Souris
Etude de l activité motrice de souris deficiente pour l’activité mitochondriale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis roulant motorisé dix minutes par jour pendant quatre jours, et une partie reçoit une injection de fixateur sous anesthésie, pour mesurer l'effet d'une protéine sur l'activité motrice et le fonctionnement des mitochondries. Le porteur indique que le tapis peut provoquer un léger stress et de la fatigue. Il conduit une partie du projet sur des cellules in vitro et réserve l'animal aux tests d'effort et aux analyses de tissus.
Objectifs
Dans le cadre de notre projet nous nous intéressons à une famille de protéine, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, nous avons montré que des homologues de cette protéine possèdent la même fonction dans la régulation du métabolisme énergétique et nous avons donc mis en évidence un mécanisme original pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique, nous voulons étudier le rôle d’un des membres de cette famille de protéines selon 3 axes : 1-Tester l’impact de la protéine sur l’activité motrice de la souris puisque les attentes énergétiques engendrent des déficits musculaires et une intolérance à l’effort. Pour cela, nous souhaitons mesurer la vitesse roulant motorisé et l’endurance des souris à l’aide d’un tapis de course. La vitesse du tapis sera progressivement augmentée et l’activité locomotrice de l’animal sera monitorée grâce à une caméra hautes fréquences. 2-Nous voulons mesurer l’atteinte énergétiques au niveau des tissus par des tests biochimiques. 3- nous voulons voir les défauts d’organisation et de morphologie des usines énergétiques des tissus, les mitochondries) par des analyses histologiques.
Bénéfices attendus
La mitochondrie sont les usines de production d’énergie dans les tissues et elles sont donc nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Des déficits mitochondriaux induisent des pathologies sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, il est nécessaire de comprendre quelles sont les causes cellulaires de ces pathologies. Notre projet se place dans ce cadre. Nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une famille de protéines dans la production énergétique. La protéine que nous étudions dans ce projet fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille et cela permettra de développer des traitements pour ces pathologies à plus long terme.
Procédures
Concernant, les tests d'effort, les animaux seront placés sur un tapis roulant motorisé pour une durée maximale de 10 minutes pendant 4 jours consecutifs. De plus, 40 animaux seront soumis a une injection unique de fixateur de tissus. Ces injections se feront sur des animaux anesthésiés. Au total, cette intervention dure 15 minutes au total.
Impact sur les animaux
Le versant comportemental de notre étude est basé sur une analyse de la marche sur tapis roulant. Ce test peut engendré un stress leger chez l'animal du à la découverte de l appareillage. Ces tests de efforts pouvent engendrés de la fatigue physique. Pour ce qui est de la perfusion intracardiaque, la procédure réalisée sur animal anesthésié suit les normes et pratiques en vigueur.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses biochimiques et histologiques sur les tissus en postmortem.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests d'effort locomoteur (sur tapis roulant) et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et des voies de signalisation sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro au niveau de l’organisme. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les tests biochimiques (20 animaux) et histologiques (40 animaux) seront effectués à partir des tissus collectés sur les animaux évalués sur tapis roulant (60 animaux). Cette approche combinée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation du projet.
Raffinement
Nos souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les animaux sont hébergés en cages collectives dans les conditions les mieux adaptées au modèle murin. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique permettant la création de nids (important pour les femelles gestantes et allaitantes) des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Dans le ,cadre spécifique de la procédure du projet, nous avons inclus une étape préalable d’habituation aux appareillages afin de limiter le stress et l'anxiété des animaux. Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant, et appliquons systématiquement un traitement analgésique et des mesures de soins lorsque nécessaire. L’ensemble des procédures est encadré et mis en oeuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des animaux adultes âgés de 10 à 14 semaines. A cette période, les souris sont adultes et présentent la capacité d’activité élevée. Ainsi, il est plus facile d’observer des différences entre les phénotypes, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Imagerie de l’athérosclérose et de l’inflammation par des lipoprotéines marquées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
428 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des plaques sous régime gras, elles reçoivent une injection de lipoprotéines marquées et, pour une partie, un agent inflammatoire, afin de tester une imagerie de l'athérosclérose. Le porteur indique mettre à mort 328 animaux pour prélever leurs tissus et transférer les 100 autres vers un autre établissement pour une imagerie sur corps entier. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de suivre ces composés injectés dans l'organisme.
Objectifs
L’athérosclérose se caractérise par l’accumulation progressive de lipides dans la paroi des artères, conduisant à la formation de plaques d’athérome pouvant obstruer partiellement la lumière artérielle. Cette maladie peut rester longtemps silencieuse avant de provoquer un accident vasculaire provoqué par la rupture soudaine de la plaque, devenue instable car fragilisée par des phénomènes inflammatoires. La cause initiale de la formation des plaques d’athérome est le captage anormal de lipoprotéines, complexes transportant le cholestérol dans la circulation. On distingue ainsi des lipoprotéines de type LDL (« mauvais cholestérol ») ou HDL (« bon cholestérol »). LDL est HDL peuvent toutes deux être captées par les cellules présentes dans la paroi artérielle. Dans un projet précédent, nous avons développé un système de marquage bimodal permettant de suivre une molécule d’intérêt au niveau du corps entier (imagerie PET) et dans des biopsies de tissus (microscopie en fluorescence). L’objectif de ce projet est d’appliquer ce système de marquage aux lipoprotéines afin d’utiliser ces dernières comme nouveaux agents d’imagerie de l’athérosclérose sur corps entier et sur biopsies de plaques. Nous testerons nos lipoprotéines marquées sur deux modèles de souris génétiquement modifiées connus pour développer, sous régime riche en cholestérol, des plaques d’athérome d’étendue modérée (souris LDLRKO) ou importante (souris ApoEKO). Nous testerons également la capacité de nos lipoprotéines marquées à discriminer des plaques d’athérome stables (souris ApoEKO sans inflammation) ou instables (souris ApoEKO avec inflammation induite par injection de LPS).
Bénéfices attendus
L’athérosclérose est une des premières causes de mortalité dans les pays développés. Les techniques d’imagerie actuelle permettent de détecter des rétrécissements artériels ou des lésions artérielles avancées, mais sont limitées à des explorations dans des régions corporelles très restreintes et ne permettent pas de discriminer des plaques stables de plaques instables. Si nos lipoprotéines marquées s’avèrent efficaces elles permettraient, après transposition à l’humain, de détecter les plaques d’athérome de manière exhaustive et de prédire leur propension à se rompre. Cette nouvelle stratégie d’imagerie permettrait ainsi d’orienter de manière plus précise la prise en charge des patients tant au niveau des interventions chirurgicales que des traitements médicamenteux. A long terme, ces nouveaux traceurs permettraient notamment de diminuer le résiduel et les récidives d’accidents vasculaires qui persistent chez les patients à risque.
