Souris
Évaluation du potentiel anti-obésité d’un composé ciblant le récepteur à l’Acide gamma amino butyrique de type B (GABAB))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, reçoivent un composé par gavage oral et subissent des prélèvements sanguins lors de tests de tolérance au glucose, avant une mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur reconnaît un isolement en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire, compensé selon lui par le rapprochement des cages. Il teste un candidat médicament anti-obésité et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative" que l'animal, un modèle informatique étant selon lui impossible.
Objectifs
Contexte : Pour les autorités réglementaires, la prévention de l'obésité d'origine alimentaire chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. Nous allons utiliser un modèle d’obésité d’origine alimentaire, des souris seront rendues obèses par exposition à un régime riche en graisse (RRG), dans lequel les lipides représentent 60% de l’apport calorique, les animaux seront mis en contact avec cette alimentation pendant 12 semaines avant de débuter le traitement.
Bénéfices attendus
L’obésité est un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Actuellement, plus de 300 millions de personnes sont obèses et ce nombre ne cesse de s’accroître. Ces patients ont un risque accru de développer des pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et plusieurs types de cancers. Soigner l’obésité permettrait ainsi de réduire de manière significative l’incidence de toutes ces maladies associées. Malheureusement, les traitements existants à l’heure actuelle sont peu efficaces et les régimes hypocaloriques ne conduisent qu’à une perte de poids temporaire, suivie très fréquemment par un retour rapide au poids initial dès la fin du régime (phénomène dit de « yo-yo »). Seule une intervention chirurgicale associant une réduction de la taille de l’estomac et une déviation de l’intestin est à ce jour efficace à long terme pour traiter l’obésité. Cependant, les risques et effets secondaires liés à cette chirurgie en font un choix de dernier recours réservé aux cas d’obésité les plus graves. Nous manquons ainsi de traitements qui permettraient une prise en charge efficace de la majorité des patients obèses tout en limitant les contraintes et effets secondaires. Ce type d’étude permettrait de découvrir de nouvelles pistes de traitement pharmacologique.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront potentiellement réalisés lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, si le composé montre une efficacité à diminuer le poids corporel des animaux obèses. Les quantités de sang prélevées sont minimes et correspondent à moins de 1% du volume sanguin total. L'acte en lui-même n'est pas douloureux.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte pour nous permettre de pouvoir quantifier la consommation de nourriture, afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux lors des différents actes expérimentaux (gavage, RMN, test de tolérance …), nous allons habituer les animaux aux expérimentateurs et à l’acte lui-même quand cela sera possible (habituation au gavage une semaine avant le début du traitement). De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle thérapie pour lutter contre l’obésité, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale, le niveau de complexité d’une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que les nombreux mécanismes biologiques qui contrôlant la balance énergétique restent inconnus. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé́ en se basant sur notre expérience ultérieure et en utilisant un estimation mathématique adapté. Les résultats seront analysés en utilisant des tests statistiques appropriés.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 18 semaines (10 semaines de RRG chez l’éleveur). Ils seront manipulés pendant 2 semaines, une semaine d’habituation générale à la manipulation des animaux (mesure du poids corporel et de la prise alimentaire) et 1 semaine d’habituation à l’administration par gavage oral. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs et aux procédures qui seront pratiquées tout au long de l'étude. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et permettent de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris arriveront à l’âge de 18 semaines dans notre animalerie, et nous commencerons un traitement de 4 semaines à partir de l’âge de 20 semaines (deux semaines d’habituation). Nous allons étudier l’effet d’un composé sur des animaux obèses, pour cela nous avons besoin que les animaux soient en contact avec le RRG pendant un minimum de 12 semaines (début du RRG chez des animaux adultes et âgés de 8 semaines).
MISE AU POINT DE LA TECHNIQUE DE GREFFE DE CELLULES TUMORALES DANS LE PANCREAS (GREFFE ORTHOTOPIQUE PANCREATIQUE) ET DU SUIVI LONGITUDINAL PAR ECHOGRAPHIE
- Recherche appliquée
- Cancers
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules tumorales dans le pancréas durant jusqu'à une heure, un suivi par échographie sous anesthésie une à deux fois par semaine, puis un prélèvement de sang et de tumeur avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur fixe des points limites, une tumeur atteignant 2000 mm³ ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort, sans que ces seuils soient forcément atteints. Le projet vise à mettre au point une technique de greffe présentée comme "plus prédictive" que la greffe sous la peau, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reconstitue la tumeur et son environnement.
Objectifs
Le pancréas est un organe qui contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) qui représente 90-95% des cancers du pancréas, se développe dans le compartiment exocrine et est très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les prévisions suggèrent que le nombre de cas d’ACP et de décès associés à ce cancer seront multipliés par 2 d’ici 2030. Cette augmentation est associée non seulement au vieillissement des populations, mais aussi à l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du diabète dans le monde. Parmi les autres facteurs de risque pour ce cancer, on trouve le tabagisme, l’abus d’alcool et des prédispositions génétiques (
Bénéfices attendus
Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.
