Souris

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises quatorze semaines à un régime riche en graisses, reçoivent des composés libérant du monoxyde de carbone puis, pour une partie, une transplantation de microbiote fécal par gavage suivie de quatorze semaines supplémentaires de ce régime, avec des prélèvements de sang à la queue sans anesthésie. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort pour prélever leurs organes. Il décrit avoir d'abord testé vingt composés sur des cellules en culture pour n'en retenir que trois, et attend de l'étude des informations sur l'intérêt thérapeutique de la transplantation fécale.

Objectifs

Les altérations de la composition et de la fonction du microbiote intestinal (dysbiose) contribuent fortement à l'obésité et aux morbidités associées. Des découvertes récentes nous indique que l’administration du monoxyde de carbone (CO) réduit la prise de poids et les dérèglements métaboliques chez les souris nourries avec un régime riche en graisses. C'est pourquoi, nous souhaitons tester l’hypothèse que le CO offre ces bénéfices sur le microbiote intestinale pendant l'obésité. Pour ce faire, les souris seront d'abord nourries avec un régime riche en graisses (HFD) pendant 14 semaines et traitées avec des composés capables de libérer du CO. Par la suite, des échantillons fécaux seront prélevés de ce groupe et transplantés par gavage oral dans un deuxième groupe de souris qui seront soumises à HFD pendant 14 semaines supplémentaires. Ce projet mènera à différents objectifs. Premièrement, celuir d'évaluer l'action thérapeutique directe du CO en reprogrammant le microbiote vers un phénotype sain. Dans un second temps, cela nous permettra de déterminer si la transplantation de microbiote fécal (TMF) reprogrammé par le traitement au CO empêche le dysfonctionnement métabolique lié à l'obésité.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du CO sur le microbiote intestinal. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique de la transplantation fécal du microbiote précédemment exposé au CO sur le dysfonctionnement métabolique pendant l'obésité.

Procédures

Les souris recevant du TMF (nombre total d'animaux = 80) seront soumises à un prélèvement de sang sans anesthésie au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé. Cette méthode est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. De même, la transplantation fécale du microbiote est réalisée par gavage oral, une procédure bien tolérée par les animaux. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour la préparation du microbiote intestinal traité avec des composés libérant du CO par gavage oral, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés afin de déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture, remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Ces 20 composés avaient tous la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse. Cependant, seulement 3 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique face aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont alors permis de sélectionner les 3 meilleurs, tout en prenant en compte leur structure chimique diversifiée.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés nous utiliserons 10 souris en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. De plus, l'analyse de la composition du microbiote par séquençage de l'ADN nécessite un certain nombre d'échantillons pour mieux homogénéiser les données. Dans nos protocoles, nous pourrons réduire le nombre de souris car les mêmes fèces obtenues à partir de souris HFD ou HFD+composés libérant du CO seront utilisées pour la transplantation fécale de plusieur animaux. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Suite à l’obtention des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi de minimiser la douleur, mais aussi la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés sur la base de données in vitro tout en n'utilisant qu'une seule dose de traitement pour chaque composé. Nous nous assurerons que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). La transplantation fécale par gavage oral est également couramment utilisée dans ce modèle pour évaluer l'effet du microbiote sur l'obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Des souris de 8 semaines seront utilisées pour démarrer nos protocoles car nous devons évaluer l'effet des composés libérant du CO sur le microbiote et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

424 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour de futures expériences. Chaque souris reçoit une puce RFID implantée sous la peau par une courte chirurgie sous anesthésie, avant un suivi comportemental automatisé en groupes de quatre pendant un à trois jours, par caméra de profondeur et apprentissage automatique. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés ensuite pour de l'électrophysiologie, de la biochimie et de l'anatomie, procédures qui supposent leur mise à mort. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser le comportement d'un organisme dans son environnement social.

Objectifs

Les études de neuroscience utilisent des modèles animaux pour étudier l'impact de facteurs environnementaux ou de mutations génétiques sur des traits complexes tels que la prise de décision et les interactions sociales. Nous voulons implanter une méthode d'analyse en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis. Cette méthode combine la vision par ordinateur grâce à une caméra infrarouge à détection de profondeur, l'apprentissage automatique pour l'identification des animaux et des postures, et l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Elle suit plusieurs souris avec précision, extrait une liste de traits comportementaux des individus et des groupes de souris, et fournit un profil phénotypique pour chaque animal.