Procédures
Injection intraveineuse de traceur d’imagerie sur souris vigiles. Une seule fois, sur tous les animaux. Régime riche en graisse sous forme de croquettes fournies ad libitum durant 12 semaines pour 232 souris au total. Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin terminal avant mise à mort sur 328 souris au total. Injection intrapéritonéale de sérum physiologique (« placebo ») ou d’un agent inflammatoire sur souris vigiles : 1 par jour pendant 5 jours. 40 souris placebo et 40 souris avec inflammation. Transport vers l’autre EU : stress lié au transport (5minutes). 100 souris au total.
Impact sur les animaux
Injection intraveineuse de lipoprotéines. Les composés injectés sont naturellement présents dans la circulation chez les vertébrés, donc leur injection ne devrait pas provoquer d’effet néfaste. Seule la contention liée à la procédure d’injection est susceptible de provoquer un inconfort chez les animaux. Régime riche en graisses. D’après nos expériences passées, le régime riche en graisse (croquettes ad libitum) donné aux souris durant les 12 semaines n’a pas d’effet indésirable sur les animaux, qui ont néanmoins un pelage d’aspect « gras ». L’athérosclérose induite après 12 semaines de régime est complètement asymptomatique et ne provoque aucune nuisance à l’animal. Injection d’un composé pro-inflammatoire. L’injection en elle-même est associée à un inconfort léger le temps de la contention. L’inflammation induite par ce composé est susceptible de générer une douleur modérée mais réversible au bout de 5 jours.
Devenir
Pour chacune des trois procédures, les prélèvements sanguins et de tissus (foie, intestin, rate, plaques d’athérome) impliquent la mise à mort des animaux sous anesthésie : 96 pour la procédure 1 ; 192 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3. Les autres animaux sont transférés vers un autre EU à des fins d’imagerie sur corps entier : 20 pour la procédure 1 ; 40 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce projet visant à étudier le trajet dans l’organisme de composés administrés par voie veineuse et destinés à des applications d’imagerie sur corps entier et sur biopsies de tissus.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature en termes de pharmacocinétique. Nos précédents projets de cinétiques utilisant des molécules portant des marqueurs bimodaux nous ont permis de connaitre les doses optimales à utiliser.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe (minimum 3 ou 4 par cage), dans des conditions standard avec enrichissement du milieu. Ils seront contrôlés quotidiennement. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel familiarisé aux souris, formé aux gestes techniques et au bien-être animal, en utilisant un appareillage de contention spécialement dédié. Elles seront effectuées hors des pièces d’hébergement pour ne pas générer un stress supplémentaire. Pour la plupart des animaux utilisés dans ce projet, l’intervention se limitera à une injection intraveineuse suivie d’une mise à mort sous anesthésie générale. Un petit nombre d’animaux recevra 5 injections intrapéritonéales visant à induire une inflammation modérée et feront l’objet d’un suivi particulier avec traitement de la douleur en cas d’apparition de signes de détresse. Tous les animaux seront surveillés après injection et ceux présentant des signes de détresse persistant au-delà de 24 heures (posture prostrée, contractions abdominales, masque de douleur, grognements) ou d’atteinte neurologique ou respiratoire (paralysie, suffocation) seront mis à mort sous anesthésie générale. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale avant mise à mort.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car ses grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’homme (fonction rénale, hépatique). Le rat ne développe pas de plaque d’athérome, même sous régime riche en graisses. Les lignées de souris génétiquement modifiées LDLRKO et ApoEKO sont les deux modèles de référence pour l’étude de cette pathologie avec deux degrés différents de sévérité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les composés d’intérêt étudiés ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de la plaque d’athérome. Du fait de la pathologie intervenant chez l’adulte, il est justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
Mise au point d’un modèle murin d’hépatite alcoolique par la cytolysine
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt-quatre reçoivent un régime alcoolisé pendant onze jours et des gavages répétés d'une bactérie productrice de toxine, pour mettre au point un modèle d'hépatite alcoolique jugé plus proche de la maladie humaine. Le porteur indique une perte de poids servant de point limite et une agressivité possible provoquant morsures et dépilations. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour cette maladie et que l'animal est "indispensable".
Objectifs
L'hépatite aiguë alcoolique apparaît chez des patients consommant de l'alcool de manière chronique et excessive. La mortalité atteint 30 à 40% à 28 jours d'évolution. La cortisone, un anti-inflammatoire est le seul traitement validé mais son utilisation est limitée par l'absence de réponse au traitement dans 40% des cas, des potentiels effets secondaires et l'absence de bénéfice sur la mortalité au-delà de 28 jours. Ainsi, un nombre significatif de patients se retrouve sans alternatives thérapeutiques. A ce jour, les modèles murins disponibles sont imparfaits en raison d'une faible inflammation et d'une fibrose légère. Ces données sont ainsi très loin de la physiopathologie observée chez les patients atteints d'hépatite aiguë alcoolique. La bactérie Entéroccocus faecalis est présente dans le tractus gastro-intestinal des humains et chez certains animaux. Chez des patients atteints d'hépatite alcoolique aiguë, elle est notamment responsable de la production d'une toxine appelé cytolysine. Récemment, il a été démontré que cette toxine est responsable de la mort des cellules du foie, les hépatocytes et ainsi aggraverait le pronostic vital du patient. Le lien étroit entre cette maladie et le microbiote intestinal est due à l'induction d'une perméabilité intestinale accrue causée par une consommation aiguë et chronique d’éthanol. L'objectif du projet est d'utiliser un modèle murin d'alcoolisation chronique connu en ajoutant des gavages intragastriques à des temps précis de la souche bactérienne productrice de la toxine, la cytolysine. Cela permettra d'obtenir un modèle murin représentatif de la réalité médicale et permettra par la suite de valider des médicaments soignant la pathologie.
Bénéfices attendus
Aucun modèle actuel ne synthétise parfaitement les caractéristiques de l'hépatite aiguë alcoolique limitant la compréhension des mécanismes permettant le développement d'étude chez l'Homme. Le modèle que nous proposons de mettre au point se veut rapide (16 jours), reproductible (souches bien identifiées et purifiées de la bactérie) et transposable à l'homme. Par ailleurs ce modèle nous permettra de tester nos molécules d'intérêts que nous avions à ce jour testé sur les modèles connus mais imparfaits. Avec ce modèle plus pertinent, les résultats de cette étude pourront conduire au développement rapide d'études chez l'Homme.
