Souris
Mesure du glycogène cérébral par spectroscopie et imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire chez la souris : Application à l’étude du modèle transgénique de la maladie de Pompe et évaluation d’un traitement expérimental.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant la maladie de Pompe, elles reçoivent quatre injections intraveineuses d'un candidat-médicament et jusqu'à trois passages à l'IRM sous anesthésie de deux à quatre heures, pour tester si l'imagerie du glycogène cérébral suit la réponse au traitement. Le porteur indique que ce traitement peut provoquer une réaction de type allergique, chute de température et léthargie, et que les souris développent les symptômes de la maladie modélisée. Il affirme que les modèles in vitro de la barrière hémato-encéphalique ne suffisent pas et conclut au recours à l'animal comme une "nécessité".
Objectifs
Au-delà du signal de l’eau, la spectroscopie et l’imagerie RMN in vivo permettent de détecter et quantifier de nombreux métabolites d’intérêt pour la biochimie, la physiologie et la pharmacologie que ce soit en conditions normales ou pathologiques. En particulier, les méthodologies à très hauts champs magnétiques permettent de détecter indirectement certains métabolites. Ces nouvelles approches d’imagerie offrent des perspectives extrêmement intéressantes pour l’étude non-invasive du métabolisme cérébral. Elles doivent permettre d’apporter une multitude d’informations physiologiques et biochimiques qui pourraient à terme aider à la compréhension des maladies cérébrales, mais aussi des maladies métaboliques affectant les muscles et de certains cancers. Ces méthodes pourraient surtout servir à l’évaluation de nouvelles thérapies. Par exemple, la spectroscopie et l’imagerie CEST/nOe à très haut champ magnétique permettent de détecter le glycogène cérébral (IRM glycoCEST/nOe) et peuvent servir de biomarqueurs non-invasifs de la progression de la maladie de Pompe et de la réponse positive à un traitement expérimental. La maladie de Pompe est une maladie métabolique rare liée à un déficience en enzyme alpha-glucosidase (GAA) fonctionnelle qui dégrade le glycogène lysosomial en glucose. Sa déficience entraîne une accumulation pathologique du glycogène dans les cellules qu’elles soient musculaires ou neuronales/gliales. Une thérapie enzymatique de remplacement existe et permet déjà d’améliorer le destin des malades mais ces enzymes de remplacement accède difficilement au cerveau. Des modèles de souris transgéniques de la maladie de Pompe ont été développés afin de mieux caractériser la maladie et aider à la découverte/validation de nouveaux traitements. Notre objectif principal est donc d’évaluer chez un modèle de souris transgénique de la maladie de Pompe (« 6neo/6neo »), l’IRM glycoCEST/nOe en tant qu’outil de suivi du processus pathologique et d’évaluation de l’efficacité d’un traitement expérimental en cours de développement.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont : 1/ La démonstration de l’efficacité du traitement expérimental, c’est-à-dire la baisse du niveau de glycogène cérébral chez la souris modèle de la maladie Pompe traitée ; 2/ La confirmation que l’imagerie CEST/nOe du glycogène permet le suivi longitudinal et non-invasif de cette baisse en glycogène préfigurant un éventuel protocole d’imagerie CEST/nOe du glycogène chez le patient atteint de la maladie de Pompe.
Procédures
Les souris modèles de la maladie de Pompe seront soumises à un traitement d’un mois consistant en 4 injections intraveineuses (du candidat-médicament ou témoin) auxquelles s’ajouteront jusqu’à 6 injections intrapéritonéales d’anti-histaminique pour le groupe « traité », en prévention d’une éventuelle hypersensibilité au candidat-médicament. Par ailleurs, tous les animaux seront scannés à l’IRM sous anesthésie un maximum de 3 fois, la durée de chaque examen étant prévus de 2 à 4 heures.
Impact sur les animaux
Les souris modèles de la maladie de Pompe souffrent de symptômes (phénotype dommageable) à partir de l’âge de 6-8 mois. Leur statut clinique est décrit à l’aide d’une grille de score clinique définie selon 4 stades cliniques, le dernier stade entrainant la mort de l’animal sans intervention. Dans le cadre de cette étude, les animaux seront étudiés au stade 1 à 2. Le traitement expérimental peut induire une hypersensibilité de type « allergique » : baisse de température corporelle, posture voutée, léthargie dans les 10 minutes suivant l’injection.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses biochimiques post-mortem.
Remplacement
Un des problèmes que ce projet vise à évaluer concerne la capacité du traitement expérimental à agir au niveau cérébral en dépit de la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Les modèles in vitro actuels de la BHE, voire de l’ensemble du cerveau ne permettent pas de mimer leur complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique. Le passage par l’expérimentation animale demeure donc une nécessité.
Réduction
L’utilisation de l’IRM en tant que méthode d’imagerie cérébrale non-invasive et non-irradiante permet de mettre en place un protocole de suivi longitudinal du glycogène cérébral économe en animaux (par rapport aux seules alternatives que sont les dosages post-mortem) pour mettre en évidence l’éventuel effet thérapeutique du traitement expérimental. Des effectifs de 20 souris (10 mâles / 10 femelles) par groupe sont considérés sur la base de nos résultats précédents. Toutefois, afin de réduire le nombre d’animaux, nos expériences auront lieu en deux temps : d’abord des cohortes de 10 souris (5 males/5 femelles) seront étudiées. Les données seront collectées et analysées. En cas de résultat positif (diminution du glycogène cérébral chez les souris Pompe « traitées »), nous arrêterons l’étude. En cas de résultat négatif, nous complèterons l’étude pour atteindre des effectifs de 20 souris par groupe et confirmer le résultat.