Procédures
-Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié -Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera de 30 min à 1 heure et sera réalisée une seule fois sur chaque animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée etc). -Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite à la chirurgie (7 à 10 j), à raison de 1-2 mesures échographiques par semaine (8 semaines maximum). La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. -Prélèvement de sang en fin d'étude, sur animal anesthésié et sans réveil consécutif, par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque. -Prélèvement terminal de tumeur : pour tous les animaux en fin d’étude, la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Tumeur pancréatique limitée à 2000 mm3 ; perte de poids limitée à 20% du poids maximal ; Signes cliniques rares : Abdomen gonflé ou apparition de métastases.
Devenir
Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…).
Remplacement
Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, permettant ainsi de se placer dans des conditions le plus proche possible de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.
Réduction
-Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. -Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons
Raffinement
- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. -Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. -La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : odes espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie oune anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie oune asepsie maintenue pendant toute la chirurgie -L’analgésie péri-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. -Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 à 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 2000 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. -Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen en cas d’apparition d’ascite.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Evaluation d’un traitement anti cancéreux chez la souris, par transfert de globules blancs modifiés pour sécréter des molécules thérapeutiques après détection in vivo de marqueurs tumoraux.
- Recherche appliquée
- Cancers
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, des injections et des prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser la tumeur, le sang et la rate. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'ulcérer et fixe ce point comme limite, et utilise des souris immunodéprimées pour qu'elles acceptent les cellules humaines. Le bénéfice attendu se réduit à une "preuve de concept" d'un système de globules blancs modifiés, et il affirme qu'on ne peut s'affranchir du modèle murin.
Objectifs
Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, car l’environnement tumorale diminue les fonctions des cellules immunitaires. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Une protéine sera ajoutée à la surface des globules blancs pour détecter des marqueurs tumoraux et cette détection conduira à la sécrétion localement des molécules médicaments par le globule blanc modifié. L'objectif de ce système est donc d'apporter une solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers en : 1) éliminant les cellules tumorales, 2) favorisant les réponses immunitaires anti-tumorales, et enfin 3) prévenant les rechutes grâce à la persistance des globules blancs modifiés et à leur réactivation en cas de nouvelles poussées de la maladie.
Bénéfices attendus
L’observation d’une diminution de la croissance tumorale dans notre projet, nous permettra d’obtenir une preuve de concept de notre circuit synthétique comme solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers.
Procédures
- Greffe sous anesthésie : Injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital sous anesthésie locale, toutes les deux semaines en prenant soin d’alterner l’œil prélevé (moins d'1 minute). -Injection IP (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Aucune douleur n’est attendue suite aux injections et prélèvements en ip et en iv sous anesthésie gazeuse et locale. De même, la pesée et la mesure des tumeurs ne devraient pas générer de douleur.
Devenir
A l'issue des procédure 1 à 3, les animaux seront mis à mort afin d'évaluer l'efficacité anti tumorale des cellules B modifiées en analysant la croissance tumorale ainsi que l’état d’activation du système immunitaire (cellules, cytokines, anticorps) dans le sang, la rate et la tumeur seront suivies.
Remplacement
Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. Après leur injection dans le sang, les cellules B modifiées, migrent efficacement et gagnent les organes périphériques secondaires où s’effectueront les étapes de maturation dépendantes de l’antigène : ganglions lymphatiques, rate... L’architecture et l’interaction avec d’autres composants cellulaires, au niveau du centre germinatif de ces organes, vont permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules productrices d’anticorps et en cellules mémoires. C’est alors in vivo que nous pourrons observer d’une part la circulation et l’activation de nos cellules B modifiées et par la suite l’effet anti tumoral de ces cellules.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. La greffe des différentes cellules tumorales sur une même souris a permis de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).
Raffinement
Les manipulations des souris NSG immunodéficientes seront effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de type II, ce qui leur permettent d’être dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Si un animal venait à se retrouver seul, une maisonnette en carton sera mise en place dans la cage. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie isoflurane afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des cellules B reprogrammées et des lymphocytes T CD4+ par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie isoflurane avec au préalable une anesthésie locale. Les prélèvements sanguins au sinus rétro orbital seront effectués sous anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.
Choix des espèces
La souris NSG (NOD SCID-/- gammaC-/-) (absence de lymphocytes B, T et NK) a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines. D’après notre expérience les souris NSG âgées d’environ 6 semaines permettent une meilleure prise de greffe.
Modulation GABAergique et cholinergique du circuit hippocampique en condition vigile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une craniotomie avec injection intracérébrale et pose d'une barre pour être enregistrées tête fixée pendant qu'elles sont éveillées, un conditionnement comportemental, puis une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur reconnaît un maintien en cage individuelle qui prive ces animaux grégaires de relations sociales, ainsi qu'un risque infectieux et l'inconfort du réveil après la chirurgie. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du cerveau présentée comme un "intérêt sociétal considérable", et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut simuler la cognition.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation d'une barre pour enregistrement en mode tête-fixée chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure comportementale expérimentale (enregistrements en mode tête fixée chez l'animal vigile) par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les dommages suivants : - l'élevage d'animaux normaux et transgéniques (mais sans phénotype dommageable) - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - les animaux doivent être maintenus en cage individuelle pendant la periode expérimentale, entrainant un déficit de relations sociales chez des espèces grégaires - du conditionnement comportemental afin de caractériser les réseaux neuronaux pendant la résolution de tâches cognitives et d'états cérébraux contrôlés - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Le nombre d'animaux nécessaires pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences est ici de 182 souris.