Procédures
Toutes les souris (n=48) du protocoles vont bénéficier d'un régime alimentaire semi liquide pendant 16 jours. Ce régime sera alcoolisé ou non (11 jours sur 16) ce qui est une variation par rapport à leur standard d'alimentation lorsqu'il y a de l'alcool. Cette intervention à base d'alcool concernera 24 souris. L'appétence pour la texture semi liquide est très importante pour les souris qui l'apprécient. 24 animaux seront soumis à des gavages intragastriques à J6, J9, J12 et J15 de la souche E. faecalis pour les groupes 2 et 4. Les gavages intragastriques en termes de temps sont très court pour l'animal et ne représentent pas de douleurs. Les 24 autres souris ne subiront pas cette intervention.
Impact sur les animaux
Nous possédons une expertise du protocole murin d'alcoolisation. Les effets indésirables observables pour ce protocole sont la perte de poids qui représente le point limite. Une procédure de raffinement spécifique est mise en place pour permettre d'endiguer la perte de poids trop importante. Le gavage intragastrique par une souche bactérienne est une inconnue cependant nous nous sommes entourés d'un laboratoire de bactériologie. De plus, la concentration administrée à chaque gavage correspond à 10g de selles humaines soit des concentrations réalistes et acceptables. Le gavage de bactéries prévu est en quantité modeste et doit être répété car en quantité insuffisante pour coloniser la flore digestive des souris et induire une intoxication aiguë. Néanmoins, pour prévenir toute incertitude liée à la tolérance des ingestions répétées de bactéries par gavage, nous avons développé un score clinique de surveillance détaillé dans la partie raffinement et constituant un point limite. Les gavages intragastriques itératifs peuvent stresser l'animal, une procédure de raffinement est prévue. L'alcoolisation chronique peut entrainer une agressivité chez certaines souris dominatrices. Cette aggressivité n'est pas constante et ni spécifique de ce protocole. L'aggréssivité se manifeste en premier lieu par des lésons de dépilation ou de morsures qui restent modestes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les souris agressives ou à l'inverse blessées seront isolées et soignées par soins locaux de bétadine. Cela ne constitue pas un point limite et la souris aggressive peut rester dans le protocole d'étude bien qu'elle soit isolée. Les maladies du foie comportent un large spectre allant de la stéatose jusqu'au cancer du foie. Des complications graves comme la jaunisse ou de l'accumulation de liquide dans l'abdomen (ascite) sont observées chez les patients malades. Ces stades ne sont pas retrouvés chez les modèles murins et ainsi ne représentent pas une nuisance potentielle.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour des analyses post mortem de différents organes (foie, rate, intestin).
Remplacement
A ce jour, il n'existe aucune approche in vitro pour étudier l'évolution d'une pathologie inflammatoire multifactorielle comme l'hépatite alcoolique et notamment le lien avec le microbiote intestinal en corrélant la présence de la cytolysine, la toxine produite par la bactérie Entéroccocus faecalis avec la mort des cellules du foie, les hépatocytes. Une étude chez un organisme vivant telle que la souris est indispensable pour pouvoir valider par la suite des études de phase 2 chez l'Homme.
Réduction
L'étude sera menée avec un nombre total de 48 jeunes souris adultes mâles pesant 18 à 20g, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle sur l'évolution de la pathologie hépatique. Ce nombre correspond au nombre de souris mâle permettant de former chaque groupe (n=12) au sein de l’étude statistiquement significatif.
Raffinement
Dès la réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l'air, ...) à leur bien-être. Une procédure d'estimation (avec des paramètres définis) et suppression de la souffrance sera mise en place. Les points limites de ce protocole concerne 1) la perte de poids de l'animal. Ainsi, une surveillance pondérale régulière (J0, J6, J8, J10, J15) et un protocole de raffinement spécifique est prévu (augmentation de la stimulation les conduisant à mieux s’alimenter, renutrition par des croquettes riches en protides). Dans les cas éventuellement graves, les animaux seront mis à mort selon le protocole en vigueur à l'animalerie. 2) Nous prévoyons d'utiliser un score de surveillance prenant en compte l'apparence, la mobilité, la réponse aux stimuli, l'ouverture des yeux, la froideur au toucher et la fréquence respiratoire. Un score élevé constitue un point limite. 3) En cas d'aggréssivité persistantes des animaux attesté par des morsures et lésions de dépilation, la souris dominante sera isolée pour prévenir toute éventualité d'aggravation des lésions. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des prélèvements d'organes seront effectués pour permettre de réaliser les analyses biochimiques et immuno-pathologiques.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est la souris C57BL/6. Ce choix a été motivé par l'expertise de l'équipe pour cet animal et cette souche pour la mise en place de modèle murin dans le cadre des maladies du foie. Ce choix nous permettra des comparaisons entre nos modèles et au niveau international avec les modèles en vigueur. De plus nous prévoyons l’utilisation future d’inhibiteurs de TREM-1 sur ce modèle s’il est probant. Le choix de l’espèce est ainsi étayé par l’existence d’un modèle transgénique KO-TREM-1. L’étude sera réalisée sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début du projet. Ce choix est motivé par l’analyse de travaux publiés dans des journaux scientifiques internationaux portant sur l’étude de l'hépatite aiguë alcoolique.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou du composé X dans la cicatrisation chez la souris C57BL/6
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux cent quarante subissent une chirurgie créant deux plaies sur le dos, jusqu'au muscle, pour tester si un régime cétogène ou un composé favorise la cicatrisation. Le porteur écrit que l'étude vise à apporter la preuve exigée pour déposer un brevet. Il indique traiter la douleur par de la buprénorphine et affirme que seul un modèle in vivo garantit des conditions proches de la clinique.
Objectifs
Le composé X est produit naturallemnt par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Le composé X a montré sur les cellules immunitaires des propriétés benefiques lors de leurs infiltration des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire ou l’application topique de ce composé X lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire (brûlures, plaies…) peut être bénéfique au patient. Ce composé peut être délivré par injection ou en application topique. Ce projet a été évalué par cellule de valorisation de brevets et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce régime chez la souris est demandée.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales qui permettront de caractériser les cellules de l'immunité, les macrophages , les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. A titre d’exemple, nous pouvons citer les lésions post-ischémiques ou la cicatrisation de grandes zones cutanées (grands brulés). De plus, le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Ce composé a montré des propriétés benefiques sur les cellules immunitaires dans un contexte de réparation tissulaire. Ce projet a été évalué par Ouest Valorisation et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce composé chez la souris est demandée.
