Souris
Rôle des récepteurs aux hydrocarbures endothéliaux sur les effets de la dioxine dans le développement du cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de 15 jours, elles reçoivent un agent génotoxique puis, pendant douze semaines, des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine et un gavage hebdomadaire de dioxine, pour induire un cancer du foie sur fond de fibrose. Le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun moyen de remplacer une telle étude, la réponse étudiée mettant en jeu plusieurs types cellulaires.
Objectifs
Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes par lesquels la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) favorise le développement du carcinome hépatocellulaire avec une attention particulière sur la contribution des cellules endothéliales dans ce processus. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui consiste à administrer un agent génotoxique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souriceaux mâles âgés de 15 jours puis à administrer du tétrachlorure de carbone (CCl4) 2 fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. Ce modèle permet le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4). L’effet de la TCDD sur la carcinogenèse hépatique sera évalué en exposant les souris à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.
Bénéfices attendus
Si la toxicité d’une exposition chronique à de faibles doses de 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sur la santé humaine est largement reconnue, elle reste encore mal caractérisée, notamment d’un point de vue moléculaire et cellulaire. Ce projet permettra de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les effets délétères de la TCDD sur le développement du carcinome hépatocellulaire. Plus largement, ce projet apportera une meilleure compréhension de l'impact des polluants environnementaux et de la voie d’aryl hydrocarbone (AhR) sur la santé humaine.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine de tétrachlorométhane (CCl4) ou son diluant (Huile) en ip à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines ; une administration de TCDD par semaine en gavage à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris et les gavages de 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Le modèle DEN / CCl4 induira le développement de tumeurs hépatiques.
Devenir
Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de la TCDD.
Remplacement
Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes et cellules endothéliales)
Réduction
Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.
Raffinement
Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.
Choix des espèces
La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique. De plus, ce modèle présente l'avantage qu'il nous permet de travailler avec des souris génétiquement modifiées. En effet, nous disposons de souris invalidées pour le gène du récepteur aux hydrocarbures dans les cellules endothéliales, il s'agit de souris transgéniques qui expriment le gène codant la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur VE-cadhérine (Cdh5) et présentent le gène AhR floxé (souris Tg Cdh5-CreERT2/+: AHRflox /flox). Pour le protocole d'induction d'un CHC sur foie cirrhotique, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Six semaines après l’injection de DEN (8 semaines de vie), les souris recevront une injection de CCl4 (dose à 0,2ml/kg d’une solution de 10% )ou de son diluant (huile) qui seront faites en intrapéritonéal 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Les souris seront exposées à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.
Etude de l’effet de principes actifs dans un modèle de colite induite chimiquement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est induite chimiquement par TNBS ou DSS pour reproduire la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, puis un candidat médicament est administré par gavage pendant dix jours avec prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur reconnaît que de fortes doses peuvent entraîner nécrose et perforation du côlon, les souris perdant plus de 25 % de leur poids étant mises à mort. Il s'agit d'une société de prestation testant les molécules de ses clients, qui affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer ces maladies et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Les MICI sont le plus souvent diagnostiquées entre 20 et 30 ans. Toutefois, elles peuvent survenir à tout âge et 15% des cas concernent des enfants. Leur fréquence varie considérablement d’un pays à l’autre, les incidences les plus importantes étant retrouvées dans les pays industrialisés, notamment en Europe du Nord-Ouest et aux Etats-Unis. Il n’existe pas de traitement curatif des MICI, mais les médicaments anti-inflammatoires actuels permettent dans la grande majorité des cas un contrôle durable de la maladie, pendant plusieurs années, associé à une qualité de vie satisfaisante. Toutefois, la recherche est très active afin de trouver de nouveaux traitements plus efficaces. Les modèles murins de colite sont très utilisés pour étudier sa physiopathologie et pour le développement de nouvelles modalités de traitement des maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Pour ces derniers, il est essentiel de sélectionner un modèle de souris qui présente de nombreuses caractéristiques qui se chevauchent avec les MICI humaines. L’objectif de notre projet est de mettre en place des modèles de MC et RCH aigue et semi-chronique chez la souris afin de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour les MICI chez les patients.
Bénéfices attendus
Le premier but de notre étude sera de trouver des doses de TNBS et de DSS qui ne soient pas trop toxiques mais soient quand même capables d’induire des lésions intestinales quantifiables et reproductibles. Cette étape préalable est très importante car il est bien connu que la severité de l’inflammation induite par ces protocoles expérimentaux est très variable entre une zootechnie et une autre car dépendant, en partie, du microbiote de chaque animal mais aussi liées à d’autres facteurs de l’environment de travail. Il est donc nécessaire de valider dans notre propre zootechnie les protocoles décrits en littérature. Le but ultime de notre projet est de mettre en place des modèles expérimentaux qui seront utilisés pour tester l’efficacité de nouveau médicaments ayant un effet anti-inflammatoire, afin de contribuer à identifier de nouveaux traitements plus efficaces pour ces maladies chroniques, notamment la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH).
Procédures
Pendant 10 jours et une fois par jour, une administration du produit test (candidat médicament ) ou de son solvant sera effectué par gavage. Chaque jour, si nécessaire, un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 10 jours par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une inflammation intéstinale chez la souris qui puisse mimer la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH). Le TNBS et le DSS induisent des dommages intestinaux dose-dépendants, des doses élevées peuvent entraîner des taux de mortalité non négligeables en raison de la perte de poids, de la nécrose et de la perforation du côlon. En revanche, des doses faibles peuvent provoquer une activité de colite de courte durée, faible ou même complètement absente. Par contre, les médicaments et les candidats médicaments que nous testerons une fois le protocole expérimental établi, sont censés réduire le degré d’inflammation du colon, donc pourraient avoir un effet bénéfique sur la santé des souris traitées. Au pire, ces médicaments ne seront pas responsables d’induire une aggravation de l’état de santé des animaux.
Devenir
A la fin de l’expérimentation les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sur animal vigil. En effet, il n'est pas possible, vu les procédures sevères appliquées, de réutiliser ces animaux pour d'autres expérimentations.
Remplacement
Le but de notre étude est de quantifier l’effet de candidats médicaments ayant des mécanismes d’actions différents sur l’inflammation intestinale chez la souris, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs capables de mimer la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
Réduction
Notre société réalise des études scientifiques externalisées par l'industrie pharmaceutique. Le nombre de groupes expérimentaux peuvent varier en fonction des demandes de nos clients. Pour la mise au point de chaque protocole (DSS et TNBS), nous utiliserons 4 groupes expérimentaux avec n=12 animaux par groupe ; au total il s'agit donc de 96 animaux. Ensuite pour les tests de nouveaux médicaments notre prévision est de réaliser 2 études par an et pour chaque protocole expérimental (DSS et TNBS). Chaque étude aura pour but de tester un candidat médicament, donc sur 5 ans nous testerons 20 candidats médicaments. Pour ces études, nous utiliserons 8 groupes expérimentaux avec n=12 animaux par groupe. Pour chaque modèle nous utiliserons donc 192 souris/an, donc 960 sur 60 mois. En total, y compris une mise au point du modèle, nous utiliserons donc (960+96=1056) x2= 2112 souris en 60 mois. Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux seront comparés entre eux en utilisant un test one-way ANOVA.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 6 par cage, avec des morceaux de coton et de bois à grignoter. Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les cages resteront à une place fixe sur le portoir et seront bougés le moins possible. Les animaux seront manipulés à des fins expérimentales uniquement dans le laboratoire et non dans leur pièce d’hébergement pour éviter de stresser les autres animaux présents dans la pièce. En cas d’administration de médicaments par voie orale, les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de d’administration intrarectale de TNBS les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution du toilettage et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids est supérieure à 25 % du poids initial, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Il existe d’autres modèles animaux de MICI mais le modèle murin donne des avantages car il y a la possibilité d’utiliser des animaux présentant des modifications génétiques spécifiques, d’utiliser des cohortes de plus grande taille et de diminuer la quantité de candidat médicament requis. Les souris seront de souche C57BL/6 ou BALB/c, car ces souches sont largement utilisées pour les études d’induction de la colite (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le rat, le chien et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et/ou d’infrastructures d’hébergement. Animaux adultes car les jeunes ne sont pas assez sensibles à l’action du DSS et du TNBS. De plus, les maladies inflammatories de l’intestin sont le plus souvent diagnostiquées entre 20 et 30 ans, les patients pédiatriques sont assez rares.
