Souris
Réponse des cancers du sein aux antiestrogènes : étude par xénogreffe chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain sous les flancs et de l'estradiol dans l'eau de boisson, puis des antiestrogènes, pour étudier une protéine liée à la résistance à l'hormonothérapie chez les patientes. Le porteur indique que la tumeur constitue le point limite, son volume au-delà de 500 mm3 déclenchant l'arrêt du protocole et le prélèvement. Il affirme que les travaux in vitro ne reproduisent pas l'activité de cette protéine et présente la xénogreffe comme "nécessaire".
Objectifs
Les patientes atteintes de cancer du sein présentent une tumeur exprimant le récepteur aux estrogènes ERalpha et sont traitées par hormonothérapie. En clinique les traitements de ces patientes par les antiestrogènes (Tamoxifen et Fulvestrant) diminuent le taux de rechute et améliorent la survie des patientes. Le Tamoxifen est administré chez les patientes pré-ménopausées et en seconde ligne, le Fulvestrant est utilisé dans le traitement du cancer du sein lorsqu'il est localement avancé. L’efficacité de ces thérapies est limitée par la résistance à ces traitements, car jusqu’à 40% de ces tumeurs rechutent après les traitements. Ceci rend nécessaire les études cliniques qui évaluent les bénéfices des traitements sur les rechutes tardives. Nous avons montré qu’une protéine fortement présente dans les tumeurs mammaires module l’activité du récepteur ERalpha dans ces tumeurs et affecte ainsi la réponse des patientes aux traitements. Le traitement par les antiestrogènes induirait l’activité bénéfique de cette protéine chez les patientes sensibles mais pas chez les patientes résistantes. Le modèle murin reproduit la réponse tumorale observée chez les patientes sensibles aux traitements. Ceci permet l’étude des mécanismes de la sensibilité aux antiestrogènes après prélèvement de la tumeur murine. L’objectif du projet est de comprendre le rôle de cette protéine dans la réponse des patientes aux antiestrogènes.
Bénéfices attendus
L'utilisation de ce modèle murin de xénogreffes qui mime la tumeur des patientes hormonosensibles permettra de mieux comprendre la résistance au traitement par le Tamoxifen et par le Fulvestrant et donc d'identifier des biomarqueurs de la sensibilité des patientes à l’hormonothérapie, d’adapter les traitements des patientes ayant un cancer du sein hormonosensible et donc d'entrevoir de nouvelles thérapies.
Procédures
Les animaux sont inoculés avec des cellules tumorales sous la peau des flancs en début des études et sont supplémentés par de l’estradiol dans l’eau de boisson, pour la durée de l'étude. L'injection des cellules tumorales sur les 2 flancs de la souris nécessite 1 minute d'endormissement de l'animal, placé sous anesthésie gazeuse (isoflurane/air). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. En fin de protocole, après sédation de la souris et dislocation cervicale, les tumeurs seront prélevées post-mortem. Le temps d'endormissement pour la sédation des souris par anesthésie chimique (Kétamine/)Rompun) est de 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris sont ceux dus à l’inoculation de cellules tumorales chez des animaux immunodéficients. Le volume tumoral est un point limite (>500 mm3 ) déterminant l’arrêt du protocole et le prélèvement des tumeurs. Les souris sont également supplémentées par des antiestrogènes et par des inhibiteurs de leur activité. Les traitements par les antiestrogènes sont donnés dans l’eau de boisson des souris ou par une injection hebdomadaire sous la peau de l’animal, ce qui limite les interventions par injection.
Devenir
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. En fin de protocole, après sédation de la souris, les tumeurs seront prélevées post-mortem après dislocation cervicale, afin d'étudier les modifications induites dans les tumeurs des souris recevant les traitements comparativement aux souris non traitées.
Remplacement
Nos travaux menés in vitro dans des cellules de cancer du sein suggèrent l’activité bénéfique d’une protéine dans la réponse aux antiestrogènes chez les patientes atteintes d'un cancer du sein hormonosensible. Ces travaux in vitro ne permettant pas de reproduire l'activité de la protéine telle qu'elle est observée dans les tumeurs chez les patientes, des études in vivo seront faites grâce à un modèle de greffe de cellules humaines de cancer du sein, chez la souris. Ce modèle murin dit de "xénogreffe" mime ainsi la tumeur mammaire humaine et est nécessaire à l’observation des caractères de la tumeur chez les patientes.
Réduction
Les études menées au préalable dans des lignées de cellules de cancer du sein ont permis d'étudier l’effet antitumoral des antiestrogènes. Cependant, ces travaux in vitro n'ont pas reproduit l'activité de la protéine telle qu'elle a été observée dans les tumeurs des patientes. Le recours au modèle de xénogreffe de cellules de cancer du sein chez la souris est nécessaire. La formation de tumeur chez les souris est d’environ 80% dans ce modèle de xénogreffe murin de cellules de cancer du sein hormonosensible. Nous étudierons l'inhibition de la croissance tumorale chez les souris par les traitements aux antiestrogènes et comparerons cette croissance entre les souris traitées et non traitées. Pour mesurer une différence significative des traitements sur la croissance des tumeurs, entre les groupes de souris traitées et celles ne recevant pas le traitement, il faut 10 souris Balbc/Nude par groupe. L'étude comporte 12 groupes et nécessite donc 120 souris.
Raffinement
Les souris cohabitent dans des cages à couvercle filtrant, dans des conditions d’humidité, de lumière et de ventilation adéquates avec un environnement enrichi par les petites cabanes-niches et du coton. sous surveillance journalière. Tout élément rentrant en contact avec la souris est stérile. Le change de la litière et de la cage s’effectue une fois par semaine par le personnel compétent de l’animalerie. Lors de l’injection des cellules tumorales, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Les traitements par les inhibiteurs des antiestrogènes sont adaptés d'après des études de la littérature scientifique qui préconisent l'inoculation de ces inhibiteurs dans l'huile de maïs stérile pour limiter les effets irritants et allergisants. L’observation de signes de douleur ou de mal être (prostration, perte de poids, morsure) entraînera la sortie du protocole de l’animal. En cas de signes de stress associés à un des points limites, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale avec une sédation préalable.
