Souris

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, puis un suivi hebdomadaire par imagerie et des contentions répétées pour mesurer la tumeur, celle-ci pouvant atteindre 2 000 mm³ avant la mise à mort, avec perte de poids et parfois nécrose. Elles sont ensuite tuées pour prélever tumeur, poumons et rate. Le porteur affirme que ces phénomènes "ne peuvent être reproduits in vitro" et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les cancers figurent parmi les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les origines du cancer sont multiples et font intervenir à la fois des facteurs génétiques et des agents extérieurs. Il a été démontré que la suractivation et/ou la surexpression de la protéine Rac1 (membre de la superfamille des protéines Rac) entraine l’initiation de différentes étapes de l’oncogénèse telles que la progression, l’invasion tumorale et la formation de métastases. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de l’activité de Rac1 serait une nouvelle stratégie thérapeutique contre la progression tumorale et des métastases. Notre objectif général est de développer de nouveaux inhibiteurs de Rac1. Après un programme de recherche dédié à l’identification de nouveaux inhibiteurs, nous avons sélectionné une molécule « lead » qui inhibe spécifiquement la protéine Rac avec une efficacité et une affinité supérieure aux molécules commerciales (EHT1864 et NSC23766). Les propriétés thérapeutiques anti-métastatiques de cette molécule lead ont été évaluées dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif . Les résultats prometteurs de cette étude nous ont amenés à développer une série chimique issue de notre molécule lead pour optimiser ce nouvel inhibiteur de Rac et envisager une utilisation clinique. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets anti-tumoraux de ces nouvelles molécules sur la croissance tumorale, le système immunitaire et la survie à l’aide de modèles murins ( immuno-compétents et immuno-déficients) de cancer du sein triple négatif

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouveaux inhibiteurs de Rac. Au regard de nos premiers résultats, ces inhibiteurs devraient présenter des propriétés anti-tumorales et anti-métastatiques. Ainsi le développement de ces molécules permettrait d’envisager de nouveaux traitements (first in class) dans de nombreux cancers invasifs tels que le cancer du sein ou le cancer du côlon pour lesquels les impasses thérapeutiques sont nombreuses, menant au décès du patient.

Procédures

Les animaux (n=1800 maximum) subiront une greffe de cellules de cancer du sein (modèle triple négatif). Une imagerie sera réalisée sur tous les animaux une fois par semaine pour suivre l’évolution des métastases. Tous les animaux seront également soumis à une contention (2 fois par semaine pendant 40 jours maximum) pour évaluer la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Aucun prélèvement sera réalisé sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ces 2 modèles de cancer du sein triple négatifs sont maitrisés dans notre laboratoire depuis plusieurs années. Notre première étude met en évidence que l’injection chronique d’un inhibiteur de Rac1 n’induit pas de toxicité chez l’animal mais permet de diminuer la fréquence des métastases, le volume de la repousse tumorale et augmente statistiquement la survie des animaux. Les 2 procédures expérimentales consistent à effectuer des greffes sous-cutanés chez des souris. Ce geste chirurgical de grade modéré peut entrainer une légère douleur et une irritation passagère qui seront surveillées et contrôlées par une médication appropriée et décrite dans cette saisine. L’évolution de la tumeur sera surveillée tout au long du protocole pour limiter les nuisances liées au modèle. En effet, par exemple la taille de la tumeur ne doit pas entraver la mobilité de la souris. Par conséquent, si la tumeur atteint 2000mm3, point limite de ces procédures, la souris sera mise à mort. Dans ce type de modèles, les nuisances attendues sont également une perte de poids (ou une non prise de poids, surtout au début du protocole) et parfois une nécrose au niveau de la tumeur peut également apparaitre. Les nuisances attendues dans ce type de modèle devraient être moindre chez les souris traitées avec les inhibiteurs de Rac1.

