Souris

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de formaline et d'adjuvant de Freund dans la patte pour provoquer une inflammation douloureuse, puis subissent des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau à 50 °C et stimulation des coussinets au filament de Von Frey. Le porteur indique que ces tests ne provoquent pas de lésion et justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier le circuit de la douleur. Les bénéfices annoncés, un antidouleur sans effets secondaires, restent formulés comme un objectif de développement.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider l’efficacité, l’innocuité et les avantages thérapeutiques de nouvelles petites molécules qui ciblent un récepteur de la sérotonine, le récepteur 5-HT7. La sérotonine, également appelé 5-hydroxytryptamine, est un neuromodulateur impliqué dans de nombreux processus cognitifs tel que l’apprentissage et la mémoire, mais également dans la régulation de comportements comme l’humeur, l’anxiété, l’appétit et la thermorégulation. Le récepteur 5-HT7 de la sérotonine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) exprimé par plusieurs organes et particulièrement dans le système nerveux central et le système nerveux périphérique (ganglions de la racine dorsal, moelle épinière, cerveau). Par sa localisation, il est impliqué dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et neuro-inflammatoires, ainsi que dans le circuit de la douleur. Les ligands actuels ciblant le récepteur 5-HT7 possèdent des limitations en termes de sélectivité et de biodisponibilité. C’est pourquoi, nous avons initié un programme de synthèse de nouvelles molécules. Des études pharmacologiques in vitro montrent que ces molécules sont plus sélectives et très affines pour le récepteur 5-HT7. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité pour le traitement de la douleur dans des modèles précliniques. Il existe des traitements de la douleur, basés sur l’utilisation d’antidépresseurs, antiépileptiques, ou bien sur l’utilisation de molécules plus fortes, tels que les opioïdes et les dérivés morphiniques. Cependant, seul 50% des patients répondent à ces traitements et la plupart du temps, les traitements qui soulagent les douleurs induisent des effets secondaires indésirables. Ainsi, notre objectif est de poursuivre le développement de nos molécules qui ciblent spécifiquement le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, afin de développer un candidat médicament pouvant être utiliser dans le traitement de la douleur sans induire d’effet secondaires indésirables. Ce projet nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans le circuit de la douleur.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu du projet est le développement de molécules thérapeutiques, visant le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, décrit dans l’item 5.5.1, pour le traitement de la douleur sans induction d’effets secondaires indésirables. Le développement pharmacologique de nos candidats médicaments pourrait non seulement avoir un impact sur la santé et le bien-être des patients mais également avoir un impact économique considérable puisque les douleurs sont la cause de la plupart des arrêts maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une administration unique des ligands et composés par injection sous-cutanée dans la nuque des animaux - Une administration unique de Formalin (formaldéhyde) en sous cutanée sur le dessus de la patte arrière - Une administration unique d’adjuvant de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactérie inactivées par chauffage) au niveau des coussinets plantaires - Prélèvement de sang par ponction intracardiaque Les tests comportementaux de classe modérée réalisés sur les animaux seront les suivants : -Test « tail immersion » : pour évaluer la sensibilité de l’animal à la température par une réponse spinale, le test d’immersion de la queue sera réalisé. La partie inférieure de la queue de la souris sera immergée dans un bain-marie dans lequel la température de l’eau est stable et maintenue à 50°C. L’expérimentateur relèvera le temps nécessaire à la souris pour relever la queue. A la fin de l’expérience, d’une durée maximale de 20 secondes pour éviter tout risque de brûlure, la queue sera soigneusement séchée. A la suite du test d'immersion de la queue, chaque animal est observé individuellement selon la grille d'évaluation critère n°3 (3.4.13). Nous avons constaté que le temps de 20 secondes à 50°C ne génère pas de lésion. Compte tenu de la classe modérée de cette procédure, les animaux seront observés selon la grille d'évaluation (3.4.13) pour une durée de 3 jours suivant le test. -Test de Von Frey : Avant la procédure, les animaux sont habitués aux boîtes tests posées sur une grille métallique permettant de visualiser facilement le dessous des pattes. La méchanoréception basale est évaluée. Des tiges plastiques calibrées (eg. Von Frey Hair) de diamètres croissants, sont appliquées sur les coussinets du rongeur en exerçant des pressions croissantes (0.007g à 2g). La pression exercée avec ces tiges ne peut en aucun cas provoquer une lésion de la zone testée. Le temps de réaction du retrait de la patte est observé, reflétant ainsi la sensibilité tactile du rongeur. Cette procédure sera reproduite 24 heures après l’induction d’une inflammation locale des coussinets suite à une injection plantaire sous-cutanée avec l’adjuvant complet de Freund (10µl). Lors de cette procédure, le test de « Von Frey Hair » sera réalisé 3 fois sur une durée de 4 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvres seront de classes modérées. Notre stratégie est thérapeutique et a pour but de tester les propriétés anti-nociceptive de ligands du récepteur 5-HT7. Ainsi, aucun effet indésirable n’est prévu sur les animaux lors de l’administration des composés. Si des signes de souffrances apparaissent au-delà des tests (>2h), un score sera établi afin de définir la marche à suivre. L’administration de Formalin, induit une inflammation au niveau du site d’injection. L’adjuvant complet de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactéries inactivées par chauffage) est un mélange classiquement utilisé en immunologie afin de déclencher une réponse inflammatoire non spécifique et durable (>5 jours). Son injection au niveau des coussinets plantaires induit localement un œdème et une sensibilité tactile accrue dans la zone affectée. Cette hypersensibilité est mesurée grâce au système « Von Frey Hair » permettant de vérifier la sensibilité tactile de type méchanoréception. Les prélèvements de sang par ponction intracardiaque sont réalisés sous anesthésie gazeuse d’isoflurane et entraînent le décès de l’animal. Les prélèvements d’organes sont ensuite réalisés.

