Souris

1700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'acide hypochloreux dans la peau, cinq jours par semaine pendant six semaines, induisant une fibrose et des ulcérations cutanées, pour tester une thérapie cellulaire contre la sclérodermie. Elles sont toutes tuées en fin de procédure pour prélever les organes. Le porteur affirme que l'efficacité d'un tel traitement ne peut être évaluée sur les seuls modèles in vitro dans un contexte d'inflammation et de fibrose.

Objectifs

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune grave. Elle est caractérisée par une fibrose systémique, des anomalies vasculaires et une auto-immunité. Cette fibrose peut concerner d’autres organes que la peau, notamment le poumon qui représente une atteinte fréquente, sévère et mortelle de cette maladie systémique. Elle touche aussi les reins ou le cœur. Des thérapies basées sur les cellules stromales mésenchymateuses (ASC) sont en cours d'évaluation clinique et les résultats préliminaires sont encourageants. Nous avons récemment montré que les vésicules extracellulaires (VE) produites par ces cellules ont des effets biologiques comparables aux cellules parentales. Cependant, des données controversées existent sur la capacité thérapeutique des ASC isolées de patients et aucune étude in vivo dans un modèle proche de la pathologie humaine n’a été réalisée. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou des vésicules extracellulaires issues de patients sur la sclérodermie induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces approches de thérapie cellulaire chez l’animal ont une portée translationnelle avant leur utilisation en clinique chez des patients souffrant de sclérodermie et pour lesquels il n’existe aucun traitement disponible à ce jour. Les cellules sont déjà en cours d’évaluation en clinique et les vésicules extracellulaires pourraient être utilisées à moyen terme dans cette pathologie. Nos études in vitro ont identifié des molécules qui pourraient jouer un rôle dans l’effet thérapeutique des cellules. Si elles confirment leur intérêt in vivo, nous pourrions valider un nouveau médicament plus efficace que les cellules en cours d’évaluation clinique. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de la sclérodermie qui est une maladie mortelle. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux recoivent des injections d’acide hypochloreux (HOCl) en intra-dermique (5 jours/semaine pendant 6 semaines) et une injection intraveineuse du traitement 1 fois à J21. L’épaisseur de la peau est mesurée au site d’injection avec un caliper toutes les semaines pour évaluer la fibrose cutanée. Ces mesures permettent d’avoir un suivi clinique de la pathologie.

Impact sur les animaux

Les cellules stromales mésenchymateuses et leurs vésicules extracellulaires ont été déjà validées pour leur rôle thérapeutique dans ce modèle de sclérodermie avec un bénéfice associé au traitement. Les injections répétées d’HOCl peuvent générer un inconfort des souris mais elles ne montrent plus de signes d’inconfort après quelques jours de manipulation quotidienne. L’injection quotidienne d’HOCl prend moins d’1 min sans anesthésie. Le modèle peut provoquer des ulcérations cutanées mais qui sont améliorées par le traitement. Le suivi des ulcères est réalisé au quotidien et les injections de HOCl sont suspendues le temps de la cicatrisation.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (prélèvements d’organes et histologie).

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou de leurs vésicules extracellulaires dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte in vivo comportant de l’inflammation, de la fibrose et du remodelage tissulaire qui sont observés au niveau cutané et pulmonaire.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et avons calculé que l’inclusion de 8 souris par groupe expérimental permet d’obtenir des valeurs significatives pour au moins deux marqueurs importants de la maladie.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées tous les jours pour vérifier l’apparition potentielle d’ulcères et l’absence d’infections. Si un ulcère apparait, le comportement des souris est particulièrement observé pour s’assurer que d’autres signes de souffrance n’apparaissent. L’injection intraveineuse des traitements est une procédure très rapide qui ne génère qu’un léger stress lié à la manipulation des souris pendant moins d’une minute

Choix des espèces

Le modèle murin de sclérodermie systémique a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de sclérodermie. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 semaines, à maturité sexuelle. Les études de mise en place du modèle ont montré une incidence à 100% de la sclérodermie.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections rétro-orbitaires reproduisant un purpura thrombotique, avec perte de poids attendue, puis subissent des prélèvements sanguins avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever sang et organes. Le porteur indique développer en parallèle des modèles cellulaires à partir de plasma humain. Il affirme néanmoins que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées.