Raffinement
Les animaux utilisés sont des souris transgéniques, qui expriment un marqueur moléculaire permettant de cibler spécifiquement les neurones du type d'intérêt, et de leur faire exprimer des molécules nous permettant de contrôler expérimentalement leur niveau d'activité. Il devient ainsi possible de tester des hypothèses quant au rôle de ces neurones dans le circuit de façon causale (que se passe t'il quand ces neurones sont expérimentalement activés ou au contraire bloqués) et non plus seulement corrélative (quand ces neurones sont ils actifs). Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. La souris est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Evaluation de la sénescence cellulaire en modèles précliniques de pathologies cardiométaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent quatre interventions provoquant une stéatose du foie ou des altérations du cœur, une injection intrapéritonéale et deux à quatre séances d'imagerie échographique sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur affirme que ces interventions n'entraînent qu'un faible niveau d'effets indésirables et pas de perte de poids, et qu'aucune approche de remplacement pertinente n'a été identifiée. Cette étude pilote cherche des marqueurs de la sénescence cellulaire, bénéfice présenté au conditionnel comme une amorce pour de futurs agents d'imagerie.
Objectifs
La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses pathologies chroniques liées au vieillissement, y compris un certain nombre de pathologies cardiométaboliques La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses maladies chroniques liées au vieillissement. Il n’existe pas de modalité d’imagerie permettant l’identification de la sénescence cellulaire in vivo, qui présente pourtant potentiellement un grand intérêt. L’objectif de ce projet est d’évaluer la présence de sénescence cellulaire dans plusieurs modèles précliniques de pathologies cardiométaboliques et d’identifier un ou plusieurs marqueurs de sénescence cellulaire communs à ces modèles.
Bénéfices attendus
Il est attendu qu’un ou plusieurs des modèles animaux testés révèlent la présence de cellules sénescentes et qu’au moins un marqueur de sénescence cellulaire, commun à ces modèles et pouvant être ciblé par imagerie moléculaire, soit identifié. Cette étude pilote devrait donc permettre d’amorcer le développement d’agents d'imagerie de la sénescence cellulaire, ciblant le marqueur identifié, et dans un même temps de valider la pertinence de modèles animaux pour tester ces agents d'imagerie après leur développement.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à des injections intrapéritonéales en début de protocole (une injection par animal). Les animaux seront soumis à des procédures d’imagerie par échographique, avant le début des interventions, à la fin de la durée d’intervention prévue et à des temps intermédiaires pour une partie des animaux, (entre 2 et 4 procédures d’imagerie par animal, sous anesthésie gazeuse et d’une durée approximative de 30 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à quatre interventions menant au développement de pathologies cardiométaboliques. Deux de ces interventions mènent au développement de stéatose du foie. Deux autres interventions mènent à des altérations du cœur. Pour deux de ces interventions (une visant le foie et l’autre le cœur), la présence de cellules sénescentes a été décrite, alors que pour les deux autres interventions, l’implication de la sénescence cellulaire reste à confirmer, ce qui fait partie des objectifs de cette étude. L’efficacité de ces interventions sera validée par imagerie échographique. Ces interventions ont été décrites dans la littérature scientifique et n’entrainent qu’un faible niveau d’effets indésirables et notamment pas de perte de poids. Le protocole d’imagerie, quant à lui, n’entraine pas de douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser les altérations tissulaires des modèles pathologiques étudiés, y compris la présence de cellulaire sénescentes, et évaluer les marqueurs communs à ces cellules sénescentes.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant l’évaluation d’un phénomène apparaissant chez l’animal suite à des interventions métaboliques au long cours, y compris dans l’optique de valider ces interventions comme modèle pour une évaluation ultérieure in vivo par imagerie, aucune approche pertinente de remplacement n’a été identifiée.
Réduction
L’étude a été conçue pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un effectif suffisant pour une analyse statistique permettant de se prononcer sur l’efficacité des interventions évaluées. Ceci implique, notamment la limitation des doses de molécules actives utilisés et des points temporels ou l’étude sera réalisé sur les bases de résultats précédemment rapportées dans la littérature, et l’utilisation d’un groupe contrôle commun.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une surveillance et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie échographique sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Cette étude porte sur l’identification de cellules sénescentes dans des modèles animaux déjà établis (et d’un marqueur, commun à ces modèles, pertinent pour le développement d’agents d'imagerie). Les modèles identifiés comme potentiellement pertinents ont été établis chez la souris. Pour cette raison, des souris au même stade de développement (adultes) que décrit dans la littérature scientifique, présentant ces modèles déjà établis, vont être utilisés pour ces travaux sur un aspect peu ou pas étudié dans ces modèles animaux.