Bénéfices attendus

Les souris présentent une organisation et un développement des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Les souris ont un riche répertoire comportemental ; notamment en ce qui concerne l’interaction social. Il n’existe pas de méthodes alternatives à l’analyse du comportement animal, permettant d’appréhender l’ensemble d’un organisme au sein de son environnement social. À ce jour, il reste donc encore indispensable d’utiliser des modèles animaux (en l’occurrence les souris des deux sexes) pour générer des connaissances valides en recherche fondamentale, dans le domaine du comportement social. Ainsi les bénéfices attendus du rpjet

Procédures

Afin d'analysee en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis, tout les animaux sont implanaté en sous-cutannée par une puces RFID permettant l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Donc toutes les souris seront soumises à une courte chirurgie sous anesthésie. Pour effectuer le suivi comportemental automatisée et sans manipulation de plusieurs souris avec précision et créer un profil phénotypique pour chaque animal, toutes les souris seront hébergées dans le système LMT par groupe de 4, sans manipulation pendant 1 à 3 jours. Au terme de la cession expérimentale les souris seront replacées dans leur cage habituelles, dans changer les groupe social. Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux (424) sont gardés en vie, dans leurs cages habituelles. Ils pourront être réutilisés ultérieurement pour des expériences d'électrophysiologie, de biochimie et d'anatomie afin de réduire le nombre d'animaux expérimentaux utilisés par l'équipe

Remplacement

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions.

Réduction

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Raffinement

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Choix des espèces

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions. Les implantataions de puces RFID auront lieu au moins une semaine avant la première période d'enregistrement. Ainsi les implantations eront réalisées entre P25 et P28. La première session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée entre P35 et P40, la seconde session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée à P100, au stade adulte.

99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pour développer une stéatohépatite non alcoolique, avec une administration orale quotidienne et des prélèvements sanguins étalés, avant des prélèvements d'organes post mortem. Le porteur décrit une étude menée pour un client afin de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et les troubles métaboliques.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée 2 fois par semaine de D-21 à D-1 - une pesée 3 fois par semaine à partir de D1 - une administration orale quotidienne à partir de D-7 - un prélèvement sanguin à la queue à D1, D29 et D57 - un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale à D-7, D29 et D57

Impact sur les animaux

L'allopécie peut survenir dans ce modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Elle semblerait être un conséquence phénotypique de cette maladie métabolique. Du moment que la peau a un aspect normal et est intact de toute lésion, aucun traitement n'est requis. Les souris peuvent être utilisé en expérimentation. Les prélèvements à D-7, D29 et D57 (7.5% du volume sanguin total) sont assez espacés dans le temps afin de permettre aux animaux de récupérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages en groupe, de par le caractère social de l'espèce. Les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

3 840 rongeurs, 1 920 souris et 1 920 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation douloureuse de la vessie est induite par injections répétées de cyclophosphamide, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments et subissent des mesures de douleur viscérale et des tests aux filaments de von Frey appliqués entre l'anus et l'urètre. Le porteur reconnaît que la nuisance pour le bien-être des animaux sera importante, le besoin constant d'uriner et la douleur de la cystite interstitielle étant reproduits chez les rongeurs. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne prédit la fonction vésicale ni la douleur viscérale.