Procédures
L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 2 procédures du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Elle concerne tous les animaux, soit 340 au total. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. Le paracetamol sera contenu dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle et jusqu’à la fin de la procédure 2. Pour la chirurgie induisant les lesions cutanées, les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine. Le maintien de l’anesthésie durant la procedure chirurgicale se fera par isofluorane. La chirurgie durera environs trente minutes et sera effectuée sur 240 souris. La buprénorphine sera administrée régulièrement en sous cutanée ) avant le réveil, 1h et 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la buprénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel sera mise à disposition des souris pour la nuit.
Impact sur les animaux
Les animaux seront utilisés une semaine après leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ils subiront ensuite une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure. Les animaux ne sont pas réveillés car nous allons prélever le sang et différents organes pour des évaluations biochimiques et histologique.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (340 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle de cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en suivant le test de Wilcoxon-Mann Whitney.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience . Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques, seront donnés. La douleur des animaux sera gérée en pré-opératoire par l’adjonction de paracétamol (1mg/ml) dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle de cicatrisation. Les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine (100microg de kétamine et 10 microg de xylazine par gramme de souris). Le maintien de l’anesthésie se fera par isofluorane 2%. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de l’opération et jusqu’à leur réveil. Des doses de buprénorphine seront administrées régulièrement (0,1mg/kg) en sous cutanée (sous 100 microL) avant le réveil, une seconde 1h après (100 microL) puis 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la burénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel (15μg/ml) sera mise à disposition des souris pour la nuit. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les modèles de cicatrisation chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester le composé X afin de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.
Etude des lymphocytes T régulateurs dans les cancers chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou un carcinogène associé à un produit inflammatoire dans l'eau de boisson pour déclencher un cancer du côlon, puis du tamoxifène, avant leur mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs. Le porteur indique que l'induction du cancer colorectal peut provoquer prolapsus et perte de poids, et affirme que seul l'animal permet une approche intégrée.
Objectifs
Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.
Bénéfices attendus
Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.
Procédures
Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).
Impact sur les animaux
A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.
Remplacement
Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.
Réduction
REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.
Etude des antidiabétiques et leurs dérivés en combinaison avec les immunothérapies sur le développement de cancers (mélanome, cancer du côlon et du pancréas).
- Recherche appliquée
- Cancers
1 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections quotidiennes de dérivés d'antidiabétiques et d'immunothérapies, puis des prélèvements de sang, pour évaluer l'effet de ces combinaisons sur le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas. Le porteur indique surveiller les tumeurs qui saignent ou suintent et mettre à mort en l'absence d'amélioration. Il affirme que le passage par l'animal est une "étape cruciale" avant l'humain.
Objectifs
Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus dans le traitement du mélanome (cancer des mélanocytes qui sont les cellules de la peau responsables de la pigmentation), à l’aide de thérapies ciblées. Mais après une courte période de rémission, le mélanome acquiert, dans presque tous les cas, une résistance contre la drogue. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles molécules candidates pour la mise en place de thérapies spécifiques. Pour ce faire, nous avons fait synthétiser plusieurs dérivés d'anti-diabétiques (composés connus pour leurs propriétés anti- mélanome). Ces composés induisent la mort des cellules de mélanomes sans affecter la viabilité des cellules normales. De plus, certains de ces composés présentent des propriétés anti-invasives. Nos différentes molécules ont préalablement testé in vitro, seules les plus efficaces seront étudiées in vivo (dans un but de réduction du nombre d’animaux), afin de se placer dans un contexte plus physiologique.
Bénéfices attendus
Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus avec l’inhibiteur d’une molécule retrouvée dans 50 % de mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées récemment. Mais elles ne donnent une réponse positive que dans 10 à 30% des cas. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies spécifiques et de combiner ces nouvelles molécules avec les immunothérapies déjà utilisées chez les patients, afin de voir si nos molécules sont capables d’augmenter leurs effets. Les cellules cancéreuses seront injectées en sous cutané dans des souris (souche C57B6J ou BalbC) pour observer l’effet des composés sur la croissance de tumeurs primaires (mélanome, cancer du pancréas et du côlon), en combinaison ou non avec les immunothérapies. Nous étudierons aussi la formation et le développement de métastases et micro- métastases pulmonaires sur les souris. Et nous pourrons observer l’effet des différents composés en combinaison ou non avec les immunothérapies sur la croissance de tumeurs non primaires. Nos composés étants des dérivés d’antidiabétiques, il serait intéressant de comparer les effets du composé antitumoral le plus efficace sur la résistance à l’insuline et sur l’intolérance au glucose avec ceux de la metformine (médicament de référence).
Procédures
1 seule Injection sous cutanée ou intraveineuse (environ 30 sec). Injection intrapéritonéale quotidienne (environ 10 sec) pendant maximum 4 s de traitement. Anesthésie gazeuse au vetflurane tous les 4 jours (environ 15 min). Prélèvement d'une goutte de sang à la queue, 7 fois sur une durée de 2 heures après une seule incision au début de l’expérience. Le prélèvement prend environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Pour les Injections faites sur les animaux,les sites sont surveillés quotidiennement. Il peut y avoir une inflammation des sites, dans ce cas on traitera à la vétédine quotidiennement et si il n'y a pas d'amélioration au bout de 3 jours, la souris sera mise à mort. Concernant, l'aspect et la taille des tumeurs: il arrive qu'une tumeur saigne ou suinte, dans ce cas traitement à la vétédine quotidien et sans amélioration au bout de 3 jours, l'animal est mis à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale
Remplacement
Après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs composés antidiabétiques ayant des effets anti-tumoraux en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces drogues sont plus efficaces sur modèles de mélanome et de cancers colique et pancréatique chez la souris . Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.
Réduction
Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Pour la procédure 1, seules 2 expériences ont suffit pour avoir des résultats statistiquement significatifs. celà nous permet de rajouter une procédure pour mieux caractériser notre dérivé antidiabétique sans avoir besoin de rajouter des animaux dans notre PEA.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Les points limites que nous avons définis sont prédidifs et suffisamment précoses pour éviter toute souffrance ou mal-être des animaux. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance
Choix des espèces
La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établie ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des molécules que nous voulons tester, un atout très important. Pour toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte (6 semaines). Elles seront commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.
