Souris
Etude de polluants atmosphériques sur l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
14 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 6 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des polluants par voie intranasale, des séjours en chambre d'inhalation jusqu'à quatre heures par jour, des administrations intrarectales, par gavage et dans l'eau de boisson, dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancer colorectal qui provoquent inflammations et lésions du côlon. L'objectif est d'étudier l'effet des polluants atmosphériques sur l'intestin. Le porteur affirme que ces processus complexes ne peuvent être modélisés in vitro.
Objectifs
L'Organisation mondiale de la santé a identifié la pollution de l'air comme le plus grand risque pour la santé environnementale du 21e siècle (OMS, 2020). La surmortalité mondiale due à l'ensemble de la pollution de l'air ambiant est estimée à 8,8 (7,11-10,41) millions de décès par an, avec une perte d'espérance de vie de 2,9 (2,3-3,5) ans, un facteur supérieur à celui du tabagisme (Lelieveld et al., 2020). Géographiquement, la mortalité due à la pollution de l'air est dominée par l'Asie de l'Est (35 %) et l'Asie du Sud (32 %), suivies de l'Afrique (11 %) et de l'Europe (9 %). Les fractions correspondantes pour les années de vie perdues sont respectivement de 29 %, 36 %, 17 % et 6 %. Les polluants atmosphériques favorisent le développement de maladies respiratoires et cardiovasculaires, et de nouvelles études montrent qu’ils impactent également les tissus intestinaux. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact des polluants atmosphériques dans 2 types de pathologies intestinales humaines : les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des effets de la pollution atmosphérique sur la santé intestinale, et donc la mise en évidence de facteurs permettant de limiter ces dommages.
Procédures
Les animaux seront soumis Procédure 1: administration intranasale sous anesthésie (durée variable : 1 seule fois ou maximum 3 fois par semaine pendant 2 semaines). Procédure 2: maintien en chambre d'inhalation pendant une durée maximale de 4heures par jour. Procédure 3: 1 administration intrarectale d'un composé. Procédure 4: administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant pendant maximum 9 jours. Procédure 5: administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 5 jours. Procédure 6: 1 administration d'un composé par gavage. Procédure 7: 1 administration intrapéritonéale d'un composé. Procédure 8:1 administration intrapéritonéale d'un composé et 3 fois 1 administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 5 jours
Impact sur les animaux
Les modèles de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et de cancer colorectal miment certains aspects de ces pathologies et entrainent des inflammations et des dommages du colon ou de l'intestin grêle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour pouvoir analyser le niveau d'inflammation et/ou de cancer des tissus intestinaux.
Remplacement
Les processus physiopathologiques complexes des maladies inflammatoires chronqies de l'intestin et du cancer colorectal faisant intervenir les voies aériennes, les voies digestives, la sphère ORL, l'alimentation, le système immunitaire muqueux et sytémique , la flore intestinale, etc, ne peuvent pas être modélisés in vitro. Mais dès que possible, les mécanismes mis en jeu seront étudiés dans des modèles plus simples telles que des cultures cellulaires in vitro afin de satisfaire à la règle du remplacement.
Réduction
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre de souris utilisées par groupe expérimental a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des conclusions statistiquement significatives et donc publiables. Les effectifs seront déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les procédures classiques seront appliquées : pas de bruit inutile et stressant, phase d’acclimatation pour tout changement d’environnement, enrichissement, application des procédures pour le nombre de souris par cage. Des anesthésies générales seront pratiquées quand les procédures sont douloureuses ou stressantes. Afin de palier à d'éventuels problèmes anormaux survenant au cours des expérimentations, des points limites ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Pour l'étude des effets suite à une exposition prénatale, les expositions seront réalisées sur la mère pendant la deuxième et troisième semaine de gestation, et les effets seront étudiés sur la descendance après induction des procédures pathologiques 3 à 8. Pour l'étude des effets suite à une exposition adulte, les expositions seront réalisées sur souris agées de 8 semaines
Lipiodol et Hystérosalpingographie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 300
Lapins : 500
1 000 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures couvrant tous les niveaux de souffrance, du plus léger au plus sévère, la plupart tués à l'issue et 120 réutilisés dans d'autres procédures. Ils subissent des accouplements, une synchronisation hormonale, des frottis vaginaux répétés, l'administration intra-utérine d'un produit de contraste par voie basse ou chirurgicale et une induction d'endométriose. L'objectif est de comprendre comment le Lipiodol, un produit de contraste iodé, améliore la fertilité féminine. Le porteur affirme que ce mécanisme ne peut s'étudier in vitro et conclut à une "nécessité" du recours à l'animal.
Objectifs
L'hystérosalpingographie est un examen radiographique (aux rayons X) de l’utérus et des trompes utérines généralement indiqué dans les bilans de d’infertilité féminine afin de vérifier la perméabilité des trompes de Fallope et la normalité de la cavité utérine. Elle consiste en une instillation de produit de contraste iodé (radio opaque) dans l’utérus et les trompes via une canule accolée au col de l'utérus. L'absence de passage du produit de contraste depuis les trompes de Fallope dans la cavité péritonéale signe une obstruction tubaire. Cette obstruction tubaire rend compte d’une infertilité féminine dans environ 35% des cas. Des travaux cliniques ont montré que l’hystérosalpingographie, quand elle est réalisée au moyen de l’injection d’une huile iodée, le Lipiodol, se traduit par une augmentation de la fertilité par rapport à la même technique réalisée au moyen de produits de contraste iodés hydrosolubles. Le mécanisme de cet effet n’est pas connu. Il existe quelques hypothèses dans la littérature. L’objet de ce projet est l’élucidation de ce mécanisme et des éventuelles conséquences endocrinologues (thyroïdiennes notamment) de l'administration d'un produit iodé ou huileux.
Bénéfices attendus
Les différentes études de ce projet seront réalisées dans le but de comprendre le rôle du Lipiodol dans l’amélioration de la fertilité et son mode d’action. Plusieurs hypothèses seront isolées et testées afin de connaître précisément le mécanisme du Lipiodol. Si un mécanisme est identifié, des essais cliniques pourront être lancés afin de confirmer l’effet en clinique. L’utilisation du Lipiodol pourra alors être revue et adaptée au mieux, pour les patientes chez lesquelles un effet pourrait être observé. En effet selon le mécanisme, il est possible que la totalité des causes d’infertilité féminines ne soit compatible avec une amélioration de la fertilité par l’administration du Lipiodol. Les patientes présentant un trouble de la fertilité pourraient donc par la suite bénéficier d’une meilleure prise en charge aboutissant à une augmentation des taux de grossesses, et évitant le recours aux procédures les plus invasives (fécondation in vitro ou autre).