Devenir

Afin de pouvoir récolter des échantillons (sang et organes) pour analyser l'effet des différents ligands , les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 à l'issue de chaque procédures.

Remplacement

L’objectif du projet, évaluer l’effet analgésique de différents ligands du récepteur 5-HT7, nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanimses neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales, entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans les mécanismes de douleur et d'anti-douleur.

Réduction

Les approches comportementales nécessitent une cohortes de 10 animaux minimun par groupe. Cette étude se focalisera sur 5 ligands à tester. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d'assurer la validité statistique des résultats. cependant, si une molécule s'avère inefficace ou toxique elle sera abandonnée.

Raffinement

Les animaux seront suivis tout au long des procédures. En effet, l'aspect général extérieur de l'animal (posture, pelage, démarche, faciès, yeux) sera observ et associé au suivit des critères évalués par la grille de score adaptée aux procédures. Si des animaux présentent des signes de souffrance (point limite: score=2 pour un critère de la grille, ils seront mis à mort en accord avec le responsable du bien être animal de ce projet. Dans le cas où 2 animaux minimum sont mis à mort et font parti du même groupe experimental (même traitement), alors ce groupe entier sera retiré de la procédure en cours.

Choix des espèces

La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques sur fond C57BL/6 et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous souhaiterions par la suite approfondir notre étude en utilisant des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO) également sur fond C57BL/6, afin de déterminer la spécificité du rôle des ligands et discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature et un comportement adulte stable.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des injections intraveineuses et des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, pour suivre la biodistribution de six molécules anticancéreuses modifiées. Les souris dont la tumeur dépasse 400 mm3 ou se nécrose sont mises à mort par dislocation cervicale. Le porteur présente l'étude comme préliminaire, destinée à sélectionner les meilleurs candidats, et revendique une réduction du nombre d'animaux grâce à l'imagerie de fluorescence.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections. Il est exprimé par les cellules immunitaires et épithéliales normales ainsi que de très nombreux cancers solides. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination empêchant les récidives. Malgré cela, aucun activateur de ce récepteur n'a jusqu’ici obtenu l'autorisation de mise sur le marché en raison d'effets toxiques, de manque d'efficacité ou d’homogénéité. Un nouvel activateur de ce récepteur a récemment été découvert, homogène, actif, spécifique et surtout très bien toléré. De nombreuses études sur souris ont permis d’objectiver l’efficacité de ce nouveau candidat médicament (non protégées, ni vectorisé), administré par voie locale (intratumorale). Afin de favoriser l'administration par voie veineuse, ce candidat médicament sera protégé (pour résister aux enzymes présentes dans le sang qui peuvent dégrader ces molécules), et vectorisé (afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et immunitaires d’intérêt). L’objectif de cette étude est donc d’observer les effets de ces protections et vectorisations sur la stabilisation et la localisation des candidat médicament au cours du temps. Il s’agit d’une expérience préliminaire destinée à raffiner le choix des meilleurs candidats (qui devront être confirmé par la suite par des études de biodistribution plus complètes et à visées statistiques). Pour cette étude préliminaire, six différentes molécules (portant différentes combinaisons de protection et de vectorisation), seront analysées. Ces molécules seront toutes marquées avec une molécule fluorescente. C’est cette fluorescence qui permettra de les localiser et de les quantifier au cours du temps, grâce à des méthodes innovantes d’imagerie en trois dimensions. Cela permettra d’obtenir une biodistribution corporelle de ces composés. Pour chacune des six molécules, cinq souris seront injectées par voie intraveineuse. Les souris seront analysées quand leurs tumeurs atteindront 100 à 200mm3. A cette taille-là, les tumeurs sont suffisamment bien vascularisées pour permettre une délivrance à la tumeur par voie sanguine.