Rôle des cellules tuft dans la réponse antivirale précoce – étude pilote
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Les souris qui perdraient plus de 20 % de leur poids ou montreraient des signes de prostration seraient tuées et autopsiées. 240 souris, dont des souris mutées privées de certaines cellules intestinales, vont être utilisées dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance léger, toutes tuées de quelques heures à cinq jours après le traitement pour prélever leurs organes digestifs. Chacune reçoit par injection dans l'abdomen ou par gavage l'une des huit substances censées imiter les étapes d'une réponse antivirale, par groupes de 15 souris, pour une étude que le porteur dit "pilote". Il juge la balance bénéfice/risque "clairement favorable" au vu de ses "données préliminaires", puis écrit n'avoir "aucune expérience préliminaire ni donnée" permettant de préjuger des effets attendus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à réévaluer les séquences des évènements de la réponse immune précoce à la suite d’une infection virale. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence de certaines cellules épithéliales impactent de manière drastique la synthèse de molécules antivirales de type interférons, molécules sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle intégré, afin de mesurer le réel impact de ce défaut d’initiation de réponse antivirale. Notre stratégie expérimentale consiste à utiliser des analogues chimiques, disponibles commercialement, validés dans la littérature, capables d’activer et de mimer chaque étape de la réponse antivirale. De manière synthétique, les souris seront traitées avec les molécules ad hoc, avant d’être analysés dans un laps de temps n’excédant pas 5 jours, pour analyses histologiques et moléculaires. Nous comparerons ainsi la mise en place de la réponse immune précoce (d’où les temps de cinétique court) entre des individus contrôles et des individus dans lesquels certaines cellules intestinales sont absentes. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quels sont les types cellulaires impliqués dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale précoce. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. A titre d’exemple, comprendre selon quelles modalités une réponse antivirale efficace doit se mettre en place est une question d’actualité, permettant virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse interféron adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale simple, nos données obtenues ex-vivo, le tout conjugué à la rapidité avec lesquelles nous devrions obtenir des réponses, font de ce projet une question importance majeure.
Procédures
Les souris se verront administrer 1 substance parmi les 8 testées au total, par voie intrapéritonéale ou gavage gastrique, à l'aide de seringue et de canules adaptées, via le personnel habilité de notre équipe zootechnique. Suite aux traitements, les animaux seront progressivement euthanasiés dans un laps de temps allant de quelques heures à 5 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de traitements initiés.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les nuisances seront celles liées à l'administration des substances aux individus: injection intrapéritonéale et gavage gastrique.
Devenir
Les animaux devront être euthanasiés, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse avec le modèle de culture d’organoïdes, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. Le système de culture d’organoides sera réutilisé en complément des données obtenues in vivo, dès que possible.
Réduction
A ce jour, nous n’avons aucune expérience préliminaire ni donnée nous permettant de pouvoir préjuger des effets attendus entre nos deux groupes d’animaux, faisant de cette étude une étude pilote. Cependant, étant donné l’absence de synthèse d’interféron dans les individus mutés, nous anticipons des différences drastiques entre nos groupes d’individus. Cette saisine intégrera donc des cohortes de 15 animaux par génotypes et par conditions de traitements, incluant tous les controles. Les conclusions seront obtenues via des analyses de comparaison de moyenne des paramètres mesurés. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction de nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris mutées pour un gène essentiel pour la différenciation de certaines cellules intestinales impliquées dans l'immunité). La comparaison de la mise en place d'une réponse entre des souris contrôles et les souris mutées pour ce gène nous permettra donc de définir les types cellulaires impliqués dans la réponse antivirale. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature
EFFET IN VIVO DE la combinaison antibiotiqueantiangiogénique SUR L’EVOLUTION DES CANCERS RARES DU PERITOINE (PSEUDOMYXOME PERITONEAL, MESOTHELIOME)
- Recherche appliquée
- Cancers
954 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de tumeur du péritoine puis des gavages et injections d'antibiotique et d'antiangiogénique, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour tester un traitement du pseudomyxome évitant une chirurgie lourde. Une partie des tumeurs est regreffée à d'autres souris pour entretenir le modèle. Le porteur affirme que cette tumeur, faite de gélatine, ne peut être étudiée in vitro.
Objectifs
Le but de ce nouveau projet est de tester l’effet combiné d’anti-angiogéniques et d’antibiotiques sur l’évolution du pseudomyxome et de ce fait pouvoir déterminer un traitement pour les patients qui ne peuvent supporter une chirurgie lourde.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir déterminer un traitement non invasif qui inhiberait l'évolution du pseudomyxome afin de traiter les patients qui ne peuvent pas supporter une chirurgie lourde et donc le traitement de référence.
Procédures
Les souris sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3%), après une injection sous cutanée locale de Lidocaïne (1mg/kg), seront soumis à une greffe intrapéritonéale d'une tumeur de pseudomyxome(1 fois 5-10min). Puis les animaux vigiles recevront en intrapéritonéale ou par gavage 2 fois par semaine pour l'anti-angiogénique (ou le solvant), et du lundi au vendredi pour le sorafenib et l'antibiotique (ou le solvant) (30secondes à chaque administration). A la fin de l'expérience, 4souris par groupe seront anesthésiées par un mélange dekétamine (80 mg/kg) et de xylazine (16 mg/kg) après une injection en sous-cutanée de buprénorphine 30 minutes avant (0,1mg/kg) (1fois 30secondes) pour l'examen de microangiographie (20- 25minutes). Enfin, les autres souris auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les antiangiogéniques car ils ont déjà été utilisés dans d'autres projets et sont utilisés à des doses non toxiques. Concernant les antibiotiques, nous n'attendons pas d'effets indésirables non plus mais comme chez l'homme, le risque d'effets notamment sur le système digestif n'est pas à écarté. Nous utiliserons les mêmes doses qui sont utilisées chez l'homme, rapporté au poids de la souris. Cependant, la surveillance quotidienne des animaux et plus précisément des points comme leur poids, leur apparence, leur comportement 2 fois par semaine notifiés dans un cahier de suivi des animaux nous permettront de déterminer si les traitements ont un effet néfaste sur la santé des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la 1ère procédure, par dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la deuxième procédure, dès que le poids aura atteint 33g. A la fin de la 1ère procédure, nous utiliserons le sang et la tumeur pour des analyses post-mortem; pour la 2ème procédure, une petite partie de la tumeur obtenue sera greffé à 3 autres souris pour maintenir le modèle.
Remplacement
Nous ne pouvons remplacer le modèle murin. En effet, cette tumeur est très peu cellulaire car essentiellement formée de gélatine, nous ne pouvons l’étudier in vitro. Il est nécessaire de reproduire la maladie par un modèle de greffe orthotopique par greffe de fragments de pseudomyxome en intrapéritonéal sur des souris nudes.
