aux infections respiratoires, 2) identifier des biomarqueurs cellulaires ou moléculaires de susceptibilité et 3) identifier des cibles thérapeutiques afin de moduler la réponse immunitaire de l’hôte et non pas en ciblant le pathogène.
Procédures
Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Afin de reproduire les infections par des pathogènes respiratoires, les souris seront infectées par des suspensions contenant soit le virus de la grippe soit la bactérie pneumocoque. Pour cela, les souris seront sédatées par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine puis quelques gouttes (40µL) de la suspension contenant l’agent pathogène ou de la solution contrôle seront déposées sur les narines des animaux afin qu’ils les respirent. Cette intervention dure quelques secondes puis les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil (15-20 min). Ainsi les pathogènes se déposent dans les voies aériennes supérieures et peuvent infecter les cellules pulmonaires, à l’image d’une infection chez l’homme lorsque les microbes sont transmis dans des gouttelettes projetées lors d’un éternuement ou d’une toux. Deux différentes doses seront testées : une dose modérée mimant une infection modérée et une dose forte permettant de reproduire une infection sévère. Sur les animaux de la procédure 1, trois prélèvements sanguins seront réalisés en submandibulaire (1 avant l’infection et 2 à différents temps après l’infection) afin de suivre certains paramètres inflammatoires systémiques. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés chaque jour. La réponse immunitaire pulmonaire sera analysée à différents temps : deux temps (précoce et tardif) lors des infections par le virus de la grippe et par le pneumocoque. Pour cela, les animaux seront euthanasiés par une injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (doléthal). Après la mort de l’animal, différents fluides biologiques (sang et lavage broncho-alvéolaire) et organes (poumons et rate) seront collectés pour analyser les réponses immunitaires mises en place.
Impact sur les animaux
Dans les cas les plus graves, la mort d’un patient suite à une infection respiratoire est la conséquence soit d’un défaut de contrôle du pathogène, soit d’une inflammation massive des voies respiratoires induite par le pathogène, provoquant un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Notre modèle d’infection par le pneumocoque chez la souris est représentatif de la 1ere catégorie. En effet, il provoque une infection très aiguë et rapide qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit à la mort des animaux en quelques jours. A l’inverse, le modèle d’infection grippale reproduit très bien la seconde catégorie où les mécanismes inflammatoires sont dérégulés et aboutissent à la mort des animaux à des temps plus tardifs. Ces infections entrainent donc des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. Afin de mimer une infection pulmonaire par voie aérienne, les souris seront infectées par voie intranasale. Cette procédure nécessite une anesthésie générale qui peut provoquer une nuisance à l’animal (refroidissement, stress). Cette instillation pulmonaire des pathogènes entraine également l’arrivée de liquides dans les poumons. Cette procédure provoque un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. Par ailleurs, chaque injection intrapéritonéale pour réaliser les anesthésies provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. En effet, concernant la procédure 1, l’ensemble des animaux auront été euthanasiés lors de la procédure afin de collecter la rate et les poumons pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure. Concernant la procédure 2, les animaux qui survivront à l’infection seront conservés jusqu’à ce qu’ils aient récupérés entièrement leur poids. Les animaux seront alors euthanasiés car ils ne peuvent être ni replacés ni adoptés car ce sont des animaux transgéniques infectés en confinement A2. De plus, la réutilisation de ces animaux n’est pas possible car la procédure subie pourrait drastiquement modifier les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer la complexité des réponses immunitaires à l’échelle d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe et par le pneumocoque est bien établi et maîtrisé par les expérimentateurs. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par des infections respiratoires et hospitalisés dans des services de pneumologie (pathologie modérée) et dans des services de réanimation (pathologie sévère). Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.