Objectifs

Le purpura thrombotique thrombocytopénique acquis (PTT) est une maladie rare et grave, touchant le plus souvent l’adulte jeune. Les manifestations de cette pathologie sont une baisse du nombre de plaquettes, une anémie hémolytique, et une souffrance brutale d'un ou plusieurs organes. Cette pathologie est souvent chronique, évoluant sur un mode de poussées entrecoupées de rémissions. Malgré la prise en charge actuelle (échanges plasmatiques, anticorps thérapeutiques), 20% des patients décèdent. Cette maladie est secondaire à un déficit en une enzyme (ADAMTS13), qui est l’enzyme physiologiquement responsable du clivage de grands assemblages protéiques de facteur de Von Willebrand » (VWF). Ce sont sur ces « filaments collants », qui ne peuvent pas être coupés par l’ADAMTS13 déficitaire, que les plaquettes circulantes viennent s’agréger, obturant ainsi les petits vaisseaux. Les microthrombi ainsi créés empêchent les tissus en aval d’être perfusés en oxygène, générant ainsi des lésions ischémiques touchant notamment le cœur et les reins. L'anémie hémolytique microangiopathique comprend la fragmentation des globules rouges causée par une lésion microvasculaire ainsi que par des dispositifs mécaniques. L’anémie hémolytique mécanique a pour conséquence une élévation des concentrations d’hème dans les plasmas de patients PTT. L'hème est un cofacteur essentiel de l'hémoglobine présente normalement dans les globules rouges. Une concentration élevée d’hème libre dans la circulation est connue pour avoir une cytotoxicité élevée et provoquer des dysfonctions rénales Récemment, il a été montré qu’AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) protégeait de la dysfonction rénale induite par l’hème dans un modèle murin de paludisme. AhR est un facteur de transcription activé par la fixation de ligand. Il est notamment connu pour son rôle dans la détoxification de ligands environnementaux. L’implication de ligands endogènes dans l’activation d’AhR a montré qu’il joue un rôle dans le contrôle de nombreuses fonctions physiologiques telles que le développement, le cycle cellulaire et la réponse immuno-inflammatoire. Parmi les nouveaux ligands identifiés, des métabolites de l’hème (bilirubine et biliverdine) sont des agonistes d’AhR.

Bénéfices attendus

Ces modèles animaux sont des outils importants pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant un PTT.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 injections rétro-orbitaires (J0, J1, J2) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Ces injections seront espacées de 24h et le volume injecté sera inférieur à 100 µL. Il seront soumis à 2 prélèvements sanguins ((J0 et J3) par ponction de la veine mandibulaire (50 µl) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). A J6, ils recevront une injection en sous cutané d'un analgésique (buprénorphine 0.1 mg/kg) 30 min avant le prélèvements cardiaque sous anesthésie générale (sevoflurane 5%) puis ils seront euthanasiés par dilocation cervicale. Les injections et les prélèvements sanguins durerons quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au modèle d'induction du PTT par injection de vWF. Chez ces souris, nous nous attendons à oberver une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 seront gardés en vie et utilisés dans la procédures n°2. Ils seront tous euthanasiés, a lissue de la procédure 2 par dislocation cervicale, sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Il est nécessaire d'euthanasier ces animaux afin de prélever le sang et les différents organes et d'anaylser le rôle d'AhR sur la sévérité du PTT par rapport à des critères biologiques, histologiques et d'expression génique.

