Souris

15 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont élevées pour porter des maladies osseuses humaines comme le syndrome de Marfan ou l'ostéogénèse imparfaite, qui provoquent selon le porteur fractures spontanées, déformations de la colonne, dilatation de l'aorte et mort prématurée. Les seuls gestes décrits sont une biopsie d'oreille pour le génotypage et un tatouage, la souffrance venant surtout de la pathologie que ces lignées expriment. Le porteur indique que les animaux sont tués faute de pouvoir se reproduire ou être adoptés, et qu'aucune analgésie particulière n'est prévue.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des souris atteintes de pathologies osseuses dans le but d'étudier ces pathologies : Dysplasie congénitale spondylo épiphysaire (SEDc), Syndrome de Marfan, Aggrécanopathies, Ostéogénèse Imparfaite, Dysplasie Diastrophique et Syndrome d'osteolyse carpotarsien multicentrique (MCTO).

Bénéfices attendus

Ce sont des maladies rares sévères pour lesquelles il n’existe pour l’heure actuelle peu ou pas de traitement. Si ces approches fonctionnaient cela permettrait de développer des traitements efficaces pour les patients et apporter un bénéfice éventuel à long terme pour les patients.

Procédures

1 Biopsie d’oreille sur animal vigile pour le génotypage (10s) ; 1 Tatouage sur les coussinets plantaires sur animal vigile (30s)

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés sont malades. En effet, les animaux atteints de collagénopathies présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris Marfan, ce modèle présentent des troubles cardiovasculaires, en particulier une dilatation progressive de l’aorte (entraînant une baisse significative de l’espérance de vie), une hyperlaxité des articulations et une déformation de la colonne vertébrale et du thorax. Ces symptômes sont également associés à des troubles de la vision. En ce qui concerne les souris Aggrécanopathies, d’après leur description scientifique, les souris présentent avec le temps des difficultés pour s’alimenter à cause d’un mauvais alignement des vertèbres cervicales. En ce qui concerne les animaux Ostéogénèse imparfaite, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une diminution de la densité osseuse provoquant des fractures spontanées. En ce qui concerne les souris MCTO, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une perte osseuse progressive, concernant généralement les os des pattes, entraînant une déformation et un handicap, ainsi qu'une insuffisance rénale chronique dans de nombreux cas. En ce qui concerne les souris Diastrophique dysplasia, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une ostéoporose des os longs, une déformation de la colonne vertébrale sévère entraînant une posture caractéristique avec tête fléchie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car ils ne seront plus en âge de reproduire et le fait que les lignées soient génétiquement modifiées et mutantes empêche tous replacement/adoption.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements nécessaires à l’expérimentation (qui fera l’objet d’un autre PEA) et leur optimisation se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Cependant, l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Plusieurs de ces modèles étant nouveaux, il est possible que le nombre d’animaux nécessaire pour les expérimentations soit amené à changer et donc en conséquence le nombre d’animaux nécessaire en élevage.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les modèles de souris choisis ici sont tous détaillés dans la littérature scientifique pour mimer la maladie humaine. Les croisements seront effectués à partir de 8 semaines d’âge (âge de maturité sexuel). Les femelles seront gardés jusqu’à 10 mois et les mâles 12 mois.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit des injections répétées d'antigènes, parfois avec l'adjuvant complet de Freund, et subit un ou plusieurs prélèvements sanguins à la veine sous-mandibulaire, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et à des médicaments. Le porteur décrit comme nuisances les injections, les prélèvements et l'euthanasie au CO2 en fin d'étude. Sur le remplacement et la réduction, il renvoie à un engagement écrit du client, qui atteste sous-traiter seulement ce qui ne peut être réalisé in vitro et n'utiliser que le nombre d'animaux "nécessaire".

Objectifs

Ces études d’immunisation sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisations sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses – comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine. Les bénéfices sont donc : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement.