Choix des espèces
La souris Balbc/Nude est couramment utilisée en oncologie car l’inoculation de cellules tumorales humaines n’induit pas le rejet de la xénogreffe dans cette espèce. Les études seront réalisées avec des souris femelles car elles portent sur le cancer du sein et chez des animaux de 8 semaines, car à cet âge, l’ensemble des fonctions est mature.
Etude de l’efficacité d’un composé anti-obésité en développement chez la souris diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour être obèses et diabétiques, elles sont hébergées seules et reçoivent une administration orale quotidienne, des prélèvements sanguins et un test de tolérance au glucose avec mises à jeun, pour tester un composé anti-obésité d'un laboratoire client. Le porteur indique que leur diabète sévère et le composé testé peuvent provoquer une perte de poids source de nuisance, et prévoit un antidouleur si nécessaire. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe et rappelle que l'objectif est de constituer un dossier de mise sur le marché.
Objectifs
L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ce composé induit une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris génétiquement modifiées obèses et diabétiques.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de par leur génotype (toute la durée de la vie de l'animal ; continu) - un hébergement individuel (sur toute la durée de l'étude ; continu) - une administration orale (quotidienne ; à partir de D-11 ; 1min) - une pesée (quotidienne ; de D-18 à D-1 ; 1min) - une prise alimentaire (2 fois par semaine ; de D-18 à D-1 ; 1min) - une mise à jeun de 4h et un prélèvement sanguin à la queue (à D-3 et D29 ; 4h et 10min) - une prise alimentaire et une pesée (trois fois par semaine ; à partir de D1 ; 2min) - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min après administration du glucose] (à D28 ; 9h). De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance (à partir de D1 ; continu).
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur génotype (db/db), les souris seront naturellement obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jêun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas), hémoglobine glyquée et les poids des différents organes.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cage individuelle du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes et de briquettes en bois. Par ailleurs, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une prise en charge de la douleur avec une injection de buprénorphine (0,05mg/kg) si nécessaire et une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Enfin, une partie des animaux seront euthanasiés par une surdose d'anesthésique (Euthasol) suivie d'une dislocation cervicale une fois les animaux endormis, elle-même vérifiée par les expérimentateurs. L'autre partie des animaux seront anesthésiés par un mélange de kétamine/xylazine, puis, une fois la ponction cardiaque réalisée, une dislocation cervicale sera réalisée avant tout prélèvement post-mortem.
Choix des espèces
Les souris db/db sont des souris génétiquement modifées qui deviennent spontanément diabétiques. Ces animaux présentent une obésité morbide, une hyperglycémie chronique, une atrophie des cellules béta du pancréas et deviennent hypoinsulinémique. Ce modèle animal est idéal pour étudier l'obésité et le diabète. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude des conséquences neurologiques de l’infection par le virus SARS-COV-2 et validation de l’efficacité de molécules prophylactiques et thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Hamsters dorés : 2164
2 524 animaux non-humains, 2 164 hamsters dorés et 360 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, suivis cliniquement puis soumis à des tests de comportement dont le détail n'est pas précisé, pour étudier l'atteinte du système nerveux par le virus et tester des molécules. Le porteur indique une perte de poids et une perte possible du goût et de l'odorat dans les cinq jours suivant l'infection, les animaux atteignant les points limites étant mis à mort. Il affirme que l'infection du cerveau ne peut être démontrée in vitro et présente ces expériences comme une "étape incontournable".
Objectifs
Il s’agit d’étudier la capacité du SARS-CoV-2 à infecter le système nerveux et d’analyser l’efficacité de nouvelles approches préventives ou curatives pour lutter contre l’infection et ses conséquences.
Bénéfices attendus
Afin d’étudier la colonisation du système nerveux central par le SARS-CoV-2, le laboratoire utilisera des modèles rongeurs reconnus dans le domaine de la physiopathologie de l’infection (hamster doré syrien adulte et souris génétiquement modifiées). L’état de santé de ces animaux, et notamment tout ce qui signe une atteinte du système nerveux, sera suivis. Enfin l’activité potentielle de molécules limitant l’entrée du virus et sa propagation dans l’organisme seront analysés. Ce projet devrait permettre à terme de mieux comprendre les mécanismes d’atteintes du virus sur le système nerveux et de développer et valider des approches préventives ou curatives dans les modèles animaux.
Procédures
Intervention 1 : Inoculation intranasale sur animaux anesthésies. 360 souris et 2164 hamsters. Durée de l’intervention : moins d’une heure/animal Intervention 2 : Suivi clinique sur des animaux vigiles (pesée et observation de l’état de santé). 360 souris et 2164 hamsters. Durée de l’intervention : environ 5 minutes/animal, répétition quotidienne selon la durée de l’expérimentation (4 jours pour la phase aiguë, 14 à 30 jours pour la phase chronique) Intervention 3 : Tests de comportement sur des animaux vigiles. 150 souris et 934 hamsters. Durée de l’intervention : moins de 20 minutes/test, maximum 3 tests/animal (1 test/jour pendant 3 jours).
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter la douleur, la souffrance des animaux (anesthésie,...) et l’angoisse (plusieurs souris ou hamster par cage, mise en place d’enrichissement sous la forme d’igloo, de coton,...). Enfin, des points limites sont clairement définis et permettent d’éliminer toute souffrance inutile. Si des animaux deviennent malades et atteignent les points critiques, ils seront mis à mort. Les animaux infectés présentent une perte de poids dans les 5 jours post-infection, avec ensuite une reprise de poids. Les animaux peuvent être présenter une perte du goût et de l’odorat également dans les premiers 5 jours post-infection. Pas de problèmes liés à la locomotion ni à la douleur sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Après leur infection dans un niveau de confinement de niveau 3, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Ces expériences viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture de neurones humains et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. En effet, l’infection de neurones in vitro ne nous permet pas de prouver si le cerveau est infecté lors d’une infection intranasale ni d’évaluer les conséquences encéphaliques lors de l’infection par le SARS-CoV-2. Il est aussi important de pouvoir tester et valider in vivo les résultats obtenus in vitro concernant le rôle du récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAChR) dans l’infection.