Réduction
En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur les modèles de Pseudomyxomes (cancer rare du péritoine) et de la variabilité observée de ces derniers, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour tester une expérience. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Vu qu'il y a un risque de mortalité lié à l'intervention permettant la greffe de pseudomyxome, les groupes seront composés de 12 souris. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 2 à 3 groupes de traitement quand cela sera possible. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe Contrôle avec les groupes traités par les combinaisons.
Raffinement
Les souris auront une période d'acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux seront observés quotidiennement. Afin d'effectuer la greffe intrapéritonéale de pseudomyxome, les animaux recevront une injection d'analgésie locale et seront sous anesthésie générale gazeuse. Avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale. Concernant l'examen de microangiographie, les animaux seront aussi sous anesthésie générale. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.
Choix des espèces
Nous utilisons l’espèce souris pour notre projet car nous avons besoin d’animaux immunodéficients (cas des souris NOD ou nude). En effet, dans ce cas les tumeurs greffées ont la possibilité de se développer sans risquer un rejet. Aussi, les essais pré-cliniques sur la souris dans le cas du pseudomyxome permettent d’obtenir des informations satisfaisantes pour l’Homme. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.
Etude du rôle du transporteur du folate dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion cérébrale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une occlusion de l'artère cérébrale provoquant un accident vasculaire, suivie d'une IRM, pour tester une molécule ciblant un transporteur du folate. Le porteur indique que l'AVC entraîne perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de dix pour cent des opérées peuvent mourir d'œdème ou d'hémorragie. Il affirme que l'évaluation d'un traitement suppose un modèle reproduisant l'ischémie puis la reperfusion.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact d'une protéine de transport nommée RFC1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire. RFC1 (Reduced Folate Carrier 1) est un transporteur membranaire du folate, notamment au niveau de la barrière hématoencéphalique (BHE). Les variants génétiques (polymorphismes) de RFC1 jouent un rôle dans la survenue des AVCi chez l’Homme, ce qui suggère un rôle de RFC1 dans la pathogenèse de l’AVCi. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible suggèrent un effet délétère de RFC1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de RFC1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une mise sous silence transcriptionnelle de RFC1 par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. L’objectif spécifique de cette DAP est d’évaluer l’effet de l’administration intracérébrale d’une molécule thérapeutique ciblant RFC1 sur la taille de la lésion cérébrale et l’intégrité de la BHE. Le groupe contrôle recevra une molécule inactive. Notre hypothèse est que ce silençage génique de RFC1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la BHE.
Bénéfices attendus
Si l’effet neuroprotecteur du silençage de RFC1 est prouvé, cela validera RFC1 comme une nouvelle cible thérapeutique, et il sera possible de tester des molécules permettant d’inhiber RFC1 et de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVCi.
Procédures
L’injection d’un ARN interférent (siRNA) in situ nécessite une injection stéréotaxique, réalisée sous anesthésie générale (
Impact sur les animaux
Suite à l'accident vasculaire cérébrale, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (
Devenir
les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires post-mortem (imagerie ex vivo haute-résolution, immunohistochimie).
Remplacement
Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo (notamment sur microvaisseaux cérébraux isolés) et montrant le rôle de la protéine RFC-1 dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ dédié aux petits animaux.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en per-occlusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (
Choix des espèces
Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.
Comparaison de l’efficacité d’un composé conjugué qui vise à améliorer l’absorption musculaire avec un composé non conjugué pour la réduction de la dynamine 2 chez un modèle de souris de la myopathie centronucléiare liée à l’X
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une myopathie qui provoque atrophie musculaire, paralysie des membres et mort vers sept à huit semaines sans traitement, elles reçoivent des injections hebdomadaires et des tests d'agrippement, avant une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil. Le projet compare deux formes d'un composé déjà en essai clinique, pour réduire sa toxicité pour le foie en ciblant le muscle. Le porteur affirme que suivre à la fois l'effet musculaire et l'absorption par le foie impose un "organisme vivant entier".
Objectifs
Les myopathies centronucléaires, sont des myopathies congénitales très sévères caractérisées par une faiblesse musculaire, une forte atrophie et des anomalies de la structure des fibres musculaires. La myopathie centronucléaire liée à l'X (XL-MTM), due à des mutations de la myotubularine, MTM1, est la plus commune et la plus sévère des formes de myopathies centronucléaires, caractérisée par une hypotonie néonatale sévère et un décès précoce. Il a été précédemment montré qu'un niveau trop élevé d’une certaine protéine dans le muscle semblait jouer un rôle majeur dans la survenue de cette myopathie et que la sous-expression de cette protéine dans un modèle murin reproduisant les caractéristiques de la maladie, pouvait l’améliorer. L’équipe a également montré qu’il est aussi possible de traiter des souris malades quand elles sont déjà affectées. Nous avons actuellement un composé en essai clinique pour réduire l’expression de la protéine impliquée. Pour concevoir l'essai clinique, les études sur la souris ont été essentielles afin d'effectuer une modélisation PK/PD (pharmacocinétique et pharmacodynamique) et de choisir les doses et la fréquence d'administration appropriées en clinique. Cependant, pour des raisons de sécurité, nous voulons éviter de donner une dose trop élevée du composé et risquer d'induire une toxicité. Par exemple, il est connu que certains patients atteints de XL-MTM ont une maladie du foie sous-jacente. L'objectif de ce projet est de soutenir l'efficacité et l'innocuité de notre composé en clinique via une approche permettant d’augmenter son efficacité tout en réduisant sa toxicité, et ce, en le conjuguant à une molécule qui cible certains récepteurs préférentiellement exprimés dans le muscle. Cette approche éviterait que le composé soit fortement exprimé dans les tissus non ciblés, tel que le foie, et permettrait d'utiliser des doses réduites du composé conjugué en clinique pour atteindre le même effet thérapeutique qu'une dose plus élevée du composé sans conjugaison. Nous souhaitons donc tester ce composé conjugué dans le modèle murin XL-MTM et comparer son efficacité et sa sécurité à notre composé non conjugué.
Bénéfices attendus
Nous avons actuellement un composé en essai clinique pour réduire notre protéine cible, dynamine 2. Pour concevoir l'essai clinique, les études sur la souris ont été essentielles. Pour des raisons de sécurité, nous voulons éviter de donner une dose trop élevée du composé et risquer d'induire une toxicité. Il est connu que certains patients de notre étude ont une maladie du foie sous-jacente. Notre composé étant injecté par voie systémique, il peut atteindre d'autres tissus que le muscle, notamment le foie. L'objectif de ce projet et son bénéfice sont donc de soutenir l'efficacité et l'innocuité de notre composé en clinique. En améliorant son ciblage musculaire, on peut utiliser une dose moindre pour un effet thérapeutique équivalent ou supérieur et ainsi augmenter la puissance et la sécurité du composé.