Procédures
Imagerie RX, IRM ou échographie (15 minutes environ), accouplement, synchronisation du cycle œstral par supplémentation hormonale (une injection en vigile), frottis vaginal (2 minutes, en vigile): pourra être répété au cours de l’étude, avec un temps de récupération adapté entre chaque procédure. Administration intra-utérine d’un produit de contraste par voies basses ou chirurgie : une fois (1 heure au plus) puis suivi de quelques semaines par imagerie (15 minutes environ), sauf en cas de mise au point ou d’intérêt scientifique de répéter l’administration Induction d’endométriose : une chirurgie (1 heure environ), puis suivi clinique de quelques semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie RX, IRM ou échographie, d’accouplement, de synchronisation ou d’identification par frottis vaginal du cycle oestral sont légères. Les nuisances attendues sur les animaux suite à ces procédures sont un potentiel inconfort au réveil dû à la durée de l’anesthésie ou lors de l’injection pour les procédures le nécessitant, ou du stress lors des contentions. La mise sous lampe chauffante ou sur tapis chauffant pendant les procédures d’anesthésie sera mis en place afin de maintenir la température corporelle, ainsi qu’au réveil. La procédure d’administration d’un produit par instillation intra-utérine, peut induire un inconfort gynécologique de l’animal, une irritation ou inflammation locale suite à l’insertion des cathéters, à la dilatation des trompes par l’injection du produit, ou à son écoulement. La procédure d’administration intra-utérine d'un produit par une procédure chirurgicale, et la procédure d’induction d’un modèle d’endométriose impliquent une chirurgie sous conditions stériles suivie d’une suture. Malgré la prise en charge analgésique post-opératoire, une démangeaison et/ou une douleur peuvent se manifester au niveau de la suture à cause de la tension des tissus et la cicatrisation. Une moindre activité et prise de nourriture peuvent être observées pendant quelques jours, suite à la chirurgie et l’anesthésie. Une collerette pourra être placée sur l’animal s’il touche trop leur plaie, et une hydratation pourra être envisagée au cas par cas si besoin. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une prise en charge adaptée à chaque observation sera mise en place.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie. A l’issue d’une étude (succession de plusieurs procédures), une mise à mort peut être réalisée sous anesthésie profonde à des fins d’analyse histologique ou de dosage, afin par exemple de caractériser la biodistribution et le mode d’action des produits testés.
Remplacement
La fertilité est le résultat de multiple processus complexes et interconnectés. Le mécanisme d’action du Lipiodol sur la fertilité est inconnu. L’étude de son effet est alors difficilement réalisable sur des modèles simplifiés in vitro. De plus, le Lipiodol n'est pas soluble dans les milieux de culture. Il semble donc nécessaire d'effectuer des études in vivo plus proche de la pratique clinique afin de mieux comprendre les effets induits par la présence de Lipiodol. Le recours au modèle animal apparaît donc comme une nécessité, au moins pour une partie des études. L’une des hypothèses mécanistiques de l’effet pro-fertilisant du Lipiodol est l’effet mécanique, par un meilleur débouchage des trompes, un effet viscosité du produit ou autre. Afin de remplacer le recours à des animaux, l’étude de cette hypothèse sera faite uniquement in vitro. Des études de cultures cellulaires in vitro pourront aussi être effectuées en complément afin d'étudier par exemple plus en détails la réponse immunologique sur un certain type cellulaire.
Réduction
Analyse bibliographique préclinique en amont pour ne pas refaire ce qui a déjà été fait, identifier les pistes à suivre, les erreurs à éviter, et faciliter les phases de mise au point. Macro-analyse de la littérature clinique pour en tirer les produits et donc paramètres qui semblent corréler avec les résultats de fertilité (guide vers une hypothèse mécanistique plutôt qu’une autre), et les pathologies répondant le mieux à l’amélioration de la fertilité après HSG (modèle le plus adapté). Recherche et contact d’équipes à contacter spécialistes dans les différents domaines (HSG clinique et préclinique, endométriose, fertilité et PMA) pour nous guider dans nos recherches (aide technique, pertinence des études, modèles, paramètres à suivre). Réutilisation des animaux pour les mises au point : - Lorsque cela est possible, premiers essais sur animaux post-mortem ou sans réveil d’animaux qui doivent être euthanasiés dans d’autres projets - Lors des étapes suivantes de mise au point, avec réveil, réutilisation d’un animal plusieurs fois si pertinent (échec précédent, non interférence avec les paramètres évalués) et procédure légère ou modérée - Un délai de 14 jours sera respecté avant réutilisation afin de permettre à l’animal de récupérer pour les HSG Lapins. Pour les souris, l’essai du passage du col et éventuellement l’injection vigile intra-utérine et contrôle par imagerie pourra être réalisé jusqu’à 3 fois par semaine, suivi d’un repos de 7 jours si une réutilisation pour le même usage est envisagée. Pour le protocole de synchronisation oestral des souris, un délai de 2 semaines sera respecté entre 2 administrations hormonales. Réutilisation des animaux au sein des études : - un échec de procédure légère ou modérée (par exemple échec d’administration intra-utérine d’un produit par voie naturelle) mènera à la réutilisation de l’animal pour un second essai, après temps de récupération nécessaire, à condition que les points limites ne soient pas atteints et si le protocole d’étude le permet. - suivi longitudinal de la distribution du produit en imagerie sur un même animal plutôt que par dosage sur prélèvement, pour réduire le nombre d’animaux en étude. - Les animaux dont l’euthanasie n’est pas nécessaire pour la finalité de l’étude pourront être réutilisés pour des mises au point de techniques/modèles, dans un autre projet, pour la formation, le prélèvement de matrices pour mises au point de techniques d'analyses.
Raffinement
Surveillance et relevé quotidien de l’état clinique, pesée régulière et scoring adapté à chaque protocole afin de quantifier l’état clinique, envisager un traitement et déterminer un score « point limite ». Enrichissement des cages d’hébergement : • Balle et bâtons en bois à ronger (lapins) • Bâtons à ronger, tubes en plexiglass pour l’abri, frisures de papier kraft pour le nid (rongeurs en groupes sociaux). Système de maintien de la température et monitoring de paramètres physiologiques lors des anesthésies. Anesthésie et analgésie : •Chez la Souris, l’administration intrautérine sera idéalement vigile en simple contention, comme cela est fait dans le cadre de l’insémination artificielle. La mise au point sera réalisée en premier lieu sous anesthésie gazeuse. Une habituation des animaux à la contention sera réalisée avant le début de la procédure afin de réduire le stress. •Chez la Ratte, si l’administration par voies naturelles est possible, elle se fera sous anesthésie gazeuse. •Dans les deux cas, si des signes de gêne ou de douleur apparaissent, une administration d’antispasmodique ou d'analgésique sera mise en place en curatif et/ou en préventif selon la fréquence d’observation de ces symptômes et la durée d’action de ces médicaments. •Chez la Lapine, la procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse de préférence, après administration d’un mélange d'un analgésique, d'un myorelaxant et sédatif, et d'un tranquillisant et sédatif. Une fois endormie, un antispasmodique sera administré afin de faciliter l’accès aux trompes en réduisant les spasmes tubaires. L’ensemble de cette médication devrait assurer le bon déroulement de la procédure et limiter les lésions éventuelles du tissu. Pour l’administration du produit par voie chirurgicale, ou chirurgie en vue de l’induction d’un modèle d’endométriose, une analgésie sera réalisée en pré-opératoire ainsi qu’en post-opératoire. Une nouvelle administration sera effectuée ultérieurement en cas de signe de souffrance les jours qui suivent. Mise en place d’une alimentation adaptée post chirurgie : •chez la Lapine, gel hydratant, quartiers de pommes, foin •chez le Rongeur, pellets placés dans la sciure plutôt qu’en hauteur, gels hydratants, friandises.