Réduction
L'analyse des résultats utilise des tests statistiques permettant de comparer dans les règles de l'art les données qualitatives ou quantitatives obtenues et limitant le nombre d'animaux au strict nécessaire d’après notre expérience. 2164 hamsters et 360 souris seront utilisés.
Raffinement
L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter la douleur, la souffrance des animaux (anesthésie,...) et l’angoisse (plusieurs souris ou hamster par cage, mise en place d’enrichissement sous la forme d’igloo, de coton,...). Enfin, des points limites sont clairement définis et permettent d’éliminer toute souffrance inutile. Si des animaux deviennent malades et atteignent les points critiques, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Le hamster doré syrien (Mesocricetus auratus) semble être le meilleur modèle animal pour l’étude d’une infection par le SARS-COV-2 en raison de la capacité de son récepteur ACE2 à se lier au domaine de liaison au récepteur de la protéine spike du SARS-COV-2 avec une affinité de liaison élevée. De plus, ce modèle animal présente une longue période d’infection avec un faible taux de mortalité. Des souris génétiquement modifiées exprimant le récepteur ACE2 humain seront également utilisées dans ce projet comme substitut d’une infection humaine. Les modifications génétiques de ces souris n’induisent pas de modifications dommageables du phénotype de ces souris, mais les rendent sensibles à l’infection par SARS-CoV-2. Ce projet utilise des souris et hamsters adultes. Nous utiliserons des animaux adultes car ces animaux présentent des signes d’infection plus proche de ce qui est observé chez l’homme (ce sont aussi les classes d’âge les plus élevés qui sont les plus touchés chez l’homme.
Formations réglementaires des personnels concevant ou participant aux procédures expérimentales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 155
Cochons : 10
475 animaux non-humains, dont 310 souris et 155 rats tués et 10 porcs réutilisés ensuite dans un autre projet, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Souris et rats subissent gavages, injections et prélèvements dont des ponctions rétro-orbitaires, les porcs une anesthésie et une intubation, non pour produire des connaissances mais pour entraîner aux gestes des personnels d'expérimentation. Le porteur indique qu'il arrive "relativement fréquemment" qu'un ou plusieurs rongeurs meurent d'un accident anesthésique, ce qui explique le nombre d'animaux prévu. Il affirme que les animaux vivants ne peuvent être "remplacés intégralement" par des modèles inertes, tout en indiquant que les participants s'exercent d'abord sur mannequins.
Objectifs
La protection des animaux utilisés à des fins scientifiques repose en Europe sur 4 points : l'agrément des établissements, le contrôle de leur origine, l'autorisation des projets et la qualification des personnels. Notre établissement assure ce type de formations pour les concepteurs depuis les années 1990 et depuis 2014 nous organisons cette formation réglementaire concepteurs-réalisateurs sous la forme de 4 modules thématiques en accord avec la réglementation actuelle. Une session annuelle a lieu avec un module général et trois modules spécialisés : un consacré aux rongeurs et au lapin, un consacré aux carnivores et au porc et un consacré aux ruminants, au cheval et au porc. Une formation est complète pour un groupe d’espèces lorsqu’un participant a suivi et validé (présence + examen) le module général et un module spécifique. L'un des facteurs de qualité de ces formations est constitué par leur partie pratique sur des modèles inertes et des animaux. En dehors de l'apprentissage indispensable des gestes techniques et de leur bonne réalisation, le fait d'être confronté à des animaux vivants au cours de la formation permet aux participants de se trouver en situation de ce type d'utilisation des animaux et alimente les débats autour des aspects éthiques d'utilisation des animaux en recherche, ce d'autant plus que de nombreux participants de ces formations sont au tout début de leur parcours professionnel. Nous garantissons un parcours pédagogique le plus didactique et éthique possible pour l’apprentissage des gestes techniques peu invasifs (contention, administrations, prélèvements), avec la réalisation des enseignements par des intervenants qualifiés et pédagogues, selon la séquence suivante : 1. Un cours théorique complet détaillant les éléments techniques et scientifiques et les points limites associés à ces gestes 2. Une séance de travaux pratiques (TP) sur modèles inertes permettant l’acquisition de ces gestes (nombreux ateliers mis à disposition des participants et animés par plusieurs intervenants qualifiés), 3. Des visites ou des TP avec des animaux vivants dans les meilleures conditions possibles pour les participants et les animaux. Notre objectif est qu’à l’issue de cette formation, les participants aient une bonne maitrise des principaux gestes techniques autorisés par une telle formation et soient en mesure de les appliquer dans les meilleures conditions possibles de respect des animaux et avec la plus grande pertinence scientifique possible.
Bénéfices attendus
Dans le cadre des formations obligatoires des personnes appelées à intervenir dans des projets de recherche impliquant des animaux, nous estimons indispensable que les apprenants pratiquent sur des animaux vivants les actes techniques autorisés par cette formation les plus courants. Depuis le début de 2016, une séance de travaux pratiques sur modèles inertes (mannequins de rats, modèles d'oreilles de lapins, mannequins de cheval ou de vache permettant les ponctions de la veine jugulaire, mannequin de porc pour la contention...) est organisée préalablement aux séances de travaux pratiques sur animaux vivants objets de la présente demande d'autorisation de projet. Cette séance permet d’acquérir la maitrise technique des gestes avant de les pratiquer sur des animaux vivants et de réduire ainsi le risque d’infliger une douleur, un stress ou une lésion à un animal (Raffinement). Il demeure que la réalisation ou l'observation d'actes pratiqués sur l'animal vivant est une partie essentielle à la qualité de la formation des personnels ayant à les réaliser dans leur activité professionnelle, garantissant ainsi des gestes en conditions réelles techniquement mieux réalisés, plus sereinement, cela au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. Ces séances sont animées par un nombre conséquent d’encadrants très expérimentés, motivés par la transmission de leurs savoir-faire et très attentifs au bien-être des animaux.