Etude de la cinétique de réactivation du chromosome X dans l’embryon de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections hormonales pour surproduire des ovocytes puis sont euthanasiées après accouplement afin de prélever des embryons datés, tandis que les mâles reproducteurs, maintenus vivants entre les accouplements, sont mis à mort vers quinze à dix-huit mois. Le porteur indique qu'aucun animal n'est réutilisé et étudie la réactivation du chromosome X au cours du développement embryonnaire. Il affirme développer en parallèle des modèles cellulaires in vitro, mais soutient qu'aucun ne remplace aujourd'hui l'étude de l'embryon préimplantatoire chez la souris.
Objectifs
Chez les mammifères, le formation de l'embryon et des gamètes (précurseurs des ovules et spermatozoïdes= nécessite un changement radical d'expression des gènes et de marques épigénétiques dans les cellules. Dans les deux cas, cela implique un profond remodelage épigénétique, à travers des modifications telles que la méthylation de l'ADN et les marques des histones, ainsi que des spécificités en fonction du sexe de l'embryon. En effet, Il est, il existe de profondes disparités entre les sexes en termes de développement mais aussi de maladie et d'occurrence et mortalité des cancers. Pourtant très peu de données existent sur le chromosome X au cours du développement, ainsi que sur les spécificités de la reprogrammation épigénétique en fonction du sexe. Au cours du développement, cette reprogrammation est essentielle à l’obtention de cellules reproductives et à la perpétuation de l’espèce et elle est accompagnée par la réactivation du chromosome X inactif chez les femelles. Ce chromosome inactif représente un paradigme de contrôle épigénétique de l’expression des gènes à l’échelle d’un chromosome entier. Quand et comment a lieu la réactivation du chromosome X ? Quel est son impact sur la lignée germinale ? Une meilleure compréhension du contrôle de l'expression génique au cours de la reprogrammation développementale permettra également de comprendre les aberrations transcriptionnelles observées dans les cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
L'utilisant de nouveaux modèles murins apportera de nouvelles connaissances sur la lignée germinale, le développement pré-implantatoire, les différences entre les sexes et le contrôle épigénétique des gènes. Cela pourra avoir des implications futures en médecine régénérative et de la reproduction, nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la transmission épigénétique entre les générations, et ouvrira de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement des cancers en prenant en compte le sexe des patients. Cela est aujourd'hui considéré comme crucial, et par l'Union Européenne, et par le NIH aux Etats-Unis.
Procédures
Les femelles sont super-ovulées pour produire plus d'ovocytes ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux. Ces femelles seront stimulées par deux injections d'hormones à 48h d'intervale , en intrapéritonéale. Ces injections sont utilisées en routine dans de nombreuses animaleries et n'entraînent pas d'effets indésirables pour les femelles. L’injection en intrapéritonéale dure en soit quelques secondes, et l’accouplement a lieu courant de la nuit suivant la 2nde injection. Le prélèvement des embryons a lieu entre le matin et le 3e jour après l’accouplement. Au total la stimulation hormonale de la première injection à l’euthanasie de la femelle est de 68 à 120h heures. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Les mâles reproducteurs resteront seuls dans leur cage, une fois l'accouplement ayant eu lieu, et avant le prochain accouplement. Nous nous assurerons d'une grande quantité d'enrichissement dans les cages pour éviter tout stress lié à l'isolement. Ces mâles seront remis en accouplement très régulièrement (plusieurs fois par mois) ce qui ne donnera pas lieu à des isolements prolongés (< 10 jours). Cet isolement est nécessaire pour éviter les bagarres entre animaux mâles après accouplement.
Impact sur les animaux
Pas d'effet indésirable attendu sur les mâles isolés car ces derniers seront régulièrement mis en accouplement (plusieurs fois par mois), ce qui ne devrait donc pas générer de stress important à l'animal. Les femelles superovulées seront manipulées au minimum, avec seulement deux injections intrapéritonéales nécessaires à 2 jours d'intervalle. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Si toutefois un animal présentait un stress important, un problème comportemental ou une apparition d'une blessure/tumeur de façon fortuite, nous euthanasierons l'animal dans les plus brefs délais pour éviter toute souffrance animale.
Devenir
Apres superovulation ou accouplement naturel, les femelles gestantes seront euthanasiées pour récupérer les embryons datés. Les mâles reproducteurs seront gardés en vie pour production d’autres embryons datés. Les mâles seront sacrifiés autour de 15-18 mois. Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet, aucun ne pourra être réutilisé.
Remplacement
Notre projet a été élaboré en conformité avec le principe des 3R. Remplacement: Notre travail se base sur des données produites en amont sur des modèles de culture cellulaire. L'inactivation du chromosome X n'existe que chez les mammifères et il n'existe pas de modèle cellulaire adéquat pour l'étude de l'embryon préimplantatoire. Le laboratoire développe actuellement de nouveaux modèles de cellules gamétiques in vitro pour remplacer dans le futur l'utilisation d'animaux. La validation de nos résultats in vitro par cette approche in vivo sur modèles murins nous confortera dans l’utilisation de ce nouveau modèle, pour l’étude du chromosome X.
Réduction
Réduction: En utilisant des technologies de pointe, sur très peu de cellules, voir sur la cellule unique, nous réduisons très fortement le nombre d’embryons nécessaires à nos études. Toutes ces technologies sont d'abord mises en place et testées sur des cellules en culture. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront, au préalable, injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) pour leur permettre une plus grande ovulation. Cela minimisera le nombre de femelles nécessaires pour l’obtention du nombre adéquat d’embryons.
Raffinement
Raffinement: nous prenons soin d'effectuer une manipulation minimale des animaux vivants. Nos expériences portent uniquement sur l’accouplement des animaux sauvages ou transgéniques dans le but d’obtenir des embryons datés et l’euthanasie des femelles au moment du prélèvement des embryons. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront également injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) à 48 heures d'écart. Nous porterons un soin particulier à l’enrichissement du milieu pour que les souris puissent se créer un nid. Cependant en cas de signes de souffrance et de détresse des animaux, des procédures d’euthanasie seront immédiatement mises en place.