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de de définir les bases pour une nouvelle voie d’administration d'un candidat médicament, en ciblant plus spécifiquement certains types de tumeurs ainsi que des cellules immunitaires d’intérêt, ce qui diminue les doses nécessaires à son activité ainsi que les effets indésirables. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle, permettant de poser les bases d’une nouvelle voie d’administration d’un candidat médicament anticancéreux, en vue d’une étude clinique chez l’homme. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le meilleur model tumoral à utiliser pour les études de biodistribution. La seconde procédure permettra de cribler les molécules modifiées sur la base de leur cinétique et quantité de distribution à la tumeur et ainsi d'évaluer le/les meilleurs candidats pour une étude clinique en injection par voie intraveineuse.

Procédures

# Greffe tumorale: injections sous-cutannées de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Injections par voie intraveineuses (produit de contraste dans la procédure-1 et molécules fluorescentes dans la procédure-2), sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Analyses par imagerie échographiques (échodoppler et echographie de contraste) sous anesthesie gazeuse (temps d'analyses cumulés de 30-40 minutes environ). # Analyses par imagerie de fluorescence 3D (non invasive) sous anesthesie gazeuse (5 minutes environ - répétées aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h ).

Impact sur les animaux

Douleurs engendrées par l’injection de cellules tumorales, la pousse tumorale, les anesthésies répétées, stress engendré lors des analyses de volume tumoral et de poids de la souris. De façon plus détaillée: #Procédure-1: (1) les animaux seront greffées avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc sous anésthésie gazeuse. (2) Suivi de croissance tumorale trois fois par semaine avec manipulation des animaux pour mesurer la tumeur et peser les animaux. (3) Lorsque les tumeurs atteignent environ 100 à 200mm3, les souris sont anesthésiées pour deux analyses en imagerie échographique consécutives (non invasive). La seconde analyse nécessitera l'injection intraveineuse (dans la veine caudale) d'un agent de contraste (toujours sous anésthésie). Le temps cumulé de ces deux analyses est d'environ 30 à 40 minutes. (4) Les souris ayant des tumeurs au-delà de 400mm3 ou nécrosée seront mises à mort par dislocation cervicale. #Procédure-2: Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc (du modèle déterminé en procédure-1). Les souris seront anesthésiées et injectées avec les molécules fluorescentes par voie intraveineuse (dans la veine caudale). Les souris seront alors analysées en imagerie de fluorescence (non invasive) sous anesthésie aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h (chaque analyse prenant environ 5 minutes). Après la dernière analyse à 24h, les animaux seront mis à mort et leurs organes récupérés post-mortem pour analyses.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort. Leurs organes et tumeurs seront prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo des molecules modifiées (efficacité, stabilité, internalisation), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire dans les donditions d'injection par voie intraveineuse afin d’analyser la biodistribution dans les organes/tissus/tumeurs au cours du temps et de définir une approche qualitative et cinétique pour poser les bases d’une étude clinique.