Réduction
Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo chez l’Homme, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant un test statistique pour échantillons indépendants. Nous estimons à 15 % minimum la différence de nos moyennes et nous souhaitons une puissance de test de 90% minimum. Pour chaque condition, 16 souris infectées (8 mâles et 8 femelles) et 16 souris non infectées (8 mâles et 8 femelles) seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et pour détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée quotidienne des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi les points limites suivants: - Perte de 25% de leur poids initial -Etat général indiquant une douleur (animal léthargique, ne répondant plus aux stimuli externes, prostré, fermeture totale ou partielle des yeux). Les souris présentant un de ces critères seront euthanasiées.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris (Mus musculus), car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Les résultats obtenus ex vivo sur les cellules humaines pourront être mieux extrapolés aux expérimentations in vivo. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse de la réponse pulmonaire anti-infectieuse. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques chez la souris : focus sur les cellules club
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures de gravité sévère et 576 de gravité modérée. Elles reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie et des injections de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, pour mesurer leur rôle dans la fibrose radique. Le porteur indique n'avoir aucun recul au-delà d'un mois sur cette association et que les lésions pourraient provoquer des difficultés respiratoires, les prélèvements étant réalisés post-mortem à un et six mois. Il reconnaît que des organoïdes pulmonaires pourraient remplacer en partie les animaux mais que le laboratoire n'est "pas armé" pour les mettre en place.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral et la qualité de vie des patients, avec une espérance de vie de plus en plus longue c. La radiothérapie est très efficace mais génère des séquelles pouvant compromettre sévèrement la qualité de vie. Nous étudions les effets des rayonnements ionisants sur les poumons qui sont des organes à risque pour le traitement des tumeurs thoraciques (e.g. poumon, sein). La réponse pulmonaire aux rayonnements ionisants fait l’objet de nombreuses publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages radio-induits, dont les pneumocytes de type I et II et les cellules endothéliales de la microvascularisation pulmonaire. Nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire. Ce sont des cellules situées sur l’épithélium bronchiolique et qui sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Ce sont également des cellules souches potentielles, capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. La protection épithéliale passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une protéine (dont la diminution a été associée au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique). Dans nos travaux sur l’effet de la dose, du volume et du protocole de fractionnement sur les lésions pulmonaires, nous avons remarqué que les conditions d’irradiation aboutissant à de la fibrose pulmonaire étaient systématiquement associées à une diminution sévère du nombre de cellules club dans les bronchioles. Dans les schémas ne générant pas de fibrose, les cellules club n’étaient pas déplétées. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de déplétion transitoire des cellules club afin de déterminer l’impact de ce type cellulaire sur le développement des lésions radiques pulmonaires. La déplétion des cellules club est induite par injection unique de naphtalène par voie intra-péritonéale. La déplétion par le naphtalène est transitoire. Ce modèle est très utilisé dans la bibliographie et ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Tous les animaux : Irradiation 80 Gy, sous anesthésie (durée max 40 min) Selon les procédures et lots : - Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée, jusqu’à une injection par semaine pendant 24 semaines) - Instillation nasale sous anesthésie (1 fois par semaine pendant 3 semaines) - Scanner sous anesthésie (4 minutes, max 4 fois)
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à une dose de 80 Gy ne génère pas de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Sur l’association naphtalène/80 Gy nous avons un recul d’un mois, sans effet clinique notable. Aucune donnée n’est disponible pour le point 6 mois. Si les lésions sont fortement aggravées, les animaux pourraient développer des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré. Il existe des modèles in vitro pouvant remplacer en partie l’utilisation d’animaux, à savoir les organoïdes pulmonaires. Ces modèles sont complexes à mettre en place et le laboratoire n’est pas armé à ce jour pour construire de tels modèles.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer les tests statistiques requis, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les groupes contrôles, 6 animaux sont suffisants. Pour les analyses en single cell RNA seq, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (mise en place de grilles de score, suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Rôle de TRPV3 et de l’innervation sensorielle dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
360 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées sont exposées à une chaleur croissante de 33 à 44 °C mimant une canicule et à des mesures cutanées sous anesthésie, pour étudier le rôle du récepteur TRPV3 dans les défauts de thermorégulation au cours du vieillissement. L'exposition à la chaleur est arrêtée si la température rectale monte de 4 °C, et les souris sont tuées par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie ses techniques d'indolores et annonce, "à terme", des pistes de traitement pour les personnes âgées vulnérables aux vagues de chaleur.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.