Remplacement

A chaque fois que cela sera possible, des modèles in vitro seront développés. Des modèles cellulaires et des plasmas humains provenant de sujets atteints de PTT seront utilisés pour décrire les mécanismes cellulaires qui sont modifiés au cours de la maladie. Les procédures auront un caractère de stricte nécessité et ne pourront pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d’information.

Réduction

Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Au cours du design de ce projet, nous avons choisi le nombre minimal d’animaux par groupe. Le calcul d’effectif est déterminé a priori afin de garantir la puissance statistique des paramètres étudiés. Pour cela, nous avons utilisé le logiciel anastats disponible sur www. Anastats.fr. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du C2VN et des équipes qui collaborent avec l’unité sur la thématique du PTT.

Raffinement

les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. L’état moribond de l’animal et la mort seront évités en tant que point limite. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites et des mesures seront prises pour les soulager en se basant sur l'évaluation de l'état d'un animal (poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Au moyen d'une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), nous déterminerons un score et agirons en conséquence (analgésie voire arrêt de l’expérimentation par euthanasie de l’animal). Les animaux seront hébergés par groupes de 6 individus par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de matériaux de nidification de type « Nestlets ».

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le plus utilisé pour générer un KO. Les modèles de souris KO pour AhR et ADAMTS13 sont largement utilisés pour étudier le rôle précis de ces molécules et pour la deuxième lignée, d’étudier le PTT (purpura thrombotique thrombocytopénique). Ils sont déja disponibles à l'animalerie du CEFOS et à l'animalerie de la faculté de pharmacie. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 10 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle) soit révolue.

315 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne de trois à quatre heures pour implanter des électrodes, puis des tests de navigation vers une récompense pendant quinze jours, avant une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. La récompense passe par une stimulation électrique du cerveau ou, à défaut, par une restriction alimentaire limitant la perte de poids à 15 %. Le porteur affirme que la modélisation informatique et les invertébrés ne permettent pas d'étudier ce comportement complexe, la souris étant l'espèce la plus appropriée.

Objectifs

Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent des fonctions cognitives complexes telles que la navigation est un des enjeux majeurs de la recherche en neuroscience. L’objectif du projet est de comprendre comment les interneurones de la couche moléculaire (MLI) du cervelet postérieur (Crus I et/ou Lobule VI) contribuent à l'apprentissage de la navigation orienté vers la récompense. Des études réalisées à la fois chez l’Homme et chez la souris ont révélé une activité des lobules Crus I et VI lors de la réalisation d’une séquence de navigation orientée vers un but. Le système inhibiteur constitué par les MLI contrôle les cellules de Purkinje qui sont à l’origine des signaux de sortie du cervelet vers le reste du cerveau. Ces interneurones jouent donc un rôle clé dans le traitement cérébelleux mais à ce jour leur rôle dans l’apprentissage de la navigation spatiale n’est pas connu.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le rôle des interneurones dans le traitement cérébelleux lors d’une tâche de navigation spatiale. Il contribuera ainsi à appréhender le fonctionnement du cerveau en conditions normales et par conséquent aidera à mieux cibler les altérations qui se présentent en conditions pathologiques (Maladie d’Alzheimer, Dyspraxie, Désorientation topographique…).

Procédures

Un groupe de 15 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (3h) -Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) - Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 150 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Injection de l'agent l'inhibiteur via microcanule à l’état vigile (5min) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) - Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 75 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) - Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 75 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) - Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min)