Réduction

La procédure-1 permet de mettre au point le modèle et de le caractériser au mieux sur un nombre limité d’animaux (5 souris par modèle tumoral – 4 modèles). Ce nombre limité d’animaux est permis grâce à des méthodes non invasives d’imagerie échographiques de pointe permettant de répondre avec précision aux questions posées sur vascularisation des tumeurs et de perméabilité de celles-ci aux traitements injectés par voie intraveineuse. Seul le meilleur modèle sera utilisé par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (8 animaux greffées pour 5 animaux analysés par molécule – jusqu’à 12 molécules). Pour éviter la dispersion des résultats, seuls les animaux les plus homogènes en termes de taille de tumeur mais aussi en termes de vascularisation seront analysés. La cinétique de biodistribution par imagerie de fluorescence constitue en soit une réduction par rapport aux biodistribution classiques en point final à chaque temps. Cette méthode évite ainsi d’avoir à procéder à de très nombreuses mises à mort d’animaux aux différents temps d’intérêt pour obtenir les mêmes résultats. Le fait que nous ne cherchions pas de résultats statistiques mais tout en étant sur un pool de tumeurs homogène et bien caractérisé, nous permet d’avoir les résultats suffisamment robustes pour répondre à la question du criblage de ces molécules in-vivo sur ce nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux, en environnement enrichi avec eau et nourriture (classique et non fluorescente) à volonté, dans des conditions sanitaires permettant que leur phénotype ne soit pas dommageable. Le changement d’alimentation pour une nourriture non fluorescente est généralement très bien toléré par les animaux et n’engendre pas de diarrhées ou autres troubles digestifs. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs (significatifs d'exclusion de l'expérience et de Mise à Mort), et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de batons à ronger. Les souris seront greffées avec tumeurs en injection sous-cutanée dans le flanc sous anesthésie gazeuse, selon les conditions publiées dans la littérature. La surveillance des animaux sera effectuée trois fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. La taille des tumeurs (de 100 à 200mm3 pour les études d’imagerie), permet une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal, avec moins de risque de nécrose. L’imagerie par fluorescence et par échographie sont des processus non invasif et non douloureux mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. L'animal est anesthésié sous isoflurane et est placé dans une cassette de contention. Pour l’imagerie échographique, la souris est fixée sur un plateau chauffant réglable afin de maintenir sa température interne, contrôlable par une sonde anale. De plus les pattes sont fixées à des électrodes permettant de contrôler en direct l’ECG. Pour l’imagerie de fluorescence, de l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir constante la température de l’animal. Les animaux sont réveillés sous une lumière chauffante et sous surveillance. Tous les animaux de l’expériences seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle physiologique complexe que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris immunodéprimées, appareillage adapté comme le FMT...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies ciblées chez cette espèce. Des souris de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement matures, ce qui est nécessaire dans notre étude de biodistribution (assimilation, barrière hématoencéphalique...) etc. Les quatre types de tumeurs greffées provenant de patients humains ou d'une souche murine différente, donc toutes non immuno-compatibles, l'utilsiation des souris immunodéficientes BALB/c Nude permettra l'absence de rejet de ces tumeurs. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée.

6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections d'hormones, des vasectomies, des transferts d'embryons ou des greffes d'ovaire pour produire et maintenir des lignées génétiquement modifiées. Le porteur décrit une activité de production pour ses "clients" et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative possible", le but étant de produire des animaux destinés à l'expérimentation. La mise à mort sert à récupérer ovaires, ovocytes ou embryons, les mâles vasectomisés et femelles receveuses étant tués une fois qu'ils ne peuvent plus se reproduire.