Procédures
Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).
Impact sur les animaux
Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).
Test de composés induisant la régénération des cellules beta pancréatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour tester cinq variantes d'un composé censé faire régénérer les cellules bêta du pancréas, qui produisent l'insuline, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner leurs organes. Chaque souris reçoit des injections de protéines, quotidiennes ou hebdomadaires, subit une prise de sang par semaine, puis, en fin d'expérience, un jeûne de cinq heures suivi d'une injection qui élève sa glycémie et de six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Une partie d'entre elles développe un diabète que le porteur dit "modéré", n'entraînant pas de "souffrance particulière", et le résumé ne nomme ni la lignée ni la façon dont ce diabète apparaît. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude du diabète "sur l'animal intact est essentielle et ne peut être remplacée", et revendique une "application stricte de la règle des 3R".
Objectifs
Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l'age, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations dans les niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules beta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 600 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques.
Procédures
Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines. Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.
Raffinement
Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).
Caractérisation du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate dans l’enthésopathie des souris TgA86
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce sont des souris transgéniques qui développent spontanément une arthrite touchant les quatre membres et la queue, avec gonflement articulaire, ankylose et un poids réduit d'environ 20 %, et qui reçoivent un inhibiteur dans leur eau de boisson. L'intervention décrite se limite à un prélèvement de sang à la queue sous anesthésie, les animaux étant tués pour analyse du sang et histologie des pattes. Le porteur revendique une bonne "transférabilité" de ses résultats obtenus in vitro et vise à comprendre l'ossification pathologique de l'articulation.
Objectifs
Les spondyloarthrites (SpA) touchent préférentiellement les enthèses, zones où les ligaments, les tendons et les capsules articulaires s’insèrent dans l'os via une zone cartilagineuse. Périphériques et/ou axiales, elles sont caractérisées par des enthésopathies. Elles présentent deux manifestations cliniques majeures : des enthésites et la formation d’enthésophytes périphériques et/ou syndesmophytes vertébraux, consécutive à l'ossification cicatricielle de l'enthésite et pouvant aboutir à une ankylose. Nous souhaitons valider in vivo les hypothèses émises à partir de nos résultats récemment publiés suggérant une implication du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans l’inflammation et l’ossification ectopique de l’enthèse. Le premier objectif de ce projet est de caractériser les modulations du métabolisme de la S1P dans un modèle murin d’enthésopathie, au niveau systémique et au niveau local dans l’enthèse d’une articulation atteinte. Le deuxième est d’évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur l’ossification ectopique de l’enthèse. Nous utiliserons à ces fins un modèle transgénique de souris présentant des enthésopathies de type SpA et un inhibiteur pharmacologique général de la voie S1P.
Bénéfices attendus
La zone de transition entre l'os et les tendons est susceptible de pathologie frequente nommée enthésopathie c'est à dire des rhumatismes inflammatoires chroniques (SpA). Un lipide d'interet appelé sphingosine 1 phosphate (S1P) pourrait être impliqué dans ces pathologies articulaires. Notre but est de determiner son role sur un modele de souris exprimant cette pathologie articulaire. Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des enthésopathies, l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la formation d'os dans les zones articulaires ce qui rigidifie l'articulation et la rend douloureuse à la mobilisation . La physiopathologie des rhumatismes inflammatoires chroniques est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse, en particulier. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur l’enthésopathie dans notre modèle et particulièrement sur l’ossification de la zone d'insertion ligament - os . Ce blocage pourrait à la fois favoriser la restauration de l'homéostasie osseuse et agir en tant qu'agent immunosuppresseur. A terme, nos données pourraient fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante, en particulier sur l’ankylose.
Procédures
Un prelévement de sang quelques gouttes au niveau de la queue sur animal anesthésiée et sous analgésie une fois dans le protocole.