Choix des espèces
L’inactivation du chromosome X est un phénomène conservé et spécifique des femelles de mammifères, impliquant que notre modèle soit la souris. Notre étude ne peut en aucun cas être menée sur d’autres modèles animaux non mammifères. De plus, il est connu que l’inactivation est un processus très dynamique pendant le développement, dépendante du stade gestationnel, de l’état de différentiation et de l’origine cellulaire. Il est donc important d’avoir recours à une étude développementale sur animaux vivants pour comprendre les mécanismes de réactivation. Nous proposons d’étudier l’expression des gènes par transcriptomique, et hybridation des ARN, et les marques épigénétiques, dans l’embryon préimplantatoire de souris entre la fécondation et l'implantation (1ère vague d'inactivation et réactivation du chromosome X) et dans les cellules germinales primordiales, qui sont présentes entre 7 et 13 jours de développement embryonnaire (dpc). Les embryons seront issus de croisements entre souris sauvages et transgéniques pour nous permettre d’isoler des embryons femelles avec une inactivation biaisée du chromosome X et des marqueurs fluorescents des cellules germinales et/ou du chromosome X. Les parents transgéniques ainsi que la descendance ne présentent aucun phénotype dommageable. Les embryons (femelles et mâles en contrôle) seront collectés entre 0.5 et 4.5 et entre 7.5 et 13.5 jours de développement embryonnaire. Les animaux transgéniques nécessaires sont déjà disponibles et nous possédons un grand jeu de données transcriptomiques sur le modèle souris dans le laboratoire.
Effets d’un traitement par anticorps dans un modèle murin de cancer des voies biliaires : suivi longitudinal en imagerie nucléaire (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées d'un cancer des voies biliaires, elles reçoivent des injections hebdomadaires de traitement pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avec un développement tumoral pouvant entraîner nécrose et perte de poids. Le porteur met à mort les animaux après la dernière imagerie pour prélever la tumeur. Il affirme que la complexité du développement tumoral ne peut être étudiée sur cellules en culture et qu'il est "primordial" de tester l'anticorps sur des souris greffées de cellules humaines.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de permettre une meilleure compréhension de la pathogenèse du cancer des voies biliaires et l’évaluation in vivo de l’efficacité d’un nouveau candidat médicament.
Bénéfices attendus
Réduction de la pousse tumorale avec le nouveau candidat medicament observée en imagerie l'aide de traceurs pertinents.
Procédures
Les souris recevront le traitement soit par injection au niveau de la paroi abdominale (éveillé, 4 injections, durée 20 secondes chacune) soit par voie intraveineuse (anesthésie , 4 injections, durée 1 minute) une fois par semaine pendant 4 semaines. Les souris seront soumises à séances d'imagerie (10 minutes chacune) à raison d'une par semaine pendant 4 semaines. Ces séances sont réalisées sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances susceptibles de survenir sont : - développement tumoral et apparition de nécrose tumorale - perte de poids de l'animal - hématome au niveau du site d'injection du radio-traceur qui disparait spontanément en 3 jours. - des nécroses au point d’injection du traitement au niveau de la paroi abdominale,
Devenir
A la fin de la procédure, c’est-à-dire après la dernière séance d’imagerie, les animaux seront mis à mort et la tumeur prélevée post mortem pour des études complémentaires (histologie, biochimie) qui viendront compléter les résultats obtenus in vivo.
Remplacement
Notre étude vise à montrer l'efficacité d'un anticorps dans le le carcinome hépatique. La complexité du développement tumoral (circulation sanguine, environnement tumoral) ne pouvant être étudié uniquement sur des cellules en culture, il est primordial de tester cet anticorps sur des modèles animaux greffés avec des cellules tumorales humaines.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été calculé afin d’inclure le minimum d’animaux pour pourvoir réaliser des tests statistiques sur les résultats obtenus. L’utilisation de l’imagerie lors d’études longitudinales permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux lors des études. De plus, le prélèvement post mortem de la tumeur pour des études complémentaires permet de compléter les informations obtenues dans l’étude sans augmenter le nombre d’animaux. Un test statistique sera utilisé pour analyser les effets d’un nouveau traitement par anticorps sur la croissance tumorale entre les différents groupes d'animaux.
Raffinement
L’environnement des animaux est enrichi (tunnel, carré de coton déchiquetable pour maintenir une activité locomotrice), les animaux sont placés à plusieurs par cage pour respecter les interactions sociales. Les souris greffées auront un suivi quotidien réalisé par du personnel préalablement formé et à l’aide d’une grille d’observation adaptée afin d’éviter toute souffrance liée au développement des tumeurs et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs lors des procédures. Les examens sont réalisées sous anesthésie gazeuse et lors des séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée avec un suivi en direct de la fréquence respiratoire et de la température corporelle afin de déceler tout signe précoce de mal-être (hypothermie par exemple). Un gel ophtalmique ainsi qu’une injection sous-cutanée de sérum physiologique à température corporelle seront administrés à l’animal juste avant le début de la séance d’imagerie.
Choix des espèces
En raison de l'absence d'une partie de son système immunitaire, les cellules tumorales injectées à cette souche particulière de souris vont pouvoir se développer et former une tumeur. Les animaux seront greffés à un âge allant de 6 à 8 semaines, âge optimal pour la prise tumorale .
Role des cellules dendritiques dans les infections virales locales et systémiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5046 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 860 d'entre elles en gravité sévère. Elles sont infectées par trois virus, un cytomégalovirus, un virus de la chorioméningite et un virus de la grippe, administrés par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou nasale, pour étudier le rôle d'un type de cellule immunitaire dans la défense antivirale. Le porteur indique surveiller la perte de poids et euthanasier les souris atteignant un point limite. Il affirme que la mesure de la réponse immunitaire "nécessite" un organisme vivant et complet, et que la souris est le modèle "le mieux approprié" du fait de sa génétique.
Objectifs
Le système immunitaire protège l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules dendritiques (DC) appartiennent au système immunitaire et agissent comme sentinelles du système immunitaire Lorsqu’un pathogène est détecté, elles transmettent des signaux qui initient et orchestrent les réponses immunitaires. Les DC se divisent en conventionnelles (cDC) et plasmacytoïdes (pDC). Les cDC agissent principalement comme présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T, qui à leur tour contrôlent l’infection et génèrent des cellules ayant mémoire du pathogène. Les pDC sont la principale source de molécules, dites Interférons (IFN), produites au cours des infections virales. Presque toutes les cellules du corps répondent aux IFN en produisant des molécules capables de bloquer les différentes phases du cycle virale (immunité intrinsèque). De plus, la réponse aux IFN est indispensable pour activer les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. Les pDC sont ainsi considérées clef dans l’immunité antivirale. Notre hypothèse est que les pDC exercent des fonctions différentes selon le type de virus et/ou d’infection qu’il engendre. Après infection, la réplication du virus peut rester limitée à l’organe d’entrée (infection locale) ou s’étendre à tout l’organisme (infection systémique). Généralement, les virus sont éliminés par l’hôte, mais, parfois, ils persistent sous forme latente ou génèrent une infection chronique. Notre objectif principal est de déterminer quelles fonctions exercent les pDC dans ces différents types d’infection. Nous étudierons la localisation et l’état d’activation des pDC présentes dans les tissus infectés dans les souris pDC-Tomato, qui permettent d’identifier spécifiquement les pDC par fluorescence. Ensuite, nous évaluerons l’impact de la perte des pDC au cours de l’infection en utilisant les souris pDC-less, qui ont un déficit sélectif en pDC. Nous infecterons nos modèles murins avec les trois virus suivants: le cytomégalovirus murin (MCMV), le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) et la souche A du virus de la grippe (IAV). IAV induit une infection locale restreinte au système respiratoire, alors que MCMV et le LCMV induisent des infections systémiques. Le MCMV persiste dans l’hôte, mais sous forme latente. En revanche, LCMV est éliminé par l’hôte, sauf dans le cas de certaines souches qui établissent des infections chroniques.