Choix des espèces
Notre espèce de choix est le Rat car c’est l’animal qui est classiquement utilisé dans les études de fertilité (réglementaires). De plus, des études de biodistribution et de toxicité à visée réglementaire seront effectuées sur cette espèce. Cela nous permettra de comparer certains résultats et d’être complémentaire à ces travaux destinés aux Autorités de Santé. Si la mise au point du modèle n’est techniquement pas possible chez le Rat, nous pourrons effectuer des études chez la Souris ou le Lapin, comme cela a aussi pu être fait dans la littérature. Ce sont également des espèces utilisées dans le domaine de l’étude de la reproduction. Les animaux seront des jeunes adultes, idéalement sexuellement matures. Pour les rats : 8-16 semaines. Pour les souris : 7-14 semaines. Pour les lapins : 3-8 mois. Pour la génération F1 : de la naissance jusqu’au sevrage.
Analyse de la contribution des macrophages lors du développement du réseau vasculaire lymphatique oculaire de la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
136 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux nouveau-nés reçoivent une injection sous-palpébrale dans chaque œil, sous analgésie par le froid sur de la glace, avec un risque de rejet par la mère au retour au nid, avant d'être tués pour disséquer leurs yeux. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle des macrophages dans le développement du réseau lymphatique de l'œil. Le porteur affirme qu'"aucune alternative in vitro ou in silico n'existe" et que l'approche in vivo est nécessaire.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques sont complémentaires des vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle important dans l’évacuation des déchets ainsi que la surveillance immunitaire au sein des organes et tissus. Ils transportent les cellules immunitaires et participent à l’activation de la réponse immunitaire. Une place de plus en plus importante du réseau vasculaire lymphatique apparaît dans le cadre des atteintes et troubles oculaires. La formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse) a ainsi été observée dans les pathologies inflammatoires de l’œil (syndrome de l’œil sec, allergies oculaires, etc..). L’implication de ces vaisseaux dans le drainage de l’humeur aqueuse de l’œil et la régulation de la pression intraoculaire, facteur de risque majeur associé au développement du glaucome, a été également proposée. Une contribution de macrophages (cellules immunitaires impliquées dans la défense de l’organisme contre les substances étrangères ou les agents pathogènes) dans la lymphangiogenèse associée à plusieurs situations pathologiques a été décrite chez l’homme. L’objectif de ce programme est d’analyser si les macrophages peuvent également contribuer de façon directe et/ou indirecte à la formation du réseau lymphatique au cours des étapes précoces du développement. La compréhension et caractérisation des mécanismes impliqués dans le développement et la formation des vaisseaux lymphatiques oculaires est nécessaire pour élaborer des stratégies thérapeutiques ciblant ces vaisseaux lymphatiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de définir si les macrophages exercent un rôle majeur au cours du développement du réseau lymphatique de l’oeil dans le modèle d’étude murin. Ils permettront d’appréhender en particulier si les macrophages peuvent constituer une source alternative de cellules endothéliales lymphatiques, cellules qui tapissent les vaisseaux lymphatiques. Comme indiqué précédemment, ces nouvelles connaissances permettront de mieux cibler la formation des vaisseaux lymphatiques lors de l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à interférer avec la formation de ces vaisseaux dans les pathologies oculaires.
Procédures
Injection sous-palpébrale (1 seule injection par œil de durée limitée : 5 à 10 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent : -la douleur qui pourrait être ressentie lors de la piqure pour l’injection, malgrè l’analgésie par le froid qui sera pratiquée ; -le rejet potentiel par la mère après retour dans le nid ; -le stress lié à la manipulation des souriceaux ainsi qu’à la variation des températures se produisant lors de l’analgésie par le froid
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans la procédure décrite sera euthanasié afin de pouvoir procéder aux analyses des conséquences du traitement sur les macrophages et les vaisseaux lymphatiques oculaires après prélèvement et dissection des yeux.
Remplacement
Aucune alternative in vitro ou in silico n’existe à ce jour. Ces études fondamentales qui concernent le développement des vaisseaux lymphatiques nécessitent une approche in vivo. L’objectif du projet étant d’analyser ce développement après l’administration d’un traitement visant à supprimer les macrophages pour analyser leur contribution, ce traitement doit être au préalable réalisé et avoir produit ses effets avant d’euthanasier les animaux pour en analyser les conséquences.
Réduction
La molécule utilisée pour détruire sélectivement les macrophages, a une action effective seulement 24h post-administration voire quelques jours post-administration selon le tissu et le mode d’administration utilisé. C’est pourquoi l’euthanasie des animaux pour caractériser le réseau lymphatique nouvellement formé sera réalisée à Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après l’injection, période au cours de laquelle se développe ce réseau vasculaire. Afin de tenir compte du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, il sera utilisé un test statistique pour le traitement des données limitant le nombre de répétitions des expériences. Dans ce contexte, la prise en compte des résultats obtenus antérieurement permet de définir un nombre d’échantillons nécessaires à 8 yeux par groupe d’étude. Par ailleurs, l’œil des animaux étudiés se trouvant fermé aux âges considérés, les 2 yeux de chaque animal seront utilisés, lorsque justifié par l’expérience, dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés pourra être revu à la baisse à l’issue des résultats obtenus lors de la première série de traitement au cours de l’expérience de déplétion des macrophages, en privilégiant l’un des stades de développement proposés (jour 2, jour 3, jour 5 ou jour 7) pour la suite de l’étude.
Raffinement
La douleur potentielle de la piqure sera atténuée par l’analgésie par le froid en positionnant l’animal nouveau-né sur la glace avant la piqure. L’injection est réalisée à température ambiante sous loupe binoculaire permettant de visualiser avec précision le geste effectué. La finalisation du réchauffement du nouveau-né, débutée lors de la manipulation, est obtenue en plaçant celui-ci 2 à 3 minutes sur un tapis chauffant à 37°C avant son retour le plus rapidement possible dans le nid auprès de la mère. Il sera veillé à enduire le corps du nouveau-né avec une goutte d’urine de la mère pour éviter tout risque de rejet
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet sont des souris C57BL6/J sauvages. Ce modèle murin est bien caractérisé pour la distribution et le développement du réseau vasculaire lymphatique de la surface de l’oeil. Plusieurs études ont également montré de nombreuses similitudes du modèle souris avec le modèle humain pour la caractérisation des atteintes et troubles oculaires, notamment concernant la formation des vaisseaux ainsi que pour les voies et mécanismes de régulation de la pression intraoculaire. Les animaux utilisés seront des nouveau-nés : Injection à Jour 0 (jour de la naissance) ; Euthanasie à Jour 1 ou Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après la naissance, selon l’expérience considérée. Les données de la littérature ainsi que nos observations montrent que les étapes précoces du développement du réseau vasculaire lymphatique de surface de l’œil de la souris C57BL6/J se déroulent au cours des premiers jours après la naissance (entre Jour 0 et Jour 7 après la naissance).