Impact sur les animaux
• Les manifestations axiales et périphériques apparaissent dès l'âge de 3/4 semaines puis s'aggravent graduellement jusqu’à la semaine 12/16, où un plateau est atteint. Les signes cliniques d'arthrite sont développés dans les quatre membres et la queue, sans distinction de sexe. Les signes cliniques périphériques consistent en un gonflement articulaire et une déformation généralisée des membres et des doigts. L’atteinte axiale, plus sévère, est caractérisée par une queue courbée et, plus tardivement, par une ankylose. Les déviations apparaissent dès l'âge de 4 semaines et leur nombre augmente progressivement. • Les souris TgA86 présentent un poids corporel et une longueur de corps significativement réduits par rapport aux souris WT (environ -20% et -10% à 15 semaines, respectivement).
Devenir
Euthanasie pour analyse de sang et histologie
Remplacement
Notre équipe travaille sur les mécanismes d’ossification pathologique. Nous nous intéressons en particulier à l’ossification de l’enthèse arthritique dans le cadre des spondylarthrites et autres enthésopathies. Nous avons obtenu des résultats prometteurs in vitro démontrant l’implication du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans l’inflammation et l’ossification ectopique de l’enthèse. Nous avons jusqu’ici utilisé des modèles murins de culture organotypique et cellulaire, ce qui laisse supposer une bonne transférabilité de nos résultats in vivo chez la souris. Nous avons montré que la voie métabolique de la S1P est cruciale dans le processus de minéralisation cellulaire en utilisant différents inhibiteurs pharmacologiques : PF-543, K-145, SKi, W146, BML-241, VPC 23019 et finalement FTY720. In vitro, l'inhibition générale de la voie métabolique de la S1P par cette molécule FTY720 a donné les résultats les plus interessants. Notre objectif est à présent de valider nos hypothèses in vivo.
Réduction
• L’étude principale ne sera réalisée que si l’étude préliminaire donne les résultats attendus, c’est-à-dire que la présence de FTY720 dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une trop forte lymphopénie. • Un total de 30/36 animaux sera nécessaire pour réaliser l'analyse statistique de notre étude principale (10/12 animaux par groupe). Pour chaque animal, le sang sera prélevé et les deux pattes postérieures seront analysées. Une patte sera dédiée à l’histologie, l’autre à l’analyse en imagerie (micro tomographie). Pour les mesures quantitatives, les comparaisons de moyennes seront réalisées - Pour l'analyse du sang : lors du sacrifice, le sang sera systématiquement prélevé pour obtenir 10/12 échantillons par groupe. D’après des données antécédentes du laboratoire, le taux de S1P a une grande variabilité interindividuelle (SD estimée à 45%). Pour observer une augmentation d’un facteur 2, un minimum de 11 animaux par groupe est requis. - Pour la mesure de la tomographie - imagerie : 10/12 échantillons de chaque groupe seront collectés. D’après des données antécédentes du laboratoire, le volume osseux des os longs des souris est relativement homogène (SD estimée à 10%), mais les variations entre les conditions sont faibles. Pour observer une augmentation de 15%, un minimum de 11 animaux par groupe est requis.
Raffinement
• Réduire l’angoisse des animaux : dans toutes les cages, la litière sera composée d’un mélange de 2 sciures (BK8-15 + Flake). L’enrichissement sera composé d’un igloo en cellulose et du papier absorbant. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement. Les animaux seront placés en acclimatation pendant une semaine entre leur livraison et le début de la procédure expérimentale. • La consommation d’eau et d’aliments sera enregistrée. Si le traitement par FTY720 dans l’eau de boisson entraine une diminution dans la prise d’eau (suivi bihedomadaire), un peu de sucrose sera ajouté pour améliorer le goût. • Un suivi hebdomadaire de la courbe de poids sera réalisé individuellement. Les souris TgA86 présentent un poids corporel significativement réduits par rapport aux souris WT (environ -20% à 15 semaines). Cependant, elles doivent suivre une croissance régulière. Une perte de poids sur deux pesées consécutives sera considérée comme suspecte et la surveillance sera accrue. • Les atteintes arthritiques des souris TgA86 seront surveillées et scorées précisémment chaque semaine. Si les animaux montrent des signes de souffrance, un traitement analgésique pourra être envisagé. Une inflammation sévère est attendue à partir de 12/16 semaines, conduisant à un gonflement articulaire qui ne devrait pas s’aggraver par la suite. Une ankylose de la queue peut apparaitre précocément, mais devrait pas nuire au déplacement des animaux. L’ankylose des membres postérieures, qui peut apparaitre tardivement (après 20 semaines), sera particulièrement surveillée. • La lymphopénie potentiellement causée par le traitement par FTY720 sera vérifiée à deux temps intermédiaires : 10 et 20 semaines. Les résultats seront connus immédiatement après les prélèvements. S’ils montrent une réduction trop importante du taux de leucocytes sanguins (supérieure à 50%), la dose de FTY720 sera aussitôt réduite.