Raffinement
Compte tenu des effets indésirables attendus, nous avons prévu : 1/ Nous favoriserons l’accès des animaux présentant des symptômes à la nourriture et la boisson (en plaçant la nourriture directement dans la cage en particulier des formulations d’eau et de nourriture gélifiées, ou en utilisant des biberons à pipette allongée). L’évolution clinique et le poids des animaux seront monitorés a minima une fois par mois avant l’apparition des symptômes, puis a minima une fois par semaine pour les souris symptomatiques. 2/ Pour prévenir les réactions d’hyper-sensibilité possiblement induites par le traitement expérimental, un anti-histaminique (prométhazine) sera systématiquement administré en parallèle des injections.
Choix des espèces
La souris est un modèle souvent employé dans les études en biologie et santé qui nécessitent le recours à un modèle animal. L’organisation, la physiologie et le métabolisme du cerveau des souris sont bien connus dans le monde scientifique. Par ailleurs, de très nombreux modèles de souris transgéniques permettent aujourd’hui de valider la pertinence de biomarqueurs et d’évaluer l’efficacité potentielle de traitement expérimentaux avant leur évaluation chez l’Homme. Des animaux adultes mâles et femelles âgées de 6 à 12 mois (donc avec la maladie) et contrôles seront examinés.
Evaluation de cibles et effet anti-leucémique et différentiateur de nouveaux composés dans la Leucémie Aigue Myéloïde sur lignées leucémiques murines et humaines et sur blastes issus de patients
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 772 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée à l'issue et douze réutilisées. Des cellules de leucémie aiguë myéloïde, de lignées ou issues de patients, leur sont injectées, parfois directement dans le tibia sous anesthésie, pour évaluer de nouveaux traitements. Le porteur cite des effets attendus tels que douleur au point d'injection, douleurs chroniques, perte de poids et développement tumoral, et affirme qu'il n'existe "aucune autre méthode probante" pour remplacer l'animal en préclinique. Les souris sont tuées en fin de procédure pour analyse de l'implantation de la leucémie.
Objectifs
La Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne traitée principalement par chimiothérapie conventionnelle associé à une forte toxicité et un taux de rechute important. Le projet porte sur l’évaluation de nouveaux traitements et de nouvelles cibles dans les LAM préalablement identifiés et validés in vitro sur modèles cellulaires. Il n’existe actuellement aucune autre méthode probante se substituant à l’expérimentation animale pour les évaluations précliniques. Ce projet est développé par un laboratoire académique et financé dans les tutelles et des associations de lutte contre le cancer et les leucémies. L’étude in-vivo validera les cibles et les candidats médicaments dans des modèles murins C57BL/6 ou NOD-SCIG -gamma (NSG).
Bénéfices attendus
Les retombées du projet sont de valider les effets anti-leucémiques / différenciateurs de nouveaux composés à visée anti-tumorale et de valider de ouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la leucémie aigue myéloïde.
Procédures
Certains animaux auront une injection en intra-tibial des cellules leucémiques sous anesthésique (isoflurane) et analgésique (buprenorphine). La durée de l'intervention est de 3 à 5 minutes et est effectuée en transcutané sans ouverture. Le nombre de souris minimum (mise au point et xénogreffes de cellules de patients PDX) sera au maximum de 572 animaux. Si les résultats des étapes de mise au point des modes d'injection (intra-péritonéal, intra-veineux ou intra-tibial) pour les lignées leucémiques humaines montrent la nécessité d'effectuer les procédures expérimentales en injection intra-tibiale, ce nombre passera au maximum à 1436 animaux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une possible une douleur transitoire au point d’injection, des douleurs chroniques, une perte de poids >15%, le développement excessif d'une tumeur ou grosseur au point d’injection sans que la charge tumorale n’excéde 10 % du poids normal de l'animal sujet aux expériences thérapeutiques, ou qui gêne les mouvements normaux de l’animal ou qui est ulcérée, la perte d’alimentation brutale ou encore une tension abdominale signe de splénomégalie ou d’ascite induisant une forte prise de poids et liée au développement de certains modèles de leucémies aigues myéoïdes, des tremblements, secousses, convulsions, boiteries ou décubitus permanent.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour analyse de l'implantation de la leucémie des modèles leucémiques ou des effets des traitements. Les souris controles seront trop agées à l'issues des procédures pour éventuellement être réutilisées dans les procédures d'implanation des cellules leucémiques.
Remplacement
L'objectif est d'évaluer les effets anti-cancéreux et/ou différentiateurs de nouveaux composés anti-cancéreux. La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude de effets antitumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique sera alors utilisé.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 3 par groupe pour les étapes de mise au point des modèles et à 8 par groupe pour les expérimentations proprement dites, nombre modulé selon une évaluation statistique par tests non paramétriques pour atteindre une valeur statistique de p-value
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe afin d’éviter le stress de l’isolement et avec des enrichissements du milieu. Le personnel est compétent pour déterminer si l’animal n’est plus dans sa zone de confort et la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre plateforme garantit l’amélioration des soins et des conditions de vie des souris. Si l'un des points limites est atteint (perte de poids, détérioration irréversible de l’état de l’animal impactant sa survie, perte d’alimentation brutale, forte prise de poids, tremblements, secousses, convulsions, boiteries, décubitus permanent), l'animal sera euthanasié pour arrêter ou empêcher des souffrances.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude des effets anti-tumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique doit alors être utilisé. Animaux injectés à 4-8 semaines (optimum de prise de leucémie décrit dans la littérature et validé antérieurement au laboratoire).