Etude des biomarqueurs métaboliques hôtes-microbiens pour renforcer l’immunothérapie du mélanome humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales de mélanome sous la peau, avec prélèvements de sang et de selles, pour tester l'effet de métabolites du microbiote sur la réponse à l'immunothérapie, avant d'être tuée pour prélever ses organes. Le porteur indique que l'immunothérapie ne bénéficie qu'à une minorité de patients et présente ce traitement comme "incontournable". Sur le remplacement, il répète qu'un système immunitaire ne peut être reconstitué in vitro et juge le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
L’immunothérapie est désormais incontournable dans la prise en charge des cancers du mélanome, du poumon et du rein. Ce traitement est basé sur la stimulation des défenses immunitaires de l’organisme favorisant la reconnaissance et la destruction des cellules cancéreuses. Bien qu’elle soit attractive, l’immunothérapie présente une efficacité restreinte, ne bénéficiant qu’à une minorité de patients répondeurs (35 %). Il est donc urgent de trouver de nouveaux biomarqueurs impliqués dans cette non-réponse à l'immunothérapie et d'en comprendre les mécanismes de résistance associés. Ce projet permettrait d'améliorer l'efficacité de l'immunothérapie des individus non-répondeurs à et in fine à en limiter la progression du cancer. Des études récentes suggèrent que le microbiote de l'hôte, c'est à dire l'ensemble des microorganismes de notre organisme, conditionne cette réponse immunitaire lors d'une l'immunothérapie et est indispensable à l'obtention d'un prognostique favorable du patient. Certains de ces effets bénéfiques du microbiote intestinal ont été attribués aux espèces bactériennes de l'hôte. Cependant, une simple corrélation de ces bactéries a été associée à une réponse efficace, sans démontrer leur causalité et les mécanismes associés. À l'heure actuelle, la métabolomique, est science récente qui permet d'étudier les métabolites issus de l'organisme et est utilisée pour identifier les métabolites, biomarqueurs d'impact sur le métabolisme complexe du patient et sur l'immunothérapie. Dans ce projet, nous sommes intéressés au métabolome de 3 cohortes de patients atteints de mélanome, recevant une immunothérapie. L’analyse du métabolome du sérum de patients hyper-répondeurs à l’immunothérapie et avec prognostique favorable, a permis d’identifier 17 métabolites d'origine de l'hôte et du microbiote. Basés sur ces résultats, l’objectif de notre projet est i) d’évaluer et valider in vivo l’effet de ces métabolites sur la croissance tumorale dans des modèles préclinique du mélanome, et d’en identifier les mécanismes métaboliques hôtes-microbiens associés, et ii) déterminer l’effet des meilleurs métabolites immunostimulants sur l'efficacité des agents immunothérapeutique dans le mélanome.
Bénéfices attendus
Ce projet sur les métabolites immunostimulateurs associé au mélanome et leur rôle potentiel dans l'efficacité de réponse à l'immunothérapie permettra: 1) de valider et de caractériser fonctionnellement les empreintes du microbiome intestinal associées au cancer et à l'immunothérapie 2) d'évaluer une pertinence clinique pour le pronostic des patients 3) développer des outils de diagnostic qui pourraient enrichir l'arsenal oncologique pour la prévention, la prédiction et la personnalisation de la thérapie du cancer.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, nous prévoyons 2 prélèvements fécaux/souris récoltés de manière naturelle (lors de la prise de la souris engendrant une défécation naturelle) (2 à 3 fèces/ souris), au Jour 7, et lors de la fin de la procédure destiné à l'analyse de la composition du microbiote, métabolome, durée 10 secondes. Nous prévoyons également 2 prélèvements de sang/souris : sur souris vigiles après anesthésie locale (lidocaïne) à Jour 7, durée 5 minutes, , lors de la fin de la procédure pour l'étude du métabolome de l'hôte. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 2 minutes (une par animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées aux injections et prises de sang, ainsi qu'à la présence de tumeurs greffées par voie sous-cutanée.
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de prélèver différents organes pour analyse du métabolome et du microbiote intestinal.
Remplacement
Il est maintenant indispensable de valider leur effet anti-cancéreux et sur l’immunothérapie à l’échelle de l’organisme entier, de façon à prendre en compte les interactions complexe de la réponse immunitaire antitumorale, celle de l’hôte et du microbiote intestinal, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal. Ce projet pourra ainsi permettre d’améliorer l’efficacité des immunothérapies des non-répondeurs par l’intermédiaire de nouveaux biomarqueurs métaboliques. L’analyse de l’impact des métabolites sur le métabolisme de l’hôte et sur son système immunitaire nécessitant l’utilisation d’un organisme complexe, le recours à l’animal est indispensable. En effet, utiliser uniquement une approche in vitro exclurait la prise en compte des possibles interactions intervenant chez l’hôte. Nous avons besoin d’un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Comme il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité, il est absolument nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été défini à l’aide d’études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin de solliciter un nombre minimum d’animaux, tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques exploitables. Le nombre de groupes proposé inclut les groupes contrôles nécessaires. L’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Par ailleurs, une veille bibliographique constante sera faite pour éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Les expérimentations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Durant l’expérimentation, l’état de santé des animaux sera surveillé quptodiennement permettant l’intervention rapide en cas de problème. La mise en place d’une grille de suivi clinique et des points limites qui seraont strictement appliqués permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: i) La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ii) La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Enfin dans la littérature, la souris C57Bl6/J s’avère être la souche la plus utilisée pour l’analyse du métabolisme et l’étude de l'interaction du microbiote intestinal sur son métabolisme. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire et le métabolisme est mature (développement thymique achevé). Ceci permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie chez l’Homme adulte, âge où sont suivi est important. De plus, les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.
Évaluation de molécules à visée thérapeutique dans des modèles murins de neuropathie périphérique induite par une atteinte du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 612
1 224 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une ligature, un écrasement ou une compression du nerf sciatique pour provoquer une douleur neuropathique, évaluée ensuite par la réponse à des stimuli mécaniques ou thermiques. Le porteur indique qu'aucun antidouleur n'est envisageable puisqu'il s'agit d'un modèle de douleur, et qu'un animal en douleur très importante sera tué immédiatement. Sur le remplacement, il juge le modèle animal "incontournable" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne prend en compte l'"organisme entier".
Objectifs
Les neuropathies périphériques sont des atteintes du système nerveux somatosensoriel dont les causes sont nombreuses. Les douleurs neuropathiques périphériques sont la conséquence d’une lésion du système nerveux périphérique et peuvent concerner un plexus (arrachement du plexus brachial), une racine (sciatique) ou une atteinte tronculaire (atteinte du médian, du péronier ou atteinte plus diffuse des nerfs périphériques). Elles sont caractérisées par des paresthésies (fourmillements, jambes sans repos), des engourdissements, des douleurs diffuses musculaires et névralgiques (déchirures, broiement), des sensations de brûlures causées par une hyperalgésie thermique (hyper-réactivité à des variations de température), souvent concomitante à une hypersensibilité aux stimuli mécaniques; ces douleurs sont ressenties aux extrémités des membres et sont extrêmement invalidantes. Des phénomènes de douleurs neuropathiques sont observées aujourd’hui chez 8 % de la population générale et constituent de ce fait un enjeu clinique important. Cependant, les traitements thérapeutiques actuels pour diminuer la douleur chez ces personnes sont insuffisants et peu efficaces sur la durée, du fait également des effets indésirables qu’ils génèrent. Il est donc nécessaire d’identifier de nouvelles thérapies pour prévenir et/ou traiter la neuropathie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché une molécule permettant aux patients atteints de cette pathologie de réduire voire effacer l'inconfort associées à cette pathologie, ainsi que de retrouver une sensibilité aux niveaux des membres atteints.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie, ainsi qu'une chirurgie (ligature, écrasement ou compression du nerf sciatique). Cette chirurgie aura lieu une seule fois dans la vie de l'animal et durera environ 20minutes. La sensibilité et/ou la douleur sera évaluée suite à cette chirurgie soit par évaluation du temps de réponse à un stimuli mécanique et/ou thermique selon la thématique.