Procédures
Souris et rats : sur animaux vigiles : gavage et pour la souris, un prélèvement à la veine mandibulaire ; sur animaux anesthésiés : plusieurs injections intra-musculaires, sous-cutanées, intradermiques, intraveineuses), et prélèvements intraveineux et rétro-orbitaires Porc : anesthésie et intubation La séance de travaux pratiques dure 2h pour chaque espèce. Chaque geste est réalisé sur quelques secondes ou minutes.
Impact sur les animaux
La contention des animaux et la réalisation des premiers gestes avant anesthésie impliquent un stress des animaux. Celui-ci est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement une semaine avant la séance de travaux pratiques, l’apprentissage préalable des gestes par les participants sur modèles inertes et un encadrement au plus près des participants, centré sur le respect des animaux. L’effet indésirable le plus fréquent est un accident anesthésique chez un rat ou une souris (pas d’événement rencontré chez le porc en 8 ans). En cas d’apnée ou d’arrêt cardiaque, une réanimation vigoureuse est pratiquée par un encadrant. Il arrive néanmoins relativement fréquemment qu’un ou plusieurs animaux meurent, ce qui explique le nombre d’animaux prévu pour chaque session. La maitrise par les encadrants du mélange anesthésique, des stratégies de réanimation et des erreurs des participants les plus fréquentes permettent de réduire année après année ces accidents anesthésiques.
Devenir
Les rongeurs (procédure 1 et 2) sont euthanasiés et les porcs (procédure 3) sont maintenus en vie et réutilisés dans un autre projet après évaluation par le vétérinaire désigné. Les souris et les rats sont euthanasiés à l’issue de la séance car aucune utilisation ni aucun replacement ne peut être envisagé pour ce nombre d’animaux, après réalisation de plusieurs gestes dont des prélèvements rétro-orbitaires et après rupture de leur statut sanitaire « Specificic pathogen free » lors de cette séance. Les cadavres des rats sont utilisés pour une séance de dissection en anatomie.
Remplacement
Les mesures prises pour le respect des 3R sont les suivantes : en premier lieu, nous estimons qu'il en va du bien-être des animaux ultérieurement manipulés par nos participants dans leur exercice professionnel qu'ils aient pratiqué ou au minimum vu pratiquer la plupart des gestes courants et peu invasifs pouvant être utiles à la réalisation de projets de recherche. Pour cette raison, nous estimons que les animaux vivants ne peuvent être remplacés intégralement par des modèles inertes. Toutefois, nos participants commencent toujours par pratiquer les mêmes gestes sur ces modèles.
Réduction
Ce projet nécessite pour 5 ans l’utilisation d’un total de 310 souris, 155 rats et 10 porcs au maximum. Le nombre d'animaux utilisés correspond à une souris par participant, un rat pour 2 participants et un porc pour 10 participants, ce qui semble le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Par ailleurs, les rats euthanasiés lors des travaux pratiques d’administrations et prélèvements sont ensuite utilisés lors de la séance de dissection pour l’anatomie. Enfin, les porcs sont ensuite ré-utilisés par une équipe de recherche. Ces réutilisations permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire.
Raffinement
La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce un entrainement des participants sur modèles inertes, à un encadrement nombreux et de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes les plus douloureux ou stressants sont réalisés sous anesthésie générale. Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long des travaux pratiques sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces travaux pratiques doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal et la pertinence des résultats scientifiques.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles les plus pertinents pour le module rongeurs-lapin, de par la fréquence de leur utilisation et leur différence de taille qui permet d’appréhender la variation des gestes techniques. Le porc est le modèle le plus pertinent pour le module carnivores-porc car la majorité des participants à ce module travaillent avec des porcs, que le porc présente un niveau de difficulté important pour l’intubation, qui justifie la confrontation à ce geste lors de la formation, et enfin parce que notre établissement utilisateur permet la réutilisation des porcs pour une autre équipe. Adultes pour les souris (16 semaines), jeunes adultes pour les rats (6-7 semaines), jeunes porcs (environ 1 à 3 mois). Les animaux sont ainsi de taille suffisante sans être trop gras (ce qui rendrait l’anesthésie plus difficile et donc dangereuse), avec une bonne homogénéité des lots pour faciliter la gestion anesthésique.
Phénotypage cardiaque d’un modèle de souris pour une myopathie centronucléaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. La moitié porte une mutation reproduisant une myopathie myotubulaire humaine, une maladie musculaire que le porteur décrit comme provoquant faiblesse et difficultés de locomotion dès cinq semaines, et toutes subissent échographie et électrocardiogramme sous anesthésie puis des mesures de pression artérielle par contention pendant sept jours. Le porteur indique que les souris mutantes ont un poids inférieur et peuvent présenter une bradycardie sous anesthésie, une perte de poids de 20 % en une semaine déclenchant l'arrêt du protocole. Il affirme que la fonction cardiaque ne peut être évaluée in vitro et présente la souris comme l'une des seules espèces permettant les modifications génétiques voulues.