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation d'un canal calcique décrite dans une maladie du cervelet de l'enfant, les souris de ce projet peuvent développer une atrophie du cervelet, une ataxie et des crises d'épilepsie de type absence. 438 souris vont être utilisées, 357 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 81 un niveau modéré. 294 passent pendant environ un mois des tests moteurs et cognitifs dits "standards" que le résumé ne nomme pas, dont 70 après une chirurgie stéréotaxique pour injecter un adénovirus qui déclenche l'expression du canal muté, 81 reçoivent des électrodes implantées dans le crâne pour un EEG de six heures par semaine pendant un mois, et 63 des séances d'échographie photoacoustique sous anesthésie. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et leur cervelet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Caractérisation in vivo de nanoparticules scintillatrices
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 265
750 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des tumeurs de glioblastome ou pancréatiques leur sont implantées, suivies d'injections de nanoparticules et de prélèvements sanguins répétés, pour tester la distribution de ces nanoparticules et leur accumulation dans les tumeurs en vue d'améliorer la radiothérapie. Le porteur cite comme effets attendus l'immunodéficience des souris, les douleurs des injections et le stress des contentions et anesthésies. Les animaux sont ensuite tués sous anesthésie pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Le but de ce projet est d’améliorer l’efficacité de la radiothérapie en utillisant des nanoparticules scintillatrices. L'objectif de l'étude proposée ici est de tester la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique, leur potentiel à s'accumuler dans les tumeurs, ainsi que le délai d'injection qui permet une accumulation optimale des composés dans les tumeurs. Les nanoparticules utilisées seront fluorescentes (fluorescence intrinsèque ou nanoparticules marquées avec un fluorophore). Dans ce cadre, nous prévoyons l'étude in vivo de 10 nanoparticules (5 nanoparticules pour des modèles de glioblastome et 5 nanoparticules pour des modèles pancréatiques). Nous étudierons deux modèles de glioblastomes (un modèle sous cutané implanté chez la souris et un modèle orthotopique implanté chez le rat) et deux modèles pancréatiques (un modèle sous cutané et un modèle orthotopique implanté chez la souris).
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer le bénéfice d'un nouveau mode de radiothérapie, basé sur des nanoparticules qui boostent l'effet de la radiothérapie, dans des modèles particulièrement agressifs et pour lesquels trop peu de solutions thérapeutiques existent. En cas de succès, ce type de traitement pourrait être proposé pour un grand nombre de pathologies tumorales.
Procédures
Pour l'étude 1: Du sang sera prélevé à différents temps après injection ( 30 minutes / 7 Jours / 14 Jours ) pour analyses ex vivo. Les prélèvement seront de 200μL pour les souris et 500μL pour les rats. Pour l'étude 2: Les prélèvements seront effectués 15 min après l'injection, puis à 1h, 2h, 3h, 5h et 7 heures post-injection. La quantité totale de sang prélevé sera d'environ 180μL soit moins de 1% du poids total de nos souris et moins de 1 millième du poids de nos rats. La mesure de 24h sera réalisée avec le sang récupéré lors du sacrifice. Pour l'étude 4: 500uL de sang seront prélevés dans la veine caudale des rats 5 heures et 24 heures après l’injection de nanoparticules. Ce volume total représente moins de 10% du volume de sang de nos rats et ne devrait ainsi pas entraîner de contraintes pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.
Devenir
Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des souris avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang. L'euthanasie des rats sera effectuée par injection intra-cardiale de barbituriques (Exagon 1ml/kg) sous anesthésie gazeuse, avant le prélèvement de pièces anatomiques.
Remplacement
Ce projet a été initié depuis 2017. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les caractéristiques des nanoparticules ont été réalisés en solution. L’ensemble des nanoparticules testées in vivo aura été préalablement testé et validé in vitro sur des cultures de cellules tumorales (2D / 3D). Seules les molécules les plus performantes seront testées chez l’animal. Cette étape d’expérimentation animale permet de progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.
Réduction
La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 6 animaux par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables (ANOVA). Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.
Raffinement
Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la soufrance et l'angoisse notament en mettant en place des points limites. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuze, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation.
Choix des espèces
Les souris Nudes permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les rats sont intéressants dans notre cas du fait de leur taille plus importante ; les injection intracérébrales sont plus faciles à mettre en œuvre de façon fiable et reproductible. Souris nudes de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines. Rats Fischer mâles de 6-8 semaines. Les rats mâles sont utilisés entre 6 à 8 semaines après la naissance, ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficiles à gérer en animalerie.
Etude de l’effet d’un traitement prenatal avec la cholestyramine et/ou la vitamine E sur le rôle du placenta dans le développement de l’athérosclérose chez la descendance adulte de souris ApoE-/- traitées.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles génétiquement prédisposées à l'athérosclérose sont accouplées, reçoivent un traitement pendant la gestation et subissent des prélèvements de sang répétés, pour étudier l'effet d'un traitement prénatal sur l'athérosclérose de leur descendance. Le porteur affirme que la molécule employée n'a montré aucun effet indésirable ni sur les mères ni sur les petits dans ses essais antérieurs. Les femelles sont tuées au jour 18,5 de gestation pour prélever les placentas et les fœtus.