Procédures
Des injections ainsi qu'une évaluation de leur phénotype (évaluation de la gravité de la maladie) seront effectué 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 3 injections) sur tous les animaux des procédures expérimentales (soit 240 animaux au total). Les injections durent 1 à 2 minutes par souris. L’évaluation du phénotype est constituée d’une évaluation plus visuelle qui dure moins de 2-3 minutes et d’un test d’agrippement qui dure maximum 1 minute et qui est répété 3 fois avec 5 minutes de repos entre chaque test. A la fin de ces 3 semaines, à 5 semaines d'âge, les dernières procédures seront effectuées sous anesthésie générale sans réveil : chirurgie et mesure de la contraction d’un muscle du membre postérieur et prélèvement sanguin par ponction intracardiaque. Cette chirurgie (anesthésie, dissection, mesure de la contraction du muscle et la ponction intracardiaque) dure au total 1 heure par souris.
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est l’effet du phénotype dommageable de la lignée choisie. En effet, les souris, dès l’âge de 3 semaines, développent les premiers signes d’une atrophie musculaire. Cette atrophie se caractérise par une non prise puis une perte de poids, une faiblesse musculaire de plus en plus importante conduisant à la paralysie des membres inférieurs, une difficulté à s’alimenter et à s’hydrater. Sans traitement, ces critères durent et s’amplifient jusqu’à la mort des souris vers 7-8 semaines. Les traitements mis en place dans nos procédures ont pour but de limiter la perte de poids voire de permettre une reprise de croissance, d’empêcher la paralysie des membres et prolonger la durée de vie des animaux. La seconde nuisance potentielle attendue sur les animaux est due aux injections qui peuvent induire des signes d'inflammation, induration, infection, occlusion intestinale (perte de poids et gonflement ventral).
Devenir
Les animaux de la procédure maintien de la lignée sont maintenus en vie pour les procédures suivantes. Lors des procédures qui suivent : Etude pilote et Dose réponse, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale, après mesure de la contraction musculaire in situ et prélèvement sanguin par ponction cardiaque (le tout fait sous anesthésie générale).
Remplacement
Nous savons que notre composé, étant injecté systémiquement, est fortement retenu dans le foie des animaux. Or certains patients présentent une maladie du foie sous-jacente. Avec le conjugué que nous souhaitons tester nous espérons d’une part pouvoir limiter son action aux muscles et d’autre part diminuer la dose sans diminuer l’efficacité. Pour attester cela, nous devons pouvoir regarder, après l’injection de nos composés, dans un même animal, l’efficacité sur les muscles et le niveau d’absorption par le foie. Ceci ne peut être étudié que sur un organisme vivant entier, d’où l’utilisation des souris.
Réduction
Les lots ont été établis en utilisant une méthode statistique adpatée à l'évaluation de l'atrophie musculaire et de l'effet des composés testés sur cette atrophie. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe sera de 15 souris pour atteindre une différence statistiquement significative lorsqu’un phénotype apparait entre les souris contrôles et les souris génétiquement modifiées. Afin de limiter le nombre de groupes expérimentaux utilisés nous avons diminué le nombre de groupes expérimentaux en ne reproduisant pas les groupes expérimentaux déjà testés dans les études précédentes sachant que les résultats obtenus sont stables et homogènes. Avant de lancer notre étude complète nous réaliserons également une étude pilote pour vérifier la faisabilité de notre projet. En effet, si l’injection de notre composé conjugué ne s’avère pas plus efficace et moins « toxique » que notre composé non conjugué actuellement en clinique, alors l’étude complète ne sera pas effectuée.
Raffinement
Une surveillance quotidienne permettra de repérer précocement les signes de souffrance / douleur / stress. Dès l’apparition de ces signes un suivi sera effectué via une fiche scoring pour définir les points limites permettant de prendre les mesures appropriées en fonction du niveau observé, limitant ainsi la souffrance de l'animal. Afin d'améliorer le bien-être animal tout au long de la vie de l'animal, de la nourriture adaptée à ce modèle de souris sera utilisée (eg. de la nourriture et de l’eau en gel ainsi que quelques croquettes seront placées dans la cage pour les souris malades à la place des croquettes sur la grille).
Choix des espèces
Nous souhaitons suivre à la fois l'efficacité du traitement et les effets secondaires sur les autres organes que les organes cibles, notamment le foie, nous devons donc utiliser un organisme vivant entier. Le modèle de la maladie que nous étudions : myopathie myotubulaire liée à l'X, est disponible chez le chien et la souris. L’utilisation du modèle canin pour une étude pilote/préclinique n’étant pas la plus adéquate (disponibilité de la lignée, nombre nécessaire, durée de vie des animaux, long processus de reproduction…) nous proposons de réaliser ces techniques sur une lignée de souris MTM1 KO disponible dans nos laboratoires. Les animaux seront étudiés à partir de l'âge de 3 semaines (âge d'apparition des symptômes et début du traitement) jusqu'à l'âge de 5 semaines pour pouvoir analyser l'effet "immédiat" du traitement sur les souris.
Etudes de connectivité fonctionnelle cérébrale dans des modèles murins de la maladie de Parkinson.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de lésion du cerveau par injection d'une toxine et la pose d'un cadre métallique sur le crâne, puis des séances d'imagerie et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier la connectivité cérébrale dans deux modèles de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que la chirurgie de lésion réduit la motivation à se nourrir pendant une semaine environ. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la complexité du cerveau, ce qui rend selon lui le modèle animal "indispensable".
Objectifs
La maladie de Parkinson touche jusqu'à 4% des personnes âgées 65 ans ou plus et est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Elle est causée par une perte de neurones dopaminergiques entraînant des symptômes moteurs et non-moteurs. La reconstitution des niveaux normaux de dopamine via l’administration d'un médicament est le traitement le plus courant de la maladie de Parkinson. Le médicament atténue de nombreux symptômes, mais pas tous, induit des mouvements musculaires incontrôlables, avec un taux d'incidence rapporté de jusqu' à 80%, après 5 à 10 ans de traitement chronique. La physiopathologie de la maladie de Parkinson et de ces mouvements incontrôlables induits par le médicament n'est pas entièrement comprise, mais des dérèglements structurels et fonctionnels des réseaux neuronaux cortico-sous-corticaux et des modifications du réseau et de la connectivité du cerveau ont été observés. Les techniques de neuro-imagerie fournissent des informations importantes sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, les mécanismes compensatoires potentiels et les effets liés au traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, si la connectivité fonctionnelle des réseaux neuronaux est modifiée en fonction de l’état de dépletion de dopamine et de sa reconstitution. Nous utiliserons une technique d'imagerie de l'échographie rapide dans un modèle murin de lésion et un modèle murin génétique de maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier une modification de connectivité fonctionelle des réseaux neuronaux et des connectivité fonctionelles dans deux modèles différents de souris de la maladie de Parkinson. Cette technique sera hautement transposable puisqu'elle mésure le même paramètre physiologique, c'est-à-dire les changements de la perfusion cérébrale, que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle clinique et puisqu'elle produira des profils de réseau en corrélation avec la progression de la maladie et la réponse au traitement. Bien que le projet proposé soit une première étape pour déchiffrer les changements du connectome dans le cerveau de souris malades par rapport au cerveau de souris saines, nous envisageons que l'imagerie pourrait être utilisée dans le développement de médicaments, comme prédicteur de l'efficacité des médicaments et pour cribler de nouveaux candidats médicaments dans des modèles précliniques.
