Souris

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intramusculaires dans les pattes arrière sur animal vigile maintenu par contention, puis deux prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, pour comparer des candidats vaccins anticytokines en développement. Le porteur indique que les prélèvements oculaires peuvent provoquer douleurs, blépharospasme et écoulements. Il conclut que l'absence de méthode in vitro rend le recours à la souris "incontournable", préférant une lignée transgénique produisant des protéines humaines.

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque animal recevra trois injections de vaccin par voie intramusculaire aux sites d’injections des pattes arrière (100 µl au total, 50 µl par patte). Les injections sont réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Ensuite, chaque animal sera prélevé 2 fois au sinus retro orbitaire sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane (anesthésie sur une durée de 5min). Le prélèvement de sang est réalisé en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des œdèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection se faisant par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’œil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'œil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, ce dernier conservera une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement-vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après le deuxième prélèvement, soit à jour 56 après la première injection, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour lequel un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques, i.e. Wilcoxon). Les groupes de souris sont divisés en sous-groupes de 10 selon leur sexe.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaires et les prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée). Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. La réponse immunitaire chez la souris est assez proche de celle de l’Homme. Dans le cas des tests de nos vaccins candidats pour l’Homme, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris transgénique. Ces souris sont capables de produire des protéines d’intérêt ayant une séquence humaine. Ces conditions sont ainsi proches des réponses immunes attendues chez l’Homme lors de l’administration de nos vaccins et sont donc plus pertinentes pour en évaluer l’efficacité.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose péritonéale, puis un traitement par injection ou par aérosol pressurisé sous anesthésie, avant une mise à mort par ponction cardiaque. Le porteur affirme que les animaux ne souffrent pas de la maladie et signale un risque de mortalité lié à la laparotomie du groupe traité par PIPAC. Il conclut que les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés aux Vésicules extracellulaires (VEs) dérivées des cellules souches car il a été montré que les VEs chargées en mTHPC (molécule utilisée en thérapie photodynamique pour l'activation des macrophages; dans notre projet nous utiliserons de la chimiothérapie dans les VEs) avaient une plus grande affinité pour les nodules de carcinose alors que la forme libre de mTHPC ciblait tous les tissus. Le mTHPC (meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin) a été utilisé dans une étude précédente pour montrer l'efficacité des VEs. De plus, nous nous sommes aussi intéressés à la grande avancée depuis 15ans dans le traitement des carcinoses péritonéales : la technique PIPAC « Chimiothérapie Intra- Péritonéale Pressurisée par Aérosols » qui consiste à délivrer pendant une coelioscopie, au bloc opératoire, une chimiothérapie pour contrôler une carcinose péritonéale et peut être rendre des cas opérables secondairement. Cette méthode s’est avérée améliorer la biodisponibilité locale de la chimiothérapie dans les nodules péritonéaux par rapport au lavage péritonéal classique. Aussi, la concentration en chimiothérapie utilisée serait moins importante. C’est pourquoi, l'objectif est de comparer l’effet de cette technique PIPAC à la simple injection en intrapéritonéale pour l’administration des VEs chargées en chimiothérapie comparée à la forme libre sur l’évolution de la carcinose péritonéale d’origine colique et ovarienne.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale (chirurgie de cytoréduction suivie d'une CHIP (chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale) qui ne peut être pratiqué sur tous les patients. De plus, ce traitement alternatif engendrerait moins d'effets secondaires car la quantité en chimiothérapie serait moins importante et l'utilisation des VEs permettrait une thérapie ciblée sur les cellules cancéreuses.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes). Elles seront soumises à un traitement soit par injection intrapéritonéale (1 à 2 fois par semaine 30 secondes) (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) soit par PIPAC (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) (1 fois 30minutes) sous anesthésie générale (une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis injection intrapéritonéale d'un mélange kétamine (100mg/kg) zylazine (10mg/kg) (1fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse postmortem.

Impact sur les animaux

A la suite de l'injection intrapéritonéale des cellules cancéreuses, les souris développeront une carcinose péritonéale qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence car les cellules injectées expriment la luciférase. Ce suivi sera indolore mais peut engendrer un stress pour l'animal. Aussi, d'après notre expérience sur les modèles de carcinose péritonéale, les animaux ne souffrent pas de la maladie et le suivi par bioluminesce nous permettra d'arrêter la maladie avant qu'elle n'évolue trop. Enfin, nous pourrons observer un risque de mortalité chez les souris qui auront la PIPAC car nous devrons effectuer une laparotomie et, la procédure de PIPAC dure 30 minutes, alors que les autres groupes recevront une simple injection intrapéritonéale. C'est pour cela que les groupes qui auront la PIPAC seront composés de 12 souris alors que les autres seulement de 10 souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Pour le remplacement, nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (ici analyser l’efficacité de la PIPAC et des VEs chargées en chimiothérapie) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. Seul l'évaluation de l'effet de la chimiothérapie sous forme libre ou dans les VEs sera analysée in vitro sur les cellules. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudier in vivo pour être sûre de son efficacité dans un organisme vivant où il y a différents types cellulaires, et différents tissus qui seront touchés.