Objectifs
L’athérosclérose est la première cause de mortalité dans le monde. Les facteurs de risque associés à l’athérosclérose sont bien connus, le principal étant l’hypercholestérolémie. Cependant, ces facteurs n’expliquent pas toujours les variations inter-individuelles. Selon l’hypothèse de Barker formulée en 1993, des facteurs environnementaux agissant durant la période fœtale et périnatale peuvent induire des altérations prédisposant au développement de maladies cardiovasculaires plus tard dans la vie adulte. Des études chez l’homme et l’animal montrent que la présence d’une hypercholestérolémie chez la mère pendant la grossesse/gestation pourrait avoir un impact sur le développement de l’athérosclérose chez la descendance. Pendant la grossesse, le cholestérol peut augmenter jusqu’à 1,5 fois. Cette augmentation, bien que nécessaire au développement du fœtus, pourrait induire une empreinte expliquant le développement précoce de l’athérosclérose chez la descendance. Cette hypercholestérolémie gestationnelle, génère également un stress oxydant qui peut s’avérer délétère pour l’homéostasie vasculaire. Nous avons montré que la souris ApoE-/-, génétiquement programmée pour développer spontanément de l’athérosclérose, en développe moins quand elle est née de mère normocholestérolémique . Dans une étude en cours, nous avons montré qu’un traitement, avec un hypocholestérolémiant et/ou un antioxydant, pendant la gestation diminue le développement de l’athérosclérose. (Résultats en cours de rédaction pour publication) Étant donné que les mères sont traitées durant leur gestation ou gestation et lactation alors que les descendants des différents groupes étaient maintenus sous régime contrôle pendant 25 semaines, notre hypothèse que ces traitements périnataux sont responsables d’une modification de l’expression de transporteurs et d’enzymes impliqués dans la fonction placentaire aboutissant à la protection des descendants de mères traitées avec ces molécules. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’effet d’un traitement périnatal avec un hypocholestérolémiant) et/ou un antioxydant sur la fonction placentaire afin d’expliquer la protection contre la progression de l’athérosclérose chez la descendance adulte de souris ApoE-/- traitées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du placenta dans le développement de l’athérosclérose de la descendance en cas d’hypercholestérolémie génétique. Les études ont montré les effets délétères du stress oxydant, entrainé par une hypercholestérolémie, sur le développement placentaire et par conséquent fœtal dès l’étape d’implantation. L’étude histologique du placenta envisagée permettra de visualiser la surface occupée ainsi que la vascularisation des différentes zones de placentas de mères recevant ou pas le traitement. Nous nous servirons de l’analyse des résultats issus à la fin de cette étude pour expliquer l’effet protecteur des 2 traitements en périnatal contre le développement de l’athérosclérose chez la descendance adulte à 25 semaines d’âge chez la souris ApoE-/- hypercholesterolémiques que nous avons récemment observé.
Procédures
Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,
Impact sur les animaux
La cholestyramine est un médicament prescrit pour l’Homme dans le cas d’hypercholestérolémie. Chez la souris, les études n’ont montré aucun effet tératogène de la molécule. Nous avons utilisé une dose similaire de la molécule (3% de la masse du régime) pendant des périodes de gestation et nous n’avons noté aucun effet indésirable : ni perte de poids, ni diarrhée chez les mères. Aucun effet sur le développement des descendants est noté. La dose de supplémentation en vitamine E (2200 UI/kg de régime) est conforme aux doses quotidiennes recommandées. Cette dose était déjà utilisée sans effets indésirables sur les mères ni les descendants. Les prélèvements chez les femelles gestantes sont réalisés au niveau de la queue et sous anesthésie locale (lidocaïne 2% sous forme de pommade) en utilisant des microvettes à capillaire pour assurer la rapidité et l’efficacité de ces prélèvements. Les femelles gestantes subiront une douleur légère associée aux prises de sang.
Devenir
Dans la littérature, les différences placentaires et fœtales entre la première portée et les portées suivantes (deuxième portée, troisième portée…) sont bien décrites chez la souris ainsi que chez d’autres espèces. Comme nous avons choisi de s’intéresser qu’à la première portée, les femelles seront mises à mort au jour 18.5 de gestation afin de collecter les placentas pour des analyses histologiques et moléculaires. Les foetus au jour 18.5 de gestation afin de collecter le foie et faire des analyses du métabolisme de cholestérol.
Remplacement
Seule une étude in vivo, c’est-à-dire incluant la complexité des mécanismes physiologiques lors de la gestation mis en jeu lors du développement de maladies cardiovasculaires en période périnatale, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (80 femelles) pour permettre une bonne évaluation statistique d’une intervention nutritionnelle entre différents groupes indépendants sur le développement de l’athérosclérose (test ANOVA et Kruskal-Wallis)
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée. Les cages seront enrichies (frisottis), les rares prélèvements de sang seront effectués au niveau de la queue ou de la veine submandibulaire sous anesthésie à l’isoflurane des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter toute souffrance. Dans le cas d’une perte de poids, d’une modification de la prise alimentaire, de l’apparence générale ou du comportement, la surveillance sera accentuée et les souris seront soignées et/ou placées sous antidouleurs (buprénorphine à 0.05 mg/kg en sous cutanée pour le palier 1, 0,1mg/kg pour le palier 2 et euthanasie en présence de 3 signes notables) afin de minimiser toute souffrance, détresse ou inconfort. Les prélèvements de sang seront stoppés momentanément jusqu’au rétablissement de l’animal. Enfin, si l’animal ne parvenait pas à se rétablir, la mise à mort sera réalisée (annexe points limites).