Procédures

Injections auxquelles les animaux vigiles pourraient être soumis (voies et volumes) : Sous cutanée : volume maximum sans adjuvant : 0,5ml, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,1ml/site, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (*) : 0,5ml/site, 4 sites max (*) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 4 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra musculaire (*) : volume maximum sans adjuvant : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (**): 0,05ml/site, 2 sites max (*) Si utilisation de l’adjuvant complet de Freund (CFA), le scientifique devra justifier par écrit avant le début de la procédure. (**) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 2 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra péritonéale : volume maximum sans adjuvant : 1ml Intra veineuse : volume maximum sans adjuvant : 0,2 ml Voie de prélèvements possible sur animaux vigiles : Veine sub-mandibulaire. Un ou plusieurs prélèvements sanguins pourront être réalisés en cours de protocole, en respectant les règles suivantes : Prélèvement unique par jour : % du sang total circulant prélevé / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10 % / 2 semaines 15 – 20 % / 4 semaines. Prélèvements multiples par jour : % du sang total circulant prélevé en 24 h / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10-15 % / 2 semaines 20 % / 3 semaines

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Les injections des antigènes +/- d’un adjuvant, Les prélèvements sanguins pour permettre l’obtention de sang, de plasma ou de sérum, L’euthanasie des animaux en fin d'étude.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin d'étude ou en cas d'atteinte de points limites.

Remplacement

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à nous sous-traiter que les études d’immunisation ne pouvant être réalisées in vitro dans l’état de l’art.

Réduction

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à utiliser le nombre d’animaux nécessaire et suffisant à la quantité d’anticorps désirée.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec du matériel de nidification comme enrichissement. Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour les études d'immunisation et en quantité suffisante pour répondre aux demandes spécifiques du scientifique.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent sous la peau une greffe de tumeur colorectale issue de patients, maintenue le temps d'obtenir le matériel biologique, avant d'être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur indique que la nuisance tient à la présence de la tumeur sur le flanc et décrit des travaux en cours pour reproduire le phénomène in vitro et se passer de la greffe. Sur le remplacement, il affirme que seule la souris permet aujourd'hui de conserver les propriétés des tumeurs de patients.

Objectifs

Chez certains patients atteints de cancer colorectal, des cellules tumorales s'échappent de la tumeur en groupes sphériques pour coloniser d'autres organes, formant des métastases. Nous avons observé que certains de ces groupes de cellules sont capables d'adhérer à l'environnement qui les entoure et interagir avec, tandis que d'autres y sont insensibles. Des tumeurs humaines, maintenues en souris puis récupérées après chirurgie, nous permettent de reproduire in vitro ces deux comportements. Ce projet vise à caractériser au niveau cellulaire et moléculaire l'impact des propriétés de ces groupes de cellules tumorales sur leur migration à travers les tissus.

Bénéfices attendus

Les tumeurs humaines maintenues en souris ont des propriétés très proches de celles tumeurs des patients. Après les avoir récupérées, leur étude in vitro participera de manière fiable à la compréhension de nouveaux mécanismes par lesquels les cellules tumorales se déplacent à travers les tissus des patients. Les résultats seront publiés dans des revues scientifiques. Cette étape de migration est une étape clé dans la formation de métastases, dont décèdent aujourd'hui la majorité des patients. Ainsi, sa compréhension permet d'envisager à plus long terme de nouvelles options thérapeutiques, en particulier pour les patients atteints de cancer colorectal, et de mieux anticiper leur pronostic.

Procédures

Implantation unique de greffe de tumeurs de patients sous la surface de la peau, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence d'une tumeur unique sur le flanc (sous-cutanée) de taille modeste.

Devenir

Suite à la greffe de tumeur en sous-cutané opérée sur l'ensemble des animaux, l'ensemble des souris seront mises à mort afin de procéder au prélèvement des tumeurs, ou en cas de dégradation importante de leur état de santé.

Remplacement

Aujourd'hui, seul le maintien sur souris de ces tumeurs dérivées de patients permet par la suite de reproduire le phénotype de polarité épithéliale des sphères de patients. Des études sont en cours au laboratoire visant à reproduire in vitro le phénotype de polarité des sphères issues de rumeurs dérivées de patients afin de pouvoir se passer de la xénogreffe en souris. La durée prévue pour ce projet prend en compte le fait que nous y parviendrions rapidement. Nous avons par ailleurs identifié dans le projet "collamoeboid" financé par l'ANR que certaines propriétés (migration, plasticité) sont partagées par les tumeurs dérivées de patients et des groupes de cellules issus de certaines lignées cellulaires. Ce projet prend donc en compte que certains axes de recherche seront désormais effectués sur des lignées cellulaires plutôt que des tumeurs dérivées de patients greffées sur souris.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux par groupe ainsi que le nombre de modèles de tumeur choisis pour l'étude, grâce à un projet précédent . De plus les souris seront suivies chaque semaine afin de s'assurer de leur bonne santé et bonne cohabitation, et ainsi minimiser le taux d'échec.