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie peuvent être à l'origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20% de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h qui sera pallié par les analgésiques. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seule une chirurgie stéréotaxique permet de cibler spécifiquement des sous régions cérébrales (placement d’électrodes, injection virus, injection d’inhibiteurs). En post-chirurgie les animaux seront isolés pour éviter la dégradation des implants entre congénres mais un jouet d’exploration sera ajouté dans la cage pour améliorer l’enrichissement. L’injection de muscimol via la micro canule n’est pas douloureuse en soi mais elle nécessite l’immobilisation de l’animal pendant environ 1 min. Les souris sont habituées progressivement à cette contention dans un linge avant le début de la procédure et ne présentent donc aucun signe d’inconfort lors de cette manipulation. De par sa nature, notre projet nécessite de réaliser des tests de comportement, néanmoins au cours des tests les animaux sont libres de leurs mouvements pour explorer l’environnement et trouver la récompense. Les tests de comportements pour être reproductibles nécessitent un environnement calme et des souris non stressées. Les expérimentateurs portent une attention particulière à habituer progressivement les animaux à la manipulation ainsi qu’aux différents environnements dans lesquels seront réalisés les tests. La fixation du câble sur l’implant crânien est conçue pour ne pas perturber l’animal dans ses mouvements, lui permettant ainsi d’explorer librement l’environnement à la recherche de la récompense. L’animal sera récompensé préférentiellement par stimulation intracrânienne du circuit de la récompense (MFB) dans le cas où cela ne serait pas possible il sera récompensé par de la nourriture. Cette deuxième option nécessitera la mise en place d’une restriction alimentaire indispensable pour motiver les souris à chercher la récompense (croquette) et ainsi à apprendre la tâche. Néanmoins cette restriction ne dure que quelques jours et la perte de poids est limitée à 15% du poids initial. Pendant le weekend end, les souris ont de la nourriture ad libitum leur permettant de retrouver leur poids initial.

Devenir

Le prélèvement et l’analyse des cerveaux post-mortem sont indispensables à la validation des procédures. Cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par perfusion intracardiaque.

Remplacement

La modélisation permet d’apporter des informations sur le fonctionnement et les opérations faites par le cerveau mais nécessite des données cellulaires et comportementales. La modélisation ne nous permet pas d’étudier le rôle des interneurones du cervelet dans l’apprentissage d’une tâche de navigation orientée vers une récompense. Les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'étude des comportements complexes ; la souris est donc l'espèce la plus appropriée pour ce type d'études.

Réduction

En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux et des analyses statistiques similaires à celles que nous utiliserons, nous estimons le nombre de souris par groupe à 20 souris. La taille des effectifs nécessaires par groupe a également été confirmée par un calcul de puissance (puissance = 80-90%, niveau de signification (alpha)= 0.05, taille de l'effet = moyen à fort)). Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble des 4 procédures, 315 souris seront nécessaires. Néanmoins la procédure 4 étant une alternative à la procédure 3, le nombre maximum de souris ne devrait donc pas excéder 240 animaux.

Raffinement

Les souris provenant d'un fournisseur extérieur ont un temps d'adaptation à la pièce d'hébergement de 5-7 jours. Afin de réduire au maximum le stress, les animaux sont habitués à être manipulés 5min par jour par l’expérimentateur avant le début du protocole expérimental. Pendant et après la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques pour diminuer la douleur. Les animaux sont placés dans des cages en communauté de 2 à 5. Les cages contiennent de la sciure, ainsi que du matériel pour la construction du nid (nid végétal) et des croquettes de nourriture à ronger. Lorsque la procédure nécessite l’isolement des animaux, un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ces cages sont fermées par une grille et ne sont donc pas hermétiques. Ainsi les informations visuelles, auditives et olfactives peuvent circuler entre les souris. Des points limites sont mis en place afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux. Ils seront suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (grille de scoring). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse couplée à des analgésiques. Avant les perfusions intracardiaques, les animaux reçoivent une injection intra-péritonéale d’analgésiques et une surdose d’anesthésique.