Choix des espèces
La souris est un modèle adéquat car c’est une espèce docile et facile à manipuler possédant une période de gestation courte. Première lignée murine à avoir été séquencée, la souris C57BL/6 offre une documentation importante, facilitant les études génétiques. C’est également une lignée stable et c’est la souche la plus utilisée en ce qui concerne l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Le modèle ApoE-/- est hypercholestérolémique, présente un profil lipidique proche de celui de l’homme et développe spontanément des plaques d’athérosclérose, similaires à celles de l’humain. Cela en fait un modèle de choix pour l’étude de l’athérosclérose. L’efficacité des traitements envisagés a été déjà démontré dans ce modèle de souris. Des souris ApoE-/- femelles âgées de 8 semaines environ seront utilisés pour la reproduction pour les différentes conditions étudiées. Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,
Développement de nouvelles capsides et de nouveaux promoteurs pour augmenter la spécificité tissulaire des produits de thérapie génique par vecteur adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique puis des prélèvements de sang répétés sous anesthésie, certaines souris modèles de la maladie de Pompe développant une faiblesse musculaire évaluée par un test de force, pour optimiser le ciblage tissulaire de ces vecteurs. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et un risque de cannibalisme chez les nouveau-nées. Toutes les souris sont tuées par dislocation cervicale pour analyser la distribution des vecteurs dans les organes.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de développer des outils de thérapie génique pour améliorer les traitements de maladies rares. La thérapie génique est un outil de plus en plus utilisé pour le traitement d’un grand panel de pathologies génétiques (maladies hépatiques, musculaires, neurologiques, etc.), il est donc important de cibler spécifiquement les tissus touchés par telles ou telles pathologies. Néanmoins, certaines difficultés restent à être surmontées et d’autres points peuvent être améliorés. L'objectif de ce projet est d'optimiser un vecteur de thérapie génique, l'AAV (virus adéno-associé), afin de le rendre plus efficace et plus spécifique pour l'organe à traiter dans le cadre de la maladie. Pour cela, nous allons travailler sur deux éléments du vecteur : la capside, la partie externe du vecteur responsable du ciblage des organes, et le promoteur, un élément qui permet l'expression du gène thérapeutique (le transgène) dans l'organe à traiter. Ce projet utilisera des souris saines pour sélectionner les meilleures capsides et promoteurs, qui seront ensuite validés sur des souris adultes et juvéniles atteintes de la maladie de Pompe pour tester leur efficacité thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier les meilleurs vecteurs AAV pour cibler de manière spécifique les organes couramment touchés par les maladies génétiques : le foie, les muscles et le système nerveux central. Le développement de vecteurs optimisés pour le(s) organe(s) cible(s) permettra de réduire la dose de vecteur nécessaire pour atteindre l'effet thérapeutique et ainsi diminuer le risque d'effets indésirables du traitement (e.g. la réponse immunitaire contre le vecteur).
Procédures
L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale pour les souris adulte ou dans la veine temporale pour les souris juvénile sera effectuée une seule fois au début de l'étude. Le prélèvement de sang sur les souris adultes sera réalisé sous anesthésie au niveau de la veine faciale à 1, 4, 7, 15, 30, 45 et 60 jours post-injection et après une fois par mois. Les souris juvéniles seront prélevées une fois par mois. Un test d’évaluation fonctionnel (grip test) sera réalisé sur les souris atteintes de la maladie de Pompe à 3 mois et 6 mois post-injection afin de vérifier l'efficacité du vecteur.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur instantanée due à l'injection du vecteur. Le stress de la manipulation peut durer jusqu'à 30 secondes. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie, la souris ne ressentira donc aucune douleur, mais la manipulation (environ 1 minute) pourra être un facteur de stress. Les souris modèle de la pathologie de Pompe pouvaient développer le phénotype pathologique progressive (faiblesse musculaire) au cours des derniers mois de l'étude. Un risque de cannibalisme pourrait être observé chez les souris nouveau-nées.
Devenir
Tous les animaux sains utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Toutes les souris atteintes de la maladie de Pompe utilisées pour tester l'efficacité thérapeutique des meilleures combinaisons capside-promoteur seront euthanasiées par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Une procédure d'élevage de souris atteintes de la maladie de la Pompe est prévue dans cette étude, les souris de cette procédure seront utilisées dans les procédures expérimentales.
Remplacement
Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste des capsides et des promoteurs grâce à l'utilisation de culture cellulaire. Ces premiers tests nous ont permis de mettre en évidence 80 capsides et 50 promoteurs intéressants. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (réponse immunitaire) et également mesurer sont efficacité de traitement d'une maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons établi une approche statistique autour du paramètre d’intérêt commun mesurable dans toutes les procédures : l’expression de notre transgène. Nous utiliserons 6 souris/groupe pour nous donner la possibilité de détecter une augmentation significative du transgène. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (798 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats. Les souris souffrant de la maladie de Pompe seront utilisées en dernier recours, afin de valider nos meilleurs candidats (252 souris).
Raffinement
Nous allons tout mettre en œuvre pour maximiser le bien-être des animaux (limitation du nombre de souris par cage, enrichissement des cages, limiter le stress lors de la manipulation des animaux, etc.). Chaque geste expérimental réalisé sur les animaux (injections et prise de sang) sera réalisé par du personnel formé, la mise en place d'anesthésies et des mesures de récupération (surveillance accrue des souris, utilisation de plaque chauffante jusqu'au réveil, etc.) seront utilisées lors de des prises de sang. Le prélèvement de sang sera réalisé au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées afin de diminuer leur stress. L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale sera réalisée après avoir favorisé la dilatation des veines (sous une source de chaleur) pour un maximum d’efficacité et de rapidité d’intervention sur l’animal, pour limiter le temps de passage en boîte de contention nécessaire à l’injection dans la queue.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux disponibles pour la maladie de Pompe (bovins, chats, moutons et caille), la souris Gaa-/- [B6;129-Gaatm1Rabn/J] est l'espèce animale la plus facile à produire. Elle reproduit la maladie de Pompe, car elle ne montre aucune activité enzymatique de GAA (dans le sang et dans les tissus), elle présente une accumulation de glycogène dans tous les tissus et l'activité locomotrice des souris est altérée. De plus, nous disposons déjà de ce modèle dans notre animalerie et nous disposons de toutes les techniques pour mesurer la réversion du phénotype liée à la pathologie. La maladie de Pompe est une maladie liée à une accumulation de glycogène dans différents tissus (foie, muscles, système nerveux central, etc.). Les outils développés ont pour but d’augmenter l’efficacité du traitement déjà disponible afin de réduire la dose de vecteur injecté. 1) Certaines souris seront injectées à l’âge adulte (4 mois) ; âge où les premiers symptômes de la maladie de Pompe apparaissent pour la colonie de souris Gaa-/-. Cette approche permettra de tester si notre stratégie permet de traiter la pathologie sur les organes matures. 2) D’autres souris seront injectées à la naissance (0-2 jours). Cette approche permettra de déterminer si notre stratégie perdure dans le temps malgré la croissance des souris et des différents tissus, notamment le foie. Les souris saines utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront injectées à 6 semaines, âge pour lequel la souris est considérée comme adulte.