Développement d’une approche radiomique basée sur l’imagerie scanner pour identifier les signatures radio-immunes dans des modèles orthotopiques de cancer ORL et pulmonaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la muqueuse orale ou, par incision du thorax, dans le poumon, puis subissent des irradiations et des séances d'imagerie scanner sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur ORL peut gêner l'alimentation et la tumeur pulmonaire la respiration, et prévoit des points limites déclenchant la mise à mort. Le projet vise à entraîner des algorithmes d'intelligence artificielle sur les images, retombées cliniques présentées au conditionnel, tandis qu'il affirme que l'étude de la réponse immunitaire exige un "organisme vivant entier".
Objectifs
L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement de paradigme dans le traitement de plusieurs cancers solides et hématologiques, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (CT-scans) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.
Bénéfices attendus
À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.
Procédures
Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la babine soit au niveau pulmonaire : - Les cellules tumorales seront injectées directement dans la muqueuse orale des souris préalablement anesthésiées, avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée < 5 min). - L’injection de cellules dans le poumon prévoit une petite incision chirurgicale à niveau du thorax de souris (sous anesthésie systémique) pour exposer la plèvre. L’injection sera effectuée travers la plèvre avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée max 20 min). Les irradiations seront faites sous anesthésie Kétamine/Xylazine (durée 15 min) Les imageries au micro-CT seront faites sous Kétamine/Xylazine ou Isoflurane (durée 15 min)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur ORL sont possibles. Pour le modèle pulmonaire, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté respiratoire. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur à son minimum. En effet, les animaux seront surveillés quotidiennement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (par exemple anti-TGF beta, anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.
Réduction
La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adaptée sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec Gustave Roussy nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Les animaux seront anesthésiés pour les procédures d’injection des cellules tumorales, d’irradiation et d’imagerie. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint). -Un complément alimentaire (Renutryl, Nestlé) sera administré aux souris pour limiter les effets de l'asthénie et de l'irradiation. - Des aliments mous (pellets ramollis d’eau) pourront également être mis dans les cages pour faciliter l’alimentation des animaux
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, les modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude.
Mise au point du modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale chez la souris : Rôle de nouveaux gènes et identification de cibles thérapeutiques d’intérêt dans l’ischémie cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 230 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez ces dernières, un monofilament siliconé bouche une artère cérébrale pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire, avant 24 heures de reperfusion puis la mise à mort pour mesurer la zone du cerveau détruite. Le porteur décrit une paralysie possible, une prostration et une hypothermie, les souris les plus atteintes selon l'échelle neurologique étant alors tuées, et 40 autres subissent un prélèvement de sang terminal sans réveil. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier le rôle des gènes dans un "système intégré" et juge le recours à la souris "indispensable".
Objectifs
En France, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap acquis de l’adulte et la seconde cause de démence. Dans plus de 80% des cas, les AVC résultent de l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin ou thrombus. On parle alors d’« AVC ischémique » ou « infarctus cérébral ». La principale cause de ces AVC reste l'athérosclérose qui se définit comme une accumulation de dépôts de cholestérol sur les parois des artères. Ces dépôts durcissent et forment des plaques d'athérome qui favorisent la formation du caillot. L’élimination du caillot devient alors une priorité pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale reste une pathologie complexe à explorer chez l’homme. Les modèles in vivo ont pour objectif de reproduire, chez l'animal, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet alors de pouvoir tester plus facilement des hypothèses physiopathologiques et déterminer des stratégies thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Pour ce projet, nous allons donc utiliser un modèle mis en place et développé chez le rat puis adapté à la souris. Ce modèle, reconnu pour être fiable et reproductible, est un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tOMCA), par insertion, pendant 1 h, d’un monofilament siliconé au niveau de l’artère cérébrale moyenne. Après 24 h de reperfusion, la taille de l’infarct sera évaluée. La mise au point et la validation de ce modèle nécessiteront l’utilisation de 80 souris au maximum. Nous pourrons ensuite étudier le rôle de différents gènes potentiellement impliqués dans la formation du thrombus (jusqu’à 5) en mesurant la taille de la zone cérébrale infarcie dans des souris avec délétion ou mutation des ces gènes d'intérêt. Nous prévoyons d’utiliser 30 souris par mutation, soit 150 souris pour 5 gènes. Les premières mutations étudiées portent sur des gènes jouant un rôle important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. Des prélèvements sanguins seront donc réalisés pour évaluer cette fonction chez nos souris (besoin de 40 souris). Pour la réalisation de ce projet, 270 souris au maximum seront donc utilisées
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (80% des AVC) résultent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus (caillot sanguin) qui empêche le cerveau d’être alimenté en oxygène par une circulation sanguine normale. Ce type d’accident vasculaire est favorisé par les facteurs de risque cardio-vasculaires comme le tabagisme, l’hypercholestérolémie ou le diabète. Les accidents ischémiques cérébraux provoquent des dommages cérébraux parfois irréversibles, pouvant conduire, lorsque les lésions sont étendues, au décès. Il s’agit donc d’une urgence médicale absolue : le caillot doit être éliminé le plus rapidement possible pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale, en dépit de sa grande fréquence, reste une pathologie complexe à explorer, de par son hétérogénéité clinique mais aussi de par ses interactions possibles avec les nombreux facteurs de risque cardio-vasculaires. Ceci explique les difficultés à aborder, chez l'homme, les nombreux mécanismes physiopathologiques et/ou à identifier des cibles pharmacologiques potentielles de la pathologie ischémique cérébrale. Ces faits ont conduit à développer de nombreux modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale chez le rat dans un premier temps, pour les adapter ensuite à la souris transgénique. Les modèles in vivo ont donc pour objectif de reproduire chez l'animal, dans un contexte physiologique proche de celui de l'homme, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet ainsi de tester des hypothèses physiopathologiques et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1: prélèvement terminal de sang en veine cave sur animaux anesthésiés (40 souris au maximum). Procédure 2: modèle d'ischémie/reperfusion réalisé sur 230 souris. L'ischémie transitoire est induite pendant 1h et la reperfusion se fait sur 24h. A l'issue, les animaux sont sacrifiés pour évaluer la taille de la zone infarcie.