Impact sur les animaux
Les chirurgies effectuées pour induire les douleurs peuvent générer des douleurs chez l'animal en post-opératoire. L'utilisation d'anti-douleur n'est pas evisageable dans ce cas particulier puisqu'il s'agit de modèle de douleur. L'environnement sera fortement enrichit pour augmenter le confort de l'animal, sa surveillance sera quotidienne. Si une observation clinique permettait de révèlait une douleur très importante chez l'animal alors ce dernier sera mis à mort immédiatement.
Devenir
3 lots de 40 animaux issus des procédures 1, 2 et 3 seront inclus dans les procédures 4 et 5 pour imagerie puis seront mis à mort . Tous les autres animaux des autres procédures seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux de neuropathies périphériques est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement lors de certaines maladies chroniques ou traitements thérapeutiques lourds. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergés selon la directive 2010/63 avec un milieu enrichi (coton, igloos...). Des points limites ont également été définis et seront appliqués si l'état clinique des animaux le nécessite.
Choix des espèces
La souris et le rat se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la douleur et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. De jeunes adultes (6-10 semaines) seront utilisés dans ce projet, il s’agit de jeunes animaux qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études
Etude du rôle des vésicules extracellulaires dans les complications cardiovasculaires associées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit un régime gras pendant seize semaines pour induire obésité et diabète, avec échographies, seize mesures de pression artérielle, prélèvements sanguins et douze injections de vésicules, avant que toutes soient tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que le régime provoque prise de poids, diabète de type 2 et mobilité réduite chez 240 souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun moyen ne peut remplacer une étude portant sur l'organisme entier.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un travail expérimental plus global ayant débuté́ en 2008 par l’étude du rôle des vésicules libérées par les cellules dans le développement du syndrome métabolique. Même si les résultats acquis montrent un rôle prépondérant des vésicules dans cette pathologie, les mécanismes par lesquels ces vésicules peuvent favoriser la formation de la plaque d’athérome et le développement de complications cardiovasculaires lors de l’obésité ne sont pas complétement connus. Cette expérimentation animale sur le modèle de souris knock-out pour plusieurs protéines jouant un rôle dans l’inflammation et le diabète nous permettra de valider les effets délétères des vésicules et d’obtenir des données en vue d’utiliser les vésicules comme des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que d’être proposées comme nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Démontrer l'implication des vésicules extracellulaires portant des protéines jouant un rôle dans le processus inflammatoire et dans le développement de la plaque d'athérome liée à l'obésité et au diabète. En plus, ces protéines transportées par les vésicules extracellulaires se sont avérés être des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques possibles pour le traitement
Procédures
Cinq interventions : - Régime riche en graisse : 16 semaines - Echographie : 3 mesures (début de protocole, mi-parcours, fin de protocole) - Mesure pression artérielle : 16 mesures, 1 fois par semaine pendant 16 semaines - Prélèvement de sang sur animaux vigiles : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime - Injection de vésicules : 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 4 semaines du protocole)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2 ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de sang à la base de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 240 souris sur 480, qui seront nourris avec le régime riche en graisse durant 16 semaines. L’effet 4 concernera l’ensemble des souris.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.
Remplacement
Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et que seule l’expérimentation animale permet un suivi complet de la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, des mâles et des femelles seront utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon complémentaire et hebdomadaire en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses). Comme le régime riche en graisse peut induire un diabète de type 2, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de détecter toutes pathologies liées au diabète. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores et la définition de points limites de Morton et Griffiths. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. En effet, les animaux sont issus d’un élevage, et il peut avoir un seul mâle par portée, rendant impossible de mettre des mâles de différentes portées ensemble afin d’éviter des conflits entre eux qui peuvent s’accompagner de blessures. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes en cartons pour se cacher et faire des nids. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. L'absence de ces protéines protège contre la réponse inflammatoire et le diabète, donc les phénotypes ne sont pas dommageables. L'absence d'une troisème protéine induit une prédisposition au développement de la plaque d’athérome, le modèle est le plus utilisé pour étudier l’athérosclérose. Les souris db/db présentent une mutation spontanée du récepteur à la leptine (modèle utiliser pour étudier le diabète et l'obésité). Avec un régime de 16 semaines la plaque est dans son état précoce.
Choix des espèces
Ce projet vise à analyser l'implication des protéines inflmmatoires dans le processus de développement de l'athérosclérose liée à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement l’implication des vésicules extracellulaires portant ces protéines dans le processus inflammatoire qui précède le développement de la plaque d'athérome. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.
Rôle de la protéine X dans le maintien de la tolérance immunitaire par les lymphocytes T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une irradiation puis une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie et deux injections intrapéritonéales, pour étudier une protéine régulant les lymphocytes T dans l'auto-immunité intestinale. Le porteur indique qu'environ 30 % des souris modifiées développent une inflammation ano-rectale, et que les animaux sont tués par dislocation cervicale pour prélever rate, ganglions et côlon. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent être reproduites in vitro de façon fiable.
Objectifs
Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux constituants normaux de l'organisme. C'est par exemple le cas dans le diabète de type 1, la sclérose en plaques ou encore la maladie de Crohn. Ces maladies sont généralement la conséquence d’une activation incontrôlée des lymphocytes T (LT). La caractérisation des protéines régulant l’activité des LT a donc un fort intérêt thérapeutique. Nous avons développé un modèle de souris dans lesquelles la protéine X est spécifiquement invalidée dans les LT ; certaines de ces souris développent spontanément une auto-immunité spécifiquement dans le colon, caractérisée par une forte activation des LT. Nous souhaitons confirmer ces données sur une cohorte plus large d’animaux, puis étudier les rôles spécifiques de X dans les différents sous-types de LT afin d’identifier le mécanisme responsable de la survenue de l’auto-immunité.
Bénéfices attendus
Ces travaux ont tout d’abord une portée fondamentale, puisqu’ils pourraient permettre l’identification d’un mécanisme moléculaire responsable du développement des maladies auto-immunes touchant l’intestin. D’autre part, nous espérons mettre en évidence les niveaux d’expression de la protéine X comme facteur de risque ainsi que comme cible thérapeutique dans ces maladies.
Procédures
Les souris seront soumises à une irradiation (30 minutes), puis recevront une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale (1 minute). Huit semaines plus tard les animaux vigiles recevront deux injections intra-péritonéales à 24h d’intervalle (2x 30 secondes).
Impact sur les animaux
Environ 30% des souris déficientes pour la protéine X développent une inflammation ano-rectale à partir de 9 mois après la naissance ; il s’agit d’un phénotype dommageable de gravité moyenne. Les autres souches de souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. L'irradiation suivie de reconstitution de moelle, l'injection de cellules par voie intraveineuse et l'injection intrapéritonéale ne provoquent pas d’effets secondaires dommageables détectables chez la souris. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et colon seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux et analyses histologiques. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X dans la fonction des lymphocytes au cours de l’auto-immunité intestinale.
Remplacement
Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.
Raffinement
Certains animaux transgéniques utilisés développent un phénotype dommageable (prolapsus rectal) ; d’autre part certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (irradiation, injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer spécifiquement le rôle de la protéine X dans les lymphocytes T et la survenue de l’auto-immunité. Ces animaux seront suivi jusqu’à un an après la naissance.