Choix des espèces
• Choix du modèle animal : Les souris transgéniques TgA86 Comme mentionné précédemment, actuellement, aucun modèle animal ne permet de reproduire fidèlement les SpA humaines, mais une dizaine de modèles sont disponibles pour étudier certaines de leurs manifestations, dont les enthésopathies . Nous avons choisi comme critères de sélection la présence d’enthésite et de spondylite, c’est-à-dire d’atteintes périphériques et axiales, l’apparition d’ossifications ectopiques et l’absence de maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Le modèle retenu est donc les souris surexprimant la forme transmembranaire du TNF-α : TgA86. Ces souris présentent une pathologie articulaire périphérique et axiale avec 100% d'incidence. Elles développent des enthésites et des zones d’ankylose. Leur phénotype de ces souris et l’évolution de la pathologie ont déjà été finement caractérisés. Le phénotype des souris TgA86 apparaît normalement à ce moment-là (vers l’âge de 3-4 semaines) Elles recevront ou non le traitement par FTY720 dès l’apparition des symptômes.
Suivi par imagerie de peptides pour le traitement de la maladie de Parkinson – Phase 2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de peptides dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, cinq séances d'imagerie de fluorescence puis un prélèvement sanguin terminal, pour vérifier si quatre peptides franchissent la barrière hémato-encéphalique. Les souris sont tuées afin de prélever leur cerveau et confirmer le passage des molécules. Le porteur décrit un "besoin urgent" de nouvelles stratégies contre la maladie de Parkinson, les bénéfices pour les patients restant hypothétiques et lointains.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une précédente demande sur l'imagerie de peptide pour le traitement de la maladie de Parkinson (MP). La MP fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central (SNC) entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’agrégats de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au SNC est l'utilisation de peptides pénétrant les neurones mais capables de passer la BHE. Parmi les cibles potentielles, le gène LRRK2 appelé « Dardarine », du mot basque dardara signifiant « tremblement », a été identifié. Des peptides interférents (IP) ciblant l'interaction des protéines PP1/LRRK2 ont été développés dans le cadre de ce projet ANR afin de disposer de nouveaux outils pour aider à comprendre cette interaction et sa signification biologique dans la MP. Ces molécules sont économiques, chimiquement polyvalentes et non immunogènes. Plusieurs peptides pour le passage de la BHE ont été synthétisés dans le projet ANR. Six peptides ont été sélectionnés et associés à trois navettes pour générer des peptides bifonctionnels capables de traverser la BHE et de bloquer l'interaction PP1/LRRK2 dans les neurones du cerveau. Nous avons évalué in vivo ces 6 peptides et les résultats obtenus in vivo ne sont pas corrélés aux données in vitro. En effet, 4 des 6 peptides ne parviennent pas à atteindre la BHE chez la souris. Etonnamment, ces 4 peptides ont une navette positionnée différemment des 2 peptides qui eux parviennent à passer la BHE. Ne souhaitant pas passer à côté d'un peptide thérapeutique, nous souhaitons évaluer ces 4 peptides in vivo après avoir repositionner la navette à l'identique des deux peptides qui eux passent la BHE.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé publique. Il existe aujourd'hui des traitements symptomatiques mais ayant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace pour cette pathologie est donc une nécessité. Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle pour permettre l’identification de peptides thérapeutiques pour traiter la MP, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents. Ce projet permettra non seulement de confirmer que les peptides sont capables de traverser la BHE mais également, d’envisager leurs utilisations chez les patients atteints de la MP pour prévenir les troubles invalidants. Ces nouveaux traitements permettront d'avoir un bénéfice direct pour les patients et leurs entourages ainsi qu'un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vigiles. Les souris seront soumises à 2 pesées maximum (réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux, l'injection