Impact sur les animaux
Ce modèle d'occlusion transitoire induit des infarctus plus ou moins sévères qui se traduisent par une mortalité importante si le temps d’occlusion de l’artère est supérieur à 3h. Dans notre étude, le temps d’occlusion n’excèdera pas 1h, limitant ainsi la taille de l’infarct et les éventuelles complications. Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h après la reperfusion . Cette évaluation confirme le succès de la tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Pour une occlusion d’1h, les souris devraient présenter au moins un léger enroulement cohérent (neuroscore 2) et selon la littérature, les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. Un neuroscore de 4 ou 5 entrainera une mise à mort de l’animal par injection IP d’un bolus d’Euthasol. Les principales complications liées à ce modèle expérimental sont : risque d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, déplacement du fil induisant un risque d’hémorragie sous-arachnoïdienne par rupture vasculaire ou encore reperfusion diminuée liée à l’altération de la paroi carotidienne. La souris , prostrée, dos voûté, poils hérissé, et probablement en hypothermie, sera alors mise à mort. Pour les autres souris, la taille de l'infarct sera évaluée histologiquement après 24h de reperfusion.
Devenir
Procédure 1: Prélèvement de sang en veine cave: procédure sans réveil car nous avons besoin d'une grande quantité de sang pour étudier l'agrégation plaquettaire. Procédure 2 d'ischémie/reperfusion: les souris sont gardées en vie pendant 24h. Après 24h de reperfusion, l'animal est mis à mort pour prélever le cerveau et évaluer la taille de la zone infarcie
Remplacement
Les modèles in vitro disponibles à ce jour ne permettent malheureusement pas l’étude de l’implication de gènes dans un système intégré. Le recours au modèle animal reste ici indispensable pour nous permettre de cibler rapidement et efficacement les gènes ayant un impact positif sur la taille de l’infarctus.
Réduction
Quand ce sera possible, les souris contrôles serviront à l’étude de plusieurs gènes. Le modèle sera alors mis en place par des personnes expérimentées et un protocole analgésique adapté sera mis en place sur toute la durée du protocole pour limiter toute souffrance de l’animal.
Raffinement
Les animaux sont stabulées dans des conditions standards d’animalerie, avec dans la cage nourriture à volonté et milieu enrichi (frisottis ou dôme). Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h , selon une échelle en 6 points. Si l’atteinte neurologique est trop importante, l’animal sera alors exclu de l’étude.
Choix des espèces
Ce modèle d'AVC ischémique a tout d’abord été mis au point chez le rat. En raison de la disponibilité de souris génétiquement modifiées permettant d'analyser le rôle physiopathologique et/ou l'intérêt thérapeutique de gènes candidats, ce modèle a également été développé chez la souris. Pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie du système cérébro-vasculaire, il est fondamental de prendre en compte l’ensemble des systèmes régulateurs de façon intégrée. Malheureusement, il n’existe pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. De plus, nous disposons déjà du modèle de souris Arhgef1, premier gène que nous étudierons dans le cadre de ce projet Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes âgés entre 2 et 4 mois.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Mise en place d’un modèle d’insuffisance cardiaque post infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature d'une artère du cœur reproduisant un infarctus, la pose d'un implant abdominal puis une chirurgie du thorax pouvant durer jusqu'à 140 minutes, avec six échographies et six prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort jusqu'à seize semaines plus tard pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'une insuffisance cardiaque doit se développer après la seconde opération et prévoit des points limites en cas de souffrance qu'il ne pourrait soulager. Les retombées annoncées, mieux comprendre la maladie et évaluer des médicaments développés par des entreprises pharmaceutiques, restent au conditionnel et à long terme, tandis qu'il affirme que suivre la fonction cardiaque sur plusieurs semaines exige un "organisme entier".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. L’insuffisance cardiaque se traduit par un remodelage du tissu cardiaque associé à des dysfonctions cardiaques. Outre une lourde mortalité (50% à 5ans après l’apparition des premiers symptômes), cette pathologie se traduit également à terme par des symptômes parfois invalidants et des hospitalisations longues et récurrentes. Les insuffisances cardiaques surviennent en très grande majorité dans les suites d’un infarctus du myocarde aigu et sont souvent associées à un remodelage cardiaque délétère. Plusieurs pistes de traitement sont à l’étude mais des efforts majeurs en ce sens restent à entreprendre. L’objectif de ce projet est d’adapter notre modèle de ligature transitoire de l’une des artères principales du coeur (mimant un infarctus du myocarde), afin de développer et caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque post infarctus. Ce modèle devrait permettre, à terme, de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux traitements médicamenteux, actuellement développés par les entreprises pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’insuffisance cardiaque est une pathologie à forte incidence (2,3% de la population adulte française) et aux conséquences lourdes (hospitalisations multiples, syndromes invalidants). Notre projet vise à caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque, nous permettant à court et moyen terme d’étudier les mécanismes impliqués dans cette pathologie et proposer à terme des cibles thérapeutiques pertinentes et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques nouvelles (études précliniques).