Etude de l’implication de l’enzyme épigénétique Ezh2 lors de l’inflammation et de la dysfonction cardiaque induite après un infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit sous anesthésie une ligature d'une artère coronaire qui provoque un infarctus puis une insuffisance cardiaque, suivie d'échographies, pour étudier une enzyme impliquée dans la réparation du cœur. Le porteur indique avoir déjà testé le traitement in vitro mais juge le recours aux animaux "nécessaire" pour valider la preuve de concept à l'échelle de l'"organisme entier". Une analgésie pré et postopératoire est prévue.
Objectifs
L'objectif central du projet de recherche expérimental est de déterminer l’implication d'une enzyme épigénétique nommée Ezh2 lors réparation cardiaque après un infarctus du myocarde. Ces résultats pourraient s'avérer déterminants pour identifier une nouvelle cible thérapeutique de l'insufisance cardiaque, une maladie consécutive à une mauvaise réparation du coeur après un infarctus du myocarde. Un objectif secondaire consistera dans un second temps, à déterminer si l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de cette enzyme peut être considéré comme un traitement pour cette pathologie.
Bénéfices attendus
Découverte d'un traitement innovant, concernant la rpéparation du coeur.
Procédures
Tous les animaux (360) auront une intervention chirurgicale (ligature coronaire) et une évaluation fonctionnelle par échographie.
Impact sur les animaux
Les animaux, après la ligature coronaire, développerons un infarctus du myocarde, puis une insuffisance cardiaque.
Devenir
Procédure N°1 maitien en vie Procédure N°2 opération chirugicale pour tous les animaux Procédure N°3 maintien en vie (une injection en IP) Procédure N°4 évaluation fonctionelle et mise à mort Procédure N°5 prélèvements biologiques
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogénèse de cardiomyopathies, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques. En effet, des études dans nos modèles animaux sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors de l’inflammation (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et des cardiomyocytes en réponse soit à l’hypertrophie soit à l’inflammation auto-immune). Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. Les effectifs nd'animaux nécessaire et l'analyse de nos résultats sont déterminés à l'aide de tests statistiques adaptés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie selon un test de puissance statistique appliqué sur des données historiques du laboratoire. Une meilleure survie post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe. Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous avons déjà évalué l’effet du traitement pharmacologique in vitro (article en révision à Nature Communications). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire pour obtenir les preuves de concepts démontrés in vitro à l’échelle de l’organisme entier in vivo.
Raffinement
Afin de limiter l’angoisse des animaux les opérations auront lieu 1 semaine après l’arrivée des souris au sein de l’animalerie afin qu’elles aient un temps d’adaptation et de repos suite au transport. Les opérations auront lieu dans une pièce isolée, calme, avec un seul expérimentateur présent afin de limiter les mouvements et les sources de bruit. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale, après contrôle de la profondeur de la sédation. Une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée 30 min avant puis 6h après la chirurgie. Une dose d'analgésie sera renouvelée sur les 48-72h post-opératoires en fonction de signes de douleurs. Application d'un anasthésique local avant incision. Un gel oculaire, permettant de maintenir une hydratation satisfaisante de la cornée, est appliqué (Humigel). L’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) par cage avec un enrichissement (des plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) sera réalisé. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé (température 21°C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux, durée du cycle de lumière (12h/12h).
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathie chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques tels que l'invalidé d'un gène de manière spécifique dans un type cellulaire voulu (cellules myéloïdes), qui ne sont souvent pas accessibles chez le rat. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure des animaux adultes de 20-24g pour ce projet. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée de la chirurgie et correspond à un âge habituel pour la thérapie génique rapporté dans la littérature.
Etude fonctionnelle des cellules souches lors de l’expansion ex vivo et de la conservation de greffons hématopoïétiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, d'une lignée fortement immunodéprimée, reçoit un conditionnement au busulfan puis des injections de cellules souches sanguines humaines, avant d'être tuée pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. Le porteur indique que le busulfan entraîne une perte de poids et que de rares animaux développent une réaction du greffon contre l'hôte conduisant à leur euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que le nichage des cellules souches dans l'organisme ne peut être reproduit in vitro.
Objectifs
Notre laboratoire a pour mission le développement et la conservation des greffons contenant des cellules souches sanguines humaines. Ces greffons sont utilisés pour le traitement par thérapie cellulaire de patients atteints de pathologies hématologiques telles que certaines leucémies, mais aussi dans certains cas, pour le traitement de cancers solides tels que le cancer du sein. Les procédures de greffe mises en oeuvre nécessitent une recherche permanente visant à améliorer et faciliter les procédures de greffe et à accroître l'efficacité de la greffe. L’objectif de ce projet vise l’optimisation de la qualité des greffons ainsi que le développement d'une nouvelle génération de greffon de cellules souches. Il s’agit principalement de préserver, voire augmenter, la capacité fonctionnelle (capacité de greffe) des greffons au cours des différentes étapes de préparation de ces greffons du donneur au receveur et notamment lors des protocoles de conservation, protocoles d’expansion, ou de manipulation géniques de ces greffons. Pour atteindre ces objectifs, il est indispensable de pouvoir analyser les cellules qui composent les greffons et notamment les cellules souches, et de pouvoir les étudier d'un point de vue fondamental.
Bénéfices attendus
Nos recherches sur les greffons hématopoïétiques et sur les cellules souches hématopoïétiques en particulier permettront une meilleure connaissance des mécanismes de régulation des CSH (survie, autorenouvellement, différenciation) d'un point de vue fondamental. Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les conditions de conservation des greffons hématopoïétiques avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques, et (iii) développer une nouvelle génération de greffons (à partir d'une source de cellules encore inexploitée (cellules du sang périphérique en homéostasie)).
Procédures
Les souris utilisées dans se projet seront soumises à des injections réalisées à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Il s'agit de piqûres réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Chaque souris subira un maximum de 3 piqûres réalisées à au moins 24h d'intervalle.
Impact sur les animaux
L'administration de bulsulfan pour le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (
Devenir
A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses, la rate et le thymus des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.
Remplacement
L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des micro-environnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH) seront réalisées chaque fois que possible.
Réduction
Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions expérimentales testées, le nombre d’animaux injectés est fixé à 7 afin d’obtenir les valeurs minimales nécessaires à la réalisation de tests statistiques lors de l’analyse des animaux. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.
Raffinement
Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation qui est marquée par la 1ère injection de busulfan (conditionnement des animaux avant greffe). Cette nourriture a pour but de limiter la perte de poids liée à la perte d'appétit elle-même liée à l'administration du busulfan. Ainsi pour une perte de poids attendue de 20% sans nourriture enrichie, cette perte est limitée à 10% grâce à l'utilisation d'une nourriture enrichie. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en cages de type 2L en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». S'agissant des animaux qui reçoivent une injection de cellules par voie intrafémorale sous anesthésie générale, une analgésie préventive est également administrée quelques minutes avant l’anesthésie générale afin de limiter toute éventuelle douleur au réveil. Tous les animaux concernés par l’injection intra-fémorale sont suivis avec une attention particulière jusqu’à leur réveil et jusqu’à la reprise d’une activité normale (locomotion, prise de boisson, relation avec les congénères…) qui intervient généralement dans les 5 à 10 minutes suivant le réveil.
Choix des espèces
Pour cette étude seront utilisés des souris NSG. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées. Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression de cette souche de souris. Elle représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.