Devenir

Procédure 1 : Mise à mort des animaux au maximum 40 jours après le début des traitements ou si un point limite est atteint. Procédure 2 : Mise à mort des animaux faite pour récupérer la tumeur, les poumons et la rate. Ces prélèvements biologiques post-mortem seront nécessaires pour étudier et caractériser les lymphocytes infiltrant la tumeur

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes et de nombreux acteurs conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Tous ces paramètres ne peuvent être reproduits in vitro c’est pourquoi le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Ce projet utilisera au maximum 1800 souris sur 5 ans. L’utilisation d’une technique d’imagerie permet de suivre au cours du temps de façon non invasive la taille des tumeurs ainsi que la cinétique d’apparition des métastases et d’autre part d’évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Cette approche permet également de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc, en parallèle de l’observation comportementale, de pouvoir adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à l’euthanasie de l’animal. De plus, en cas de résultats négatifs d’une molécule testée dans la 1ère étape expérimentale, l’étape 2 ne sera pas engagée ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées (soit 240 souris/molécule testée). Nous utiliserons un test de Mann-Whitney pour les analyses intergroupes, un test de Wilcoxon pour les intragroupes et un test de Log-rank sera utilisé pour l’analyse de la survie. Une p-value inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Uniquement le personnel qualifié et expérimenté réalisera les expérimentations animales afin que les procédures soient réalisées efficacement et avec les soins appropriés afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés 3 à 5 par cages et les cages sont enrichies avec des frisottis. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines (modèles de xénogreffes sur souris immunodéprimées) et murines (modèles syngéniques sur souris immunocompétentes). Pour cette étude, nous utiliserons de jeunes femelles adultes (âgées de 8 semaines) pour bénéficier de l’influence hormonale sur la croissance tumorale (tumeur mammaire)

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle leur impose de sévères atteintes du squelette, cyphose, scoliose et déformation de la cage thoracique, et une espérance de vie réduite par le risque de rupture de l'aorte, entre 27 et 240 jours. Elles reçoivent des injections, jusqu'à six prélèvements de sang et une biopsie de l'oreille, puis sont tuées pour analyse des organes. Le porteur annonce un bénéfice "éventuel à long terme" pour les patients atteints de cette maladie rare et affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie des os avec des troubles cardiovasculaires. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour les symptômes cardiovasculaires de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d'un traitement pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections traitements (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet a d’importantes atteintes squelettiques comprenant une sévère cyphose, une scoliose et une surcroissance de la cage thoracique ainsi qu’une espérance de vie réduite due à une importante probabilité de rupture aortique. Il est connu que l’espérance de vie de ces animaux est de 27 à 240 jours notamment à cause des problèmes vasculaires intervenant à des âges différents selon les animaux et ne pouvant donc pas être prédits. Cependant ces animaux arrivent à se déplacer et manger. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents traitements produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage . Chaque cage contient des enrichissements de type tige en papier, igloo et buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant du Syndrome de Marfan, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et plusieurs études démontrent que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées dans ce modèle. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 24 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