Objectifs

Le développement des techniques de reproduction assistée au cours des dernières décennies a révolutionné le domaine de la recherche. Aujourd’hui elles sont incontournables pour la production d’animaux d’expérimentation, la préservation de ressources génétiques précieuses ainsi que pour la génération de nouvelles souris génétiquement modifiées reproduisant des maladies humaines. L’objectif de ce projet est de proposer ces techniques dans le cadre de l’hébergement et du maintien de leur modèles expérimentaux pour lesquels la reproduction naturelle n'est pas possible ou qui nécessitent d’être exempté de certains pathogènes.

Bénéfices attendus

Les techniques constituant ce projet permettront la création et/ou le maintien de modèles génétiquement modifiés reproduisant des maladies humaines afin de mieux les comprendre et à long terme de développer des traitements. Ces techniques de reproduction peuvent également être utilisées dans le cas d’animaux porteurs de pathogènes à éliminer.

Procédures

Les femelles donneuses subissent 2 injections d’hormone intra-péritonéales (30 sec/inj) à 48h d’intervalle. Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée (durée

Impact sur les animaux

Les femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons subissent deux injections d'hormones par voie intra-péritonéale (30 secondes/injections) à 48h d’intervalle. Compte tenu de l’innocuité connue des substances administrées, aucun effet indésirable particulier n’est attendu suite à cette procédure. Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée (durée

Devenir

La récupération d’ovaires (P4), d’embryons ou d’ovocytes (P1) nécessite la mise à mort des animaux. Les mâles vasectomisés (P2) et femelles receveuses (d’ovaire (P4) ou d’embryon (P2)) seront euthanasiés lorsqu’ils ne seront plus en âge de se reproduire.

Remplacement

Le but de ce projet étant de produire des animaux destinés à l’expérimentation, il n’y a pas d’alternative possible.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux nécessaires dans le cadre de ce projet a été calculé en se basant sur les données de la littérature sur les taux de succès et de d’efficacité des différentes étapes des procédures. Cependant la formation continue du personnel effectuant les procédures et la répétition des gestes techniques devraient contribuer à l’amélioration du taux de réussite des procédures et donc une réduction du nombre d’animaux engagés au cours du temps. Par ailleurs, dans le cas d’animaux présentant des difficultés à se reproduire de façon naturelle, l’utilisation de technique de reproduction assistée devrait permettre de produire moins d’animaux géniteurs dans le cadre de l’élevage ou du maintien de colonies.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation générale des signes cliniques (week-ends et jours fériés inclus). Les animaux présentant des signes de souffrance seront pesés et suivis quotidiennement selon la fiche d’observation/points limites annexée à ce projet (INS-008-04). Le document joint (INS-008-04) permettra également d'assurer le suivi et la surveillance des lignées à phénotype dommageable. Les animaux ayant atteint les points limites seront mis à mort immédiatement. Une période de convalescence post-opératoire (de 7 à 10 jours) pour les animaux subissant une chirurgie est attendue durant laquelle les animaux font l’objet d’un suivi accru en ce qui concerne les signes éventuels de douleur, dans ce cas-là une nouvelle dose d’analgésie pourra être administrée.

Choix des espèces

La mise au point de l’ensemble des techniques utilisées a été réalisée sur le modèle souris dans le cadre de la création ou du maintien de modèles génétiquement altérés. Cette espèce représente l’essentiel des demandes d’expérimentation de la part de nos clients. Les mâles (quelle que soit la procédure) et les femelles receveuses (P3) sont utilisés à partir de 8 semaines d’âge (âge correspondant à la maturité sexuelle.) Les femelles donneuses d’ovocytes (dans le cas de fécondation non naturelle, P1) ou d’ovaire (P4) sont utilisés à partir de 3 semaines d’âge (âge permettant la récolte du plus grand nombre d’ovocyte et donc permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisé).