Formation aux gestes techniques et chirurgicaux pour les études portant sur l’AVC
- Formation professionnelle
Rats : 100
2 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un cathéter veineux puis sert à provoquer un accident vasculaire cérébral par thrombine, chlorure de fer ou électrocoagulation, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques et chirurgicaux. Le porteur présente cette formation comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans les études de l'établissement. Les animaux sont tués par perfusion transcardiaque après imagerie.
Objectifs
L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 17 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 60% gardent des séquelles neurologiques, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. Les projets associés à cette pathologie qui sont réalisés dans l'établissement utilisent des techniques méritant un apprentissage pour acquérir la finesse des gestes techniques et chirurgicaux. Cette formation pratique aura pour résultat de réduire le nombre d'animaux des groupes expérimentaux associés aux projets ultérieurs grâce à une meilleure reproductibilité des gestes chirurgicaux des expérimentateurs ainsi qu'une meilleure prise en charge du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.
Procédures
1 - Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de traitements (n=2500, durée de la procédure :15 minutes) 2 - Approches endovasculaires : (n=1800 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris par type de modèle x 3 modèles pour cette procédure) et (n =75 rats pour 3 personnes = 5 ans de projet x 5 rats par type de modèle x 3 types de modèles dans cette procédure) 2.1 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine (durée de la procédure :1.5 heures) 2.2 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par application de FeCl3 (durée de la procédure :1.5 heures) 2.3 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par électrocoagulation (durée de la procédure :1.5 heures) 3 - Approche extracranienne (n=600 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris pour ce modèle, durée de la procédure: 45 minutes) et (n=5 ans de projet x 5 rats pour ce type de modèle = 25 rats pour 3 personnes) 4 - Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) et/ou par échographie ultrasonore (n=2500, durée de la procedure :15 minutes). La totalité des animaux (n=2500) seront mis à mort par perfusion transcardiaque selon la dérogation. Chaque animal subira la procédure 1 : pose de cathéter dans la veine caudale de la queue, la procédure 2 ou 3 suivant le type d'approche et le type de modèle, la procédure 4 d'imagerie suite à l'induction de l'ischémie et seront enfin perfusés (dérogation de mise à mort).
Impact sur les animaux
Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entrainement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également les nuisances attendus sur les animaux.
Devenir
A partir de la procédure 1 (Pose de cathéter sur la veine caudale), tous les animaux seront utilisés pour les procédures suivantes : un type de modèle selon l'approche pour induire l'ischémie (procédure 2 ou 3) et la procédure d'imagerie suivie de la perfusion transcardiaque.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expériencen prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 10 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM, échographie) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les travaux de recherche pré-cliniques ont amené à développer l'utilisation de souris transgéniques (tPA null/tPA KO). Cela renforce l'intérêt de s'entrainer sur des souris : espèce qui sera utilisée par la suite. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus mais il est utilisé à moindre mesure, justifiant son nombre plus limité prévu ici. Il n'existe pas de rats transgéniques sur la thématique mais sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines et auront un poids de 35 g environ pour les SWISS et d'environ 20 g pour les C57BL/6J et d’environ 300 g pour les rats Wistar ou SPRAGUE DAWLEY âgés de 10 semaines également. Nous réaliserons nos modèle sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Etudes des conséquences mutationnelles de différentes génotoxines sur la réparation de l’ADN.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.
Objectifs
Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.
Bénéfices attendus
Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.
Procédures
Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.
Impact sur les animaux
Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.
Réduction
Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.
Etude des effets neuromodulateurs de la pregnénolone en réponse aux ligands endogènes et exogènes du récepteur aux cannabinoïdes de type-1 : Analyses comportementales et moleculaires chez des souris mutantes CB1-E134G.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, trente-deux étant opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une injection de THC ou d'autres composés, puis 912 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'effet neuromodulateur de la prégnénolone chez des souris mutantes. Le porteur indique que la mise en cage individuelle peut provoquer un stress d'isolement et que les mises à mort se font par inhalation de CO2. Les souris ne sont pas réutilisées pour éviter tout effet cumulatif des traitements.
Objectifs
Le cannabis est une des drogues d’abus la plus utilisée dans le monde (166 millions d’utilisateurs dont 15 millions de personnes dépendantes). Le ∆9-tétrahydrocannabinol (THC) est le composant principal du cannabis et est responsable des effets toxiques et addictifs observés lors de la prise de cannabis chez l’homme. Le THC fait partie de la famille des cannabinoïdes et agit au niveau du cerveau via les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (CB1). Ces récepteurs CB1 participent à la régulation de nombreuses fonctions biologiques, comme la régulation de comportements liés à la cognition, à la régulation de l’équilibre énergétique, ou encore des réponses liés au stress et à l’anxiété. Une dérégulation de l’activité de ces récepteurs CB1 en réponse à la prise de cannabis (ou de THC), peut donc être à l’origine de désordres psychiatriques et comportementaux importants. Le développement de thérapies pouvant atténuer les effets neurologiques d’une sur-activation CB1 est donc un enjeu de santé publique majeur. Il a été montré, chez le rongeur de laboratoire, un nouveau mécanisme de régulation endogène qui se met en place dans le cerveau et permet de diminuer fortement les effets toxiques d’une telle sur-activation par le THC. De fortes concentrations de THC vont activer le récepteur CB1 de façon excessive et un stéroïde, la pregnénolone, va alors être libérée dans le cerveau et agir directement sur le récepteur CB1 pour réduire son activité et bloquer les effets toxiques du THC. Notre projet de recherche consiste à mettre en évidence le rôle physiologique de la pregnénolone dans la régulation des récepteurs CB1. Pour cela, notre stratégie a été de développer une souris mutante, chez laquelle la pregnénolone ne peut pas se lier au récepteur CB1. Cette souris ne comporte pas de phénotype dommageable. Nous envisageons d’étudier des comportements non invasifs, et les mécanimes moléculaires qui y sont liés, chez ces souris à l’âge adulte en comparaison à des souris ayant un récepteur CB1 intact.