Choix des espèces

Le modèle murin est idéal pour répondre à notre question scientifique. En effet, il existe un grand nombre de lignées de souris transgéniques que nous pourrions utiliser dans le cadre de notre projet d’étude du rôle des interneurones dans la navigation spatiale. Dans ce projet nous utiliserons une lignée transgénique qui exprime l’enzyme Cre-recombinase spécifiquement dans les cellules qui expriment la Parvalbumine. L’utilisation de cette lignée permet d’inhiber spécifiquement les interneurones du cervelet. De plus, la souris est un animal explorateur pour lequel de très nombreux tests de comportement ont été développés ainsi tous les travaux antérieurs de l’équipe ont été réalisés chez la souris, notamment les travaux sur lesquels se basent nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Les tests comportementaux des différentes procédures devront donc être réalisés sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous commencerons donc les procédures 1 et 4 sur des souris âgées de 4 à 5 semaines. Au maximum les souris seront âgées de 5 mois à la fin de la procédure dans laquelle ils sont inclus.

2800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur patte puis une bithérapie anticancéreuse administrée, la croissance de la tumeur pouvant provoquer perte de poids et nécroses cutanées relevant du point limite. Les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever tumeurs, rate et ganglions. Le porteur affirme que la complexité du cancer ne peut être appréhendée in vitro et que la souris est la seule espèce disponible pour ces modèles.

Objectifs

Ces dix dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Dans certains cancers, les cellules tumorales sont capables d’inhiber certains mécanismes du système immunitaire. Par exemple, certaines cellules tumorales expriment la protéine PD-L1 qui est le ligand du récepteur PD-1 présent à la surface des lymphocytes T (LT) activés. Cette liaison, entre PD-1 et PD-L1, entraîne un épuisement des LT. L’une des approches de l’immunothérapie est d’empêcher l’épuisement des lymphocytes T en utilisant des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI). Ces inhibiteurs sont des anticorps monoclonaux dirigés, par exemple, contre PD-1 et PD-L1. Cet outil thérapeutique a montré des effets puissants et durables seulement sur un faible pourcentage de patients (20 à 25%). L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des LT au sein de la tumeur. Une des manières permettant de rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur est de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Ce processus implique de nombreuses molécules, notamment le VEGF qui en est l’inducteur principal. L’inhibition de l’angiogenèse favorise la réponse anti-tumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur et en augmentant l’infiltration immunitaire. La combinaison thérapeutique des ICI et des anti-angiogéniques est aujourd’hui approuvée dans plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée dans l’étude de cette bithérapie, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette combinaison est nécessaire pour mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. De ce fait, l’objectif de ce projet est d’identifier les acteurs de la réponse immunitaire après une bithérapie αPD-1 et αVEGFR-2. Nous avons montré que cette bithérapie améliore les réponses anti-tumorales dans deux modèles de cancers colorectaux : MC38 et CT26 et dans un modèle de cancer du pancréas KPC. Au regard de ces résultats, nous souhaitons comprendre comment la réponse immunitaire se met en place dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans plusieurs modèles pour déterminer les acteurs clés permettant d’améliorer l’efficacité des thérapies. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte sous anesthésie à l’isoflurane avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en IP (30 secondes). 1,3,7,10 et 14 jours après le premier traitement par αPD-1, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour le sacrifice). Par la suite, les tumeurs, ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. Pour y remédier, des croquettes seront mises à disposition directement dans la cage après observation de la perte de mobilité. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Ces nécroses seront prises en compte dans le score limite et pourra mener à la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendu. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation. De plus, diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (TC-1, MC38, KPC, LLC-1,) et les Balb/c (CT26, TS/A et 4T1). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un analogue de la vitamine D est appliqué sur leurs oreilles pour déclencher un eczéma avec rougeurs et croûtes, et certaines lignées reçoivent des injections répétées pour dépléter des cellules immunitaires. Elles sont mises à mort pour analyser la réponse immunitaire de la peau et des ganglions. Le porteur affirme que la complexité de la réaction immunitaire rend nécessaire le recours à l'expérimentation in vivo pour confirmer des résultats déjà obtenus in vitro.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d'autres affections telles que l'asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par du prurit et de l'eczéma, affecte 10% à 20% des enfants et 1% à 3% des adultes. Les patients présentent une inflammation de la peau avec notamment une infiltration de cellules immunitaires. Nous utilisons un modèle murin de dermatite atopique, générée par l'application d'un analogue à la vitamine D, le calcipotriol (MC903), directement sur la peau. La dermatite atopique générée dans ce modèle est due à l'induction de la cytokine TSLP au niveau des kératinocytes de l'épiderme. Nous avons démontré que les cellules dendritiques activées par TSLP expriment OX40L et que cette molécule est impliqué dans l'induction de lymphocyte T régulateur (Treg) capable de limiter réponse inflammatoire causant l'eczéma (non publié). Dans ce projet, nous souhaitons poursuivre l'utilisation de ce modèle murin de dermatite atopique afin d'étudier plus particulièrement le rôle des cellules dendritiques exprimant OX40L induisant les Treg.

