Souris
Evaluation et caractérisation de la réponse immunitaire de différents vaccins contre les virus infectieux SARS-CoV2 et Grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections dans le muscle de la patte et des prélèvements de sang au niveau de l'oeil, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des candidats vaccins contre le SARS-CoV-2 et la grippe. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance, tout en prévoyant l'exclusion et la mise à mort immédiate des souris montrant prostration ou perte de poids. Sur le remplacement, il indique que le modèle souris est adapté mais aussi "imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques".
Objectifs
Les épidémies de coronavirus et de grippe posent un problème majeur de santé publique. Ces 2 virus sont soumis à de nombreuses modifications génétiques limitant l’efficacité des vaccins actuels. Le virus SARS-Cov2 possède, entre autres, une protéine permettant l’entrée du virus dans les cellules. C’est la cible des vaccins actuels qui génèrent une réponse immunitaire générant de nombreux anticorps de courte durée de vie. Le virus possède également la nucléocapside (N) contenue à l’intérieur du virus, qui est la protéine qui mute le moins entre les différentes souches de coronavirus. Pour le virus de la grippe, il existe également une protéine très conservée, la nucléoprotéine (NP), faisant d’elles des cibles pertinentes pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. La technologie mise au point permet aux candidats vaccins d’être très accessible aux cellules du système immunitaire pour protéger des infections. Un partenariat avec une entreprise de biotechnologie permet l’obtention de nouveaux candidats contre la Grippe ou le SARS Cov2 contenant cette technologie. Il est intéressant d’étudier si ces nouvelles formulations vaccinales sont capables de produire des anticorps permettant de lutter contre les virus, mais également de stimuler le système immunitaire afin d’obtenir une protection longue dans le temps. Plus précisément, pour le projet SARS Cov2 les réponses immunitaires sont étudiées suite à l'injection de différents candidats vaccins contenant la protéine permettant l’entrée du virus et/ou la nucléocapside. Pour le projet grippe, des formulations vaccinales avec NP sont caractérisées dans la lutte contre les épidémies saisonnières. Ces études seront réalisées chez le modèle souris. Techniquement, les formulations vaccinales à tester sont injectées dans le muscle de la patte qui est une voie utilisée pour étudier de nombreux phénomènes immunologiques. Des prélèvements de sang réalisés permettront de quantifier les anticorps générés chez les animaux, et des prélèvements d’organes, post mortem, seront étudiés pour valider si les candidats vaccins sont efficaces.
Bénéfices attendus
Les nouveaux condidats vaccins sont très prometteurs pour la santé humaine. Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 ou produits chaque année contre la grippe saisonnière, sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis de protéines du virus présent à sa surface. Avec l’apparition de nombreuses mutations et donc l’apparition de nouveaux variants, des formulations vaccinales, visant à développer une réponse immunitaire à long terme, pourrait permettre de pallier les problèmes des vaccins actuels. Cela permettrait de mieux traiter les patients avec un vaccin capable d’induire une protection contre différentes souches de SARS-CoV-2 et de la grippe. Selon les résultats obtenus, il pourra être envisagé de porter ce projet à plus grande échelle avec la possibilité de phases cliniques.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21 ou 28 jours selon la procédure utilisée et dureront environ 5 à 10 secondes par souris. Pour 30% des animaux, 2 prélèvements de sang seront réalisés, le premier durant les phases d'immunisations, et le second au jour de sa mise à mort. 100ul de sang seront prélevés au niveau de l'oeil sur animaux vigiles. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne) sera appliqué. Chaque prélevement durera 5 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Pour l'ensemble du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Toutefois, si une souris présente des signes de souffrance tel que la prostration, l'absence de réponse aux stimuli extérieurs ou la perte de poids, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes et des différents tissus ciblés. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires. L'analyse de puissance et l'estimation de la taille de l’échantillon se font en amont de l’expérimentation. Test d’hypothèse: est-ce que la moyenne de la population traitée avec une constructions X est différente de la moyenne de la population contrôle et de la moyenne des autres groupes immunisés. Pour les analyses des résultats et les comparaisons de plusieurs échantillons nous utilisons les Analyses de variance ou ANOVA (one-way analyses of variance) qui va consister à chercher le rapport entre la variance entre les groupes et la variance à l'intérieur des groupes. Également les tests statistiques comme des tests de comparaison de moyennes de Student, ou non paramétrique (Mann Whitney) avec un seuil minimal du risque alpha fixé à 5% peuvent être utilisés selon les comparaisons souhaitées.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine. L'immunisation est réalisée dans le muscle. C'est une voie permettant l'obtention d'une bonne réponse immunitaire et étant le peu invasif pour l’animal. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local (Tétracaïne, une goutte) sera appliqué.