Objectifs
MTM1 est un gène muté dans une maladie musculaire sévère appelée myopathie myotubulaire. Les patients masculins atteints de myopathie myotubulaire présentent une forte hypotonie dès la naissance associée à une faiblesse musculaire généralisée et des déficiences respiratoires. Les patients nécessitent alors une assistance respiratoire et plus de 60% d'entre eux ne survivent pas plus de 2 ans. Ce projet a pour objectif principal de quantifier d'éventuels impacts sur la fonction cardiaque associés à cette pathologie. Une précédente étude dans le coeur des souris ayant mis en évidence plusieurs gènes et fonctions moléculaires affectées par la maladie, nous souhaitons obtenir des données quantitatives précises pour étudier l'impact de ces dérégulations sur la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Pour cette étude, nous évaluerons les conséquences fonctionnelles d'une mutation de Mtm1 sur le coeur, ce qui n'a jamais été réalisé auparavant. Ce modèle chez la souris reproduit fidèlement les symptômes de patients atteints de myopathie myotubulaire, et présente une altération de l'expression des gènes dans le coeur. En caractérisant quantitativement la fonction cardiaque de ces souris, nous espérons ainsi mieux comprendre les mécanismes causant cette pathologie.
Procédures
Les animaux (16 souris) seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme, et à une mesure non invasive sur animaux vigiles (mesure de pression artérielle grâce à un manchon gonflable positionné autour de la queue) d'une durée de 20 minutes répétée une fois par jour pendant sept jours.
Impact sur les animaux
Pour cette étude , nous utiliserons un modèle atteint de myopathie myotubulaire. Cette souris développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 5 semaines d' âge en moyenne. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur aux animaux contrôles. Pendant la procédure expérimentale, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la platforme de l'échographie tout au long de l'expérience. Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme. Les souris subiront une contention lors de la mesure de pression artérielle.
Devenir
Afin de pouvoir réaliser une analyse histologique, les animaux d'expérience (16 souris) seront mis à mort pour prélever leur coeur, ce qui nous permettra de réaliser des analyses histologiques complémentaires.
Remplacement
Nous souhaitons caractériser la myopathie myotubulaire, une maladie génétique affectant les muscles. La souris est physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, et il existe un modèle de souris présentant un mutation sur le gène Mtm1 qui conduit à l'absence de la protéine correspondante. Ce modèle reproduit fidèlement les symptômes des patients atteints de myopathie myotubulaire. Il nous permet donc d’étudier et de mieux comprendre cette pathologie. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car l’évaluation de la fonction cardiaque serait impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 8 souris mâles par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. C’est le nombre d'animaux par groupe nécessaire pour atteindre la significativité statistique. Nous prévoyons donc 16 animaux d'expérience pour cette étude. Les géniteurs ne présentent pas de phénotype dommageable, on compte donc au total 16 animaux pour cette étude.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de mouvement apparaissent, de la nourriture en gelée sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude de la souris en question sera prématurément stoppée. L'échographie et l'électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie, et toutes les précautions adéquates seront prises pour assurer le bien-être des animaux lors de la procédure expérimentale (plaque chauffante à 37°C jusqu'au réveil, gel ophtalmique pendant l'anesthésie pour éviter le désechement de la cornée).
Choix des espèces
La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de myopathie myotubulaire, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction d'un organe, le coeur. Pour caractériser le phénotype cardiaque de ces souris, les animaux seront étudiés à 5 semaines, ce qui est un âge auquel on peut observer des effets sur les muscles squelettiques. Nous faisons donc l'hypothèse qu'un éventuel impact sur la fonction cardiaque serait également visible à cet âge. Les symptômes très sévères observés chez les souris à partir de 6 semaines ne nous permettent pas de réaliser cette étude à un âge plus avancé.
Identification de la fonction de la protéine SELENON dans la régulation glycémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 192 opérées du pancréas sous anesthésie et tuées avant tout réveil et 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement invalidées pour le gène SELENON, une partie reçoit une alimentation enrichie pendant six semaines pour induire un syndrome métabolique, avec mesures répétées de la glycémie et prises de sang, pour étudier le rôle de cette protéine dans la régulation du sucre. Le porteur indique que les souris peuvent développer un diabète avec perte de poids supérieure à 20 %, polyurie et hypo ou hyperglycémies, une insulinothérapie devant limiter ces atteintes. Il affirme qu'aucun autre modèle n'existe et qu'il est "impératif" d'étudier la protéine dans un organisme complet où tous les acteurs de la glycémie sont présents.
Objectifs
Le projet de recherche porte sur l’identification de la fonction de la protéine à sélénium SELENON, dans les mécanismes de la régulation glycémique en conditions physiologique et physiopathologique. La mutation de SELENON est responsable de dystrophies musculaires chez l’homme. Néanmoins, la fonction de SELENON et les mécanismes impliqués dans ces dystrophies musculaires restent inconnus et aucun traitement n’est actuellement proposé. Curieusement, l'expression de SELENON n'est pas limitée au tissu musculaire. En effet, plusieurs données de la littérature décrivent la présence du gène SELENON dans le pancréas. Le pancréas est un acteur central de la régulation de la glycémie. Par ailleurs, il a été démontré l’importance du dialogue muscle-pancréas dans le contrôle de ce système de régulation de la glycémie. De plus, dans certaines études réalisées sur une cohorte de patients atteints de myopathie liée à SELENON, il a été démontré que des index de masse corporel faibles sont associés à des niveaux d'insuline à jeun et post-prandial élevés, suggérant un risque élevé de résistance à l'insuline. L'objectif du projet est d'étudier le rôle de SELENON dans le pancréas dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, sa fonction dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie.
Bénéfices attendus
Les différentes analyses qui seront réalisée lors des études in vitro et in vivo de ce projet, nous permettront d’identifier les facteurs contrôlant l'expression de SELENON et fourniront des informations précieuses sur le contexte de son activité. Elles nous aideront également à évaluer la contribution d’un dysfonctionnement pancréatique au développement de la maladie musculaire. Enfin, les découvertes qui seront obtenus lors de ce projet nous permettrons d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du diabète mais également des maladies musculaires.