Bénéfices attendus

L'identification et la caractérisation d'une population de cellule dendritique capable d'induire des lymphocytes T régulateurs anti-inflammatoire permettant de limiter la réponse immunitaire de la peau permettrais de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi dans d'autres pathologies impliquant le systéme immunitaire (maladies autoimmunes, cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou autoimmunes, ou à l'inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.

Procédures

Une application d'un analogue de la vitamine D sera réalisé sous anesthésie légére au niveau des oreilles. Les souris seront traitées tous les deux jours pour un maximun de 6 traitements de 1 minute chacun (6 x 1 min = 6 min). Lors des traitements 5 et 6, les animaux développeront un eczéma localisé au niveau des oreilles, ce qui entrainera l'apparition de rougeur et d'éventuelles petites croutes. Afin de dépléter une population de cellule immunitaire, une lignée de souris sera soumise à deux injections une semaine avant de débuter la procédure d'application de l'analogue de la vitamine D. La déplétion sera ensuite maintenu lors du traitement avec l'analogue de la vitamine D via une injection au jour 0 puis au jour 5 du traitement avec l'analogue de la vitamine D. (4 injections au total d'une durée de 2 secondes chacune). Pour induire la délétion de notre gène d'intérêt, les animaux de la lignée concernée recevront une injection par jour pendant 5 jours. Des injections permettant de maintenir la délétion du gène d'intérêt seront ensuite effectuées tout les 3 jours pendant la procédure d'application de l'analogue de la vitamine D (9 injections d'une durée de 2 secondes chacune). Les sites d'injection seront alternés entre les différentes injections. Aucun prélévement sur animal vigile et aucune procédure chirurgicale ne sont prévues.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont un eczèma au niveau du site d'application de l'analogue de la vitamine D, à savoir les oreilles, qui pourront engendrer de légéres démangeaisons, rougeurs et formation de croute. Aucun effet secondaire notable n'est attendu suite aux injections.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux traités seront mis à mort à la fin du traitement pour analyser la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la peau.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées et 2 lignées de souris sauvages afin d'identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) serviront à l'analyse de l'expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d'effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le traitement au niveau de l'oreille droite des souris nous permettra d'utiliser l'oreille gauche en tant que contrôle non traité. (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traités ou non avec l'analogue de la vitamine D.)

Raffinement

L'application de l'analogue à la vitamine D sur les oreilles ne nécessite qu'une anesthésie légère. A partir du jour 9 jusqu'au jour 11 on observe un épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactive après stimulation, ou si des lésions au niveau des sites de traitement apparaissent, elle sera retirée de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Certaines lignées nécessiteront l'emploi d'injections. Les sites d'injections seront alternés et attentivement surveillés. En cas d'inflammation au niveau d'un site d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et bénéficiera de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et réseaux cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris est très proche de celui de l'Homme, de plus la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d'étudier le système immunitaire mature à l'âge adulte.