Choix des espèces
La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro
Etude du rôle du récepteur CD47 dans un modèle d’uvéite
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une inflammation de l'oeil leur est induite par injection d'une émulsion et d'une toxine, avec transfert de cellules immunitaires et suivi par imagerie de la rétine, pour tester le récepteur CD47 comme cible thérapeutique. Le porteur affirme que cette uvéite n'entraîne pas de douleur perceptible et que la perte de vision importe peu, la souris se déplaçant grâce à ses vibrisses. Il justifie l'effectif élevé par la forte variabilité du modèle et écarte le remplacement, les études in vitro ne montrant pas les signes cliniques.
Objectifs
Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le potentiel thérapeutique de différentes cibles en empêchant soit l'activation du système immunitaire soit le recrutement de cellules immunitaires dans l'œil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ces récepteurs identifiés ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de ces cibles pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur CD47 comme potentielle cible thérapeutique chez l'Homme en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'œil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer quelles cellules immunitaires sont impliquées.
Procédures
Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection sous-cutanée (ISC) d’une émulsion protéique ou le transfert adoptif de cellules immunitaires par injection intraveineuse (IV). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible. Puis traitements par injections intrapéritonéale (IP) ou intra-vitréenne (IVT). Toutes les injections (ISC, IV, IP et IVT) sont rapides (moins d’une minute). Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Induction d’EAU par injection sous-cutanée d’une émulsion de peptides et injection IP d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique) => phénotype modéré car nuisance visuelle (EAU) mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer (utilisation de ses vibrisses). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'études des signes cliniques de la pathologie ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d'étude.
Réduction
Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 1450 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isofluorane. Les animaux sont hebergés en goupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant l'expérimentation. Si nécessaire, et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatoués. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement par le personnel animalier compétent. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âge auquel ils sont susceptibles de développer la pathologie.
Etude du rôle thérapeutique de la modulation de MT5-MMP dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection d'un virus dans le cerveau, puis sont évaluées à quatre mois par des tests comportementaux, l'open field et le labyrinthe en Y, avant perfusion intracardiaque et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des traitements et décrit les manipulations comportementales comme indolores. Il juge encore "indispensable" le recours à l'animal, les modèles cellulaires iPS ou CRISPR n'offrant selon lui que des informations partielles.
Objectifs
Ce projet répond à des interrogations scientifiques qui sont essentielles au développement de nouvelles stratégies anti-Alzheimer innovantes ciblant MT5-MMP. Les objectifs du projet sont les suivants :
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera: A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliquant MT5-MMP dans : 1) le métabolisme de l’APP et plus précisément celui de ses fragments neurotoxiques, C99 et Abêta ; 2) le métabolisme de Tau ; et 3) les processus inflammatoires dans le cadre de la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités de MT5-MMP qui pourraient apporter des solutions chez l’homme.
Procédures
Le projet est organisé sur une seule procédure car les animaux de départ (nouveau-nés au stade P1) seront utilisés jusqu'à la fin de l'expérimentation (5 mois). La procédure est organisée en 4 étapes : 1) injection intracérébroventriculaire d'AAV9 dans des souris nouveau-nées. Nous injecterons par voie intracérébroventriculaire (ICV) des souris nouveaux-nées 5xFAD et leurs contrôles sauvages à P1 avec des AAV9 qui codent pour différents variants de la protéase MT5-MMP. Cette étape d'injection est d'une durée de 30 sec. 2) Génotypage des nouveaux-nés. Une biopsie de la queue (< 1 mm) est réalisée et les petits sont remis avec leur mère. Le génotypage permettra l'identification WT (sauvages) ou 5xFAD (Alzheimer). Cette étape est réalisée dans la durée de l'anesthésie. 3) Analyse comportementale. Quatre mois après l’injection, les capacités cognitives des souris seront évaluées dans des tests comportementaux, notamment l’open field et le labyrinthe en Y. La durée des manipulations dans l'open field est de 2x5min pendant 5 jours, et la durée des manipulations dans le labyrinthe est de 8min pendant 5 jours. 4) Perfusion intracadiaque et prélèvements. La durée de cette étape est d'environ 15min. Suite aux tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés, leurs cerveaux récupérés pour des analyses histopathologiques ou microdisséqués pour des analyses biochimiques. Ces analyses porteront sur différents marqueurs de la pathologie, notamment en relation avec le métabolisme de l’APP et de ses fragments les plus toxiques (e.g., C99, peptide Abêta), l’accumulation de la protéine tau, ainsi que sur des marqueurs cellulaires et moléculaires de la neuroinflammation.