Raffinement

Les animaux seront suveillés quotidiennement. L'intervention de greffe sera effectuée sous anesthésie générale. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux bénéficeront de nourriture et d'eau ad libitum ainsi que d'un environnement enrichi.

Choix des espèces

Dans notre projet d’étude, nous allons réaliser des greffes de tumeurs de patients rendant indispensable l’utilisation d’animaux immunodéprimés pour s’assurer du non rejet de la tumeur par l’animal. De plus, les tumeurs de patients utilisés sont issues du consortium CREMEC où des banques de stockage ont été réalisées suite aux passages des tumeurs en souris. Pour ces raisons, ajoutées à l’expérience du personnel animalier dans la manipulation des rongeurs, l’animal le plus pertinent est la souris immunodéprimée pour nos expérimentations. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.

5 000 rongeurs, 4 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner le personnel d'un prestataire de recherche préclinique à des gestes techniques, chaque animal recevant jusqu'à quinze administrations par injection ou gavage et cinq prélèvements sanguins avant d'être tué. Le porteur présente le projet comme un moyen de réduire à terme la souffrance des animaux en fiabilisant les gestes, et indique employer en priorité des animaux surnuméraires. Sur le remplacement, il affirme utiliser d'abord une formation théorique et des supports non vivants pour limiter le recours aux animaux vivants.

Objectifs

La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi les connaissances théorique et pratique des méthodes expérimentales sur le modèle animal. Ce projet de formation vise à réutiliser les animaux surnuméraires non-utilisés ou non -randomisés dans des études dans un souci de réduction. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation s’adresse aux personnes réalisant les procédures expérimentales dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société – prestataire de services en recherche préclinique. Le vétérinaire ou son délégué assure la formation théorique en anesthésie, analgésie, euthanasie et sur le suivi clinique et notamment sur la reconnaissance des signes de souffrance. Les responsables formation qui ont la délégation du responsable de l’établissement assurent la validation des compétences en anesthésie, analgésie et euthanasie. Chaque technicien de recherche suivra un programme de formation, dont une partie nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Dans le cadre de ce programme, chaque technicien doit prendre connaissance et maitriser les techniques d’administration des produits, les techniques de prélèvement sur rongeurs (souris et rats) et les techniques d’imagerie. La formation de chaque technicien sera encadrée par le personnel formé (tuteur) avec les compétences reconnues. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La bonne maitrise des procédures expérimentales non-invasives et invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles.

Bénéfices attendus

Le tutorat pour chaque compétence et la validation du tutorat sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique, ... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale. De plus, la formation continue des techniciens nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelle procédure/technique dans le but d’un raffinement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, des gavages et des prélèvements sanguins. Le nombre d’actions est limité : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 Administrations ou utilisations autres (tonte, imagerie, tatouages) • 5 Prélèvements Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus et en l’absence de points limites atteints. Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes en moins de 30 secondes. Les procédures non-invasives et faiblement invasives comme le gavage, les injections intrapéritonéales et sous cutanées sont réalisées sur les animaux vigiles. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur. Certaines procédures (injections intra-veineuse, intra-musculaire, intra-rectale, prélèvements de sang), nécessitent l’anesthésie gazeuse (isoflurane) pour la contention des animaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de procédures expérimentales non maitrisées peut induire une augmentation du stress, une angoisse ou une douleur.

Devenir

A l’issue de cette procédure les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Application du principe de Remplacement : Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos permettra de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal. L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.