intraveineuse unique de peptide sera réalisée sous analgésie locale couplée à une anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes). Les imageries de fluorescence, un total de 5 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure, seront réalisées sous anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la préhension des souris pourra être généré lors de la pesée des animaux, deux pesées de moins de 30 secondes seront réalisées. Du stress pourra également être généré au moment de la préhension de la souris pour l'analgésie oculaire (moins de 30 secondes) et lors de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes. Une seule injection intraveineuse rétro-orbitaires sur souris anesthésiée sera réalisée (moins de 30 secondes). Du stress pourra être généré lors des anesthésies gazeuses nécessaires pour réaliser les imageries sur les souris (5 imageries maximum/souris).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever les cerveaux qui seront imagés par fluorescence afin de confirmer que le(s) peptide(s) ont passé la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
L'objectif étant de confirmer que des peptides ont la capacité de passer la barrière hémato-encéphalique (BHE), ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre l'objectif. Par contre, des études de modélisation informatiques ont permis de désigner des peptides d'intérêt. Les peptides générés ont été évalués in vitro sur un modèle mimant la BHE par une monoculture de cellules endothéliales capillaires cérébrales avec un milieu conditionné par des astrocytes dans un transwell système. Seuls ceux démontrant une activité in vitro sont évalués in vivo.
Réduction
Quatre peptides couplés à un fluorophore seront évalués ainsi qu'un contrôle négatif. Nous avons également fait le choix de n'utiliser qu'une seule posologie (5mg/kg) pour chaque peptide afin de sélectionner le meilleur candidat et ce, dans le respect du principe de réduction. Le choix de la posologie s'est basé sur des données d'imagerie antérieures utilisant des peptides pour le traitement d'autres pathologies. En conséquence, le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre de souris par groupe, 4 souris par peptide afin d’obtenir des résultats exploitables et valides. Nous comparerons les moyennes de fluorescence cérébrale des différents peptides (loi normale par un test de Bartlett puis analyses des moyennes par un test ANOVA).
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure qui a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Au cours de la procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors la préhension des animaux pour les pesées (durée de moins de 30 secondes par animal). Afin de limiter le stress et l'inconfort de l'animal, une analgésie oculaire sera mise en place par l'utilisation d'un collyre ophtalmique. Les souris seront ensuite endormies par anaesthésie gazeuse et les peptides seront injectés par voie intraveineuse (durée de moins de 30 secondes par animal). Les souris seront ensuite imagées à différents temps sous anesthésie gazeuse (5 imageries par animal d'une durée de 5 minutes chacune). Tout au long de la procédure, les souris seront suivies, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude par imagerie. De ce fait, nous utiliserons des souris, de la souche Swiss non consanguines, qui sont couramment utilisées pour les études de pharmacologie et de distribution. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude d'imagerie et de distribution de produits.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation de fructo-oligosaccharides à chaîne courte (« FOS ») sur la force musculaire et la microbiote intestinal, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mâles logés seuls, elles fournissent trois prélèvements de fèces et passent des tests d'effort sur tapis roulant et de force de préhension, avant une anesthésie sans réveil pour prélever leurs muscles. Le porteur teste l'effet d'un complément, les fructo-oligosaccharides, sur la performance musculaire et le microbiote, et vise des "allégations pour valoriser les produits" d'un industriel. Il reconnaît qu'aucun effet nocif n'est attendu de cette molécule déjà autorisée chez l'humain, mais affirme que le recours à l'expérimentation in vivo est "incontournable".