Impact sur les animaux
Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés. Les interventions telles que l'injection ICV chez le jeune et la biopsie de la queue sont réalisés sous anesthésie. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique en injection IP d’un mélange Kétamine (150 mg/kg) et Xylazine (15 mg/kg) suivi d'une perfusion intracardiaque. La mort survient par les effets du surdosage anesthésique.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, pour compléter nos observations in vivo (compréhension des effets bénéfiques de l’absence de MT5-MMP), nous avons développé des approches expérimentales in vitro comme des cultures primaires ou des cultures HEK ou iPS, avec des sous-expression/sur-expression de MT5-MMP, en parallèle du développement de modulateurs d’activité de MT5-MMP. Nos résultats obtenus doivent à présent être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux anti-MT5-MMP dans la MA doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle 5xFAD. Ces souris 5xFAD représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).
Réduction
Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - WT (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 - 5xFAD (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 Soit 384 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions et prend également en compte un certain nombre d’échec dès l’étape d’injection des AAV à P1.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et une attention particulière sera accordée aux procédures de raffinement. Les souris disposeront de nids végétaux à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l'environnement et matériau de nidification afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité tout en procurant un sentiment de sécurité chez l'animal.
Choix des espèces
Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour étudier l’impact de MT5-MMP sur les marques de la pathologie nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (5xFAD) exprimant les gènes humains codant pour l’APP et la PSEN1 (préséniline 1) portant, respectivement, 3 et 2 mutations familiales de la MA, d’où leur nom 5xFAD. Toutes les souches possèdent le même fond génétique C57/BL6 et seront générées à l'animalerie. Les animaux seront utilisés à deux stades : 1) Stade post-natal P1, dans lequel les injections d’AAVs seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de MT5-MMP dès les premiers jours de vie post-natale. 2) Stade adulte à l’âge de 4 et 5 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle on peut déjà observer des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique.
ONCO-SC Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 5000
Près de 250 études par an, au gré des commandes des clients : 62 500 rongeurs, soit 57 500 souris et 5 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une société prestataire de recherche préclinique leur greffe des tumeurs sous la peau, dans la peau ou dans la graisse mammaire, puis leur administre des composés anticancéreux par le nez, la trachée, la bouche ou par injection, jusqu'à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Dans le résumé publié, la description des effets néfastes s'arrête au milieu d'une phrase, sur "une évolution du volume tumoral". Le porteur affirme que seuls les petits rongeurs offrent un statut immunodéprimé "indispensable à l'implantation de cellules tumorales humaines". Sur le devenir, il écrit seulement "Les animaux seront mis à mort", alors que le champ structuré déclare 3 000 souris et 200 rats réutilisés.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Implantation de transpondeur pour identifier l’animal en sous cutané, sous anesthésie générale (Isoflurane 3-5%) en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe. Induction tumorale : Sous anesthésie Test de composés chimiques ou biologiques : - Administrations intra-nasales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%), maximum 25µL par narine. - Administrations intratrachéales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%). - Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%) si nécessaire, si possible sous contention. - Administrations PO sous contention Mesure des animaux : sous contention Prélèvements : - Sang : o prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale à l’isoflurane (exemple non exhaustif : veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire). o prélèvement par piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention. o prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Ensuite, constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale. - Prélèvements de tissus (foie, cœur, poumons etc…) post mortem. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique, confirmée par une deuxième méthode physique. Le pentobarbital sera évité en cas de prélèvement des poumons du fait de son caractère irritant. - Mise à mort par le CO2, confirmée par une deuxième méthode physique. Cette méthode sera évitée en cas de prélèvement des poumons. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir : prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Trois types de greffe pourront être faites dans ce projet : Sous cutanée, intradermique et dans la graisse mammaire. Dans chaque cas, il y aura une évolution du volume tumoral ce
Devenir
Les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études de screening de composés ou de modèles, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Dans l’objectif de raffinement, toutes les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la structure chargée du bien-être animal. Pour les nouveaux modèles la SBEA analysera les conséquences des procédures sur le bien-être des animaux, la validité des résultats scientifiques obtenus, et ils détermineront les points limites. Toutes les procédures invasives, mais aussi la plupart des procédures faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle tumoral. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal est observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance, sont suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Trois types d’enrichissements sont systématiquement ajoutés (sizzle-dri (souris), hutte ou tunnel (rats), batônnets, nourriture dans la cage) La greffe de tumeur est une procédure de gravité modérée, réalisée sous anesthésie générale gazeuse à l’Isoflurane. Lorsque l’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprenorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe projet. Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Dans de rares cas il sera possible de travailler avec des animaux plus jeunes (4 semaines d’âge minimum pour leur réception et 6 semaines pour la manipulation).