Réduction

Application du principe de Réduction : Pour former le personnel, nous utiliserons principalement et en priorité les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1 et les documents de référence validés par le comité éthique)

Raffinement

Application du principe de Raffinement : Pour cette formation seront utilisés exclusivement les animaux en bon état général. L’état des animaux sera régulièrement évalué, si besoin par le vétérinaire ou par la personne chargée du bien- être des animaux. Toutes les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis seront respectés. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus et une souffrance qui peut perdurer, le tuteur ou la SBEA pourra prendre la décision d’euthanasier l’animal. Les administrations seront avec du sérum physiologique parfois supplémentés par un colorant compatible avec les injections pour les validations de la bonne administration. Les prélèvements sanguins respecteront les recommandations du comité d’éthique. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, l’anesthésie sera privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence du comité d’éthique seront appliqués.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expérience précliniques. L’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences. Animaux adultes. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société

3 092 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'une heure, un protocole de défaite sociale où chacune est mise cinq minutes par jour pendant dix jours au contact d'un agresseur pouvant la blesser, et un test de peur conditionnée, pour étudier l'effet des oméga-3 sur les suites d'un stress chronique. Le porteur reconnaît que la défaite sociale et la chirurgie peuvent nuire aux animaux, ensuite tués pour prélever des structures cérébrales. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des régimes alimentaires et des comportements exige des animaux vivants et vigiles.

Objectifs

Le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Notre laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.

Bénéfices attendus

L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.

Procédures

1 - procédures chirurgicales - durant 1h d'opération / 2 - protocole de défaite sociale - 5 minutes pendant 10 jours / 3 - test de peur conditionnée - 5 minutes par jour pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

Le protocole de défaite sociale ainsi que les interventions chirurgicales sont susceptibles d'induire des nuisances sur les animaux. Au cours de la défaite sociale, les 5 minutes en contact avec l'agresseurs représentent un délai conséquent pouvant être source de blessures. L'attention des expérimentateurs est tout particulièrement maximale à ce moment là, et en cas d'attaques trop fortes mettant en danger la vie de la souris, les animaux sont séparés. Au cours de la chirurgie tous les moyens sont mis en oeuvre pour respecter les conditions d'aseptie mais le risque d'infection n'est pas négligeable, justifiant un suivi post-opératoire strict. Le test de peur conditionné est une source de stress pour les animaux, une attention particulière est apportée au animaux avant, pendant et après l'expérience. Le reste des procédures ne représente pas de nuisances pour les animaux. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en œuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre de la défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée pour les protocoles de défaite sociale, et de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Les régimes alimentaires démarreront après 3-7 jours d'acclimatation et se poursuivront pendant 8 semaines jusqu'aux expériences de comportement. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte. Les souris issues de la reproduction intramuros seront sevrées à l'âge de P21. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Les expériences de comportement démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines afin de voir les effets à long terme des différentes expériences.

16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris porteuse d'une tumeur du foie reçoit cinq injections intraveineuses et neuf séances d'imagerie sous anesthésie sur quatre semaines, pour vérifier si des nanoparticules atteignent la tumeur. Le porteur indique que la croissance de la tumeur constitue une source de souffrance possible, se traduisant par la prostration et une grosseur abdominale, les souris étant ensuite tuées pour prélever le foie. Sur le remplacement, il affirme que les essais in vitro sur lignées cellulaires doivent être complétés par un test in vivo qu'il juge "indispensable".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des types de cancer du foie. Il est au cinquième rang mondial en terme d’incidence et au deuxième en terme de décès par cancer et son incidence est en augmentation constante. L’introduction de l’immunothérapie dans le traitement du CHC à un stade avancé a récemment permis d’augmenter la survie globale de certains patients. Néanmoins, le sorafenib, un médicament utilisé depuis 15 ans, reste toujours une option thérapeutique. Le sorafenib limite la croissance de la tumeur. Malheureusement, des phénomènes de résistance au sorafenib apparaissent souvent. Identifier des molécules qui permettraient de lutter contre l’apparition de ces phénomènes de résistance est donc un enjeu très important pour améliorer la survie des patients atteints de CHC. Plusieurs molécules jouant ce rôle ont été identifiées in vitro, parmi lesquelles, des petits ARN, dits ARN interférants (siRNA). Comme la preuve en a été faite avec les vaccins contre le coronavirus, les ARN peuvent être transportés vers et délivrés à des cellules de l’organisme à l’aide de nanoparticules. Ils ont l’avantage 1) de présenter en général une plus faible toxicité que les médicaments classiques in vivo et 2) d’avoir également montré leur efficacité dans d’autres types de cancer. Le but du projet est de vérifier que l’on peut apporter des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (LNP) au sein d’un CHC chez la souris. Si la réponse est positive, l’étape suivante consistera à déterminer si la combinaison sorafenib – siRNA permet d’augmenter l’effet du sorafenib seul et donc, d’entraîner la régression, voire la disparition des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) sont de plus en plus utilisés dans la thérapie du cancer. De nombreux essais cliniques sont en cours et un siRNA avait déjà reçu l’autorisation de mise sur le marché de l’administration américaine (FDA) en 2018. Déterminer s’il est possible d’utiliser cette technologie dans un modèle de cancer du foie chez la souris est important pour pouvoir ensuite valider la capacité de siRNA sélectionnés à réduire, voire à faire disparaître des tumeurs du foie, en combinaison avec le sorafenib, médicament de référence dans le traitement de ce cancer, mais qui permet essentiellement de ralentir la croissance de la tumeur, quand il est employé seul.