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de collagénase dans le genou pour provoquer une arthrose, chez des animaux jeunes et âgés, afin de cibler les cellules sénescentes du cartilage. Le porteur reconnaît que l'injection peut induire une douleur articulaire. Il affirme que l'étude de la sénescence dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

L’arthrose est la maladie la plus repandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes. Nous proposons ainsi, dans ce projet: d'établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et agées, puis de voir si le maintien intégral des extremités des chromosomes permet la protection contre l'accumulation de ces cellules sénescentes et donc la protection contre le développement de l'arthrose.

Bénéfices attendus

Le but est de comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose. A long terme, nous éspérons : soigner l'arthrose chez la souris et proposer des thérapies chez l'Homme qui miment le transgène (télomérase).

Procédures

Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase), le temps d'une injection (10-15 secondes).

Impact sur les animaux

L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.

Devenir

A la fin du projet, une mise à mort sera effectuée pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement par l'équipe de zootechniciens et par notre groupe 1 fois par semaine. Pour le bien-être animal, il existe une grille de points limites avec un score.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. On donc reproduira les mêmes conditions chez les souris jeunes et les souris âgées. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par à l'aide de l'expression de la télomérase.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ligature partielle de la veine cave pour provoquer une thrombose veineuse, puis une injection de vésicules extracellulaires, pour étudier leur rôle dans la coagulation. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie. La mise à mort se fait par surdosage anesthésique afin de récupérer le caillot formé.

Objectifs

La thrombose est un sujet de santé publique important puisqu'elle touche environ 70000 personnes par ans en France. L'étude des vésicules extracellulaires dans ce domaine est prometteur car elles sont de potentiel biomarqueur du risque de thrombose. Les vésicules extracellulaires sont produites par toutes les cellules de notre corps et sont impliquées dans de notre processus grâce à leur contenu en protéine. Des travaux préliminaires ont montré qu'elles transportent des protéines décrites dans les processus de coagulation, c'est à dire de formation des caillots mais également dans la dégradation, la lyse, de celui-ci. Ce projet a donc pour but de montrer la contribution des vésicules extracellulaires dans la formation et la dégradation de ces caillots.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du rôle de ces vésicules extracellulaires dans la formation des caillots permettra d'améliorer la prise en charge des patients. En effet, le dosage des vésicules extracellulaires à partir d'un prélèvement sanguins chez les patients permettrait de les classer en fonction de leur risque de thrombose et ainsi d'instaurer un traitement préventif pour éviter l'apparition d'un caillot.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à une ligature partielle de la veine cave inférieure pour produire un phénomène de stase veineux pour reproduire les conditions de formation de thrombose veineuse profonde humaine. Cette intervention est de courte durée, environ 15 minutes. Les animaux recevront une injection de vésicules extracellulaires par voie caudale 30 minutes après l'intervention. De plus les animaux recevront par injections des traitements antidouleurs toutes les 12 heures après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une période de stress et/ou de douleur liée à la procédure de chirurgie qui sera exercée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par un surdosage en anesthésiant à la fin de la procédure dans le but de récupérer le thrombus formé dans la veine cave inférieure. Nous effecturons différentes analyses sur celui-ci et nous procèderons à un prélèvement sanguin de l'animaux pour mesurer différents paramètres reflétant les mécanismes de coagulation et de fibrinolyse chez l'animal.

Remplacement

Des expériences réalisées in vitro, dans le but d'étudier l'impact du profil coagulolytique de vésicules extracellulaires, nous ont permis de mettre en évidence leur mise en jeux lors de la formation et de la lyse d'un thrombus. Mais ces modèles in vitro sont très simplifiés. En effet, la formation d'un thrombus in vivo est un processus complexe mettant en jeu de nombreuses entités cellulaires, sub-cellulaires et protéiques. L’étude d'un système aussi complexe n’existe pas in vitro d’où la nécessité de l’explorer in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux strictement nécessaire pour atteindre un résultat significatif a été calculé. Avec comme objectif de résultat une diminution de 50% de la prévalence de formation d'un thrombus dans la veine cave inférieure 10 animaux seront nécessaires par bras expérimental.