Physiopathologie de l’arthrite : modèles de souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite, avec injections intra-articulaires et prélèvements de sang sous anesthésie, pour évaluer une protéine et repositionner des médicaments existants. Le porteur indique que l'arthrite provoque une douleur et fixe un point limite au score maximal aux quatre pattes ou à 20 % de perte de poids, seuil déclenchant la mise à mort. Il affirme que la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu'au niveau d'un "organisme entier", les rubriques réduction et raffinement se réduisant à quelques lignes.
Objectifs
1)-Evaluation du rôle de la protéine QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse. 2)-Evaluation de médicaments qui induisent QKI5 ou de lentivirus-QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse (Repositionnement de médicaments déjà existants sur le marché).
Bénéfices attendus
Compréhension du rôle de QKI5 dans l'arthrite et l'inflammation. Repositionnement de médicaments qui induisent QKI5 pour une application anti-inflammatoire et anti-érosion osseuse.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, aucune procédure chirurgicale. Prélèvements de sang sous anesthésie. Injections IP de serum ou de médicament Injections intra-articulaires sous anesthésie. Durée de la procédure pour chaque souris : 5 minutes.
Impact sur les animaux
L'arthrite induite par les différents modèles provoquera une douleur dont l'intensité sera examinée suivant le codage suivant : Le point limite est atteint lorsque le score de l’arthrite est de 12 (3 à chaque patte) et le score total (apparence générale, apparence des orbites, apparence des oreilles, prise alimentaire ou boisson) est > 15 ou lorsque la perte de poids est de 20 % . Les modèles présentés ici ne sont pas nouveaux et ont été décrits de façon extensive dans la littérature par d'autres auteurs.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux justifiée par l'impossibilité de réutilisation.
Remplacement
la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu’au niveau d’un organisme entier. Cependant, chaque fois que cela sera possible, les analyses seront effectuées sur des cellules en culture. Réduire : Raffiner : La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.
Réduction
Le nombre de souris sera limité au strict nombre nécessaire pour une signification statistique des résultats. Six à 8 souris par groupe d’expériences seront utilisées. Les tests statistiques Mann-Whitney et t de Student seront utilisés.
Raffinement
La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.
Choix des espèces
Les souris possèdent des articulations dont l’inflammation reproduit l’arthrite humaine. Seule l’espèce Mus Musculus possède les souches nécessaires (Transgéniques, KO, KI) Age adulte : 8 à 16 semaines pour l'expérimentation car le système immunitaire est mature. A partir de 8 semaines pour les prélèvements de souris K/BxN car elles sont adultes et que l'arthrite est bien établie.
Effets thérapeutiques d’anticorps G6b-B monoclonaux et bispécifiques sur un modèle murin de thrombopénie induite à l’héparine (HIT).
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent de l'héparine et des anticorps par injections répétées, avec des prélèvements de sang quotidiens à la queue, pour modéliser une thrombopénie induite par l'héparine. Le porteur indique qu'une ablation de phalange sert au génotypage et peut être douloureuse et invalidante, et que les injections et prélèvements peuvent provoquer douleur et saignements, aggravés chez les souris thrombopéniques. Il conclut que ce processus complexe est difficile à reproduire in vitro et nécessite des souris modifiées.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle majeur dans l’arrêt des saignements. Ce processus physiologique est finement régulé afin de permettre une réponse rapide, tout en prévenant le risque de thrombose (formation d'un caillot dans un vaisseau sanguin). L’héparine est un anticoagulant permettant de prévenir les thromboses, utilisé notamment lors de chirurgie. C’est l’un des anticoagulants les plus utilisés. Mais parmi les patients recevant de l’héparine, 1 à 3% vont développer une thrombopénie induite par l’héparine (HIT), une complication pouvant être potentiellement mortelle. Cette réaction provoque une thrombopénie (diminution anormale du nombre de plaquettes circulantes) suite à une activation anormale des plaquettes sanguines, pouvant également aboutir à une thrombose. L’objectif de ce projet est de cibler les récepteurs plaquettaires impliqués dans la régulation de l’activité des plaquettes sanguines. Le but étant de pouvoir empêcher ou prévenir des réactions telles que la HIT en ciblant ces récepteurs. Pour cela, nous voulons tester l’utilisation d‘anticorps qui permettent de cibler différents récepteurs : un récepteur inhibiteur de l’activité plaquettaire et les récepteurs activateurs impliqués dans la HIT. Notre hypothèse est que l’activation du récepteur inhibiteur va induire l’inhibition/inactivation du récepteur activateur, permettant ainsi de réduire ou prévenir le syndrome de HIT. Sur le long terme, cela pourrait permettre de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans le cadre d’une HIT ou d’autres syndromes impliquant une activation anormale des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre le rôle de récepteurs plaquettaires dans l'activation des plaquettes et plus spécialement dans la réaction de HIT. A long terme, les différents anticorps que nous testons pourraient mener à de potentielles voies thérapeutiques afin de prévenir ou d'empécher par exemple la réaction de HIT.