Réduction

Nous n'avons pas effectué de tests de puissance mais en dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. , 12 quand il y a un risque de mortalité lié à la procédure réalisée. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser deux groupes de souris contrôles pour 4 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans sacrifice à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront une période d'acclimation de 5 jours minimum et seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Nous utiliserons des BALB/c pour créer une carcinose colique (lignée cellulaire CT26) et des C57BL6 pour créer une carcinose ovarienne (lignée cellulaire ID8). Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation stéréotaxique de sondes de microdialyse ou de canules, puis une microdialyse de quatre heures ou des tests comportementaux, le labyrinthe en croix surélevé et le test de nourriture en milieu nouveau, pour étudier la transmission GABAergique dans la réponse aux antidépresseurs. Le porteur qualifie les nuisances de très faibles et affirme que le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur. Il conclut que l'usage de la souris est "indispensable", seul un animal entier vivant et vigile permettant selon lui d'appréhender ces réponses.

Objectifs

Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS, dont la fluoxétine) affectent le fonctionnement de différentes zones cérébrales pour induire l'effet antidépresseur. Parmi elles, l'hippocampe est une structure cérébrale clé à l'interface de différentes fonctions : cognition, émotion, ou encore régulation hormonale. Il est donc important de comprendre comment les ISRS affectent le fonctionnement des différents types de neurones qui composent l'hippocampe. Parmi eux, les interneurones du gyrus dentelé sont une cible de choix. En effet, ils sont un lien avec beaucoup d'autres neurones de l'hippocampes grâce à leurs nombreuses connexions. Ils expriment aussi le récepteur 5-HT3 de la sérotonine ce qui les rend sensibles aux élévations de la transmission sérotoninergique induites par un ISRS. Enfin, le rôle des interneurones GABAergiques est controversé quant à leur lien avec les jeunes neurones issus de la neurogenèse adulte hippocampique qui est un élément important de la réponse aux antidépresseurs. Ce travail vise donc à évaluer dans un premier temps comment un traitement chronique avec un ISRS affecte la transmission gabaergique et si cette transmission affecte la réponse comportementale au traitement antidépresseur. Dans un second temps nous évaluerons si l’ablation génétique de la neurogenèse hippocampique affecte cette transmission gabaergique.

Bénéfices attendus

La compréhension de l'implication de transmission gabaergique de la réponse aux antidépresseurs est un élément important dans la compréhension globale de la réponse aux antidépresseurs. Si cette compréhension s'est approndie largement sur les systèmes monoaminergique et plus récemment sur le sytème glutamatergique, le système gabaergique n'est à ce jour que peu étudié dans le cadre de la réponse aux traitements antidépresseurs. Ceci peut paraitre étonnant tant l'utilisation des benzodiazépine est courante dans la pratique clinique pour traiter les commorbidités anxieuses chez des patients dépressifs notamment en début de traitement avec un antidépresseur.

Procédures

Les animaux auront une implantation stéréotaxique soit de sondes de microdialyse soit de canule d'administration locale. Les animaux seront soit dialysés (4h) soit seront évalués dans un test comportemental (le labyrinthe en croix survélévé (5min) ou le test du novelty suppressed feeding (6min)) après administration locale de la molécule d'intérêt. Dans le cas de la microdialyse la chirurgie prend une tretaine de minutes il en va de même pour l'implantation du guide canule pour l'adminstration locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations locales seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Les implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. Le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires sont réalisée chez l'humains sous simple anesthésie locale.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour vérification anatomique des implantations.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui induisent une réponse neurochimique ou comportementale n'est à ce jour pas modélisable. Ainsi seul un animal entier vivant et vigile permet d'appréhender ces éléments.