Raffinement

L'angoisse des animaux sera dépistée et évitée. Les animaux seront hébergés en groupe (5 individus par cages) dans des conditions d'accès à l'eau et l'alimentation et leur milieu sera enrichi (sous la forme de carré de coton pour fabriquer leur nid) afin de limiter le stress. Des visites régulières post-chirurgie seront effectuées toutes les 12 heures pour s'assurer du bien-être de l'animal grâce à différents critères d'apparence générale (amaigrissement et posture), d'apparence de la peau et du pelage, et de l'interaction avec les autres animaux (hyperactivité, hypoactivité, prostration). Ces observations peuvent conduire à l'euthanasie de l'animal si les points limites sont franchis (par exemple une perte de poids importante). De plus, lors de ces visites une injection d'antalgique sera effectué pour limiter la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle in vivo disponible le plus simple à exploiter aux vues des données existantes dans la littérature, de sa taille et de sa disponibilité. Les animaux seront utilisés entre 6 et 8 semaines de vie (poids compris entre 18 et 25g) ce qui permet d'avoir un modèle comparable aux données décrites dans la littérature.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont gavées cinq jours de suite pour déclencher une maladie rénale héréditaire, puis suivies par recueil d'urine en cage métabolique. Le porteur signale que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et que les animaux peuvent développer une soif et des urines excessives. Il affirme que les modèles cellulaires, y compris les organoïdes rénaux, ne permettent pas d'étudier un rein vascularisé.

Objectifs

La néphronophtise est une maladie rénale héréditaire rare affectant l’enfant et le jeune adulte. La maladie se révèle par une augmentation du volume des urines et une soif excessive. En parallèle, le rein subit de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa transformation en un tissu fibreux non fonctionnel. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. La néphronophtise est une maladie rénale dont les mutations affectent le cil primaire. Dans le rein, le cil primaire baigne dans l’urine et agit comme une antenne de signalisation. Les mécanismes liant les altérations du cil primaire à la destruction du rein ne sont pas bien compris. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle du cil primaire sur le développement de la maladie rénale. A cette fin, nous générerons des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de développer un modèle murin qui récapitule la néphronophtise humaine et d’enlever le cil primaire spécifiquement dans le rein dans ce même modèle. Ceci sera obtenu par gavage sur des souris adultes. Le phénotype rénal sera observé à différents temps après le gavage (1, 2, 3, 5 et 11 mois).

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de la néphronophtise.

Procédures

Les 600 animaux seront soumis à l’âge de 4 semaines à un gavage sur 5 jours consécutifs à l’aide de sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Chaque semaine les animaux seront pesés. Pendant la durée de la procédure, chaque mois, un spot urinaire sera prélevé par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé chez certains animaux à un temps donné, l’ensemble des animaux sera soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Les patients atteints de néphronophtise souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux utilisés dans ce projet sont donc susceptible de développer ces symptômes après gavage au tamoxifène. Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l’issue de la Procédure 1, les 600 animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons une ANOVA à 1 facteur suivi d’un test de Tukey pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages répétés et réduire les risques de perforation de l’oesophage, des sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Afin de limiter les nuisances induites par le développement de la néphronophtise (polyurie, polydispie), une attention particulière sera portée à l’accès en eau avec vérification et remplacement des biberons d’eau régulièrement pour éviter toute souffrance hydrique. La propreté des cages sera également contrôlée régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Ces souris seront mises à mort 3/4 jours suivant la fin du recueil et une attention particulière sera portée sur les mâles remis ensemble pendant cette période. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Des points limites spécifiques à la procédure ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris âgées de 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront sacrifiées à l’âge adulte à différents temps après l’induction de la délétion (1 mois, 2 mois, 3mois, 5 mois et 11 mois), temps qui ont déjà été étudiés dans d’autres pathologies rénales.