Procédures
L'injection des traitements par voie intrapéritonéale (IP) ou d'héparine par voie sous-cutanée (SC) se feront sur souris vigiles. Chaque souris aura une injection IP au début de l'expérience (J0) et une injection SC quotidienne à partir de J1 pendant 4 jours. Ces procédures seront effectuées de manière rapide et efficace (moins d'une minute) afin de minimiser le stress induit par la préhension de l'animal. Un petit volume de sang sera prélevé à la queue de l'animal, après section ou retrait de la croute formée, de façon quotidienne pendant 5 jours (de J0 à J4) puis un dernier prélèvement aura lieu à J7 si nécessaire. Les anticorps à tester seront injectés par voie intraveineuse (IV) sous anesthésie, soit une fois au début de l'expérience (J0), soit quotidiennement pendant 3 jours (de J2 à J4) en fonction du protocole étudié. Pour le prélèvement de sang terminal, la durée de la procédure est inférieure à 10 minutes. Elle sera réalisée sous anesthésie et sera suivie de la mise à mort de l'animal avant son réveil.
Impact sur les animaux
La phalangectomie (PE1) utilisée à la fois pour le génotypage et l'identification des souris peut engendrer une douleur et peut avoir un potentiel caractère invalidant. Les injections intrapéritonéales ne présentent pas de douleur (PE2), hormis celle de l'insertion de l'aiguille. Pour les injections intraveineuses (PE2), les nuisances attendues sont une douleur et un risque de saignement suite à l’injection. Suite à la procédure, les animaux pourront présenter une thrombopénie. Les prélèvements à la queue peuvent engendrer une douleur et un saignement peut survenir après section de la queue, notamment chez les souris thrombopéniques.
Devenir
Les animaux seront injectés en intrapéritonéal et un prélèvement de sang à la queue sera réalisé, de manière quotidienne pendant 5 jours. A l'issue de cette procédure, le sang sera prélevé de manière terminale au niveau de l'aorte abdominale et tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
La thrombopénie induite par l’héparine est un processus complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire de façon complète in vitro. La compréhension de ces processus physiopathologiques est impossible chez l’homme : il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Pour induire une HIT et tester l’efficacité des différents anticorps, il est déterminant d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour l’expression des facteurs et récepteurs impliqués dans ce processus.
Réduction
La stratégie du développement de la nouvelle lignée est conçue pour impliquer le moins d’animaux possibles. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est calculé afin d’obtenir suffisamment d’évènements informatifs et de permettre l’analyse de données statistiquement significatives. Un effectif de 3 expériences indépendantes est prévu afin de réaliser des tests statistiques permettant d’évaluer le rôle des récepteurs G6B dans la thrombopénie induite par l’héparine.
Raffinement
Le développement des bébés générés pour la nouvelle lignée sera observé attentivement afin de s’assurer que ces animaux ne présentent pas d’handicaps. Le phénotype de la lignée sera étudié et un passeport phénotypique sera réalisé. Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux entre 2 et 5 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Quelques croquettes sont déposées dans le fond de la cage afin d’aiguiser le comportement de recherche de nourriture. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites sera établie pour chaque procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire et ainsi limiter la souffrance. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduits au maximum. Pour cela, les injections intraveineuses ainsi que les prélèvements à la queue seront réalisés sous anesthésie générale et les souris seront maintenues sur une tablette chauffée à 37°C. Suite à l'injection intraveineuse, un anesthésique local sera appliqué pour éviter tout douleur. Pour le prélèvement de sang terminal, l'animal sera sous anesthésie générale et maintenu à 37°C. A la suite du prélèvement, l’animal sera sacrifié avant son réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour notre étude car des travaux publiés montrent la génération de souris génétiquement modifiées permettant d’induire ce syndrome de HIT. Pour réaliser notre étude, nous allons remplacer dans cette lignée le récepteur inhibiteur murin par le récepteur humain que l’on souhaite étudier afin de réguler l’activité des plaquettes. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. L’âge des souris n’étant pas un critère de choix, nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Lésion chronique des neurones dopaminergiques de la substance noire et neuroprotection par thérapie génique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un virus exprimant une forme mutée de l'alpha-synucléine pour induire une lésion type Parkinson, puis une injection d'amphétamine avec observation du comportement rotatif, avant perfusion intracardiaque. Le porteur indique que la chirurgie cérébrale peut provoquer stress, douleur locale et variations de poids, et que les cerveaux seront prélevés pour analyse. Il présente le projet comme un préalable à une demande d'essai clinique de thérapie génique et écarte le remplacement, l'in vitro n'offrant pas le contexte physiologique.