Objectifs

La cystite interstitielle (CI), désormais appelée « syndrome de la vessie douloureuse » est une maladie inflammatoire de la vessie qui se caractérise par des envies anormales d’uriner (envies pressantes et/ou fréquentes) et par des douleurs importantes dans le bas ventre et la vessie, au niveau de l’urètre ou au niveau du vagin chez les femmes, parfois accompagnées d’une difficulté à uriner. La sévérité des symptômes est variable d’une personne à l’autre mais dans le cas grave la maladie est très invalidante. Alors que la cystite « classique » est une inflammation de la vessie causée par des bactéries, la cystite interstitielle est une affection chronique, c’est-à-dire qu’elle dure dans le temps, dont les causes ne sont pas élucidées. Il est difficile de connaître le nombre exact de personnes atteintes par cette maladie, qui est probablement sous-diagnostiquée. La prévalence (nombre de cas dans une population donnée à un moment précis) varie selon les pays. En Europe, les estimations vont d’une personne atteinte sur 12 500 à une personne sur 1500. Si tout le monde peut être affecté, 90% des patients souffrant de cystite interstitielle sont des femmes. La maladie survient en moyenne entre 30 et 40 ans, et 25% des patients ont moins de 30 ans. On ne connaît pas encore les causes de cette maladie, qui a longtemps été considérée comme d’origine psychologique. Une des hypothèses avancées concerne l’altération de la perméabilité de la paroi vésicale. L’intérieur de la vessie est normalement tapissé par une couche de protéines (glycosaminoglycanes notamment) dont le rôle est de protéger la paroi des composants agressifs et toxiques de l’urine. Or cette couche protectrice est déficiente (et donc perméable) chez 70% des personnes atteintes de cystite interstitielle. Les éléments toxiques (par exemple le potassium concentré) pourraient alors pénétrer la paroi de la vessie, provoquer une inflammation et déclencher la pathologie. La cystite interstitielle, à cause des douleurs qu’elle engendre et l’envie incessante d’aller aux toilettes, nuit énormément à la qualité de vie des personnes atteintes. La communauté des patients et les urologues demandent une recherche plus active sur cette pathologie car les traitements proposés aujourd’hui ne sont pas efficaces. L’objectif de notre projet est de mettre en place un modèle expérimental de cystite interstitielle chez le rongeur, afin de pouvoir tester des candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui le médecin urologue ne dispose pas de médicaments spécifiques pour soigner cette maladie très invalidante. Il utilise donc des thérapies pour soulager la douleur, comme les antalgiques, ainsi que les antispasmodiques, les relaxants musculaires ou encore les anticonvulsivants. Le médecin peut introduire une solution stérile qui contient un ou plusieurs médicaments dans la vessie en insérant un cathéter dans l’urètre. Ces médicaments agissent alors directement sur la paroi de la vessie. Toutefois, l’efficacité de ces traitements est très limitée et de courte durée. Il est donc urgent de mettre au point de nouveau médicaments. Le but ultime de notre projet est de mettre en place un modèle de cystite interstitielle qui sera utilisé pour tester l’efficacité de nouveau médicaments ayant différent mécanismes d’action, afin de contribuer à mettre sur le marché des médicaments plus efficaces.

Procédures

1) Induction de la pathologie. Cette étape expérimentale est réalisée sur 6 jours par des injections intrapéritonéales répétées de cyclophosphamide sous anesthésie générale au jours 0- 3 - 6. La durée de cette procédure est de 5 minutes. 2) Prélèvement de sang: Un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 3 jours par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique. La durée de cette procédure est de 10 minutes. 3) Administrations des candidats médicaments par voie systémique ou intravésicale. Le produit à tester sera injecté 1 fois/jour entre les jours 7 et 9 du protocole expérimental. La durée de cette procédure est de 5 minutes pour les voies systémiques et de 30 min pour la voie intravésicale. 4) Enregistrement des mictions en continu pendant 72 heures dans cage métabolique. 5) Enregistrement des scores de douleur viscérale. Cette procédure ne sera pas appliquée aux animaux utilisés pour les études en cage métabolique. Les rongeurs seront observés par un expérimentateur pendant 30 minutes pour déterminer un score de douleur viscérale. Ensuite un autre test sur animal vigile sera utilisé pour étudier la douleur référée liée à la vessie, par les mono-filaments de Von-Frey appliqués entre l’anus et l’urètre. Les mesures sont prises en utilisant la méthode ascendante avec une série de filaments. Les animaux sont d’abord acclimatés à l’environnement pendant 60 minutes chaque jour pendant 2 jours. Ensuite, après administration de cyclophosphamide, des stimulus sont appliqués. Chaque stimulus consiste en une application de 5 s du filament de von Frey à la région abdominale inférieure à des intervalles de 5 minutes. La durée de cette procédure est de 30 minutes.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une forte inflammation vésicale chez le rongeur qui puisse mimer la cystite interstitielle. Les symptômes de cette pathologie sont le besoin constant d’éliminer de très faibles quantités d’urine. Les patients ressentent la plupart du temps un besoin fréquent d’uriner, et ce jour et nuit. La douleur, constante ou intermittente, peut être très importante dans la CI : généralement elle s’intensifie lorsque la vessie est pleine, et diminue transitoirement après la miction. Il y aura donc les mêmes symptômes chez les rongeurs. La nuisance pour le bien-être des animaux sera donc importante. D'autres nuisances seront liées à l'administration repetée de candidats médicaments à tester, en utilisant différentes voies d'administration, c'est à dire voie orale (gavage) , voie intraperitoneale, voie sous-cutanée, voie intravésicale, voie intra-détrusoriale.