Procédures

Les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse avant les 5 injections intraveineuses (30 secondes par injection) et les 9 examens d’imagerie (5 à 10 minutes par examen) qu’ils subiront pendant les 4 semaines de l’expérience, de façon à limiter au maximum la douleur et l’angoisse. Pour améliorer les conditions d’anesthésie, la chambre d’accueil dans laquelle se trouve l’animal durant l’acquisition des images est chauffée à 37°C.

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs du foie pendant la durée de l’expérience constitue une source de souffrance possible. Elle se traduit généralement par un état de prostration et une grosseur abdominale. Concernant l’expérience elle-même, les injections par voie intraveineuse et les scanners seront effectués sous anesthésie gazeuse, par le personnel de la plateforme d’imagerie formé à ces gestes techniques, ce qui réduira l’angoisse et la douleur des animaux. Les produits injectés n’ont pas de toxicité décrite. Néanmoins, les souris seront particulièrement surveillées dans les 48 heures suivant l’injection des LNP pour détecter l’apparition éventuelle de signes de toxicité (ulcération cutanée, prostration, dyspnée).

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure, leur foie prélevé pour vérifier l’absence de lésions hépatiques causées par l’administration des siRNA encapsulés dans des nanoparticules et pour confirmer la présence de la fluorescence dans la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de cancer du foie ont montré l’efficacité des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) seuls et surtout en combinaison avec le sorafenib. Pour se rapprocher de conditions plus physio-pathologiques, il est indispensable de tester leur efficacité sur des modèles in vivo.

Réduction

Lors d’une précédente expérience, les bons résultats obtenus en cours d’expérience nous ont permis de ne pas utiliser tous les animaux prévus au départ. Ce sont ces animaux restants que nous utiliserons dans le présent projet. D’autre part, les effectifs définis ont été déterminés sur la base de notre connaissance de ces souris, en particulier de la cinétique de développement de leurs tumeurs du foie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 5 souris de même sexe par cage. Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. L’acquisition des images aura lieu sous anesthésie gazeuse dans une chambre chauffée à 37°C, pour réduire l’inconfort et l’angoisse des animaux

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose en cancérogenèse, pour se rapprocher au mieux du développement tumoral chez le patient. C’est en particulier le cas du cancer du foie. Les souris utilisées dans le présent projet développent des tumeurs du foie aux alentours de 20 semaines. C’est donc à cet âge que les souris rentreront dans la procédure.

398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une invalidation du gène Bmp9 reproduisant la maladie de Rendu-Osler, sont isolées seize heures par mois pendant quatre mois pour recueillir leur urine et reçoivent des injections sous anesthésie sans être réveillées. Le porteur indique qu'environ 40 % des mâles peuvent perdre du poids rapidement et présenter des atteintes du foie et du rein, et que l'isolement peut les angoisser, tous les animaux étant tués pour prélever organes et tissus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue une maladie touchant plusieurs organes et s'aggravant avec l'âge.

Objectifs

La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes (atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau). Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Des gènes responsables de cette maladie ont été identifiées chez les patients atteints de Rendu-Osler. Le modèle de souris du laboratoire permet de reproduire la plupart des symptômes des patients. L’objectif du projet est de comprendre comment les vaisseaux sont perturbés chez les patients et à partir de nos observations de proposer de nouvelles pistes de traitement pour une meilleure prise en charge. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie, cerveau).