Objectifs
La maladie de Parkinson se caractérise notamment par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire. Via le recours à de multiples modèles animaux de cette pathologie, notre laboratoire a démontré le rôle essentiel de la protéine EN1 pour la survie de ces neurones. Il est à noter qu’une seule et unique injection de EN1 permet une activité neuroprotectrire pendant >12 semaines, suggérant que son mécanisme d’action repose sur des leviers épigénétiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer si faire exprimer EN1 de façon durable via des vecteurs viraux de type AAV permettrait de prolonger son effet neuroprotecteur. Pour ce faire, nous prévoyons de développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la substance noire via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. L’expression durable de EN1 sera induite grâce à l’injection d’un second AAV. Afin de soutenir une prochaine demande d’essai clinique pour l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de la protéine thérapeutique hEN1 chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, ce projet a deux objectifs. Objectif 1 : développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la SN via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. Objectif 2 : Utiliser des vecteurs viraux (type AAV) pour permettre une expression durable d’EN1 dans le but de prolonger son effet neuroprotecteur.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’investigations précliniques qui devront permettre la soumission d’une demande d’essai clinique pour l’utilisation d’un outil de thérapie génique chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet développe un modèle murin de lésion chronique qui permettra de mieux rendre compte de l’aspect évolutif de la pathologie humaine. Quant à l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de EN1, elle devrait permettre une action neuroprotectrice prolongée et offrir de nouvelles perspectives pour le traitement de la maladie de Parkinson.
Procédures
Ce projet contient 3 procédures avec plusieurs interventions par procédure. Un maximum de 292 souris seront utilisées dans ce projet. 1) Injection stéréotaxique intracérébrale : La chirurgie se déroule en conditions d’asepsie et d’anesthésie et analgésie générale sur des souris âgées de 60 jours au minimum. Un maximum de 292 souris seront injectées d’un adeno-associated virus. La procédure dure moins d’une heure. Les souris seront gardées un maximum de 16 semaines après injection. 2) Injection intrapéritonéale d'amphétamine pour stimulation du système nigrostriatal et suivi du comportement rotatif : La procédure se déroule sur animal vigile. Après une injection intrapéritonéale d’amphétamine, l’animale est filmé pendant 10 min dans une boite ouverte. Un maximum de 204 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 30 minutes. 3) Perfusion intracardique : La procédure se déroule en conditions d’anesthésie et analgésie générale. Un maximum de 292 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, des souris peuvent ne pas supporter la chirurgie ou avoir un mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Aussi, suite à une injection stéréotaxique intra-cérébrale, il est possible que les animaux soient stressés, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. Après une période de surveillance post anesthésique, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec leurs congénères. Nous ne nous attendons pas à une certaine mortalité dû aux molécules injectées. Dans le cadre du suivi des animaux selon les paramètres définis dans une grille d’évaluation du bien-être, à la suite d’une injection intracérébrale, les animaux seront observés quotidiennement pendant 5 jours (puis 2 fois par semaine), afin de détecter au plus vite les signes de perturbations du bien-être animal et d’intervenir dans les plus brefs délais.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau collecté afin de permettre des analyses histochimiques permettant d’évaluer la lésion induite par la surexpression de la synucléine et/ou l’effet protecteur de EN1 sur les neurones DA de la SN.
Remplacement
Ici, nous chercherons à développer un modèle murin de la maladie de Parkinson avec des AAVs dont l’expression a été déjà validé. Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. L’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de EN1. Enfin, le développement d’un modèle chronique de la maladie de Parkinson n’est pas réalisable in vitro car la diffusion et toxicité de la protéine synucleine mutée ne peuvent être évaluées que dans le contexte physiologique.