52 souris âgées de 15 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un facteur pathogène et, pour une partie, la pose d'électrodes puis un isolement une semaine sur deux pour enregistrer leur sommeil pendant plusieurs mois. Leur cerveau est ensuite prélevé pour analyse après la mort. Le porteur affirme que la souris reste "incontournable" et présente le projet comme visant à valider un premier modèle animal évolutif de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est connue pour ses symptômes moteurs dus une dégénérescence neuronale bien identifiée. D’autres symptômes de la MP sont aujourd’hui caractérisés comme le trouble du comportement en sommeil paradoxal (TCSP). Pendant le sommeil paradoxal (SP), nous sommes inconscients et naturellement paralysés. Les patients TCSP (âgés d’une cinquantaine d’années) perdent cette paralysie et extériorisent alors leurs rêves sous forme de mouvements incontrôlés dangereux. Le TCSP est le meilleur marqueur diagnostic à 10 ans de la MP, ces deux pathologies étant donc intimement liées. Sur la base de nos travaux récents chez les rongeurs, nous avons formulé une hypothèse sur ces mécanismes délétères communs aux deux pathologies, affectant d’abord les neurones controlant le sommeil, puis au cours du vieillissement ceux atteints dans la MP. Le délai entre l’apparition du TCSP et de la MP refléterait la lente propagation des processus dégénératifs à travers le cerveau au cours du vieillissement. Notre objectif est de tester cette hypothèse en tentant de reproduire chez la souris âgée ces mêmes processus pathologiques affectant le SP puis d’observer si un syndrome parkinsonien se develope avec le temps, comme observé chez les patients MP. Ce projet de recherche préclinique s’articule autours de deux volets experimentaux complémentaires et menés en parallèle, l’un anatomo-pathologique (neurones dégénérés), l’autre physiologique (modification du sommeil) et comportemental (comportements de type parkinsonien), permettant de corréler les différents evénements pathologiques et leur évolution au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Malgré d’intenses recherches, un modèle animal reproduisant fidèlement au cours du vieillissement la maladie de Parkinson (MP) fait encore défaut, en particulier au cours de la période pendant laquelle la pathologie s’installe insidieusement dans le cerveau. L’un des biomarqueurs pré-symptomatiques de la MP reconnu aujourd’hui est une maladie du sommeil (Trouble comportemental en sommeil paradoxal) qui anticipe la MP d’une dizaine d’années. Il y a donc un intérêt à comprendre les mécanismes pathologiques liant le TCSP et la MP. Concrètement, ce projet scientifique ambitieux vise à valider le premier modèle animal évolutif dont la puissance résiderait dans la reproduction chronologique des évènements pathologiques prenant place, insidieusement, pendant la phase pré-symptomatique de la MP. Cet outil ouvrirait des perspectives pour l’élaboration de stratégies neuroprotectrices pour anticiper précocement l’évolution aujourd’hui encore irréversible vers la MP.

Procédures

Pour ce projet de recherche préclinique, 2 procédures expérimentales sont prévues nécessitant l’utilisation d’un total de 52 souris âgées de 15 mois. Procédure 1 (n = 20 souris, 2 lots de 13 et 7 individus, respectivement): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP, suivi de l'implantation d'électrodes à demeure permettant l'enregistrement chronique du sommeil. Les souris seront isolées une semaine sur 2 en chambre d'enregistrement, dans un baril de plexiglass transparent de 25cm de diamètre contenant enrichissement, eau et nourriture ad libitum et filmées 24h/24h. En fin de procédure (12 mois maximum apès la chirurgie selon l’évolution de leur état général), les souris subiront une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux. Procédure 2 (n = 32 souris, 4 lots, n = 8 individus chacun): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Selon les lots experimentaux, les souris ainsi traitées subiront 30, 60, 90 ou 180 jours après la chirurgie une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux afin de corréler l’évolution des modifications anatomo-pathologiques aux effets physiologiques observés et au vieillissement.