Bénéfices attendus
Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, la depression, ou encore les troubles du comportement alimentaire. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1 par la pregnenolone. Cela sera rendu possible par l’utilisation d’un nouveau modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, chez lesquelles le site de fixation allostérique de la pregnenolone est invalidé.
Procédures
1) Traitement: Un total de 1264 animaux recevra un traitement par injection dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux (10ml/kg pour la souris). L’ensemble des animaux ne recevra qu’une seule injection. 2) Tests d’étude des comportements : L’ensemble des tests prévus dans cette étude concernera 912 animaux. Les tests seront réalisés sur des animaux vigiles après administration aigüe d’un traitement (délai allant de 30 minutes jusqu’à 24h). 3) Procédure chirurgicale: La procédure sera réalisée chez 32 souris sous anesthésie générale sans réveil. 4) Mise à mort : elle sera réalisée chez l’ensemble des souris, soit pour faire des prélèvements de tissus pour des analyses ultérieures (chez 320 animaux), soit à la fin des expérimentations (chez 912 animaux), car les animaux ne pourront pas être réutilisés.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux pourraient survenir à leur mise en cage individuelle, qui pourrait entraîner un « stress » lié à l’isolement. Cependant, cet isolement sera fait sur un temps court et sera compensé par un enrichissement des cages et des contacts visuels et sonores entre chaque cage. Des effets indésirables pourraient survenir lors de l’induction de l’anesthésie. Les méthodes de mise à mort peuvent également entraîner des effets indésirables, cependant elles seront réalisées dans des conditions expérimentales appropriées afin de limiter toute souffrance ou angoisse pour l’animal.
Devenir
Procédures I à V et VIII : Les animaux des procédures ayant recours à l’injection de THC et l’analyse des effets comportementaux du traitement seront mis à mort par inhalation progressive d’un mélange air/CO2. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ultérieurement afin d’éviter tout effet cummulatif des traitements sur le comportement des animaux. En outre, les effets cummulatifs de l’administration de THC chez les souris mutantes CB1-E134G n’est pas connu, en particulier sur les niveaux d’expression du récepteur CB1 et sur la synthèse de pregnénolone. Afin de pallier à ces éventuels biais expérimentaux, des groupes indépendants de souris seront utilisés. Procédure VII : Les animaux de la procédure VII seront mis à mort par injection d'euthanasiant couplé à une perfusion intracardiaque d’un mélange de paraformaldhéhyde (formaline 4%). La mise à mort des animaux et la fixation des tissus est ici nécéssaire pour l’analyse de l’expression du récepteur CB1 par des approches immunohistochimiques. Procédures VI et IX : Les animaux des procédures VI et IX seront mis à mort par décapitation rapide. La méthode de mise à mort par décapitation est nécessaire dans notre projet pour pouvoir prélever rapidement du sang afin de faire des analyses ultérieures. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres méthodes, comme la dislocation cervicale, car la récupération ultérieure du sang serait difficile due à sa coagulation et ceci entraînerait un biais expérimental. Les études des voies de signalisations ainsi que la quantifications des endocannabinoïdes et neurostéroïdes ne pouvant être réalisées que sur des échantillons ex vivo. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés et induire ainsi des biais expérimentaux.
Remplacement
Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches subsitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier au préalable le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1, ainsi que la probabilité d’invalider ce site de fixation par une mutation ponctuelle du gène codant pour le CB1. Cette mutation a ensuite été validée in vitro, nous permettant de vérifier que la pregnénolone ne pouvait pas se lier au récepteur muté. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. Nous utiliserons ici un modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, ce qui nous permet de connaitre la faisabilité et les conditions appropriées des procédures expérimentales.
Réduction
Un nombre de 8 à 10 souris par groupe expérimental sera nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets génotype. Les tests statistiques consisteront au préalable en un test de normalité, puis en un test d’analyse de variance à deux facteurs, suivi si besoin de tests post-hoc. Dans le cas où les données ne suivraient pas une distribution normale, des alternatives non-paramètriques aux tests cités ci-avant seront realisées. Enfin, les études réalisées en amont ainsi qu’une connaissance accrue de la bilbiographie sur le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques, en particulier pour les expériences ayant recours à l’utilisation de THC. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites (Voir Annexe 1 ; tableaux 3 A, B, C et Annexe 2, Tableau 1). De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuissances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des animaux (Varholick et al., ScientIfic Reports, 2019), et afin de reproduire les conditions d’hébergement des projets précédents. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation (Gouvela & Hurst, Plos one, 2013). Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 1h avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des mutations génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’homme. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de l’homme, ce qui permettra une possibilité de translation chez l'homme dans des études de recherche & développement des résultats obtenus dans le projet de recherche. De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Enfin, des études préliminaires réalisées in vitro ont démontré la conservation du site de fixation de la pregnenolone sur le récepteur aux cannabinoïdes CB1 chez le récepteur murin et humain; ce qui encourage l’utilisation de ce modèle dans notre étude. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie). Ce projet se fera dans la continuité de projets précédents chez ces souris au même âge et permettra de mieux appréhender les mécansimes de régulation endogène du récepteur aux cannbinoïdes CB1 par la pregnénolone.