Procédures
Certaines souris subiront une chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue et de preparation pour imagerie. Une partie des animaux sera soumise à des études d'imagerie fonctionnelle après une injection aiguë ou chronique de médicaments dopaminergiques. D'autres animaux subiront une évaluation comportementale par plusieurs tests comportmentaux. En tout, 240 souris subiront une chirurgie d'une durée de 20-30 min.
Impact sur les animaux
Certaines souris subiront une chirurgie : le montage d' un cadre metallique sur le crane, et d'autres subiront une opération supplémentaire : la chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue. La chirurgie des lésions rendra les animaux moins motivés de se nourrir pendant environ une semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort pour des analyses de tissus post mortem. Pour la fixation du cerveau, une perfusion intracardiaque avec une solution de paraformaldehyde sera utilisée et la procédure sera realisée sous une anesthésie générale profonde. Les tissus sont prélevés sur animaux morts.
Remplacement
Remplacement : A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet. L’analyse de la connectivité sur animal éveillé n’a été mise au point à ce jour que chez la souris.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Nous estimons que N=12 animaux sont suffisants par groupe. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Raffinement : Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesia générale. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal anesthesie et vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé ; des séances d'habituation seront effectuées au préalable. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur,souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.
Choix des espèces
Cette étude vise à étudier la connectivité cérébrale. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux. Notre choix s’est porté sur la souris car l’étude d’imagerie par ultrasons chez l’animal éveillé a été mise au point seulement dans cette espèce. Les animaux ayant atteint un poids corporel de 30 gr (âgés d'environ 4-6 mois) seront soumis à une chirurgie d'injection intracrânienne de 6-OHDA, les tests comportementaux auront lieu 3 semaines après, pour toutes les groupes expérimentaux.
Rôle des cellules progénitrices dans le remodelage du tissu adipeux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras, soumises à des cycles de perte et de reprise de poids, à des gavages de tamoxifène ou de doxycycline et à des prélèvements sanguins répétés, certaines isolées cinq jours en cage de calorimétrie, pour étudier les cellules progénitrices du tissu adipeux. Le porteur écrit que "chaque animal sera exploité afin d'apporter le maximum d'information". Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces fonctions et que seule une approche in vivo permet de les explorer.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer l'implication des progéniteurs du tissu adipeux dans les fonctions du tissu adipeux et les conséquences métaboliques à l'échelle des tissus adipeux et systémiques Nous chercherons (i) à identifier des acteurs moléculaires importants dans la fonction fibrotique et inflammatoires de progéniteurs et (ii) à savoir si moduler la fonction des progéniteurs suffit à améliorer en locale les fonctions du tissu adipeux et le métabolisme systémique dans le contexte de l’obésité et des variations pondérales.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'identifier les acteurs moléculaires critiques de la fonction des progéniteurs du tissu adipeux, ce qui permettra à terme de développer des stratégies innovantes pour permettre de limiter les désordres métaboliques qui sont associés à l'obésité. De plus, nos résultats permettront également de trouver des moyens d'optimiser la perte de poids et ses effets métaboliques.
Procédures
Les animaux seront rendus obèses à l’aide d’un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines. Chez les animaux anciennement obèses, la perte de poids) est permise soit par le remplacement du régime gras par du régime chow sans restriction calorique et donc disponible ad libitum ; soit par une restriction calorique modérée opérée alors que les animaux sont toujours sous régime gras. Dans ces 2 cas de figure, la perte de poids s’étend sur une période de 4 semaines. Pour le modèle yoyo, l’obésité est induite par un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines, ensuite une perte de poids est induite par le remplacement du régime gras par du régime chow (ad libitum) pendant 4 semaines. Puis une ré induction de l’obésité est opérée par une réexposition au régime gras pendant 4 semaines. Chez les souris minces, obèses, anciennement obèses ou yoyo, pour l'étude du contrôle de la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 4 heures et ils subiront des prises de petits volumes de sang (environ 150ul). Ainsi qu'un gavage ou une injection ip en début d'expérience. Le test de tolérance au glucose ou le test de sensibilité à l’insuline durent environ 2,5 heures. Chaque gavage ou injection dure moins de 20 secondes. Les prises de sang durent moins de 30 secondes. Pour les besoins de certains modèles OGM inductibles, les animaux se verront administrer du tamoxifène par gavage (5jours successifs, 150ul en moyenne, chaque gavage dure moins de 20 secondes) ou de la doxycycline (ajoutée au régime gras pendant 8 semaines ou ajoutée au régime chow pendant les 4 semaines de perte de poids). Afin d'étudier l'homéostasie énergétique, certains animaux seront analysés en cage de calorimétrie pendant 5 jours, ce qui nécessite l’isolement des animaux au cours de la période d’analyse. L’analyse de composition corporelle par RMN ne dure pas plus de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les différents tissus adipeux.
Remplacement
Dans le tissu adipeux, la fonction cellulaire des progéniteurs va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. De plus, nos données montrent que l’état d’activation des progéniteurs va en retour avoir des conséquences histologiques et fonctionnelles sur le tissu adipeux. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions des progéniteurs in situ. L’évaluation de l’activité des cellules progénitrices du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.
Réduction
Chaque animal sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les modèles de souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. L’approche de croisement pour produire les animaux génétiquement modifiés est optimisée pour qu’une majorité des animaux produits soient utilisés. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. 984 animaux sont impliqués
Raffinement
Les animaux sont regroupés à 4-5 animaux par cage et le milieu est enrichi avec des bandes de papier et des abris en carton à usage unique. Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).
Choix des espèces
Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. La présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 8 semaines.