Réduction
Sur la base de notre expérience antérieure, nous prévoyons d'utiliser 8 souris par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Pour les analyses histologiques, nos résultats préliminaires indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour avoir suffisamment de puissance statistique (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Nous proposons n=8 pour maintenir la puissance statistique en cas de décès au cours de la chirurgie ou de mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Les données quantitatives obtenues feront l’objet d’une analyse de variance, suivie de tests post hoc. Si les distributions des moyennes sont normales, nous utiliserons des tests statistiques paramétriques (Student ou Anova). Si ce n’est pas le cas, nous opterons pour un test non-paramétrique (i.e. Mann-Whitney). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux, la caractérisation de nos différents lots/type de virus étant notamment réalisée sur des effectifs réduits. En effet, dans le cadre des expériences visant à optimiser les conditions d’utilisation de nos AAVs, nous prévoyons d’avoir recours à des injections bilatérales afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.
Choix des espèces
La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de maladie de Parkinson ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative pour laquelle l’âge moyen d’apparition des premiers symptômes est de 57 ans en France. Nous utiliserons donc exclusivement des souris adultes dont l’âge sera voisin de 60 jours.
Etude de la fonction de la protéine CKIP1 dans les microglies de souris EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection abdominale cinq jours de suite avant mise à mort et prélèvement de tissus cérébraux, pour étudier une protéine des cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés relèvent de la connaissance générale et d'une "potentielle cible pharmacologique". Il indique avoir développé un modèle de culture cellulaire pour limiter le recours à la souris entière, tout en jugeant les expériences in vivo non modélisables.
Objectifs
Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.
Procédures
Une Injection abdominale 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).
Impact sur les animaux
Inconfort lié à des injections répétées
Devenir
Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés et les analyses réalisées avec des test statistiques appropriés. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.
Impact du microbiote intestinal dans les maladies neurodégénératives – MICROBIOTALZ
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
1 389 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur des souris modèles d'Alzheimer, le porteur décrit une déplétion du microbiote par antibiotiques ou laxatif pouvant provoquer des diarrhées, des prélèvements de sang et de selles, et un conditionnement par la peur reposant sur trois chocs électriques. Il indique que les souris donneuses de microbiote sont tuées d'emblée et que les receveuses le sont après les tests, pour analyse du cerveau. Le remplacement est écarté au motif que l'étude des déficits de mémoire ne peut se faire in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le lien entre la dysbiose intestinale présente dans les souris 5xFAD, modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer, et l'amplitude des déficits de mémoire de ces animaux. Nous souhaitons démontrer la causalité de la dysbiose intestinale sur les phénomènes mnésiques.
Bénéfices attendus
L'identification de souches causales et/ou protectrices de la pathologie constituera la base d'une prévention de la maladie d'Alzheimer basée sur la restauration d'un microbiote intestinal sain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (2 min) et de selles (1 min) : les fèces et environ 150μL de sang seront prélevés en sous-mandibulaire au démarrage de l'experimentation et à la fin de l'étude 60 jours plus tard.
Impact sur les animaux
La déplétion du microbiote endogène des animaux par antibiotiques ou laxatif peut induire des diarhhées qui seront toutefois temporaires car la réintroduction d'un microbiote intestinal complet traite immédiatement ces symptomes. Lors de la procedure de conditionnement par la peur, les 3 chocs électriques administrés aux animaux vont générer une douleur transitoire. Lors de la réexposition des animaux à l'environnement où ils auront reçu les chocs, un stress sera mesurable si leurs performances de mémoire ne sont pas altérées.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux donneurs de microbiotes sont mis à mort et ne rentrent pas expérimentation. A l'issue des procédures 1 à 3, les animaux receveurs sont conservés jusqu'à la fin des traitements et des tests de comportement. A l'issue de la procédure 4 (dernier test expérimental), tous les animaux sont mis à mort pour analyse de la pathologie cérébrale.
Remplacement
L’étude des déficits de mémoire nécessite l’utilisation d’animaux, ceci ne pouvant se faire sur des modèles in vitro.
Réduction
Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 12 souris receveuses par groupe était suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. Taille minimale des groupes receveurs : le nombre d’individu varie entre 9 et 22 animaux en fonction du test comportemental. Nos expériences seront réalisées sur des groupes de 12 animaux/traitement et reproduites sur 2 à 3 lots d’animaux différents soit au total 24 à 48 animaux/groupe (logiciel G*power, erreur α de 5%, puissance (1-β err prob) de 80%). Plan d'analyses statistiques (logiciel Graphpad Prism7) -Vérification de normalité des données : test de D'Agostino-Pearson -Distribution Gaussienne => analyse de variance à un facteur (ANOVA) puis test de Dunnett pour correction des comparaisons multiples par rapport à la condition Véhicule -Distribution non Gaussienne => test de Kruskal-Wallis puis test correctif de Dunn's -Niveau de significativité à p=0,05. La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. •Stratégie de réduction La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. Le suivi longitudinal des performances mnésiques produira un recueil de données multiples pour un même animal. Le projet prévoit une multiplicité d'analyses post mortem sur un même animal.