Procédures
Procédure1 : Pour le prélèvement du pancréas, une incision de l’abdomen et la mise en place d’un tube très fin en plastique dans le pancréas seront réalisés sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). Procédure2 : Les souris seront soumises soit à de l’alimentation standard appelée normal diet soit à une alimentation enrichie, appelé High Fat Diet pendant 6 semaine afin d’induire un syndrôme métabolique (durée classiquement décrite dans la littérature). Quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosages. Une fois par mois la fonction réelle du pancréas sera évaluée. Le test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie (0,6 µL de sang par mesure) toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL (incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose et 200 µL en postprandial. L’injection de glucose est réalisée sur animal vigile soumis à une contention manuelle. En fin d’étude, les animaux seront mis à mort et les organes prélevé (pancréas, muscles…) pour réalisation d’études histologique, protéomique et génomique.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, il pourrait être envisagé le dévelopement d'un phénotype diabétique chez les souris KO. Ainsi, une dégradation de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. etc... Néanmoins, l’insulino-thérapie qui sera mise en place pour traiter l'hyperglycémie devrait empêcher ces nuisances.
Devenir
L'objectif du projet est d'aborder l'expression de SELENON dans les tissus pancréatiques dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, son activité dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie. Ainsi, les devenir des animaux après chaque procédure se justifie par : - Procédure 1 : Cette procédure permet d’obtenir des îlots pancréatiques, source de cellules indispensable pour les études menées sur le diabète (mécanismes moléculaires de l'insulino-sécrétion physiologique et physiopathologique...). - Procédure 2 : L’euthanasie des animaux nous permettra de réaliser des études histologiques, de protéomique et de génomique sur les différents organes impliqués dans la régulation de la glycémie et sur les organes impactés par le diabète. Ceci nous apportera de cruciales informations sur le rôle de SELENON dans le développement du diabète afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutique de cette maladie. Enfin, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement.
Remplacement
En dehors de notre lignée de souris transgénique, il n’existe pas d’autre modèle permettant d’étudier le rôle du gène SELENON dans la fonction musculaire et la régulation glycémique. Des études menées in vitro sur des cultures cellulaires de muscle nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires et voies cellulaires auxquels participe SELENON. Toutefois, ces études ne permettent pas de comprendre l’importance physiologique de ces processus dans la formation et la maintenance du tissu musculaire. Par ailleurs, un îlot pancréatique est un ensemble complexe composé de différents types cellulaires interconnectés les uns avec les autres pour réguler de façon adapté la fonction régulatrice de la glycémie par la sécrétion de différentes hormones telles que l’insuline, le glucagon etc… Les lignées cellulaires n’ont pas réussi à l’heure actuelle de reproduire efficacement ce fonctionnement. Ainsi, la culture primaire d’îlots pancréatiques est indispensable pour une telle étude in vitro. Enfin, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’évaluer le rôle de SELENON dans un environnement physiologique et physiopathologique, il est également impératif de l’étudier dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés.
Raffinement
Les cages ventillées des souris seront enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges et de carrés de nidification. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et de prise en charge des animaux tout au long de leur séjour dans notre animalerie. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle. De plus, concernant l’isolement d’îlots pancréatiques, la cathétérisation du canal cholédoque à ce stade de développement est bien maîtrisée au laboratoire et permet une bonne reproductibilité des rendements en îlots pancréatiques. Enfin, pour ce projet, les mâles et les femelles seront utilisés car nous souhaitons caractériser le rôle de SELENON dans la régulation glycémique quel que soit le sexe.
Rôle de l’immunosénescence dans le pronostic rénal après une agression rénale aiguë.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, et certaines souris jeunes sont irradiées puis reconstituées avec les cellules de souris âgées, pour étudier le rôle du vieillissement immunitaire dans l'atteinte rénale. Le porteur indique un risque de mortalité de 20 à 30 % lié à l'induction de la maladie et décrit un stress transitoire lié aux chirurgies et injections. Il affirme que la maladie est trop complexe pour des modèles in vitro et présente la souris comme l'espèce "la moins susceptible de ressentir" douleur et souffrance.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier l'impact du vieillissement sur l'infiltrat immunitaire durant l'Insuffisance Rénale Aigue (IRA) et de tenter de trouver de nouvelles interventions ciblant les cellules immunitaires pour prévenir 'lInsuffisance Rénale Aigue (IRA) et sa transition vers l'Insuffisance Rénale Chronique (IRC) chez les sujets âgés.
Bénéfices attendus
Meilleure compréhension des mécanismes immunitaireset physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue chez des souris agées et recheche de traitements pharmacologiques potentiels
Procédures
1/ groupe IRA : L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ) sur des souris males et femelles de 2 et 18 mois anesthésiées. 2/ groupe inhibiteur pharmacologique : Après IRA, des souris seront exposées ou non à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. 3/ groupe chimère hématopoiétique : Des souris jeunes seront irradiées puis le compartiment hématopoiétique sera reconstitué par des cellules provenant de souris agées. Par la suite une IRA sera induite >>Avant sacrifice, tous les groupes d'animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale : diurèse en cage metabolique (1 fois), débit de filtration glomérulaire (2 fois : J0 et avant sacrifice), prise de sang (3 fois : J0, H6, J2) au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50μl) pour mesurer l'urée plasmatique.
Impact sur les animaux
Protocole #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Protocole #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Protocole #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes pour des analyses post sacrifice.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).
Réduction
Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Pour ce projet portant sur l’immunosénescence, nous avons besoin de comparer des animaux jeunes à des animaux vieux. Pour cela, nous utiliserons des souris de 2 mois (jeunes) et de 18 mois (vieux).
Etudes de fertilité ou de screening en toxicologie de la reproduction chez le rongeur et le lapin
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 13048
Lapins : 2576
18 404 animaux non-humains, dont 13 048 rats, 2 780 souris et 2 576 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un produit par gavage quotidien pendant jusqu'à seize semaines, les femelles subissent des lavages vaginaux répétés et une partie des animaux a été ovariectomisée ou castrée, pour évaluer la toxicité de produits sur la reproduction selon des lignes directrices réglementaires. Le porteur indique que le produit testé peut altérer l'accouplement, la gestation, la mise bas et le développement des descendants, et que la nature des nuisances dépend de chaque substance. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces essais et les présente comme "indispensables" à la mise sur le marché.