Devenir

A l'issue des Procédures 1 ou 2, tous les animaux seront euthanasiés car il ne sera plus possible de les reutiliser.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur la fonction vésicale chez le rongeur éveillé, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs de la fonctionnalité vésicale dans sa globalité, ni de la douleur viscérale.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 12, étant donné la variabilité interindividuelle de réponse à la cyclophosphamide. Un calcul de puissance statistique basé sur les données de la littérature pour ce modèle, nous a montré que l'utilisation de 12 animaux par groupe nous permettra de détecter une différence de 25% entre les animaux traités avec le solvant (contrôles )et les auimaux traités avec le candidat médicament. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 4 et 8 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupe égal à 12) seront comparés entre eux en utilisant un test two-way ANOVA, suivi par un post-test.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 2-4 (rats) ou 4-6 (souris) par cage, en fonction de leur poids corporel, avec de l’enrichissement dans les cages (tuyau, igloo, aspen brick et cocoon). Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les cages resteront à une place fixe sur le portoir et seront bougées le moins possible. Les animaux seront manipulés à des fins expérimentales uniquement dans le laboratoire et non dans leur pièce d’hébergement pour éviter de stresser les autres animaux présents dans la pièce. En cas d’administration de médicaments par voie orale, les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de l’administration de cyclophosphamide, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution de l’activité de toilettage et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l'animal sera euthanasié. Dans le cas où un prélèvement de sang est nécessaire, les animaux seront manipulés sous anesthésie générale (isoflurane) afin de minimiser le stress et la douleur. Pendant le séjour dans les cages métaboliques pendant 72 heures, les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Les animaux seront en contact visuel et olfactif entre eux mais le matériel d’enrichissement au niveau du sol de la cage ne pourra pas être utilisé car il peut interférer avec la collecte des fèces et des urines.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour l’étude de la fonction vésicale. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés à la fonction vésicale sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats seront de souche Wistar ou Sprague-Dawley, les souris de souche Swiss ou C57Bl/6 car ces souches sont largement utilisées pour les études de la fonction vésicale (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines d'âge (adulte) pour avoir une équivalence chez l'Homme.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues dans l'obscurité totale pendant sept jours, exposées à la lumière une à quatre heures, puis euthanasiées par perfusion intracardiaque pour analyser l'activité des interneurones du cortex visuel. Le porteur indique que ce projet sert d'abord à former des étudiants aux techniques, en plus de l'objectif de connaissance. Il affirme que les alternatives non animales ne sont pas encore disponibles et retient la souris pour la modification génétique aisée.

Objectifs

L'exposition soudaine à la lumière, après une période d’obscurité, induit une modification très importante de l’activité de tous les types des neurones du cortex visuel. Cependant, parmi toute la population neuronale de cette région, les interneurones sont les cellules les plus affectées. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation de ce groupe cellulaire. Dans ce but, les souris seront hébergées dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours et seront ensuite exposées à la lumière entre 1 et 4 heures. Après cette exposition, elles seront mises à mort et leur cerveau sera prélevé pour faire des analyses moléculaires post-mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de ces techniques leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Ce projet permettra de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation des interneurones du cortex visuel.

Procédures

Les animaux seront hébergés dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours. A la fin de cette période, les souris seront exposées entre 1 et 4 heures à la lumière avant d’être euthanasiées par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à l'hébergement dans le noir: stress

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses moléculaires post-mortem

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex cérébraux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement. Il est important de noter que des alternatives non animales ne sont pas encore disponibles .