Impact sur les animaux

Procédure experimentale n° 1 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP. Des électrodes permettant l’enregistrement en continu de l’activité du cerveau pendant le sommeil seront posées à demeure. Pendant cette intervention d’une durée de 90 min, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (-5%) avec un retour au poids initial en 48h. Pendant la semaine de récupération, les souris seront 2 par cage avec un séparateur grillagé de sorte qu’elles puissent interagir tout en limitant les possibilités d’agression et de détérioration des électrodes. Elles seront isolées une semaine sur 2 en caisson individuel pour l’enregistrement de leur sommeil et de leurs comportements pour toute la durée de la procédure. Nous attendons l’apparition d’un TCSP sans savoir par avance si/quand il apparaîtra, ce délai constituant de fait l’objectif de l’étude. Nous serons quotidiennement vigilants pour détecter dès que possible l’apparition de signes comportementaux et physiologiques indicateurs du TCSP, de modifications quantitatives et qualitative de leurs sommeil et de leurs comportements. En fin de procedure, elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil. Procédure expérimentale n°2 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Pendant cette intervention d’une durée de 60 minutes, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (- 5%) avec un retour à la normale en 48h. Les souris seront alors placées à 4 par cage pour favoriser les interactions sociales. Elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil après 30, 60, 90 et 180 jours de survie apres la chirurgie pour prélever leur cerveau. N’attendant pas de dérèglement de leur sommeil ni de leur comportement, elles seront cependant régulièrement observées pour détecter de légères dégradations de leur état général, possible au cours du vieillissement.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, les souris subiront une anesthésie générale profonde et sans réveil pour nous permettre de récupérer leur cerveau dans les meilleures conditions de préservation des tissus neuronaux et d’analyser ainsi l’évolution des phénomènes dégénératifs cérébraux au cours du vieillissement (selon la durée de survie après la chirurgie initiale) et de les corréler avec les modifications de leur sommeil et de leurs comportements. Les données anatomiques ainsi obtenues chez des souris âgées seront comparées à celles obtenues chez des souris jeunes avec les mêmes paradigmes expérimentaux, permettant de mieux comprendre ce qui se passe pendant le vieillissement.

Remplacement

L’intérêt d’étudier le TCSP réside dans son caractère prédictif de la MP. Il est impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade car aucune méthode d’imagerie cérébrale spécifique de la MP n’est encore disponible à l’hôpital. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés chez des patients décédés pour confirmer le diagnostic mais ils ne permettent pas d’étudier l’origine de la maladie. Par ailleurs, des animaux moins évolués que les mammifères (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans etc.) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent de sommeil paradoxal et la complexité de leur cerveau n’est en rien comparable avec celle de l’Homme. D’autres méthodes prometteuses se développent actuellement comme la modélisation in silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour aborder des mécanismes pathologiques complexes responsables de ces pathologies évolutives et neurodégénératives. Aussi, l’utilisation de la souris est encore aujourd’hui incontournable et c’est un animal parfaitement adapté aux études physiologiques et comportementales de très longue durée prévues dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux (n=52) nécessaire pour cette étude est légitimé par son organisation en 2 procédures expérimentales (physiologie/comportement et anatomo-pathologie) conduites en parallèle. La taille de chaque lot a été calculée, optimisée et réduite à son minimum sur la base de nos travaux antérieurs mettant en œuvre les mêmes techniques expérimentales chez la souris. Ces calculs tiennent compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données expérimentales (petits échantillons): 1) des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales ; 2) la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés ; et 3) la dégradation des signaux au cours du temps (plusieurs mois de suivi longitudinal) pouvant rendre leur interprétation aléatoire. Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale se terminant par une anesthésie sans réveil avec prélèvement du cerveau pour analyses post-mortem, éliminant toute possibilité de réutilisation. En revanche, le nombre de lots, et donc celui des souris, pourra être sensiblement réduit selon les résultats obtenus, en particulier pour la procédure expérimentale n°2. Ainsi, les lots prévoyant des temps de survie post-traitement de longue durée seront abandonnés si des indices de TCSP et de perturbations locomotrices apparaissent plus précocement.

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel par le maintien d’interactions sociales quotidiennes, les souris seront hébergées dès leur arrivé dans notre animalerie en groupes de 4 individus par cage jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge de 15 mois, marquant alors le début des deux procédures expérimentales. L’agressivité peut augmenter avec le temps chez certains mâles, nous obligeant alors à les séparer du groupe. Le cas échéant, ils seront placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé afin que les deux souris puissent interagir mais sans contact direct. De plus, des enrichissements seront systématiquement mis en place dans les cages pour favoriser le bien-être des animaux pendant toute la durée des procédures. Après l’étape de chirurgie sous anesthésie générale, l’état de santé des animaux sera suivi régulièrement jusqu’à la fin des procédures, une attention particulière étant d’abord portée à la récupération post-opératoire (ajout d’AINS si nécessaire, suivi du poids, de la mobilité et du comportement). Nous utiliserons donc une grille d’évaluation de différents paramètres pour suivre leur retour objectif à des valeurs normales pendant la semaine de récupération. Une fois les procédures débutées, notre préoccupation sera de suivre quotidiennement l’évolution de plusieurs paramètres physiologiques et locomoteurs pertinents pour notre étude (qualité et quantité du sommeil, locomotion, exploration, etc.) pour détecter rapidement l’apparition de signes caractéristiques du TCSP et suivre de près la dégradation de l’état de santé général, aussi lié au vieillissement naturel. Ces modifications constitueront dès lors le point limite de nos procédures expérimentales avec mise à mort sans délai, pour prévenir l’apparition d’une éventuelle souffrance et d’une dégradation de leur autonomie, tout en établissant la preuve de concept recherchée dans cette étude.