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une supplémentation avec un produit naturel, la fructo-oligosaccharides à chaîne courte (FOS), sur la force musculaire et la nature du microbiote intestinal chez la souris. Ces effets peuvent être à l'origine d'une modulation de la performance sportive chez l'homme. Pour cela, nous allons mesurer la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), le temps limite au seuil anaérobie (CMA) et la force maximale d’agrippement (Grip Strength) chez une population saine de souris mâles. Nous allons également observer si les changements des capacités musculaires peuvent être en relation avec un changement dans la composition du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront d'envisager d'autres analyses qui pourront conduire à des évaluations chez l'homme. Dans ce sens, les résultats vont permettre des allégations pour valoriser les produits naturels commercialisés par l'industriel.
Procédures
1. Trois prélèvements de Fèces à réaliser la semaine 8, la semaine 12 et la semaine 16, pour chaque souris : Pendant le déroulement du protocole, 3 échantillonnages de fèces seront réalisés pour chaque animal. Nous récoltons les fèces des animaux, au moment où ils sortent de l’orifice du rectum. Les échantillons sont congelé -80°C pour analyse et caractérisation du microbiote intestinal. 2. Evaluation de la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), sur tapis roulant. C'est la vitesse à partir de laquelle la consommation d'oxygène est considérée maximale. Il s'agit d'une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 3. Une fois la valeur de la VMA connue, nous ferons l'évaluation de la capacité maximale aérobie (CMA), également sur tapis roulant. Il s'agit du temps que la souris est capable de passer à courir à sa VMA. C'est une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 4. Test pour mesurer la force musculaire : Grip Strength : 3 fois /16 semaines et avec une durée de 0-5 min.
Impact sur les animaux
Compte tenu que le produit que nous testons est une molécule qui est déjà autorisée et utilisée chez l’homme, aucun effet nocif, toxique ou secondaire n’est attendu. Les rongeurs sont des animaux naturellement coopératifs pour faire de l'activité physique. Si un problème survient pendant les tests d'évaluation ou une perte de poids supérieure à 20% sur la durée du protocole, ils seront considerés dans le point limite. Si ces changements sont observés, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
A l'issue de la fin du projet, une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélever des échantillons de muscles pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettrons d'identifier les acteurs moléculaires qui vont participer dans les changements observés.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à identifier les effets d’une molécule (FOS) sur la performance musculaire . Pour cela nous avons besoin de mesurer la performance lors d'une activité physique. Il n'existe donc pas d'alternative in vitro pour ce type d'évaluation (activité physique). La nécessité de la recherche rend incontournable le recours à l'expérimentation in vivo.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 16 souris, afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. Nous avons calculé le nombre d'échantillon nécessaire par groupe pour pouvoir juger de l'effet du produit. La taille correspond à 16 animaux/groupe. Nous avons conclu que 16 doit être le nombre d'animaux par groupe. Cela représente désormais 48 animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour juger la significativité des donnés.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et eau mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à une injection intra-péritonéale d'anesthésiant en surdose.
Choix des espèces
La souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. Elle possède un développement rapide et une taille réduite. Nous avons choisi les BALB/c, mâles, car nous avions besoin d'un modèle de souris sain, robuste et avec une bonne disposition pour l'activité physique. De plus, ce sont des lignées consanguines ce qui reduit les écarts des réponses individuelles. Mâles, agés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle et développement musculaire.
Évaluation d’extraits végétaux sur la prévention de maladies chroniques de l’intestin (MICI) dans différents modèles murins.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par un traitement chimique ou par une modification génétique, pouvant entraîner perte de poids, saignements et diarrhées, avec administration orale quotidienne d'extraits végétaux et deux prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. Le porteur veut formuler une association d'extraits végétaux à visée commerciale contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Il affirme que l'évaluation de ces maladies "ne peut pas être réalisée in vitro".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de formuler une association d’extraits végétaux permettant de limiter le développement de maladies chroniques de l’intestin (MICI) chez la souris. La formulation sera validée sur un modèle MICI pharmacologique induit par un traitement au dextran sulfate de sodium (DSS) puis la dose optimale sera déterminée dans une nouvelle étude sur ce même modèle. Afin de renforcer les résultats, la formule sera également évaluée sur un 2eme modèle MICI génétique faisant intervenir des souris IL10 KO. Ce projet a également pour objectif de renforcer les connaissances sur les bienfaits des extraits végétaux dans la prévention des MICI et d’identifier les mécanismes d’action mis en jeu.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de formuler une association d’extraits végétaux pouvant avoir une action bénéfique sur la prévention d’inflammation / dysbiose intestinale. Cette formulation pourra être portée au niveau clinique chez l’homme et permettre à terme d’aider les personnes souffrant de MICI. Ce projet permettra également de renforcer les connaissances sur les MICI et d’identifier les mécanismes d’actions apportés par certains actifs végétaux sur la prévention de ces maladies.