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les procédures, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouveles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Raffinement

Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique formé et compétent. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être del’animalerie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène. Les expériences doivent être réalisées sur animauix adultes lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour l'ablation de cinq sixièmes des reins, puis un régime riche en phosphate pendant dix semaines afin d'installer une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires. Le porteur décrit une hypertension attendue chez 75 à 80 % des animaux opérés et précise que les prélèvements sont terminaux. Il présente ce projet comme un préliminaire "indispensable" à l'étude des mécanismes de la maladie et affirme que l'expérimentation sur animal entier est "indispensable" pour une pathologie systémique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associée au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation potentiellement mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi des vaisseaux, ce qui entraîne une rigidification du système vasculaire et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études sur la population ont montré que plus la fonction rénale est altérée plus les risques de mortalité sont élevés. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de notre projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Les modèles animaux décrits dans la littérature ne sont pas adaptés à la question scientifique que nous posons. Ainsi, la première étape qui fait l’objet de cette demande d'autorisation, consiste à optimiser la mise au point d’un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. L’IRC sera induite par ablation de 5/6ème des reins, technique que le chirurgien impliqué dans ce projet maitrise parfaitement. Pour favoriser l’apparition de calcifications vasculaires, les souris ayant subi cette ablation seront soumises à un régime riche en phosphate pendant 10 semaines. L'apparitions des CV sera évaluée par coloration spécifique des arches aortiques prélevés à partir de nos modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet est un préliminaire indispensable permettant d’établir un modèle de souris optimisé pour pouvoir par la suite évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques de l’hyperphosphatémie chez les patients en IRC. Les connaissances sur les mécanismes responsables de l’évolution de cette pathologie et la gestion de l'IRC ont considérablement augmenté, et le contrôle du niveau de phosphate dans le sang à tous les stades de l'IRC est considéré comme l'un des aspects les plus importants pour améliorer les résultats cliniques de l'IRC. En effet, un taux élevé de Pi sérique est le plus important facteur de risque associé à la CV dans la population générale. Pour faire face à la toxicité du Pi et à ses conséquences sur les risques cardiovasculaires, la compréhension des actions moléculaires et cellulaires du Pi est d'une importance capitale. Elle permettra de contrôler les effets néfastes de la toxicité du Pi et de proposer des recommandations diététiques au niveau sociétal. Cela aura de grandes implications sociales et économiques en matière de bien-être et de vieillissement en bonne santé.

Procédures

Deux chirurgies à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.

Impact sur les animaux

L’insuffisance rénale chronique induite par néphrectomie des 5/6 est bien tolérée chez la souris. L’expérience du chirurgien en charge de l’opération porte sur plusieurs centaines d’animaux, sans mortalité observée dans les 3 mois suivant la chirurgie. Les niveaux d’insuffisance rénale obtenus par néphrectomie des 5/6 restent modérées grâce à l’hypertrophie de la portion résiduelle de rein. En effet la concentration plasmatique d’urée (un marqueur classique de la fonction rénale) est de 5-6 mmol/L chez les souris contrôle et de 18-25 mmol/L chez les souris néphrectomisée. Pour faire le parallèle avec la clinique humaine, nous avons par le passé mesuré la clairance de la créatinine chez ces animaux et pu grader l’insuffisance rénale comme correspondant à un stade 3-4 en clinique humaine (stades pour lesquels les stratégies de suppléance rénale ne sont pas encore mises en oeuvre). Les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie. La supplémentation de l’eau de boisson des animaux néphrectomisés avec du bicarbonate de sodium (80 mM) permet d'empêcher les acidoses.

Devenir

des prélèvements terminaux sans réveil pour tous les animaux sont nécessaires pour évaluer l'apparition des calcifications vasculaires dans ce modèle.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (72 souris) a été calculé au plus juste afin d’offrir la puissance statistique maximum. Pour calculer la taille des groupes et les analyses de puissance statistique, nous avons utilisé l'outil G*Power (erreur de type I = 0,05)

Raffinement

Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie (associant anesthésie locale per-opératoire et l’usage de dérivés morphiniques) et un système d'évaluation du bien être et de la douleur permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (regroupement par 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisotis permettant aux souris de se fabriquer un nid)

Choix des espèces

Nous avons choisi de mettre en place ce modèle d’étude chez la souris car nous utiliserons dans un deuxième temps des souris génétiquement modifiées, toutes sur fond génétiques C56BL/6, pour des gènes importants pour l’homéostasie phosphocalcique afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets du Pi dans l’IRC avec CV associées. Des souris adultes de 20 semaines seront utilisées pour pouvoir confronter nos résultats avec d'autres modèles décrits dans la littérature.