Choix des espèces

Pour plusieurs raisons, nous avons choisi de travailler avec des souris âgées de 15 mois au début des procédures expérimentales. A cet âge-là, les souris sont à la moitié de leur espérance de vie, en pleine santé et sont matures sur le plan cérébral et locomoteur avec un cycle veille-sommeil stabilisé, efficace et consolidé. C’est à cet âge moyen qu’apparaît le TCSP chez les patients, précurseur de la MP. Le sommeil paradoxal (SP) est spécifique aux mammifères incluant la souris et l’Homme. Des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson, vers etc) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité / inactivité) mais ils n’ont pas de SP et la complexité de leur système nerveux n’est pas comparable à celle des mammifères. Ces modèles animaux ne sont donc pas des alternatives à la souris pour étudier le sommeil et développer des modèles précliniques de ses principales pathologies. Nos travaux récents ont identifié chez la souris les structures cérébrales ciblées dans le TCSP, leur organisation anatomique étant très similaire à celle du cerveau humain. Enfin, c’est une espèce animale plus adaptée que le rat aux études physiologiques et comportementales de longue durée (pas d’augmentation significative du poids et du volume corporel) facilitant ainsi leur manipulation et hébergement sur le long terme et raccourcissant la durée des procédures du fait de leur plus courte espérance de vie (2,5 ans maximum).

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et obèses par leur lignée db/db, elles sont exposées à des sons de forte intensité, jusqu'à 116 décibels, provoquant des pertes auditives, puis subissent des mesures d'audition sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés. Leur oreille interne est prélevée après la mise à mort, ce prélèvement ne pouvant se faire sur un animal vivant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives validées" et conclut à la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

La transmission d’un son de l’oreille externe en signaux aux cellules ciliées, cellules sensorielles de l’oreille interne situées dans la cochlée et reliées au nerf auditif. La vibration du tympan est transmise via la fenêtre ovale au liquide de l’oreille interne via les osselets (marteau, enclume et étrier). Les ondes sonores transmises dans le liquide de l’oreille interne sont traduites en signaux électriques par les cellules ciliées. Ces signaux électriques sont transmis au cerveau par le nerf auditif. Lorsque les cellules ciliées sont lésées, par une substance chimique, un traumatisme ou par le vieillissement, la personne a une perte auditive. Plus de 90% des pertes auditives sont dues à une destruction des cellules ciliées ou du nerf auditif (Hildebrand et al., 2008; Kujawa and Liberman, 2019). Dans le cadre du diabète et plus particulièrement celui de type-2, le mécanisme conduisant à une surdité n’est pas clairement établi. Plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une atteinte vasculaire au niveau de la cochlée, par analogie avec la rétinopathie et la néphropathie diabétique résultant d’une altération des micro-vaisseaux sanguins avec l’épaississement du sang par l’hyperglycémie. En parallèle, le diabète de type 2 induit une inflammation systémique chronique qui à terme peut avoir des répercussions au niveau de l’oreille interne et entraîner une dégradation des cellules ciliées, ou une augmentation de la susceptibilité au bruit. Chez la souris, il a été démontré qu’un trauma acoustique modéré, provoquant une surdité temporaire chez les animaux sains, induisait une surdité permanente chez des animaux diabétiques (Han et al., 2018). Enfin, une neuropathie périphérique ciblant le nerf auditif pourrait également conduire au développement de la surdité en lien avec le diabète. Il n’existe aucun traitement pharmacologique pour la surdité et les traitements du diabète, bien que permettant un meilleur contrôle de la glycémie ils ne traitent pas le cause de l’hyperglycémie qui reste élevée avec des conséquences au long-terme. Face à l’augmentation constante de la prévalence de ces deux pathologies, la recherche d’une solution thérapeutique adaptée reste un enjeu majeur de santé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont de valider ou d’invalider l’efficacité de candidats médicaments dans ces indications thérapeutiques. Ceci permettra de mieux sélectionner les candidats médicaments et de concentrer la rechercher et développement uniquement sur les candidats médicaments avec un haut potentiel d’efficacité.