Etude du rôle d’une protéine et des défenses immunitaires dans la guérison de la leucémie.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 344 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules leucémiques prélevées sur des souris malades leur sont injectées dans la veine de la queue, sans anesthésie, avant jusqu'à 21 jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, parfois l'implantation d'une capsule sous la peau du dos et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse dans le fémur sous anesthésie. Le projet cherche quelle partie d'une protéine permet d'éliminer les cellules leucémiques sous traitement, compare pour cela des souris avec et sans système immunitaire, et suit certaines d'entre elles jusqu'à un point limite terminal pour mesurer leur survie. Le porteur justifie le choix de la souris en affirmant qu'elle et l'humain "partagent 99 % de leurs gènes", et en conclut que les résultats "pourront être facilement transposables à l'être humain".
Objectifs
Notre projet s’intéresse à un sous-type de cancer du sang appelé leucémie. Cette maladie est causée par un modification des molécules d’ADN présentes dans les cellules à l’origine des globules rouges et blancs. On observe chez les patients atteints d’une leucémie un blocage de la production de globules blancs fonctionnels, qui s’accumulent dans la moelle osseuse. Les études menées sur des modèles souris de leucémie ont permis d’identifier le rôle essentiel d’un élément cellulaire (on parle de protéine) dans la réponse au traitement. En effet, en absence de traitement, cette protéine est déréglée dans les cellules leucémiques et ne contrôle donc plus leur survie et leur fonctions. Les précédents travaux ont identifié deux médicaments qui permettent l’élimination des cellules leucémiques notamment en redonnant à cette protéine son rôle de régulateur de la survie des cellules. Nous cherchons maintenant à déterminer quelle partie de cette protéine permet d’éliminer les cellules leucémiques en réponse au traitement. Nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris qui possède la même modification d’ADN que les patients et développe spontanément une leucémie. Lorsque ces souris tombent malades, nous pouvons récupérer les cellules leucémiques et les injecter dans de nouvelles souris pour obtenir un modèle fiable, répétable, que nous pouvons analyser en profondeur. Dans ce projet, nous produiront de nouvelles cellules leucémiques qui présentent différentes variations de la protéine pour tester leur réponse au traitement. Des traitements allant de 3 heures à 21 jours seront administrés aux souris malades. Nous utiliserons également des souris ne possédant pas de système de défense immunitaire pour déterminer si ces défenses sont importantes pour guérir de la leucémie. Enfin, nous analyserons directement les cellules leucémiques pour comprendre comment elles réagissent au traitement.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux travaux permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans la guérison de la leucémie ainsi que le rôle que joue le système immunitaire dans la réponse au traitement. A plus long-terme, comprendre les mécanismes qui permettent l’élimination des cellules cancéreuses dans la leucémie pourra amener à de nouveaux traitements dans les autres types de leucémie qui présentent un très mauvais pronostic.
Procédures
Les cellules leucémiques récupérées des souris développant spontanément la leucémie seront injectées par voie intra-veineuse (dans la veine caudale sur souris éveillée, durée de l'injection: 1 minute) dans des souris ayant ou non un système immunitaire (cela permettant de déterminer le rôle du système de défense dans l'effet des traitements). Cette injection permettra le développement de la leucémie dans ces souris. Nous mettrons en place la stratégie thérapeutique en utilisant une combinaison de médicaments couramment utilisés pour traiter ce type de cancer. Cela correspond en l'administration quotidienne d'une molécule thérapeutique par injection intra-péritonéale (dans l'abdomen de la souris éveillée, durée de l'injection: 10 secondes) pendant 21 jours, pouvant être combiné à la mise en place sous la peau du dos de la souris d'une capsule permettant la libération continue du second médicament (implantation réalisée sous analgésie et anesthésie générale, l’opération dure une dizaine de minutes). Dans certaines expériences, deux autres traitements seront évalués. Ils seront administrés dans l'eau de boisson pendant toute la durée de l'expérience. Le suivi du développement du cancer sera suivi par un prélèvement de la moelle osseuse au niveau du fémur. Pour cela les souris seront anesthésiées et recevront un traitement anti-douleur préventif. Le prélèvement sera réalisée 2 fois maximum durant la vie des animaux (avant et après traitement).
Impact sur les animaux
Dans les modèles leucémiques, des signes cliniques de la maladie peuvent apparaître durant sa progression. Ces signes incluent des modifications de l’apparence (manque de toilettage, yeux clos…) ou du comportement (mobilité, agitation) et une augmentation de la taille de la rate. Les prélèvements de la moelle osseuse avant et après traitement pourraient induire une douleur pendant quelques heures après l’intervention. Les traitements utilisés dans ce projet peuvent induire des nuisances. Tout d’abord, l’implantation de la capsule sous la peau du dos peut entraîner une gêne dans le déplacement. Ensuite, les injections dans l'abdomen sont réalisées quotidiennement jusqu’à 21 jours consécutifs, pouvant générer une douleur localisée au site d'injection et un stress lié à la manipulation quotidienne des souris. Enfin, les différents traitements peuvent conduire à une perte de poids des animaux, poids regagné aussitôt le traitement terminé pour les souris dont la survie est étudiée après la fin du traitement.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin du traitement afin de prélever un maximum d’organes et ainsi évaluer les mécanismes d'action de ces molécules thérapeutiques dans le cas des cancers du sang. Certains des animaux seront utilisés pour déterminer la survie des animaux traités jusqu’à l’atteinte des points limites terminaux (euthanasie dès l'atteinte d'un point limite terminal).
Remplacement
Un grand nombre de tests a déjà été effectué sur des cultures de cellules (in vitro). Mais ces modèles sont limités car ils ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant (absence d'interaction entre cellules saines et cancéreuses). De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Enfin, les souris disposent d’un système immunitaire proche de celui de l’humain qui permet d’étudier les interactions entre les cellules immunitaires et la leucémie.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. Un traitement anti-douleur sera administré avant chaque geste pouvant générer une douleur (implantation de la capsule sous la peau du dos, prélèvement de la moelle osseuse dans le fémur).
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs traitements. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes afin de reproduire le plus fidélement possible la pathologie humaine et l'effet des traitements.
Impact de la survenue d’un accident vasculaire cérébral dans un modèle murin de désordres métaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Chaque souris reçoit un régime gras pendant plusieurs mois, des prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital, puis une chirurgie qui bouche une artère cérébrale pour provoquer un AVC. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne sera administré après cet AVC pour ne pas fausser les résultats, et que les souris seront tuées à différents stades pour prélever le cerveau. Sur le remplacement, il affirme qu'un projet de neurosciences intégratives de ce type ne peut être mené in vitro.
Objectifs
Le déclin cognitif est un processus naturel survenant avec le vieillissement. Néanmoins il peut être accéléré et aggravé par la présence de troubles métaboliques, particulièrement lorsque ceux-ci sont présents à un âge moyen, ou par la survenue d'évènements vasculaires cérébraux (AVC). Nous avons montré précédemment sur un modèle à long terme (12 mois) l'apparition progressive de troubles métaboliques en réponse à un régime enrichi en gras (hypercholestérolémie, intolérance au glucose, hyperglycémie de stade prédiabétique, stéatose, augmentation de la graisse viscérale). Des altérations de la flexibilité de la mémoire, de la mémoire de reconnaissance visuelle ainsi que des altérations fonctionnelles des vaisseaux cérébraux de surface et intraparenchymateux ont été observées de manière concomittante et étroitement corrélées à l'augmentation de la graisse viscérale. Le but de cette étude est d'évaluer l'impact de la survenue d'un AVC dans ce contexte de troubles métaboliques et vasculaires, tant en termes de lésions tissulaires et d'altérations vasculaires qu'en termes de déclins moteurs et cognitifs. Des modulations pharmcologiques seront ensuite réalisées pour tenter de freiner les conséquences délétères observées.