Procédures
Les animaux recevront une adminiastration orale d'extraits végétaux quotidiennement du début à la fin de l'étude. Cet acte a une durée de moins de 10 seconde, contention comprise. Deux prélèvements de faibles volumes sanguins (en début et fin d'étude) sont également prévus. Cet acte a une durée de moins d'une minute, contention comprise.
Impact sur les animaux
L’utilisation de souris IL10 KO et le traitement au DSS auront pour objectif de développer une dysbiose intestinale et une inflammation du colon. Cette dysbiose si elle est trop importante pourrait entrainer une perte de poids, des saignements ou des diarrhées.
Devenir
À la fin de chaque procédure, les tissus seront prélevés pour permettre la réalisation d'analyses complémentaires. Les animaux seront donc euthanasiés.
Remplacement
L’évaluation des MICI dans leur contexte global ne peut pas être réalisée in-vitro. Le recours à l’animal ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.
Raffinement
Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
La souris B6.129P2-Il10tm1Cgn/J est une souris mutante qui développe spontanément une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Cette souche est adaptée à l’objectif recherché et est décrite dans la littérature. La souris C56BL/6 est largement utilisée dans la recherche sur les maladies métaboliques. Lorsque ces animaux sont exposés à du DSS dans de l’eau de boisson, ils développent également une inflammation de l’intestin. Ce modèle est également bien décrit dans la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (6-8 semaines en début de procédure). Pour les souris DSS c’est à cet âge que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature en début d’induction. Pour les souris IL10 KO, l’inflammation apparait au cours du temps. En intervenant sur des jeunes adultes on intervient en amont de la maladie ce qui est l’objectif recherché dans ce projet.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue pour induire un cancer du foie, certaines recevant des drogues anticancéreuses, avec un suivi par imagerie jusqu'à un volume tumoral de 1 500 mm³. Le porteur qualifie la nuisance de l'injection de "temporaire" et inférieure à trente minutes, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut faire souffrir les souris. Il affirme que la validation in vivo est "indispensable" après les tests sur cultures cellulaires et organoïdes.
Objectifs
La grande complexité du carcinome hépatocellulaire (CHC) est liée à plusieurs caractéristiques influençant leur évolution et leur résistance au traitement, notamment son hétérogénéité moléculaire intra- et inter-tumorale. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin génétiquement modifié qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de coopérants pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en utilisant la technique d'injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris (IH) qui permet de transfecter des plasmides dans une certaine proportion d'hépatocytes (0.1% - 1% d'hépatocytes).
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue. La durée est très courte (inférieure à 5 secondes). Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue, par voie orale (per os), intrapéritonéale ou intraveineuse (veine de la queue). Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance, induite par l'injection IH, n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Pendant cette période, les souris seront suivies constamment par les expérimentateurs. Au delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial de la tumorigenèse, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux. Cependant, la formation des tumeurs pourra induire chez certaines souris des souffrances que nous évaluerons et que nous essaierons de minimiser grâce à des stratégies d’optimisation de bien être animal couramment utilisées dans l'ensemble de nos projets de recherche (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d'hébergement). A la fin de l'expérience (entre 2-5 mois et/ou lorsque les tumeurs atteignent au volume total maximal de 1500 mm3), les souris seront euthanasiées. Le volume des tumeurs étant évalué par imagerie non invasive.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, ce qui est le cas lors d’expériences réalisées avec les animaux. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères: poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation).
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.