1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section chirurgicale du nerf vague puis, pour certaines, un régime gras induisant une stéatohépatite, avant des prélèvements post-mortem, pour étudier le lien entre foie, nerf vague et inflammation de la rétine. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ces chirurgies n'entraînent ni douleur ni détresse et un rétablissement complet, sur la foi de ses projets antérieurs. Il conclut que l'étude dans un "organisme entier" ne peut être reproduite sur cultures cellulaires.

Objectifs

Nous avons précédemment démontré comment l'inflammation pathogène est un moteur important de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Nos données préliminaires montrent que l'innervation vagale a un impact profond sur l’inflammation, et que des vagotomies expérimentales augmentent considérablement l'accumulation de macrophages pathogènes dans un modèle de DMLA. Une aggravation similaire des vagotomies est observée dans le modèle NASH et il a été démontré que l'innervation vagale contrôle le métabolisme hépatique, qui influence la libération de macrophages de la moelle osseuse et probablement du réservoir des monocytes spléniques. Dans l'ensemble, l'image d'un mécanisme de la voie anti-inflammatoire du nerf vague, relie le métabolisme hépatique et la régulation des populations de monocytes et macrophages. L’influence du foie, et en particulier de la NASH, sur l’état inflammatoire systémique et son impact sur une maladie inflammatoire comme la DMLA reste mal connue. Nous proposons d'analyser ces interactions en utilisant des approches chirurgicales et génétiques, des techniques de séquençage d'ARN en masse et unicellulaires. Notre projet aidera à déchiffrer les rôles joués par le foie, la moelle osseuse et la rate dans la voie anti-inflammatoire du nerf vague.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du nerf vague et du foie dans la réponse inflammatoire systémique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra d’établir des stratégies anti- inflammatoires qui pourront bénéficiées aux patients atteints de la DMLA et de NASH. De plus ce projet pourra éclaircir un rôle potentiel de la NASH dans la pathologie de la DMLA.

Procédures

Les souris seront soumises à des chirurgies : vagotomies cervicales gauche et des branches hépatiques du nerf vague ou des chirurgies sham (contrôles). Chaque souris subira une seule opération qui dure 15-20 min sous anesthésie et analgésie. Elles auront ensuite une période de récupération de 3 semaines. Ce type de chirurgie est bien connue de notre équipe ; les souris se rétablissent complètement et rapidement et on n'observe généralement ni douleur ni détresse. Les souris seront ensuite soumises à une diète standard ou à une diète riche en lipide induisant le Nash, qui n'induit pas de détresse particulière. Nous étudierons l’impact de ce régime sur 2 temps : un temps court (4 semaines) et un temps long (12 semaines). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal.

Impact sur les animaux

Avec ce projet les nuisances attendues sont celles des chirurgies. Ces chirurgies sont bien connues de notre équipe et on observe généralement un rétablissement complet et rapide sans douleur ni détresse particulière. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie (ce que nous n’avons jamais observé sur ce type de chirurgie dans nos projets passés ou en cours) l’animal sera sorti de l’étude. Le régime WD n’entraîne pas de douleur ou de détresse perceptible (pas de changement du comportement de la souris), seulement une prise de poids qui sera surveillée.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la variabilité entre les souris d'un même lot et en raison du nombre d'analyses différentes post-mortem (FACS, biologie moléculaire et histologie) pour lesquelles les techniques recquièrent l'intégralité des tissus. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 1080 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux sont identifiés par bagues numérotées. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de Xylazine. En prévention de la douleur, nous administrerons de la buprénorphine en sous cutanée. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique (LUBRITHAL) est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux qui ont subi une chirurgie sont observés quotidiennement avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. On observe généralement un rétablissement complet après les chirurgies sans douleur ou détresse particulière.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour le NASH et la vagotomie. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie.