Bénéfices attendus
Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les fonctions des pDC dans l’immunité anti-virale. L’identification des mécanismes moléculaires qui instruisent les différentes fonctions des pDC murines ouvriront des perspectives de nouveaux traitements pharmacologiques visant à inhiber ou promouvoir l’activation des pDC humaines selon les différents contextes pathologiques. Nous pourrons étendre nos études à l’homme car nous avons développé dans notre laboratoire des cultures de pDC humaines dérivées de précurseurs hématopoïétiques du sang de cordon. Nous pouvons ainsi étudier dans ces pDC les conséquences fonctionnelles de la perte d’expression d’un gène candidat grâce à des technologies d’ingénierie génétique. Nous déterminerons si les mécanismes moléculaires identifiés chez la souris sont conservés dans les pDC humaines et, si oui, quel est l’impact de leur inactivation.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. L'infection systémique par MCMV sera effectuée par voie intraperitoneales sur des souris vigiles. Cette infection dure une minute/souris. Les infections LCMV clone Armstrong et IAV seront effectuées par voie intranasale sur des animaux anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine/xylasine (injection intraperitonéale). L'infection par voie intranasale dure 1 minute/souris et les souris se réveillent 30 minutes après l'injection de l'anesthésie. L'infection LCMV clone 13 sera effectuée par voie intraveineuse sur des souris anesthésiées avec de l'isofluorane. L'infection par voie intraveineuse dure 1 minute/souris, le traitement par anesthesie dure 5 minutes/souris. Dans certaines expériences nous prélèverons le sérum des souris infectées. Cela sera effectué une seule fois par prélèvement retrorbitale et sur animaux anesthésiés avec isoflurane. L'anesthésie plus le prélèvement durent en totalité 5 minutes. Le volume de sang prélevé sera de maximum 200µl.
Impact sur les animaux
Nous surveillerons différents paramètres, comme la perte de poids, la douleur, le stress, l’inactivité, une mobilité réduite, ainsi que tout comportement anormal, induits dans toutes les procédures sévères de notre projet. Nous définirons une grille de score spécifique à chaque modèle d’infection et nous surveillerons quotidiennement les souris infectées. Lorsque les souris auront atteint un score correspondant à un point limite nous procéderons à l’euthanasie immédiate des souris souffrantes.
Devenir
Mise a mort de tous les animaux
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours des différents modèles d’infections virales in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Ainsi le modèle murin est un modèle de choix pour notre étude.
Réduction
Nous utiliserons 5046 souris pour mener à bien cette étude. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène C57BL/6J pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Ainsi, chaque expérience devrait pouvoir être répétée indépendamment deux fois, avec 4-5 animaux par groupe, minimum requis pour s’assurer de la bonne reproductibilité des résultats.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles exemptes d'organisme pathogène spécifique (EOPS). La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Un animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs, notamment pour les animaux placés en hauteur car trop exposés à la lumière. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans chaque procédure et des grilles de score spécifiques à chaque modèle d'infection seront utilisées pour le suivi des souris infectées. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes dont le système immunitaire est mature. Elles auront entre 6 et 12 semaines. Dans le cas spécifique de chimères de moelle osseuse appellées « shield » nous utiliserons des souris agées de 4 semaines au moment de la reconstitution (voir procédure 1).
Caractérisation et sélection de composés ciblant un nouveau mécanisme d’action biologique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil, c'est-à-dire une mise à mort sous anesthésie sans reprise de conscience. Auparavant vigiles, elles subissent des contentions, des injections et une administration orale de composés, puis sont endormies et tuées pour prélever sang et organes, afin de caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution d'inhibiteurs enzymatiques. Le porteur affirme avoir mené de nombreux tests in vitro et sur embryon de poisson zèbre en amont pour limiter le recours aux souris. Il conclut que l'expérimentation animale est "obligatoirement requise" par les agences réglementaires avant tout essai clinique, sans autre alternative.
Objectifs
Le projet consiste à caractériser les propriétés de pharmacocinétique, de pharmacodynamique et de biodistribution de composés inhibiteurs d'une famille d'enzyme par voie systémique et orale. Au final, le but sera d'identifier et d'isoler les meilleurs composés. Les résultats constitueront un ensemble de données qui alimenteront le dossier préclinique réglementaire en vue d'obtenir les autorisations pour réaliser les essais cliniques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples et d’une très grande valeur pour le développement pharmaceutique envisagé. Cibler le mode d’action de l’enzyme d’intérêt n’a jamais été réalisé dans le panorama scientifique et pharmaceutique. A terme ces composés pourront servir à réaliser des essais cliniques humains dans des indications médicales comme certaines neuropathies, pour espérer apporter de nouveaux traitements dans des maladies présentant de forts besoins médicaux insatisfaits. Ainsi, les résultats du projet alimenteront la base de connaissances scientifiques et renseigneront sur les effets pharmacologiques et potentiellement toxiques de la voie de signalisation ciblée. L’ensemble des travaux proposés alimenteront le dossier à soumettre aux agences réglementaires en vue d’obtenir les autorisations d’essais cliniques. Ce projet permettra également de développer les compétences des équipes sur la recherche pharmaceutique qui pourront largement être mises à profit pour de futurs projets et pour la diffusion des connaissances.
Procédures
Les souris vigiles recevront des manipulations de "classe légère", comme des contentions (30 à 45 secondes, 3 à 4 fois maximum, sur une période de 24 heures) et des procédures équivalentes à une piqûre (15-30 secondes, un maximum de 3, sur une période de 24 heures). Pour les administrations en voie orale (une seule fois par animal), la contention et l'administration dureront au maximum 1minute par animal. Pour les manipulations classées sans réveil, les animaux recevront un analgésique, puis seront endormis par anesthésie générale (20 à 25 minutes, une seule et unique fois pour un animal). Nous veillerons à l’application des gestes corrects par le personnel qualifié pour limiter le stress des animaux et assister pendant toute la procédure à l'observation des animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Un de nos composés administré par voie systémique à des souris à des doses 4 fois supérieures à la dose efficace n’a présenté aucune toxicité apparente, ni à l’échelle macroscopique ni sur des paramètres anatomopathologiques. Ce résultat préliminaire important présage de l’absence ou du peu d'effets indésirables. De plus, nous savons que les données de la littérature entrevoient un profil de toxicité favorable pour nos inhibiteurs. Les animaux seront manipulés avec ou sans contention et seront soumis à des prélèvements de petits volumes sanguins, suffisants pour réaliser les analyses, mais n’entraînant pas de perturbations physiologiques. Ces manipulations représentent des douleurs de l’ordre d’une piqûre. Pour l'ensemble du projet, nous avons établi un score de suivi des animaux basé sur l'apparence physique, des signes cliniques et comportementaux pour contrôler nos procédures et limiter toute souffrance animale. Notamment, nous répertorierons toute anomalie liée au comportement (la tonicité et la réactivité), la posture (s’il y a isolement), l’alimentation, la température corporelle, les excrétions ; Et rapporterons le cas échéant, tout effet délétère au responsable du bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des mesures à prendre. En cas d'effet indésirable avéré, aucun animal ne sera laissé sans traitement palliatif, et si non applicable, sera immédiatement sorti du protocole.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’échantillons et d’organes afin de les analyser. Ces échantillons uniques et précieux permettront de réaliser les analyses microscopiques pour déterminer les effets de l’action des composés inhibiteurs et déterminer quels organes reçoivent ou non la molécule, ce qui permettra de réaliser la caractérisation à visée pharmacologique et réglementaire. L’euthanasie sera réalisée conformément aux méthodes recommandées par la réglementation et les comités d'éthique et de bien-être animal. Nous veillerons au contrôle des méthodes utilisées par le personnel formé et qualifié pour éviter toute souffrance animale.