Effets de souche bactérienne sur la production d’hormone
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des souches bactériennes dans l'eau de boisson pendant vingt-sept jours, hébergées seules pour mesurer leurs prises alimentaire et hydrique, et subissent un prélèvement de sang à la queue puis un prélèvement terminal par ponction cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que l'apport bactérien pourrait perturber le transit intestinal et que la prise de sang initiale représente 15 % du volume sanguin. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans le développement de composés thérapeutiques visant à moduler ou restaurer le microbiote afin de produire une hormone spécifique. Cette étude se déroulera en deux étapes avec une étape préliminaire ayant pour but de sélectionner la souche bactérienne la plus efficace. Dans un second temps, à partir de cette souche-candidat, une dose-réponse sera effectuée afin de déterminer la dose optimale pour les études futures.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés thérapeutiques visant l'humain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouveau composé modulant ou restaurant le microbiote permettant la production d'une hormone spécifique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types de prélèvement, un prélèvement sanguin à D0 par la veine caudale (2x100µL) sur animal vigile et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque sur animal anesthésié par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.). Par ailleurs, les animaux auront des souches bactériennes par l'eau de boisson de D0 à D27. Les 24 souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesures individuelles de la prise alimentaire et de la prise hydrique implique l'hébergement individuel des animaux. L'administration des souches bactériennes par eau de boisson de D0 à D27 pourrait engendrer des modifications du transit intestinal (non prévue initialement dans l'étude). La seule manipulation pouvant engendrée une nuisance est le prélèvement sanguin à D0 (200µL) par la veine caudale (représentatif de 15% du volume sanguin total). L'ensemble des souris seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.). Les souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d'un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et hydrique et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudés sont les suivants : le poids corporel, la prise alimentaire, la prise hydrique, la cytokine IL-10 (serum) et l'hormone ocytocine (plasma). De plus, l'étape 1 du projet nous permet de réduire drastiquement le nombre d'animaux à utiliser pour la dose-réponse de l'étape 2. Cette étape préliminaire est indispensable pour le respect de la règle des 3R.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitement seront administrés via la nourriture ou la boisson, permettant de limiter les manipulations et le stress liés à l'administration des traitements. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois spécialement conçus pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment). L'ensemble des souris sera euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est le modèle de souris le plus classiquement utilisés et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 7 semaines, au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population de jeune adulte.
Preuve de concept de la valeur ajoutée de l’utilisation de l’IRM dans l’étude d’un modèle de lymphome implanté chez la souris immunocompétente
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.
Objectifs
Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.
Procédures
-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.
Impact sur les animaux
- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).
Remplacement
Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.
Réduction
Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.
Nouvelles thérapies moléculaires et cellulaires dans la prévention du rejet de greffe.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie et, pour une partie, une greffe de peau entre donneuse et receveuse préalablement immunisée, pour étudier des traitements contre le rejet d'organe. Le porteur indique des complications possibles de cicatrisation, de saignement ou d'infection au site de greffe, et une déshydratation liée à un bandage trop serré. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et d'organes.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminales sont des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Ceci s'explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines HLA du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps anti-HLA avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du HLA étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse, ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation de nombreux patients. Certaines protéines HLA, comme le HLA A2, sont plus souvent en cause, parce qu’elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre le HLA du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certains plasmocytes producteurs d’anticorps anti-HLA ne peuvent pas être ciblés par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Notre projet vise à développer une approche thérapeutique plus sélective qui cible uniquement les lymphocytes B et plasmocytes qui produisent les anticorps contre une protéine HLA spécifique du donneur. Une telle approche permettrait à la fois d’obtenir une meilleure efficacité en ciblant également les plasmocytes, et une meilleure tolérance, en préservant les lymphocytes et plasmocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps anti-HLA.
Bénéfices attendus
Cet étude permettra le développement et la validation préclinique des nouvelles stratégies de thérapie cellulaire et moléculaire visant à prévenir et traiter le rejet humoral, de façon à faciliter l’accès à la transplantation des patients sur liste d’attente.
Procédures
Les procédures #1, 2 et 3 impliquent des prélèvements sanguins hebdomadaires (100ul) sur souris anesthésiée ( pour monitorer l’efficacité, d’abord, du protocole d’immunisation (J-7 avant début du traitement) et, en suite l’efficacité, de nos traitements dans évolution du tôt d’anticorps et lymphocytes B spécifiques. La procédures #3 prévoie aussi une procédure de greffe de peau entre souris donneuse et souris receveuse pre-immunisée contre le donneur : la procédure chirurgicale est effectué une seule fois sur souris anesthésiée pendant 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure 3, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection. Ces complications sont rares (
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale pour collecter le sang (ponction intracardiaque) et les organes d'intérêt (ratte, foie, os, poumon, ganglions) pour l'analyse des effets des traitement sur les différents sous populations de lymphocytes B.
Remplacement
Des études préliminaires sur cellules sont en cours pour établir l’efficacité in vitro des différents traitements (cellulaire et moléculaires) sur une population mixte de lymphocytes dérivés de souris immunisées contre le HLA A2. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude pré-clinique.
Réduction
Les études in vitro nous permettront d’estimer l’efficacité des différentes approches testées. Dans le cas de résultats clairement négatifs (absence d’effets), la procédure relative au traitement en question sera retirée du projet et les souris ne seront pas utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui pourront entrainer le cas échéant l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de la chirurgie pour les animaux greffés.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).