Objectifs
Ce projet doit permettre l’évaluation de la toxicité d’un produit chez le rongeur et le lagomorphe sur les fonctions de reproduction notamment, et/ou sur la santé, conformément aux lignes directrices : - ICH M3 (R2), S5 (R2). - OCDE 421 et/ ou 422. - OCDE 440 et/ou 441. Les procédures peuvent être indispensables pour une mise sur le marché ou un enregistrement de produit, et permettre la sélection de doses pour des études postérieures. Les études de cette procédure permettent aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition en fournissant des informations sur les effets toxiques majeurs (détermination d’une dose sans effet adverse, d’une marge de sécurité pour l’utilisation/exposition humaine).
Bénéfices attendus
Ces études permettent d’intégrer globalement l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce). En effet, à ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais des études in vivo restent indispensables pour une évaluation complète de l’exposition maternelle à certains produits. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441 correspondent au Niveau 3 de test de screening in vivo dans le contexte du « Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens » (GD 150 (OCDE, 2018)) et ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires dans le contexte de la démarche et dans la suite des tests précédents, comme test de screening essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien.
Procédures
Les animaux sont traités le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière (jusqu’à 16 semaines, mais dépend du type d’étude), avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux (jusqu’à 5 semaines). Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle (jusqu’à positivité du test), observations ophtalmologiques (en général 1 occasion par étude), mesures de pattes (1 à 2 fois par semaine jusque l’âge adulte), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels, en général 1 occasion par étude). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur. Chaque technique (administration par voie orale, réalisation d’un frottis vaginal, examen ophtalmologique, mesure de la longueur de la pattes, évaluation du comportement) dure moins d’une minute par paramètre par animal. Les animaux utilisés dans le cadre des OCDE 440/441 pourront avoir fait l’objet d’une chirurgie (femelles ovariectomisées ou mâles castrés), tel que demandé par les lignes directrices. Cette chirurgie aura été réalisée chez le fournisseur d’animaux, selon autorisation du fournisseur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, des difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, des altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. La toxicité du produit administré peut cibler chaque phase. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ces types de procédure en raison de la complexité que représente un organisme vivant et celle des processus de développement des concepti et des échanges dynamiques entre mère et descendance. Ces études in vivo, ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires au cours de cette démarche et dans la suite des évaluations et tests précédents. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441, font partie d’une batterie d’essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances susceptibles d’interagir avec le système endocrinien, et, à terme, d’évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l’environnement.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est en moyenne de 20 par sexe afin d'obtenir au moins 16 portées par groupe permettant d'avoir des résultats cohérents. Au-dessus de 20-24, il n'y a pas d'amélioration de la cohérence et de la précision des résultats. Ce nombre de portées par groupe (entre 16 et 20-24) est recommandé par la ligne directrice ICH. Le nombre d’animaux par groupe est lui aussi celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e). Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable (i.e., en conformité avec la réglementation en vigueur). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. En cas de plaie et/ou douleur, possibilités de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les lagomorphes ou rongeurs, notamment le rat, sont les espèces de choix car : - recommandées par les lignes directrices et pertinentes pour atteindre les objectifs des études, - présentent notamment une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de descendants par portée, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rat, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - font l’objet de données historiques robustes, - l'utérus des rattes est considéré (notamment par les lignes de l'OCDE 440) comme un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et des antagonistes des œstrogènes, puisque les tissus utérins répondent par une croissance rapide et vigoureuse à la stimulation par les œstrogènes, - l’emploi de rats castrés et des cinq tissus sexuels cibles est jugé pertinent par les lignes directrices de l'OCDE 441 pour le dépistage in vivo d’agonistes et d’antagonistes des androgènes et d’inhibiteurs de 5α-réductase. Le produit sera administré à des animaux juvéniles ou adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement), car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements et doivent correspondre aux âges requis par les lignes directrices. Dans les OCDE 440/441 : conformément aux exigences des lignes directrices associées, le produit pourra être administré à des animaux ayant subis une chirurgie (femelles ovariectomisées ou males castrés), car l’activité endocrine endogène des animaux doit être réduite au minimum afin de pouvoir évaluer l’effet du produit seul. Les petits qui naissent dans le cadre de certaines études (OCDE 421/422), seront gardés pendant une partie de la lactation (selon les lignes directrices ; observation du développement des petits pendant les premières périodes de vie).
Amélioration du traitement de l’accident vasculaire cérébrale via du tPA encapsulé dans des nanomembranes plaquetaires
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine après pose d'un cathéter dans la veine de la queue, puis les lésions sont évaluées par IRM avant prélèvement du cerveau, pour tester un nanomédicament censé améliorer le traitement de l'AVC humain. Le porteur indique que certaines souris peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone lésée. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et présente la souris comme le meilleur compromis entre "pertinence scientifique" et "sensibilité de l'espèce".
Objectifs
L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 15 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 33 % avec une incapacité permanente, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. L'ambition principale du projet est de mettre au point un nouveau modèle de nanomédicaments « intelligents » afin d'améliorer l'efficacité thrombolytique du rtPA, réduire le risque de saignement systémique, d'hémorragie, et d'évaluer le taux de recanalisation par des techniques d'imagerie. Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.
Bénéfices attendus
Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'un AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'un AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à un modèle d'accident vasculaire cérébral ischémique. Puis un cathéter intraveineux sera mis en place pour permettre l'injection des différents traitements. Les lésions cérébrales seront ensuite évalués par imagerie par résonnance magnétique (IRM). Enfin les cerveaux seront prélevés pour permettre de futures analyses.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la pate avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un carré de coton (Nestlets), dôme en carton, paillettes), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).