Remplacement
Pour caractériser le devenir de nos composés inhibiteurs dans un organisme, le recours à l’expérimentation animale est obligatoirement requis par les agences réglementaires avant le passage à l’expérimentation clinique humaine. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris vivantes, sans aucune autre alternative. Toutefois, avant de proposer de tester nos composés inhibiteurs chez la souris, nous avons réalisé une multitude de tests in vitro, in cellulo et ex vivo pour traquer de potentiels effets toxiques et/ou indésirables. Jusqu’alors, nous avons analysé et confirmé que nos inhibiteurs n’engendrent aucun effet sur la prolifération et la survie cellulaire, le métabolisme énergétique, le métabolisme du calcium intracellulaire cardiaque. Nous avons également évalué la toxicité sur le développement de l’embryon de poisson zèbre par balnéation sans relever d’effet toxique notable. Avant de rédiger ce projet, nous avons veillé à mettre au point des méthodes robustes de détection et d’analyse sur des modèles non animaux. En somme, toutes ces préparations en amont permettent de drastiquement limiter les mises au point sur des échantillons issus de l’expérimentation animale.
Réduction
Nous avons déjà vérifié qu’un de nos composés ne provoque aucun dommage sur des neurones primaires de rétine jusqu’à dix fois la dose efficace. De plus, nous avons réalisé des expérimentations sur des lots très restreints d'animaux pour évaluer les potentiels effets délétères de nos composés sur le système nerveux ou plus généralement dans la circulation générale et n’avons relevé aucun effet dommageable. Le déroulé de ce projet, construit sur une séquentialité, permettra de bien choisir les doses minimales et maximales à utiliser et de révéler les organes cibles où les molécules s’accumulent : ces données sont prédictives des effets indésirables à anticiper et permettront de réduire de façon significative le nombre d’animaux. Nous avons défini des filtres décisionnels de sélection permettant d'étudier les composés inhibiteurs sur un faible nombre d’animaux de manière incrémentale et ainsi de rapidement réduire le nombre de composés à analyser et le nombre d'animaux. Ensuite, nous avons prévu d’arrêter chacune des procédures dès lors que les objectifs seraient atteints (par exemple, retenir 5 composés formulés ou non). Ceci permettra de facto de réduire le nombre d’animaux. Des tests statistiques sont prévus pour établir des corrélations clés, évaluer systématiquement la robustesse des résultats obtenus et interroger leur significativité. Ces tests permettront de contrôler la variabilité expérimentale, ce qui limitera drastiquement le nombre de répétition. En somme, ces analyses permettront de cerner des tendances ou valider des résultats sans recourir à un grand nombre d’animaux.
Raffinement
A réception, les souris seront stabulées une semaine dans leur habitat d’hébergement avant toute manipulation. Aucun animal ne sera jamais délaissé en isolement. De manière générale, pour pallier au manque de recul de l’effet de nos composés, les animaux traités seront suivis rigoureusement et quotidiennement pour traquer l’émergence d’effets indésirables potentiels. La méthodologie choisie permettra de détecter l’atteinte des « points limites » les plus précoces. Nous prévoyons de rapporter tout effet délétère au responsable de bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des orientations à suivre. Plus spécifiquement, notre stratégie de raffinement prévoit de rechercher l’émergence d’effets toxiques selon le suivi du comportement (agitation ou prostration), de l’apparence physique des animaux (clôture des yeux, aspect du pelage et du poil), et du suivi des signes cliniques (température corporelle, rythme respiratoire, poids corporel, état des fèces). De plus, nos travaux cadreront les fonctions rattachées aux organes à monitorer. Nous porterons alors une attention stricte aux fonctions biologiques liées à ces organes. Nous prévoyons qu’aucun animal présentant un signe de souffrance ne sera laissé sans traitement palliatif. Nous prévoyons une prise en charge des nuisances en apportant un complément à l’alimentation et à l’eau si nécessaire. Un animal recevant une injection sera désinfecté localement avec un antiseptique. Les manipulations plus invasives prévoient d’abord une analgésie, puis une anesthésie générale pour pallier à toute douleur potentielle.
Choix des espèces
La souris est un des modèles de petit animal de laboratoire utilisé pour étudier les caractéristiques pharmaceutiques in vivo pour des inhibiteurs de nature chimique. De plus, ce modèle est reconnu par les agences réglementaires de médicaments pour constituer les preuves pharmaceutiques et scientifiques en vue d'obtenir les autorisations d'essais cliniques. Puisque l’application de nos composés inhibiteurs est prévue pour des adultes, ce projet prévoit donc d’utiliser des souris mâles et femelles adultes, ce qui permet de réaliser l’étude alors que le contexte hormonal adulte est déclenché. Nous n'avons pas trouvé d'alternative de remplacement.
Etude des conséquences d’un déficit local d’expression de gènes sur l’activité cérébrale chez la souris par imagerie ultrasonore fonctionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau de vecteurs viraux bloquant l'expression de gènes associés au syndrome de Rett et à une encéphalopathie épileptique, puis une séance d'imagerie ultrasonore sous anesthésie, le blocage pouvant provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs. Le porteur indique s'attendre à des troubles légers du fait de la petite zone ciblée, et met à mort tous les animaux à la fin. Il affirme que la complexité de ces maladies ne peut être reproduite in vitro et exige un travail chez l'animal vivant.
Objectifs
Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont généralement des pathologies très sévères et handicapantes et encore mal comprises. Mieux comprendre les symptômes fonctionnels observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur les pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett ou l’encéphalopathie épileptique précoce de type 4. Ces maladies, respectivement provoquées par une perte de fonction des gènes MECP2 ou STXBP1, se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (troubles cognitifs, moteurs, troubles respiratoires ou épilepsies). De manière globale, les traitements existants pour les maladies orphelines neurologiques d’origine génétique sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier l’impact d’un blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris, par injection de vecteurs viraux adéno-associé (AAV) contenant des petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) spécifiques des gènes d’intérêt, sur l’activité cérébrale in vivo mesurée par imagerie fonctionnelle ultrasonore à haute résolution. Etablir des profils d’altérations fonctionnelles in vivo pour ces gènes d’intérêt permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces maladies et constituera une base d’évaluation pour de futurs candidats-médicaments.
Bénéfices attendus
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs.