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier et caractériser des manifestations phénotypiques chez les souris Bmp9-KO s’apparentant à celles de la pathologie humaine (dilatations de petits vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses, malformations artério-veineuses dans les différents organes fréquemment touchés par la pathologie). Il est attendu que ces éléments apparaissent et s’intensifient sur les animaux vieillissants comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur le développement de la maladie. Actuellement les patients ne bénéficient que de traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. Les attendus de ce projet sont d’apporter des connaissances scientifiques en recherche fondamentale, publiées pour être rendues accessibles à l’ensemble de la communauté scientifique. A plus longue échéance, l’objectif est, en étroite collaboration avec des cliniciens, d’élargir le champ des possibilités thérapeutiques pour les patients en ciblant des mécanismes de la pathologie qui n’avaient pas été explorés auparavant.

Procédures

Dans une des procédures, une fois par mois pendant 4 mois, les animaux vigiles sont isolés pendant 16h pour le recueil de leur urine. Pour toutes les autres procédures de ce projet, les animaux seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Dans certaines procédures, les animaux recevront en plus un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Après anesthésie, les animaux peuvent recevoir par injection un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes selon les procédures. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures. Dans une seule des procédures, le groupe d’animaux vigiles recevra une injection d’un réactif (durée du geste n’excédant pas quelques secondes), qui diffusera pendant 3h avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont variables en fonction de la procédure. 1) Dans la procédure d’élevage, environ 40% des mâles peuvent présenter une perte de poids rapide. Les animaux mâles et femelles peuvent aussi présenter de manière variable et non prévisible des atteintes sur différents organes : foie et rein. 2) Dans la procédure de recueil des urines, les animaux peuvent être angoissés par l’isolement pendant 16h.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, sauf pour celle qui concerne le suivi métabolique, tous les animaux soient euthanasiés , afin de récupérer les organes, les tissus ou les cellules. A l’issue de la procédure de suivi métabolique, les animaux seront inclus dans la procédure «Etude de la prolifération cellulaire et collecte d’organes » au cours de laquelle ils seront euthanasiés pour récupérer les organes.

Remplacement

Il est possible d’obtenir des cellules de patients ayant les mutations responsables de la pathologie. Ces cellules sont utilisées pour des études sur la voie de signalisation in vitro. En revanche, il n’est pas possible à partir de ces cellules isolées (qui sont des cellules de poumon ou de foie) d’étudier la manière dont les jonctions anormales entre les veines et les artères se forment, ni d’étudier le retentissement de ces malformations sur différents organes tels que le cœur, ou les saignements intestinaux par exemple. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant reconstituer la pathologie de Rendu-Osler qui affecte différents organes et dont les symptômes s’intensifient avec l’âge. Il est également très difficile, pour des raisons éthiques, d’obtenir des cellules de foie ou de poumon d’individus sains.

Réduction

Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. 10 souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tous les animaux ayant été utilisés dans la procédure pour le recueil des urines, pourront être utilisés dans une autre procédure. De la même manière, les animaux reproducteurs seront également réemployés dans d’autres procédures.

Raffinement

Afin de surveiller le bien-être des animaux, la mise en place de points limites et une visite quotidienne pour évaluer les différents points seront effectuées. Les points limites décrits sont des signes qui pourraient être observés pendant l’élevage de l’animal dans l’animalerie. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet seront des souris qui présentent une mutation génétique donnant les mêmes symptômes que les patients de Rendu-Osler. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le rôle de ce gène dans le développement de la maladie de Rendu-Osler. Les souris sont suivies tout au cours de leur vie. La maladie de Rendu-Osler est une maladie dont les symptômes apparaissent avec l’âge. Pour évaluer l’évolution des symptômes chez les souris, des groupes d’animaux seront constitués et analysés à différents âges pour comprendre le développement des anomalies et les premiers mécanismes qui se développent avant même l’apparition de symptômes.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc puis une injection de cellules Natural Killer dans le sinus rétro-orbitaire, avec une mesure quotidienne de la tumeur, pour étudier l'activité antitumorale de ces cellules immunitaires. Le porteur indique que les souris sont tuées quand la tumeur atteint 15 millimètres ou dès qu'un point limite est atteint, comme une gêne au déplacement ou une prostration. Sur le remplacement, il affirme que le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires en jeu rend la modélisation in vitro impossible et que les cellules NK n'existent que chez les mammifères.