Réduction

Le calcul de puissance effectué pour les expériences de microdialyse a été réalisé avec le logiciel biostatGV. Les concentrations de GABA et de glutamate dans les dialysats sont attendues avec un écart type estimé à 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 25% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 14 animaux par groupe nombre qui est augmenté à 15 pour pallier aux aléas expérimentaux. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p

Raffinement

Un anesthésique (hydrate de chlorale) est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux

Choix des espèces

L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche 129 Sv Tac par son niveau basal faible de negenèse adulte hippocampique. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs viraux et d'un Nanoprimer dans la veine caudale, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant un à trois mois, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objectif est d'évaluer un produit censé réduire les doses de vecteurs de thérapie génique et leur toxicité pour le foie. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène « médicament » dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix comme en atteste la commercialisation de trois produits de thérapie génique utilisant les vecteurs AAV (Luxturna®, Glybera® et Zolgensma®). Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Cependant, l’administration de l’AAV par voie intraveineuse (IV) peut induire une élimination rapide du gène « médicament » par le foie. Pour compenser cette élimination, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires afin de toucher les tissus cibles comme les muscles squelettiques, le cœur, les poumons etc…). Par ailleurs, il a été rapporté que chez les patients que ces fortes doses de vecteur peuvent induire des effets indésirables liés à une toxicité dans le foie. Cette toxicité a entraîné dans certains cas la suspension des essais cliniques. Dans cette étude, nous proposons de tester un Nanoprimer® (Curadigm) en combinaison avec notre vecteur AAV pour d’une part diminuer son élimination par le foie et favoriser l’atteinte de tissus-cibles tels que les muscles squelettiques et d’autre part, prévenir l’hépatotoxicité liée à la forte concentration du vecteur après son injection. L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les souris seront injectées en IV dans la veine caudale avec dans un premier temps 100 µl de PBS ou d’AAV. Selon les groupes d’animaux, 150µl de Nanoprimer seront injectés 10 minutes après l’injection d’AAV puis à J+2 et J+5. Pour ces injections, les souris seront placées dans un tunnel de contention. Pour limiter le désagrément de la piqûre, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections puis toutes les semaines jusqu’à l’euthanasie pour les animaux suivis pendant 1 mois. Pour les souris suivies pendant 3 mois, les prélèvements seront espacés tous les 15 jours au bout du premier mois et ce jusqu’à la fin du protocole. Le prélèvement n’excédera pas la quantité recommandée par animal par semaine soit 7.5% du volume sanguin total. Les animaux seront anesthésiés dans une cage à induction, puis transférés sur une planche chauffante équipée d’un masque anesthésique. Le sang sera prélevé au niveau de la veine jugulaire par du personnel compétent pratiquant ce geste en routine. Conformément à la réglementation, la mise à mort des animaux sera réalisée sur des souris isolées visuellement et phoniquement du reste des animaux. Les animaux en attente, resteront dans leur cage et salle d’hébergement. Afin de réaliser des études post mortem, les animaux subiront une anesthésie gazeuse préalable suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine.

Impact sur les animaux

Les vecteurs AAV et le Nanoprimer ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’injection en intra veineuse dans la veine caudale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour limiter le désagrément, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Pour le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse et ne pourra donc pas ressentir de douleur. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressenti après le réveil. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales ou la décapitation