Procédures
Les 60 animaux effectueront une procédure comprenant 2 interventions majeures : 1) Injections stéréotaxiques dont l’objectif est la mise en place du modèle de blocage de l’expression du gène (durée : 1 heure) • Réalisées sous anesthésie générale et analgésie • Sur la totalité des animaux décrits dans cette demande de projet • Chaque animal subira de manière bilatérale, une injection stéréotaxique dans le cortex d’un vecteur AAV contenant des shRNA permettant le blocage de l’expression d’un gène • Aucune autre intervention ne sera effectuée jusqu’à la session d’imagerie, trois semaines plus tard. 2) Imagerie fUS dont l’objectif est la visualisation des atteintes fonctionnelles de l’activité cérébrale dues au blocage des gènes (durée : 1 heure) • L’imagerie fUS sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane et médétomidine) ; la préparation du protocole d’anesthésie optimisé pour l’imagerie cérébrale dure environ 35 minutes • La session d’imagerie comportera une mesure de 15 minutes de l’état cérébral basal puis de 7 minutes de l’état cérébral sous stimulation du système visuel • Sur la totalité des animaux décrits dans la demande
Impact sur les animaux
Le blocage de l’expression des gènes d’intérêt sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que sur une petite zone du cerveau, nous prévoyons des troubles légers, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires sur ces gènes (pour le gène MECP2, des atteintes transitoires des réflexes sensori-moteurs ont été décrites chez le jeune rat après injection de shRNA intraventriculaire, et des troubles de la mémoire et des interactions sociale chez la souris après inactivation locale du gène dans l’amygdale ; pour le gène STXBP1, des épisodes d’épilepsies d’absence ont été décrites chez la souris après inactivation spécifique du gène dans la voie corticostriatale). L’injection stéréotaxique des vecteurs sera réalisée dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie (buprénorphine, et lidocaïne en local).
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort.
Remplacement
La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude. Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures.
Réduction
Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, un minimum de 8 animaux par condition est requis afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une taille d’effet de 7%, avec une variabilité de 5%, une puissance de 80% et un risque alpha de 5%. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie (si le succès de l’injection n’est pas confirmé en immunohistochimie post-mortem notamment). Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués.
Raffinement
L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est une espèce pour laquelle on dispose de données dans la littérature concernant l’impact comportemental d’une inactivation des gènes MECP2 et STXBP1, ce qui permettra une comparaison avec nos données d’imagerie. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. De précédentes études utilisant ce type d’approche par inactivation locale des gènes MECP2 et STXBP1 ont obtenu des symptômes similaires à la pathologie humaine chez des souris adultes, nous utiliserons donc également des souris adultes.
Traitement des cancers des voies biliaires métastatiques par anticorps
- Recherche appliquée
- Cancers
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent en intraveineuse des cellules de cholangiocarcinome humain puis jusqu'à treize injections d'un anticorps, les métastases pulmonaires attendues induisant une détresse respiratoire et une dégradation de leur état. Le porteur indique mettre à mort les animaux pour prélever des organes à des fins d'analyse. Il affirme que son approche "nécessite" une validation sur "animal entier" avant toute transposition chez l'humain.
Objectifs
Le cancer du foie est la 3ème cause de mort par cancer dans le monde et le cholangiocarcinome (CCA) est le 2ème cancer primaire du foie le plus fréquent. Ce cancer des voies biliaires est une forme de cancer hautement métastatique, de mauvais pronostic et avec une incidence croissante. La résection chirurgicale est le seul traitement curatif bien que seuls 30 % des patients y sont éligibles et que les récidives après la chirurgie sont fréquentes. Cependant, la maladie étant asymptomatique en stade précoce, la grande majorité des patients atteints de CCA sont diagnostiqués à un stade avancé et/ou métastatique. Les poumons, le foie ainsi que les os sont les sites préférentiels métastatiques. Pour ces patients, les options thérapeutiques sont limitées aux chimiothérapies et soins palliatifs, des traitements insatisfaisants avec une efficacité limitée et de nombreux effets secondaires. Ainsi, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer l’état de santé de ces patients. Dans ce contexte, l’utilisation de modèles précliniques in vivo représente une approche cliniquement pertinente permettant de récapituler les métastases ainsi que d’évaluer le potentiel anti-métastatique de nouvelles thérapies. Dans notre laboratoire, nous avons développé un anticorps dirigé contre une protéine de la membrane des cellules. Il a été démontré que cette protéine est impliquée dans le développement du cancer, la croissance tumorale, ainsi que dans les processus d’invasion et de dissémination des cellules tumorales. Ainsi, cette protéine dans les CCA entraîne l’aggravation de la maladie par une progression tumorale rapide. Par conséquent, cette thérapie ciblée contre cette protéine apparait comme une solution pour le traitement du CCA, notamment pour les formes métastatiques. Afin d’évaluer l’effet de cet anticorps, l’utilisation de modèles animaux se révèle donc cliniquement pertinente et nécessaire.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l’efficacité de notre anticorps sur la dissémination des cellules tumorales, ainsi que sur la formation et le traitement de métastases dans les cas de CCA. Cette approche thérapeutique innovante pourrait permettre le développement clinique de notre anticorps afin de bénéficier aux patients sans options thérapeutiques satisfaisantes.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux recevront une injection intraveineuse de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse. La moitié des animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anticorps avant l’injection des cellules cancéreuses, puis 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum, soit 13 injections maximum. L’autre moitié des animaux recevront d’abord une injection de cellules cancéreuses puis l’anticorps sera injecté en intrapéritonéal 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum, soit 10 injections maximum. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Les injections intraveineuses et intrapéritonéales prennent moins d’une minute à être réalisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont imputables aux cellules tumorales injectées qui vont former des métastases, notamment au niveau des poumons. Ces métastases vont de fait induire une détresse respiratoire et une dégradation de l’état de santé des animaux.
Devenir
Les animaux en expérimentation seront mis à mort afin de récupérer certains organes pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre approche thérapeutique nécessite une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’activité notre anticorps. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori grâce à un logiciel d’analyse statistique. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort (gel ophtalmique évitant la sécheresse des yeux) sont appliquées lors de l’injection des cellules cancéreuses. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation approfondie est réalisée 2 fois par semaine.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines formant des métastases afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche utilisée permet une prise de greffe efficace des cellules humaines et le développement de métastases. Les animaux seront utilisés à un stade adulte de 8 à 10 semaines. Les adultes devraient mieux supporter les cellules tumorales métastatiques, notamment pulmonaires, de par leur développement plus avancé et leur plus grande capacité respiratoire.
Mise en place de modèles de lymphomes, de cancer du sein et des LAM (leucémie aigue myéloïde), et caractérisation de thérapies ciblées dans ces modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 135 d'entre elles en gravité sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, dans le sang ou en intra-lymphatique, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés et des séances d'imagerie, pour créer des modèles de lymphomes, de cancer du sein et de leucémie aiguë et tester des thérapies ciblées. Le porteur indique que la dissémination tumorale peut provoquer une perte de poids et fixe un point limite quand la masse tumorale dépasse un certain volume. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine, seul l'animal permettant selon lui d'appréhender la tumeur et son microenvironnement.
Objectifs
Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les cellules du système immunitaire qui, même si au départ du développement tumoral sont anti-tumoral, peuvent devenir pro-tumorales ou être désactivées. Parmi ces cellules immunitaires, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Nous cherchons à activer les LT et désactiver les macrophages associés aux tumeurs (TAM). Le rôle des LT qui sont cytotoxiques, est en effet d’éliminer la tumeur. Cependant, ils peuvent être inhibés par les cellules tumorales et les différentes cellules du MET au niveau par exemple des « immune checkpoints » (ICP). Le but est alors de lever cette inhibition avec des anticorps ou des molécules qui ciblent ces ICP. Les macrophages au sein de la tumeur sont sensés au départ éliminer les cellules tumorales par phagocytose par exemple, cependant, à un certain stade de la tumeur ils reçoivent des signaux les transformant en macrophages pro-tumoraux. Le but est alors d’inhiber la fonction de ces TAM. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM.
Bénéfices attendus
L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral , d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement.