Procédures
Selon les groupes expérimentaux, les animaux suivront l’un des parcours suivants : 1) Deux chirurgies, espacées de 14 jours, seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée (durée : environ 20mn et 140mn maximum respectivement) : la première chirurgie implique la pose d’un implant dans l’abdomen et la seconde chirurgie implique une chirurgie au niveau du thorax. Le suivi des animaux implique 6 examens échographiques (20-30 minutes chaque examen) et 6 prélèvements sanguins (1 minute chaque prélèvement), sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation (à 6 reprises). L’animal est mis à mort au plus tard 16 semaines après l’infarctus pour le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque. 2) Une chirurgie unique, impliquant une chirurgie au niveau du thorax est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée (durée de 140mn maximum). La mise à mort est réalisée 48h plus tard (sous anesthésie et analgésie), après un rapide examen échographique (10mn, sous anesthésie et analgésie), pour permettre le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont réalisées intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée, impliquant l’injection de substances en sous-cutané et une mise sous respirateur (pour la seconde chirurgie). Les animaux sont réveillés en fin de chirurgie, impliquant des soins post-opératoires adaptés aux gestes réalisés. Un délai de 15 jours entre les deux opérations permet un rétablissement complet de l’animal avant la seconde opération. Les examens échographiques (non invasifs) et prélèvements sanguins sont réalisés sous sédation ou anesthésie générale selon l’examen. Pour les groupes d’animaux avec infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu après la seconde chirurgie. Des points limites sont donc établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement du cœur pour mesures de la taille d’infarctus ou analyses tissulaires (selon les groupes expérimentaux).
Remplacement
L’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de paramètres tels que l’activité électrique cardiaque, la fonction cardiaque ou la température corporelle, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. Il s’agit enfin ici de la mise en place d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque nécessitant par essence le recours à l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - Les approches chirurgicales et la compatibilité entres les méthodes de chirurgie, de mesures et d’imagerie seront au préalable validés sur des cadavres d’animaux mis à mort dans le cadre d’autres projets. - Les procédures seront réalisées de manière successive pour une validation par étape, limitant ainsi le nombre de tests et de groupe d’animaux au strict minimum nécessaire. - L’adaptation d’un protocole d’infarctus du myocarde déjà éprouvé au laboratoire nous permet de pouvoir comparer les résultats obtenus à nos données historiques, nous affranchissant d’avoir recours ici à des animaux pour l’un des groupes d’intérêt de ce projet. - Certains groupes seront réalisés en 2 sessions décalées : la première session comportera 2/3 des effectifs de chaque groupe. La seconde session (1/3 restant, au maximum) ne débutera qu’après analyse des résultats complets de la première session. De cette manière, l’interprétation des résultats de la première session nous permettra d’adapter au plus juste l’effectif et le sexe des animaux de la seconde session. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
- Le présent projet doit permettre de valider une approche chirurgicale moins invasive que la méthode classique utilisée dans les études antérieures. C’est une approche que nous souhaitons pouvoir ainsi appliquer à nos futurs projets impliquant un infarctus du myocarde. - Le suivi de la température corporelle et de l’activité électrique cardiaque à l’aide d’un implant, en particulier en période post-opératoire, fournira des données importantes longitudinales supplémentaires sur l’état général des animaux en expérimentation. Ces données doivent nous permettre notamment d’optimiser nos conditions de réveil (température de la couveuse de réveil, timing d’extubation de l’animal, etc.) pour l’ensemble de nos projets impliquant un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de la cardioprotection. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, nous permettant de profiter d’un excellent retour d’expérience. A l’inverse, ce projet doit justement permettre de raffiner davantage notre modèle murin d’infarctus du myocarde utilisé par ailleurs dans d’autres projets. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (6 à 16 semaines) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe.
Deficits synaptiques cerebelleux dans un modele murin des maladies du spectre Schizophrene
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
563 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Les souriceaux reçoivent trois injections de phencyclidine pendant leur deuxième semaine de vie, ce qui provoque des heures d'hyperactivité, une difficulté à se nourrir et un retard de prise de poids. Ils sont ensuite tués par décapitation après sédation ou par perfusion, pour prélever le cerveau et étudier les synapses du cervelet. Le porteur affirme qu'une telle étude "ne serait pas possible en culture cellulaire" et nécessite des animaux vivants.