Devenir
A partir de la procédure 1 (Pose d'un cathéter dans la veine caudale de la queue pour l'injection des différents traitements pharmacologiques), tous les animaux seront utilisés pour la procédure 2 (Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine) puis la procédure 3 (Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM)) qui sera suivie de leur mise à mort.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. De plus, l'utilisation de technique d'imagerie non invasives permettant un suivie longitudinal du même individu permet de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la néphropathie lupique dans un modèle de lupus érythémateux disséminé chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lupus, elles subissent pendant vingt semaines des administrations répétées de molécules, un gavage quotidien possible, des passages en cage à métabolisme et des mesures de filtration rénale sous anesthésie, pour tester les candidats médicaments d'un client. Le porteur indique ne connaître ni la nature ni les effets des molécules testées, et signale des effets possibles comme des infections, des lésions de l'œsophage ou des hématomes aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’atteinte rénale dans un modèle de lupus érythémateux disséminé.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de lupus érythémateux disséminé.
Procédures
Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune procédure chirurgicale. Les animaux pourront subir toutes les procédures expérimentales pendant 20 semaines. Ils pourront avoir des administrations de candidats médicaments ou réactifs de traitement de façon quotidienne pour les voies per os et sous-cutanées, 1 fois par semaine pour les voies intra-péritonéales, intraveineuse et 2 fois par semaine pour la voie intramusculaire. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme par groupe de souris ou de façon individuelle pendant 24H 1 fois par semaine. Les animaux pourront avoir une mesure de filtration glomérulaire qui consiste à une anesthésie légère pour scotcher le capteur d’enregistrement et une administration intra-veineuse. Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés sont génétiquement modifiés pour qu’ils développent spontanément une néphropathie lupique. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. La procédure expérimentale est longue (20 semaines) et les animaux peuvent avoir des traitements répétitifs pouvant engendrer des effets indésirables comme des infections, des lésions de l’œsophage par exemple, des hématomes aux points d’injection… Une attention particulière sera apportée lors des administrations.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie lupique dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur le lupus érythémateux disséminé et sur la néphropathie lupique se fera au cours du temps (jusqu’à 20 semaines) par des techniques non-invasives : évolution dans le temps du phénotype (scores des lésions cutanées de 0 à 6), mesure de la protéinurie par bandelette urinaire et récolte urinaire par cage à métabolisme, ce qui réduit fortement le stress de l'animal. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettront pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié. . Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié (souris MRL/MpJ-Faslpr/J, communément appelées souris MRL-lpr). Ces souris développent une maladie auto-immune ressemblant au lupus érythémateux disséminé en raison d'une mutation (Faslpr) qui favorise la survie des lymphocytes auto-réactifs, et d'un fond de souche (MRL/MpJ) prédisposé à l'auto-immunité. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation d’un traitement anti cancéreux chez la souris, par transfert de globules blancs modifiés pour sécréter des molécules thérapeutiques après détection in vivo de marqueurs tumoraux.
- Recherche appliquée
- Cancers
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, une injection de lymphocytes B et T modifiés, puis un suivi par bioluminescence sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie censée diriger des globules blancs vers la tumeur. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une ulcération des tissus cutanés et que les contentions induisent un stress modéré. Il affirme qu'on ne peut pas s'affranchir du modèle murin et conclut que le recours in vivo est "indispensable".
Objectifs
Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Les propriétés de reconnaissance du globule blanc seront améliorées afin qu’il détecte les cellules tumorales et génère en réponse une forte réponse immunitaire anti-tumorale qui conduira à la destruction de la tumeur. L’un des principaux avantages de cette thérapie est qu’elle permet de prévenir des rechutes du cancer car les globules blancs modifiés persistent dans l’organisme sur le long terme et pourront être réactivés en cas de nouvelles poussées de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer dans un premier temps la capacité de nos cellules B à se diriger vers le site de la tumeur et l’activation du circuit des cellules B reprogrammées puis dans un second temps l’efficacité anti tumorale de ces cellules. Ces procédures vont nous permettre de vérifier la localisation des cellules modifiées et réinjectées ainsi que la libération localisée de la molécule thérapeutique par ces cellules in vivo.
Procédures
- Greffe sous anesthésie : Injection de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Suivi de la bioluminescence sous anesthésie (entre 5 secondes et 8 minutes maximum en fonction de l’intensité lumineuse émise et les limites de saturation de la caméra photosensible). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Injection du substrat pour la bioluminescence (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 28 jours. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Un stress modéré sera induit par les contentions préalables aux anesthésie gazeuse et locale, aux pesées et aux mesures des tumeurs.
Devenir
A l'issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort afin de quantifier la luminescence ainsi que la présence de lymphocytes B modifiés dans la tumeur et dans la rate.
Remplacement
Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. La nouveauté de ce traitement est la sécrétion locale des molécules thérapeutiques au niveau de la tumeur exprimant le marqueur ciblé. Or pour étudier la localisation des cellules modifiées dans l’organisme après injection ainsi que la zone anatomique de sécrétion de la molécule médicament par ces cellules, le modèle in vivo est indispensable. De plus, l’activation des lymphocytes B (globules blancs modifiés) est un processus relativement complexe et fait intervenir plusieurs organes où s’effectueront les étapes de maturation ainsi que de nombreux types cellulaires. Pour l’heure ces processus d’activation ne peuvent être reproduits in vitro, c’est pourquoi le recours à un modèle in vivo est indispensable.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le suivi de la bioluminescence des cellules B modifiées in vivo a permis de réduire le nombre d’animaux dans les procédures 1 et 2 en permettant de suivre la localisation et l’activation du circuit sans mettre systématiquement à mort les animaux à différents temps. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).
Raffinement
Les manipulations des souris immunodéficientes seront effectuées dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des lymphocytes B et T sera faite sous anesthésie avec au préalable une anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines (cellules tumorales et immunitaires humaines). D’après notre expérience, pour cette souche de souris, un âge d’environ 6 semaines permet une bonne prise de greffe des cellules tumorales.
Optimisation de l’efficacité anti-tumorale des lymphocytes T humains dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.
Objectifs
Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.
Devenir
La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.
Remplacement
La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.
Réduction
Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.
Choix des espèces
Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.