Procédures
Procedure n°1: après anesthésie, injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée (SC) . La prise tumorale sera ainsi évaluée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins en rétro-orbital (50μl) seront réalisés au moment de l'injection (T0) et à différents temps pendant la durée de l'expérimentation (J10, 15, 20, 30). Ces prélèvements seront faits sous anesthésie gazeuse et nous alternerons l’oeil prélevé. Afin de visualiser les anticorps thérapeutiques monoclonaux, l’injection se fera par voie IP. L’efficacité thérapeutique sera évaluée par mesure au pied à coulisse de la tumeur ainsi que par imagerie à l’IVIS (pendant 3 min). Procédure n°2: Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. Procédure n°3: l’anticorps anti-TAM couplé à une molécule fluorescente ou à une drogue ou couplé à des nanoparticules, sera injecté seul ou en combinaison avec un anti-PD1 à des souris xénogréffées. Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC ou en orthotopique. La tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins seront faits de la manière que la procédure 1. Procédure n°4: Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC dans le flanc, en intra-veineuse (IV) dans la veine caudale ou en intra-lymphatique (IL) dans le talon . Afin d’évaluer in vivo l’effet indirect des ACM anti-CD20, les cellules immunitaires de type NK ou lymphocytes T préalablement marquées avec des sondes fluorescentes afin de les visualiser à l’IVIS, seront injectées en IV . Les ACM, également préalablement marqués, seront quant à eux injectés en IP comme indiqué dans la procédure 1. la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine et les souris seront pesées 2 fois/ semaine. des prélèvements sanguins seront effectués comme dans la procédure 1. Procédure 5: injection en IV, IP, SC ou intramusculaire d'une molécule à T0 puis les souris sont observées et pesées pendant 5 semaines tosu les 3 jours.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante mais les animaux seront sacrifiés avant que la tumeur ne soit trop grosse, l'injection en intra-veineux sera la dissémination tumorale très importante partout pouvant induire perte de poids. Les prélevents de sang et l'analyse de la fluorescence par imagerie se feront sous anesthésie et peuvent engendrer un stress due à l'anesthésie. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveuineux peut engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.
Remplacement
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 5 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Nous utilisons les tests statistiques adéquats en fonction des conditions variables d'expérimentation (t-test ou Wilcoxon ou Mann Withney).
Raffinement
Concernant les mesures de raffinement, les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd du poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1600-1800 mm3) ou si la tumeur est nécrosée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.
Rôle de Rdh10 dans le contrôle des fonctions du système nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être déficientes en vitamine A active, elles subissent une série de tests comportementaux moteurs et cognitifs, des examens de la rétine sous anesthésie et des injections répétées d'un marqueur, avant une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur indique vouloir caractériser les conséquences de cette déficience sur le système nerveux et la vision. Il affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et reste "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui la diversité des mécanismes in vivo.
Objectifs
La vitamine A et ses formes actives jouent des rôles très importants au cours du développement et dans la physiologie de divers organes. Ces molécules sont les ligands de certains récepteurs nucléaires qui contrôlent l’expression de gènes. Si les fonctions développementales de la vitamine A et de ses récepteurs sont bien caractérisées, les fonctions aux stades adultes restent encore mal connues. Ceci s’explique par le fait que des modèles murins génétiquement modifiés pour étudier la fonction de la vitamine A ne sont pas compatibles avec la survie de l’embryon. La solution trouvée pour palier à ce problème a été de produire un modèle murin génétiquement modifié, déficient en certaines formes actives de la vitamine A, mais supplémenté en celles-ci via l’alimentation maternelle, afin d’obtenir des embryons viables. Ces mutants ainsi obtenus pourront être analysés à l’âge adulte pour caractériser les défauts fonctionnels résultant d’une déficience en vitamine A. L’objectif de ce projet est de caractériser les conséquences liées à un déficit de la forme active de vitamine A : (1) au niveau du système nerveux central, en effectuant un ensemble de tests comportementaux pour analyser les fonctions motrices et cognitives ; (2) au niveau de la vision (les déficits visuels étant la première caractéristique de la déficience en vitamine A chez l’humain) par des analyses des performances visuelles; (3) après complétion des tests, les cerveaux des animaux seront utilisés pour des analyses moléculaires supplémentaires afin de déterminer si le déficit en vitamine A affecte la prolifération cellulaire, et d’analyser ses gènes cibles potentiels.
Bénéfices attendus
Des déficiences dans le métabolisme de la vitamine A se caractérisent chez l’Homme par des troubles de la vision. La vitamine A est obtenue dans l’organisme sous forme bioactive par une enzyme spécifique. Ces formes bioactives de la vitamine A sont ensuite capables de se lier à différents récepteurs pour réguler l’expression de gènes. Différents modèles murins spécifiquement mutants pour ces récepteurs ont été conçus mais ceux-ci ne permettent pas d’étudier les conséquences d’une déficience en vitamine A, contrairement à notre nouveau modèle murin. Celui-ci est déficient en l’enzyme spécifique permettant d’obtenir la vitamine A, privant l’animal de la forme bioactive de la vitamine A. Ainsi, grâce à des études comportementales et visuelles et des analyses moléculaires, les conséquences de cette déficience seront comparées aux différents modèles murins mutés pour les récepteurs de la vitamine A. Ce projet permettra pour la première fois de décrire précisément les conséquences comportementales et visuelles de souris déficientes en formes actives de la vitamine A. Des mutations de certains récepteurs de la vitamine A, avaient déjà été décrites chez l’Humain mais pas entièrement caractérisées, d’où l’intérêt de ce projet pour compléter les connaissances déjà acquises jusqu’ici. Des influences environnementales, notamment nutritionnelles, vont vraisemblablement impacter la santé des individus atteints. C’est pourquoi il est important de disposer de modèles mammifères permettant de reproduire ces anomalies, afin d’en tirer les bénéfices applicables à la santé humaine par la suite. En effet, ils permettent de caractériser les conséquences fonctionnelles et pathologiques, et de les traiter par des stratégies (nutritionnelles, pharmacologiques …) pouvant aussi être mises en œuvre chez les patients humains.