Procédures

Les animaux vigiles seront exposés à des sons de forte intensité 2 intensités seront testées 100 et 116dB. Trois protocoles d’exposition seront testés : 100dB durant 2 heures 100dB durant 2 heures chaque jour jusqu’à 7 jours consécutifs 116dB pendant 1 heure Des mesures d’audition seront réalisées chaque semaine sous anesthésie générale. Un prélèvement de sang sera réalisé chaque semaine (au maximum 100µl) L’administration de traitement sera réalisée. Le traitement pourra être administré chez les animaux vigiles lors des traitements administrés par voie orale, intra-péritonéale, intraveineuse, sous cutanée. Le traitement sera réalisé chez des animaux sous anesthésie générale lors des traitements par transtympanique.

Impact sur les animaux

Développement d’un diabète de type 2 et d’une obésité. Pertes auditives consécutives à l’exposition au son de forte intensité

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car des prélèvements de l’oreille interne sont réalisés pour des analyses anatomopathologiques. Le prélèvement de l’oreille interne ne peut se réaliser sur des animaux vivants donc les animaux sont euthanasiés en vue de ces prélèvements.

Remplacement

Remplacer : le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour évaluer l’audition et développer des modèles pathologiques de trauma acoustique ou d’acouphènes. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. L’influence d’une pathologie métabolique telle que le diabète de type-2 sur la surdité est complexe, impliquant plusieurs facteurs (vasculaires, inflammatoires et modifications lipidiques) qui ne peuvent être évalués que in vivo chez l’animal. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.

Réduction

Réduire : le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistiques, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Cette approche nous permettra d’obtenir des résultats fiables

Raffinement

Raffinement : dans nos études, les impératifs éthiques associés, tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal, seront intégrés avec une attention particulière pour le phénotype diabétique et obèse (entre 5 et 25 semaines d’âge fenêtre d’âge des animaux inclus dans nos études). Un contrôle hebdomadaire de la glycémie et du poids des animaux nous permettra de suivre l’hyperglycémie et l’obésité dans le temps. Parmi les complications liées au diabète possiblement attendus, la polyurie (augmentation de la fréquence et du volume d’élimination urinaire), la polydipsie (augmentation de la sensation de soif) et la polyphagie (augmentation de la sensation de faim) sera prise en charge via des conditions d’hébergement adaptés (change des cages plus fréquent, mise à disposition de plus d’eau et de nourriture) . Une attention particulière sera portée aux procédures anesthétiques sur animaux obèses, par rapport au stockage de certains produits anesthésiants dans les graisses.