Objectifs
Le cerveau est composé de différents types de neurones, qui établissent entre eux des contacts appelés synapses. Ces synapses peuvent être très différentes dans leur morphologie et/ou leur manière de fonctionner, chaque type de synapse ayant ainsi sa propre « identité synaptique ». Les synapses sont considérées comme des acteurs centraux des pathologies comme la schizophrénie. Cependant, la plupart des analyses ont été faites à l’échelle des structures cérébrales et peu d’études se sont penchées sur l’identité des synapses affectées. La schizophrénie est une pathologie neuropsychiatrique provoquant des symptômes psychotiques, émotionnels et des déficits cognitifs comme des problèmes de mémoire ou d’attention. Le cervelet est une structure intéressante à étudier dans la schizophrénie puisque certains patients présentent des déficits et une activité anormale dans cette structure du cerveau. De plus, son implication dans des processus cognitifs est de plus en plus fréquemment mise en évidence. Les neurones de ce réseau et leur architecture particulière sont très largement caractérisés, ce qui en fait un modèle de choix pour l’étude des déficits des synapses. Nous avons récemment étudié les altérations des synapses du cervelet dans un modèle murin connu pour mimer certaines composantes de la physiopathologie de la schizophrénie. Ce modèle murin consiste en l’injection de Phencyclidine (PCP) chez le souriceau à 7, 9 et 11 jours après la naissance, sachant que le PCP est connu pour induire des symptômes similaires à ceux induits par la schizophrénie chez l’humain. Cette première étude nous a permis de montrer que le PCP conduit à une augmentation de l’activité du réseau de neurones du cervelet et à des déficits au niveau d’un type de synapses qui semblent être liés à des changements transitoires de la quantité de molécules situées à la surface des neurones et qui seraient importantes pour former ces synapses. Le présent projet est la suite de cette étude et consiste à déterminer quels sont les neurones du réseau dont l’activité est modifiée par l’injection de PCP et quels sont les effets sur la composition moléculaire et la fonctionnalité de leurs synapses.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie touche 1% de la population. Les symptômes associés à cette maladie sont très variés et apparaissent à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte. Les patients présentent des déficits cognitifs (problèmes de concentration, d’attention, de mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts dans le développement des neurones. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de cette maladie, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connexion entre les neurones sont visibles dans le cortex cérébral chez des patients atteints de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits dans la structure du cerveau appelée cervelet chez certains patients schizophrènes, son implication dans cette pathologie reste très mal étudiée. Nos résultats récents obtenus sur le modèle murin de schizophrénie, le modèle PCP, nous ont permis d’identifier des déficits au niveau de synapses du cervelet, suite à la modification de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet. La présente étude nous aidera à mettre en évidence les molécules des synapses qui sont potentiellement modifiées en fonction de l’activité des neurones et qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles ne sont pas présentes en quantité normale.
Procédures
Nous injecterons le NaCl 0.9% (contrôle) ou la Phencyclidine (PCP) en sous-cutané, trois fois à 2 jours d’intervalle pendant la deuxième semaine de vie post-natale. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose de PCP ou de NaCl 0.9% à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du cou qui permet également l’insertion de l’aiguille la plus fine possible (29G) afin de limiter la douleur. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris recevront une injection d'anesthésique local afin de prévenir toute douleur qui pourrait être engendrée par l'injection de la dose léthale d'euthanasiant qui précède la perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Chez l’homme, le PCP à des effets psychotomimétiques tels que l’altération de l’image corporelle, des sentiments d’éloignement et de solitude. Lorsqu’il est injecté chez la souris en néonatal, des altérations cognitives sont visibles chez la souris adulte. Parmi elles, des déficits de mémoire spatiale et un déficit dans la capacité de reconnaissance de nouveaux objets sont observés. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures. Après les injections de PCP ou NaCl 0.9%, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement. Pour toutes les études d’électrophysiologie ou protéiques, les animaux seront euthanasiés par décapitation après une sédation à l’isoflurane pour prélèvement du cerveau. Pour l'étude d'histologie, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur des tissus pour pouvoir procéder à des analyses en immunohistochimie.
Remplacement
La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Il existe actuellement plusieurs modèles de souris pour la schizophrénie, dont le modèle pharmacologique qui nous intéresse : la souris PCP (Phencyclidine). Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Afin de tenir compte de la perte potentielle de souriceaux qui peut aller jusqu’à 20% dans un élevage normal, nous estimons avoir besoin de 6 portées par expérience pour avoir de 15 à 21 souris par condition et par timepoint. Les expériences sont stoppées lorsque l’on atteint le nombre minimum, soit 15 animaux par condition. Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid et de diminuer tout stress éventuel. De même, les injections sous-cutanées chez le souriceau seront réalisées avec les aiguilles les plus fines possibles (29G) afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Si un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress dans les jours qui suivent les injections (souriceau hors du nid, pas de lait dans l’estomac indiquant des problèmes importants pour se nourrir, posture anormale…) témoignant d’une altération du bien-être des animaux, l’expérimentateur pourra consulter le personnel compétant de l’animalerie ou le vétérinaire pour avis, afin de mettre en place une médication adaptée si cela est possible. En cas de souffrance ne pouvant être prise en charge, l’animal sera sorti du projet avec une euthanasie immédiate sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie si l’expérimentateur n’est pas joignable.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent leur maintien de manière relativement simple, tout en gardant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. L’analyse sera faite à P7, P9, P11 pour les expériences 1 (immunohistologie), 2 (électrophysiologie par multi electrode array) et 3 (analyse de protéines synaptiques) afin de connaître en détail l’effet directe de chaque injection de PCP sur le réseau olivo-cérébelleux. Les analyses des expériences 1, 2 et 3 ainsi que de l’expérience 4 (électrophysiologie sur tranches de cervelet) se feront aussi à P30 qui correspond à l’âge où la connectivité du réseau olivo-cérébelleux est finalisée et commence sa maturation. Cette période chez la souris correspondrait ainsi au début de la période de déclanchement de la pathologie chez l’homme, à savoir à la fin de l’adolescence ou le jeune adulte. Le modèle PCP néonatal a été très largement décrit dans la littérature, et une injection chronique développementale à P7, P9 et P11 a montré des effets comportementaux légers à long terme, cohérents avec des déficits observés chez les sujets schizophrènes. De plus, la période d’induction du modèle est cohérente pour mimer les altérations neuronales produites par des stimulations pendant le troisième trimestre de la grossesse.