Procédures
Ici, nous voulons étudier les conséquences de la déficience en vitamine A sur le cerveau et les fonctions visuelles. Pour cela, nous réaliserons divers tests comportementaux cognitifs et moteurs sur l’ensemble des animaux utilisés ici (n=24, 12 contrôles ; 12 mutants). Ensuite, la moitié des animaux (n=12) recevront une anesthésie générale par voie respiratoire (pendant 5min) afin de visualiser la rétine et ses potentiels défauts (par observation du fond de l’œil par exemple) chez le mutant. Une semaine après, une seconde expérience sous anesthésie générale par injection dans l’abdomen d’anesthésique et d’analgésique (5sec) sera réalisée pour évaluer la réactivité de la rétine à des flashs lumineux. Enfin, pour caractériser l’effet moléculaire de la déficience en vitamine A, nous procéderons à la mise à mort de l’animal pour ensuite prélever le cerveau et réaliser des analyses moléculaires. Pour déterminer l’effet cellulaire généré par la mutation de l’enzyme spécifique, nous injecterons un produit chimique dans l’abdomen de l’autre moitié des animaux (n=12) pour marquer les cellules en croissance 2 fois par jour (matin et soir) pendant 3 jours pour augmenter le signal du marquage. A l’issue de la dernière injection, les animaux seront anesthésiés généralement et recevront une perfusion intracardiaque afin de fixer les tissus et de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immuno-histochimiques. Aucun animal n’est maintenu en vie au cours de ces expériences car nous préleverons le cerveau pour réaliser des analyses moléculaires et immuno-histochimiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal pour les injections intra-péritonéales. En effet, les tests comportementaux à effectuer ne sont pas sujets à causer la moindre souffrance, et les analyses rétiniennes sont réalisées sous anesthésie générale sans endommager les yeux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les fonctions cérébrales. Il permet de même les investigations des fonctions visuelles dans le modèle le plus proche de l’Homme. En effet, la complexité biologique des signalisations par la voie rétinoïde ne permet par de remplacer les animaux par des modèles, par exemple cellulaires, parce qu’ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés, le nombre d'animaux utilisés (groupes de 12, 6 expérimentaux, 6 témoins) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues, chez des souris de fond génétique mixte à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes sera recherchée par application d’un test two-way ANOVA, suivi de tests post-hoc. Il a été vérifié préalablement que la distribution des valeurs est normale avec ce type de test. La seule variable incompressible est le nombre de femelles gestantes qui permettra d’obtenir, dans les portées, le nombre de mutants requis pour les procédures. Dans l’optique de réduction, un nombre limité d’accouplements
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, dans une plateforme phénotypique à la pointe de l’art (Institut Clinique de la Souris), effectuées en conditions standard sans aucune administration, par exemple, de composés pharmacologiques.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la vitamine A et les conséquences physiopathologiques de sa dysfonction, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain, des grandes fonctions physiologiques, de l’existence de tests fonctionnels validés pour ce modèle, et de la possibilité de mettre en œuvre des approches préventives (nutritionnelles) ou thérapeutiques qui pourront être ensuite transposées vers l’Humain. Chez l’humain les déficiences en vitamine A se caractérisent par des troubles de la vision. Afin de mieux caractériser le rôle de la vitamine A dans ces troubles, nous utiliserons des animaux adultes (10 semaines).
Endometriose : validation de modèles souris et évaluation de l’efficacité de candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Des souris donneuses reçoivent trois injections d'œstradiol puis sont tuées pour récupérer leur tissu utérin, dont les fragments sont injectés dans l'abdomen de souris receveuses, porteuses d'une mini-pompe implantée sous anesthésie qui diffuse de la substance P, censée entretenir l'inflammation, ou du sérum physiologique. 2 400 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang. Il s'agit de provoquer une forme profonde d'endométriose puis d'y tester des candidats médicaments, par voie veineuse, vaginale, abdominale, sous-cutanée ou par gavage, et le porteur s'attend à une douleur "persistante modérée ou sévère transitoire" et à une perte de poids d'environ 15 %. Avec 8 à 16 receveuses par groupe et une donneuse pour deux receveuses, il ne dit pas combien de molécules ni de groupes justifient un effectif de 2 400 souris.
Objectifs
L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.
Procédures
Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront implantés avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Par ailleurs, on comptera une souris donneuse pour deux souris receveuses.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi au moins deux fois par semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. Des mesures adaptées seront mises en place pour les animaux perdant du poids. En cas de perte de poids constatée supérieure à 10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude sur ce modèle. Elle sert à évaluer la douleur et le comportement des animaux.
Choix des espèces
- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.
Système rénal
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 1000
1000 souris et 1000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un millier d'entre eux réutilisés et les autres tués à l'issue. Ils subissent selon les cas une ligature d'un uretère, l'ablation des deux tiers puis de la totalité d'un rein ou des protocoles de diurèse, avec des prélèvements sanguins et une insuffisance rénale attendue, pour tester des candidats médicaments de firmes pharmaceutiques. Le porteur indique que les animaux des procédures chirurgicales sont euthanasiés pour prélever les reins, ceux d'une procédure pouvant être gardés vivants sauf si un prélèvement incompatible avec la survie est requis. Il reconnaît que des cultures cellulaires apportent des données préliminaires mais affirme qu'elles ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'environnement immunologique intact.
Objectifs
Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabète ou d’hypertension artérielle entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale chronique. L’insuffisance rénale aiguë, qu’elle soit par exemple d’origine obstructive (obstruction des voies urinaires dont la cause peut-être la présence de calculs ou d’un adénome prostatique) ou toxique (intoxication médicamenteuse), est également une situation clinique fréquente. Si elle n’est pas prise en charge, une insuffisance aiguë peut rapidement évaluer en insuffisance chronique. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales chroniques, aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. L’insuffisance rénale chronique est un enjeu majeur en santé publique. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Elle se caractérise par une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à la destruction progressive du parenchyme rénal. L’insuffisance rénale peut rapidement détériorer l’état de santé des patients (exemples : anémie, fatigue, confusion mentale, troubles psychiques, hypertension, troubles du rythme cardiaque) ou mettre en jeu le pronostic vital (exemples : œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral, les infarctus du myocarde). Comprendre et lutter contre le développement de l’insuffisance rénale et de l’apparition de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments, ou de s'assurer qu'ils ne modifient pas la fonction rénale ou n'induisent pas eux-mêmes une insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'insuffisance renale aiguë ou chronique. Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter la fibrose rénale. Jusqu’à présent, la dialyse ou la greffe restent les seules stratégies appropriées.
Procédures
Dans les procédures chez la souris (fibrose par ligature d’un uretère, diurèse), un prélèvement sanguin terminal (sans réveil) sous anesthésie gazeuse (isoflurane) peut être réalisé. Dans les procédures chez le rat, un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (isoflurane) est réalisé juste avant l'euthanasie. Selon les besoins de l'étude (rat/souris), des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans ce cas, le volume prélevé sera inférieur ou égal à 15% de la volémie sanguine et ne sera répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure de ligature d’un uretère, une phase de chirurgie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés (isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Un uretère est ligaturé. Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récupération post-chirurgicale, les animaux reçoivent un antalgique. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la ligature de l’uretère. Dans la procédure de 5/6 néphrectomie, deux phases de chirurgie sont nécessaires. Pour chaque phase (espacée d’une semaine), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une petite laparotomie latérale est pratiquée en condition d'asepsie. Dans la première phase, le rein gauche est exposé et les 2/3 du rein sont excisés. Dans la seconde phase, le rein droit est entièrement excisé. Après chaque phase de chirurgie, les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la 5/6 néphrectomie. Dans les 3 procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude. Le traitement est généralement effectué en une occasion (procédure de diurèse) ou pendant plusieurs semaines (4 ou 12 semaines maximum après la ligature d’un uretère ou la 5/6 néphrectomie).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédures, il est attendu une insuffisance rénale. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (réduction de la masse rénale, ligature unilatérale d'un uretère), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Pendant les périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum), l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Après la procédure de ligature d'un l'uretère, la rétention de l'urine ou hydronéphrose peut être accompagnée de douleurs lombaires. Les stades d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde, observés chez l'homme à un stade avancé de l'insuffisance rénale nécessitant le plus souvent une greffe (d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ne sont pas atteints dans les procédures décrites dans ce projet (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.
Devenir
Dans la procédure 1, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang (et/ou un prélèvement d'organe) non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures 2 et 3, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur des modèles d’insuffisance rénale, des tests in vitro (exemple: culture cellulaire 3D de fibroblastes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (mort cellulaire, prolifération des fibroblastes, modification de la matrice extracellulaire), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 6-12 animaux par groupe selon la procédure (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système renal du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et et 6 mois, conformément aux données historiques.