Choix des espèces

Le modèle de diabète chez la souris db/db est bien établi et caractérisé. Nous sommes en mesure de suivre l’évolution de l’audition chez cette espèce. C’est pourquoi nous avons choisi de travailler avec cette espèce dans le cadre de ce projet. Concernant le stade de développement nous allons inclure de jeunes adultes (développement du diabète à partir de 5 semaines et jugé non délétère selon la bibliographie de l’éleveur jusqu’à 25 semaines). Pour s’affranchir des pertes auditives liées à l’âge et se focaliser sur l’influence du diabète.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle génétique leur fait développer des tumeurs pulmonaires chez toutes les souris dès six semaines, avec un affaiblissement respiratoire et une mortalité atteignant 100 % à 35 semaines, et elles reçoivent sur animal vigile un génotypage par prélèvement de la queue puis des injections répétées dans l'abdomen. Les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou qui se prostrent sont mises à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne permet cette évaluation et conclut à la "nécessité" d'un système immunitaire complet.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux seuls ou en combinaison avec une immunothérapie dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous évaluons l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec une immunothérapie dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dance ce protocole subiront un prélèvement tissulaire de 2mm au niveau de la queue afin de réaliser leur génotypage et un marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. Ce geste est pratiqué sur animal vigile et prend 5 secondes. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine à partir de 8 semaines) et/ou une immunothérapie (1 injection par 2 semaines de 12 à 18 semaines). Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris conduit à la formation de tumeurs pulmonaires dans 100% des souris à partir de 6 semaines et de manière moins fréquente à des lymphomes thymiques. Les symptômes du développement tumoral et l’apparition possible d’une mortalité chez certains individus est observée à partir de 12 semaines. Une mortalité de 100% des souris est observée à 35 semaines. Ces lésions induisent ainsi des difficultés respiratoires conduisant à l’affaiblissement général de l’animal. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales pouvant générer de la douleur. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant la modification génétique à l’origine du développement tumoral seront mis à mort à 18 semaines dans la procédure 1 ou en même temps que les dernières souris présentant la modification génétique et qui atteignent un point limite dans la procédure 2.

Remplacement

La présence d’un système immunitaire complet, des cellules tumorales et du tissu sain d’origine est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de notre candidat médicament. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de son efficacité dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle ainsi que pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Procédure 1) Le nombre de souris sera de 20 par groupe de traitement avec 4 traitement différents effectués sur des animaux porteurs ou non de la maladie. Soit un total de 20 souris x 8 groupes = 160 souris. Cette procédure sera réalisée en 2 lots de souris soit 320 souris pour l’ensemble de la procédure de manière à pouvoir réaliser l’ensemble des analyses biologiques nécessaire à l’évaluation de l’activité du candidat médicament et à la compréhension de son mécanisme d’action. Procédure 2) Le nombre de souris sera de 35 par groupe, permettant d’effectuer les études de survie avec les 4 traitements différents sur les animaux porteur ou non de la maladie. Soit 35 x 8 = 280 souris. Procédure 3) Le nombre de souris sera de 10 par lot dans les deux procédures. Chaque lot de la procédure 3 est préalable aux lots de la procédure 1 et 2. Soit un total de 30 souris. La réalisation du second lot de la procédure 1 et la procédure 2 seront conditionnés aux résultats obtenus avec la première expérience. S’il n’y a pas d’effet sur l’incidence tumorale, le reste du protocole ne sera pas réalisé, constituant une réduction. La stratégie de croisement des souris génétiquement modifiées est optimisée de manière à générer des individus qui seront tous utilisés dans les différentes procédures. De plus, les femelles et les mâles entreront dans les analyses de manière à utiliser tous les individus générés pour ce projet.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 1 à 3 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 12 semaines. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles ainsi qu'un blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ces souris. Les individus concernés seront mis à mort. Les animaux seront mis à mort si la perte de poids supérieure est à 20% du poids maximal observé ou la prostration de l'animal. Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure, soit à 18 semaines en procédure 1 ou à l’obtention d’un point limite en procédure 2. Les animaux non porteurs de la maladie de la procédure 2 seront mis à mort en même temps que les derniers animaux porteurs. Dans la procédure 3, la stratégie de croisement fait appel à des femelles sauvages de manière à ce qu’elles ne présentent pas les effets délétères liés à la mutation génétique. Les mâles sont prélevés et restitués à l’élevage de la lignée de manière à ne pas avoir à générer d’individus pourteurs de la maladie supplémentaires.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes tels que les souris sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.