Effets d’une délivrance entérique d’un peptide bactérien sur l’homéostasie glucidique et la composition du microbiote intestinal chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est rendue obèse et prédiabétique par un régime hypercalorique de deux à quatre mois, puis toutes sont opérées pour poser un cathéter dans l'intestin grêle et reçoivent des perfusions quotidiennes et des prélèvements de sang à la queue. Elles sont ensuite tuées pour prélever leurs organes. Le porteur présente le projet comme un "passage obligé vers la clinique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un organisme vivant.
Objectifs
De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif, elles représentent 90% du microbiote intestinal. Celui-ci régule le métabolisme énergétique et le système immunitaire. Ces bactéries produisent une grande diversité de substances bactéricides, appelées bactériocines. Ces bactériocines agissent comme des antibiotiques et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries pathogènes. Nous utiliserons un modèle préclinique de souris, rendues obèses et prédiabétiques par un régime alimentaire riche en graisses. Ces animaux souffrent également de dysbiose. Les animaux contrôles, seront nourris avec un régime standard. Suite à des recherches bibliographiques, nous avons sélectionné une bactériocine, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur l’homéostasie glucidique et la composition du microbiote intestinal. Nos résultats précédents nous ont permis de démontrer l’effet positif d’un traitement intra-péritonéal avec cette molécule sur la tolérance au glucose et la sécrétion d’insuline chez des souris prédiabétiques. Ainsi, ce peptide est potentiellement une cible d’intérêt via un effet direct sur des tissus cibles. Nos derniers résultats ont également montré que, lorsque ce peptide est administré par voie orale pendant plusieurs jours, celui-ci est dégradé au niveau du duodénum. Ainsi il n’atteint pas le colon, au niveau duquel il pourrait avoir un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ce peptide est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. C’est pourquoi nous aimerions l’administrer quotidiennement par voie entérique, à l’aide d’un cathéter placé directement au niveau iliaque de l’intestin grêle chez la souris. Notre projet vise à étudier et valider la preuve de concept du rôle de ce peptide en tant que régulateur de l'homéostasie du glucose et ayant un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ainsi cette molécule pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 192 animaux.
Bénéfices attendus
Le peptide que nous utilisons est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. Dans des situations de déséquilibre de cet écosystème, comme observé dans les situations d’obésité ou de diabète de type 2 (DT2), une administration par voie entérique de notre molécule pourrait avoir des effets sur la composition du microbiote intestinal et sur la régulation de l’homéostasie glucidique. Notre projet vise à étudier et valider cette preuve de concept, et pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans l’intestin grêle. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux seront perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Puis ils auront 2 jours de pause avant d’être à nouveau perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Les animaux seront vigiles. 4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront vigiles.
Impact sur les animaux
Pour tous nos protocoles nous veillons à diminuer les effets indésirables prévus sur les animaux. Nous utilisons un régime alimentaire riche en gras, pour rendre nos animaux obèses, mais nous leur laissons le régime standard pour que les animaux aient toujours le choix. Malgré leur prise de poids, les animaux se déplacent correctement. Pour la chirurgie nos animaux reçoivent des soins avant, pendant et après l’opération afin d’éviter toute souffrance. Nous les surveillons tous les jours après l’opération jusqu’à leur rétablissement. Avant d’effectuer des tests sur nos animaux, nous les habituons pour diminuer leur stress le jour de l’expérience. Pendant l’expérience, nous respectons les volumes de prélèvement et d’administration autorisés, et nous les surveillons.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6j mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.
Réduction
Dans le domaine de la diabétologie et vu le type de mesures que nous allons effectuer, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe (n=8) de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Afin d'obtenir des souris obèses et prédiabétiques, nous devons les soumettre à un régime hypercalorique, à partir de l'âge de 8 semaines, pendant 2 mois. Ainsi, toutes nos expériences seront réalisées sur des souris adultes d'un âge minimal de 4 mois. Utiliser des animaux adultes mime la situation chez l'Homme où le diabète de type 2 apparait également à l'âge adulte.
Impact d’un traitement chronique avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.
Procédures
L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).
Impact sur les animaux
L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).