Objectifs

Les cellules immunitaires Natural Killer (NK) appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes. En effet, ces cellules sont capables de reconnaître et d’éliminer les cellules infectées par des virus mais également les cellules cancéreuses. Ces cellules sont également douées d'une certaine mémoire, ce qui signifie que leur réponse sera amplifiée lors d'un second contact avec une cellule infectée ou tumorale. Ainsi, chez des souris porteuses de tumeurs, il a été montré une diminution de la taille des tumeurs et une meilleure survie des souris quand celles ci sont traitées avec des cellules NK pré-activées. Cette pré-activation consiste en une incubation de 16h de cellules NK purifiées avec un cocktail de cytokines. Les cellules NK ainsi pré-activées sont dites cellules NK mémoires car elles montrent une meilleure survie et de meilleures fonctions effectrices in vitro et in vivo lors d'un second contact avec des cellules tumorales. Le but de ce projet et de mieux comprendre l'interaction et l'importance de chaque cytokine prise séparément et en cocktail sur la préactivation des cellules NK. Il permettra notamment d'évaluer l'importance de différentes voies moléculaires en aval de ces cytokines pour la génération de NK mémoires. Afin d'évaluer leur rôle anti-tumoral in vivo, les cellules NK seront traitées avec différentes combinaisons de cytokines en présence d'inhibiteurs de ces voies. Ces cellules NK seront ensuite injectée à des souris porteuses de 4 types de tumeurs afin d'établir l'importance de ces voies moléculaires sur l'activité anti-tumorale des NK mémoires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact des cellules NK préactivées sur la pousse tumorale et de caractériser les voies essentielles à leur fonction in vivo. Il pourra permettre d'affiner les méthodes de pré-activation des NK, méthodes potentiellement transposable en immunothérapie contre le cancer.

Procédures

Injection de cellules tumorales en sous cutanée sur le flanc droit, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois . Injection de cellules NK purifiées préactivée en intra veineuse au niveau du sinus retro-orbital, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois. Mesure de la tumeur, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, journalier.

Impact sur les animaux

Le transfert de cellules NK par injection intra veineuse au niveau du sinus retro-orbatal ne devrait créer aucun stress particulier. Les cellules tumorales seront injectées en sous cutané au niveau du flanc droit ce qui conduit à une gêne associée à la pousse de la tumeur, c'est pourquoi la mesure de la tumeur sera journalière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint.

Remplacement

Ce type de projet nécessite l'utilisation de modèles animaux, le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu étant trop nombreux et leurs interactions trop complexespour pouvoir être modélisés in vitro. D'autre part, les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères ce qui exclut le recourt à d'autres modèles animaux non mammifères.

Réduction

Une étude bibliographique appuyée par nos expériences relevant d'autres projets nous ont déjà permit de définir les doses de cellules tumorales et NK à injecter ainsi que la cinétique de croissance des tumeurs ce qui limite les études préliminaires. Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé de façon à apporter des réponses statistiquement fiables tout en évitant des mises à mort inutiles (test de LogRank pour les statistiques reliées à la survie, nombre d'animaux par groupe calculé par epiR package version 0.9-030). Afin d'optimiser le nombre d'animaux utilisés de nombreux paramètres sur la pousse de la tumeur, la fonction des cellules NK et leur phénotype à la fin de l'expérimentation seront analysés sur un même animal.

Raffinement

Lors de cette procédure, un suivit des animaux et des mesures journalières de la tumeur seront réalisées. Ainsi l'animal sera mis à mort lorsque le plus grand diamètre de la tumeur atteint 15 mm (Workman et al, BJC, 2010). D’autre part, les animaux seront mis à mort dans l’un des cas suivants : blessure au niveau de la tumeur, gène dans le déplacement, prostration, absence d’interaction avec le groupe. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique jusqu'à disparition des symptômes.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées (KO, KI, possibilité d'utiliser la technique CRISPR/cas9) et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Cet âge correspond, selon la courbe de croissance des souris C57BL/6, à un poids de 19-21 grammes à jeun. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.