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude pilote, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour avoir suffisamment de données pour une suite ou non de ce projet. En première intention, 110 souris réparties sur 11 groupes seront utilisées pour tester le Nanoprimer et l’AAV8 avec deux doses différentes. Selon les résultats obtenus, des analyses supplémentaires pourraient être étendues à d’autres sérotypes d’AAV cliniquement pertinents comme l’AAV9. Dans ce cas, 4 groupes représentant un total de 40 souris supplémentaires seraient injectés.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Par ailleurs, l’utilisation de souris est justifiée par la disponibilité de nombreux modèles murins transgéniques mimant des pathologies pouvant être traitées par thérapie génique. La preuve de concept de l’utilisation du nanoprimer co-injecté avec le vecteur de thérapie génique pourra être étendu à différents modèles de maladies. Notre étude sera réalisée sur de jeunes adultes d’environ 8 à 12 semaines.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des applications cutanées répétées de la bactérie Staphylococcus aureus, d'imiquimod, de calcipotriol et de l'allergène DNFB, ainsi que des injections de toxine diphtérique, pour induire psoriasis, dermatite atopique et eczéma de contact, avec un risque de nécrose cutanée. L'objectif est d'étudier la réponse immunitaire mémoire de la peau. Le porteur affirme que cette réponse tissulaire ne peut être remplacée par des modèles in vitro.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie colonisant la peau des patients atteints de dermatite atopique (DA) et de psoriasis (Pso). Des données cliniques montrent que S. aureus aggrave la DA, mais il n’y a pas d’évidence pour le Pso. La compréhension des mécanismes par lesquels la bactérie aggrave une inflammation cutanée plutôt qu’une autre permet de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées sur ces mécanismes. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin montrent qu'une souche de S. aureus isolée de patients atteints de DA, est capable d’induire une inflammation cutanée de type DA, ainsi qu’une infiltration de lymphocytes T. D’autres résultats montrent que la réponse mémoire à S. aureus diffère dans des modèles sans inflammation cutanée préalable, des modèles de Pso ou de DA. Mais le rôle des lymphocytes T induits par S. aureus dans ces modèles est actuellement inconnu. Un modèle d'eczéma allergique de contact (EAC), fort pourvoyeur de lymphocytes T, sera également inclus. L’objectif principal du projet est de caractériser la réponse mémoire à S. aureus dans les différentes conditions d’inflammation cutanée (DA, Pso ou EAC) afin de trouver de nouveaux mécanismes par lesquels S. aureus est capable d’aggraver la DA. Les objectifs des procédures sont : (i) caractériser l’infiltration de lymphocytes T induite par S. aureus dans des modèles de Pso, de DA et d’EAC ; (ii) caractériser le rôle de l’infiltration de lymphocytes T dans la réponse d’hypersensibilité à S. aureus et son rôle protecteur lors d’une réexposition à la bactérie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objet l’étude des mécanismes impliqués dans la dermatite atopique (DA), une maladie complexe touchant jusqu’à 20% des enfants dans les pays occidentaux. Les bénéfices attendus sont multiples. 1. Comprendre l’interaction entre colonisation cutanée à S. aureus et réponse immunitaire cutanée ; 2. Corréler la qualité de la barrière cutanée (normale, inflammée type 2, 17 ou 1) et la réponse mémoire cutanée à S. aureus ; 3. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus aggrave la DA. Ces analyses mécanistiques s’intrègrent dans la réflexion actuellement menée sur les thérapeutiques à développer pour traiter et/ou prévenir la DA chez l’homme. La compréhension des mécanismes par lesquels S. aureus pourrait aggraver une inflammation cutanée, selon la qualité de la barrière cutanée, devrait ouvrir des opportunités thérapeutiques ciblant 1. S. aureus et ses toxines, 2. le microbiote cutané commensal et 3. la réponse immunitaire cutanée à S. aureus. Ainsi ces données alimenteront la réflexion sur l’utilisation des inhibiteurs de toxines de S. aureus, la restauration de la barrière cutanée par l’utilisation d’émollients éventuellement associés à l’application de bactéries commensales ou de pré/probiotiques et l’utilisation de traitements ciblés sur les lymphocytes T résidents mémoires.

Procédures

Application de Staphylococcus aureus à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 applications) et éventuellement une application à J60 (1 application). Durée 5 secondes par face. Application quotidienne de 10 µl d’imiquimod de J0 à J3 et J6 à J8 (7 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 12.5 µl de calcipotriol par face d’oreille, à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 5 µl/face d’oreille de DNFB 0.13% à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Injection intrapéritonéale d'un mélange dilué de kétamine et xylazine à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 injections) et éventuellement une injection à J60 (1 injection). Durée de l'injection 5 secondes. Injection de toxine diphtérique diluée à J56 et J59, et J66 (3 injections). Durée de l'injection 5 secondes. Mesure de l'épaisseur quotidienne des oreilles. Durée de la mesure 3 secondes par oreille. Sédation par isoflurane 3,5% pendant 30 secondes. Pesée dans une boîte adaptée, durée 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo, animaux, ne peut être remplacée par d’autres modèles. Il s’agit d’une caractéristique de la biologie cutanée : nous analysons la réponse immunitaire tissulaire, et non systémique. Ainsi les modèles in vitro, s’ils tendent à être optimisés, ne permettent pas d’analyser la réponse mémoire tissulaire. Par ailleurs, les modèles humains ne sont pas développés pour cette thématique, limités par le nombre de prélèvements réalisables. Il n’existe pas d’autre modèle expérimental de DA, de Pso ou d'EAC avec colonisation cutanée par S. aureus. Les modèles de peau reconstruite, de plus en plus utilisés en biologie de la peau, ne permettent pas l’inclusion et la stabilité de cellules immunitaires de type lymphocytes T ; l’analyse en phase mémoire est actuellement impossible. Par ailleurs, l’étude des lymphocytes T résidents mémoires se fait nécessairement au sein d’un complexe immun cutané qui n’est aujourd’hui pas modélisé dans ces peaux reconstruites. Au niveau humain, isoler les mécanismes immunitaires induits par S. aureus chez des patients atteints de DA (ou d’autres pathologies cutanées) est évidemment impossible. Les méthodes d’exposition aux bactéries (type patch-tests) ne sont pas développées et sont limitées par le nombre de biopsies réalisables chez l’Homme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.