Bénéfices attendus
Ce projet a l'avantage de proposer 2 modèles murins totalement maitrisés au laboratoire: la mise en place progressive de troubles métaboliques et l'induction d'une ischémie-reperfusion cérébrale. Ces 2 profils sont souvent retrouvés en clinique humaine et les médecins sont parfois indécis quant à la prise en charge de ces pathologies, d'autant plus quand celles-ci sont associées. Grâce à ces 2 approches, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes d’action et les conséquences observées et envisager, des projets de recherche translationnels avec la clinique.
Procédures
La mise en place des troubles métaboliques chez les souris sera évaluée par des dosages plasmatiques des marqueurs standard (cholestérol, triglycérides, glycémie, leptinémie et insulinémie). Des prélèvements sanguins seront effectués tous les 3 mois de 6 à 12 mois de régime au niveau du sinus rétro-orbital, après anesthésie des animaux à l’isoflurane 2%. Une quantité maximale de 200μl de sang sera récupérée à chaque fois. En parallèle, un test de tolérance oral au glucose sera effectué. Les souris seront mis à jeun 6h avant l'expérience. A 6 mois de régime, les animaux subiront une chirurgie afin d'induire une ischémie cérébrale par le biais de l'occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue sur ce projet repose sur le fait qu'aucun analgésique ne sera administré après l'induction de l'ischémie cérébrale afin d'éviter les effets neuroprotecteurs induits par ces molécules et ainsi ne pas interférer sur les résultats obtenus. Cette absence d'analgésie est justifiée scientifiquement et a été validée lors des précédentes autorisations de projet. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas, et les animaux seront euthanasiés en fonction des poids limites décrits.
Devenir
L'ensemble des animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures d'induction de troubles métaboliques, d'induction d'une ischémie cérébrale et d'imagerie. Ils seront mis à mort à différents temps après les évaluations comportementales (6-9 et 12 mois de régime) par injection létale de pentobarbital (Dolethal, 182,2 mg/kg en ip) dont la dose sera calculée en fonction du poids de l'animal. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Il s'agit d'un projet portant sur l'impact des de la sruvenue d'un AVC en présence de troubles métaboliques, avec des approches neuronales, vasculaires et comportementales . Un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 4800 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études comportementales et la réponse aux traitements présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air), avec enrichissement
Choix des espèces
Les souris de souches C57Bl6 de sexe mâle ont été décrites dans la littérature comme étant un modèletrès pertinent de troubles métaboliques car très sensibles au régine "high fat". D'autre part nous avons au sein du laboratoire une longue expertise des modèles d'ischémie-reperfusion chez la souris. Les animaux seront adultes, âgés de 8 semaines conformément au modèle précédemment développé de troubles métaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, modèle de la maladie d'Alzheimer, subit sous anesthésie une injection de molécules directement dans le cerveau après incision du crâne et pose d'agrafes, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuée pour découper le cerveau en tranches. Le porteur indique que ces lignées développent plaques, déficits de mémoire, troubles moteurs et mort prématurée dès l'âge de six mois. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne conviennent pas et que l'étude des réseaux neuronaux exige un "organisme entier".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie qui, en entrainant la mort des neurones du cerveau, altère la mémoire. L'objectif de ce projet est de permettre une meilleure compréhension des modifications de l’activité des neurones associés à la MA et d’évaluer l’efficacité / toxicité de molécules en développement sur ces modifications. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de souris qui miment la maladie. Ce projet de 5 ans comporte 1 procédure qui consiste à administrer directement au niveau du cerveau, sur animal préalablement anesthésié et analgésié, des molécules en développement afin d’évaluer leur action contre les symptômes de la MA.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique associé à notre plateforme d’enregistrement de l’activité des neurones sur des coupes de cerveau permettra de mettre en évidence les modifications de l’activité des neurones associés à des modèles de la MA et de tester les effets protecteurs de molécules en développement sur les modifications du réseau de neurones impliqués dans la MA. Ce projet permettra ainsi d'approfondir les connaissances actuels sur les déficits neuronaux liés à la MA et ainsi de permettre le développement de nouvelles molécules chez l'Homme afin de traiter ces déficits.
Procédures
Procédure chirurgicale: -Administration d’anti inflammatoire (par exemple, Type Carprofene, 10 mg/Kg SC) ou de morphinique (Type Buprénorphine, Buprecare, 0,03 mg/kg; SC) 30 minutes avant l’anesthésie. (maximum 5 minutes) -Anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane sous 1 litre d'air et maintien 0.5-1.5% d’isoflurane sous 1 litre d'air) (maximum 5 minutes) -Application d’un gel ophtalmique (type Ocrygel) dès que l’animal est endormi afin d’éviter le dessèchement de la cornée. (maximum 2 minutes) -Injection d’un analgésique local en sous-cutané au niveau de la zone à inciser (maximum 2 minutes) -Placement de la souris profondément endormie dans le cadre stéréotaxique dont les barres d’oreilles ont été enduites d’un analgésique local (maximum 5 minutes). -Vérification du niveau d’anesthésie de l’animal en permanence en observant son rythme respiratoire et en testant le réflexe du retrait (maximum 2 minutes) -Incision de la peau (envion1.5 cm) au-dessus du crâne et nettoyage/désinfection de l’épicrâne (Type Vétédine) (maximum10 minutes). -Fermeture de la plaie à l’aide d’agrafes (maximum 5 minutes) Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié selon les méthodes réglementaires (au maximum 5 minutes).
Impact sur les animaux
Le premier modèle de souris utilisé pour ce projet présente une accumulation spontanée et progressive d’un peptide dans le cerveau, formant des plaques. Jusqu'à l'âge de 8-9 mois, les plaques ne sont pas observées au niveau du cerveau. Au cours de cette période "pré-plaque" de la maladie, un déficit de mémoire a été mis en évidence dans ce modèle. A l'âge de 11-12 mois les plaques commencent à apparaitre dans le cerveau. Les 2 autres modèles de souris utilisés pour ce projet sont caractérisés par une modification progressive de la composition d’une protéine présente dans le cerveau dès l'âge de 3 mois, entraînant des déficits de mémoire. Ces souris développent progressivement des problèmes de locomotion, une perte de poids, et un décès prématuré dès l'âge de 6 mois. Suite à l’administration des molécules en développement dans le cerveau, les animaux peuvent présenter des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la phase de chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (anti-douleurs et antibiotiques si besoin). Dans ce cas, les points limites préalablement définis permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces.
Devenir
Les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront tous mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.
Remplacement
L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessite donc l’étude des réseaux neuronaux sur un organisme entier. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des test statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (nids végétaux, copeaux de bois à grignoter, contact visuel et olfactif entre les animaux, commutation progressive de la lumière et interactions fréquentes avec les humains…). Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques (en pré-opératoire) et analgésiques (en pré- et post-opératoire), gel ophtalmique, maintien d'une température constante (tapis chauffant)...Si besoin, les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé après la phase d’opération pendant 3 jours. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 10 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée. L'atteinte d'un point limite entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en oeuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi et dans la procédure expérimentale. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.