25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois doses d'un peptide viral greffé à des nanoparticules d'or et subissent deux prélèvements sanguins rétro-orbitaux puis une ponction cardiaque terminale, pour évaluer l'effet-dose d'un candidat vaccin contre le SARS-CoV-2. Le porteur n'attend pas d'effet indésirable au-delà d'une surveillance accrue des doses élevées. Il affirme que la comparaison des réponses immunitaires ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

L’immunisation contre les antigènes majeurs du SARS-CoV-2 est la stratégie développée par les vaccins anti-COVID19 avec les plateformes mRNA et Adénovirus. L'effet attendu de la vaccination contre l’infection par les coronavirus y compris le SARS-CoV-2 est la montée d’une immunité adaptative protectrice chez l’individu vacciné qui est validée principalement par la présence d’anticorps dirigés contre la protéine S. La limitation de cette stratégie vaccinale est un risque de générer des mutations chez le virus pouvant le rendre résistant. Ceci peut s’avérer être le cas si la protection contre l’infection virale n’est pas optimale parmi certains groupes de population incluant les sujets ayant un système immunitaire moins efficace due à des désordres du métabolisme comme le diabète. Il est donc important de proposer une stratégie vaccinale alternative qui ciblerait plus particulièrement cette catégorie d’individus. La stratégie proposée ici repose sur la délivrance d'un peptide viral issu d'un antigène majeur du SARS-CoV-2 et greffés à des nanoparticules d’or dans la cellule immunocompétente afin d’initier une réponse humorale spécifique contre le pathogène. Une étude précédente nous a permis de sélectionner un peptide issu de la protéine S comme candidat vaccin en raison de son immunogénicité plus importante. L’étude qui sera réalisée permettra d’évaluer l’effet-dose de ce candidat vaccin sur la réponse humorale de souris et d'affiner le protocole de vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer l'effet-dose du candidat vaccin et d'affiner le protocole de cette nouvelle stratégie vaccinale.

Procédures

Chaque animal : - recevra 3 doses de 100 µl de peptides répartis en 2 points de 50 µl ; - sera soumis à 2 prélèvements sanguins rétro-orbitaux de 150 µl et 1 prélèvement sanguin par ponction cardiaque terminale pour prélever un volume maximal de sang. Les injections et les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et la ponction cardiaque terminale sera suivi d'une dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Lors d’un projet précédent, une dose d’environ 5 µg de peptides couplés aux nanoparticules a été injecté à plusieurs souris et aucun effet indésirable n’a été observé. En augmentant les doses injectées, des effets indésirables ne sont pas attendus mais une attention particulière sera portée aux souris recevant des doses d’antigènes supérieures à 5 µg.

Devenir

Les 25 souris du projet seront sacrifiées suite au dernier prélèvement par ponction cardique terminale.

Remplacement

La comparaison des réponses immunitaires induites par les différentes doses de vaccin ne peut se faire que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé grâce au logiciel GPower 3.1 en prenant en considération qu’une ANOVA serait réalisée sur les résultats obtenus avec une puissance de 0.8. Les résultats obtenus précédemment avec une dose de 5 µg de peptides conjugués aux nanoparticules ont permis de déterminer ce nombre, prenant en considération que la réponse immunitaire évolue de façon linéaire avec la dose de vaccin.

Raffinement

Toutes les injections d’antigènes et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale par du personnel expérimenté. Suite aux prélèvements rétro-orbitaux, de l’ocrygel sera appliqué sur les yeux des souris pour limiter tout risque d’irritation. Les souris seront observées et pesées régulièrement afin de suivre leur état de santé. Une attention particulère sera accordée aux groupes recevant des doses d’antigènes supérieures à 5 µg.

Choix des espèces

La lignée murine BALB/c sera utilisée car ces souris sont considérées comme bonnes répondeuses immunologiques suite à l’injection répétée d’un antigène considéré. Des souris de 6 semaines seront utilisées pour ce projet (animaux sevrés et système immunitaire mature)