Raffinement
•Suivi des animaux Inspection - 2 à 3 fois par semaine avec prise de poids 2 fois par semaine, avant chaque injection. Une grille d’évaluation de l’état général de chaque animal sera remplie (présentée en annexe 2) avec identification de points limites où une prise en charge adaptée sera effectuée. •Hébergement et raffinement - Hébergement en cage collective contenant de l'enrichissement environnemental (matériel pour la nidification). Les animaux seront tatoués afin de pouvoir les identifier dans la cage collective. •Procédure de conditionnement à la peur - Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 3 chocs d'une durée courte de 2 secondes est suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. L'intensité des chocs sera adaptée à la taille/poids de l'animal au moment de l'expérimentation.
Choix des espèces
Les souris C57Bl/6J, utilisées dans nos études, représentent des lignées classiques pour les études en neurobiologie, principalement pour l'étude de la mémoire. La lignée de souris transgénique 5xFAD (fond C57Bl/6J) est également une lignée très utilisée pour modéliser la maladie d'Alzheimer car elle récapitule l'ensemble de la neuropathologie à l'exception de la pathologie Tau. L'extrême rapidité d'apparition des symptômes fait de cette lignée transgénique le modèle le plus adapté pour étudier une modification de l'apparition des déficits de mémoire induite par des interventions sur la composition du microbiote intestinal. Les souris Swiss présentent une alternative aux souris C54BL/6J, étant également de très bons modèles d'étude des performances mnésiques. Les études seront réalisées sur des animaux adultes car les pathologies étudiées seront des pathologies se développant à l'âge adulte.
Etude du rôle des cellules stromales mésenchymateuses et de l’expression des microARN lors du développement de fibroses induites par le tetrachloride de carbone (CCl4) dans un modèle murin (C57BL/6).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone tous les deux jours pendant huit semaines pour induire une fibrose du foie, avant une mise à mort par ponction cardiaque et prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la fibrose ne provoque aucune douleur et vise à comprendre le rôle de cellules souches et l'effet de la metformine sur cette pathologie. Il indique que le modèle cellulaire ne suffit pas et conclut que le passage par l'animal est inévitable pour cette étude.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de la fibrose hépatique. La fibrose hépatique est caractérisée par l'accumulation excessive des constituants de la matrice extracellulaire dans le parenchyme hépatique. Cette pathologie est la complication majeure de toutes les maladies chroniques du foie induites par une infection virale, des perturbations métaboliques, l'abus d'alcool. Une fibrose hépatique non contrôlée peut entrainer in fine une cirrhose du foie, un dysfonctionnement hépatique et un carcinome. A ce jour, il n’existe aucun traitement ni moyen de diagnostic précoce. Aussi, plusieurs voies de recherche et de développement sont en cours pour palier à ce déficit. Notamment la metformine, un traitement du diabète de type 2 qui présenterait des effets anti-fibrotiques intéressants. Dans le foie, comme dans les autres organes, les cellules effectrices de la fibrose sont les myofibroblastes. D’origine encore largement débattue, les myofibroblastes dériveraient principalement des cellules stromales mésenchymateuses (MSC). Lors de leur différenciation en myofibroblastes, les MSC expriment une combinaison spécifique de cytokines, facteurs de croissance, hormones ainsi que des miARN et pourraient par ce biais réguler les phénomènes de fibrose. Il existe plusieurs méthodes pour induire expérimentalement une fibrose hépatique chez l’animal de laboratoire. Nous utiliserons le modèle de fibrose induite par l’injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone (CCl4) chez les souris C57BL/6. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 50 individus pour la durée que couvrira ce projet. L’objectif de notre étude est de comprendre le rôle des MSC dans le développement de la fibrose hépatique, d’identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans la pathogenèse de la fibrose hépatique et d’étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique. Permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose, d’identifier les miARN biomarqueurs du développement de la fibrose, permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie et étudier la capacité de la metformine à induire une régression de la fibrose hépatique.
Procédures
Les souris subiront une injection intrapéritonéale tous les 2 jours pendant 8 semaines (n=50). L'injection durera à chaque fois en moyenne 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections se feront avec une bonne contention de l'animal. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analagésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections. La fibrose hépatique ne provoque aucune douleur. La ponction cardiaque (1 mL) sera précédée d’une anesthésie volatile par isoflurane (1,5 à 2%) et suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires.
Devenir
Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%). Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique).
Remplacement
Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules souches mésenchymateuses hépatiques apportent quelques résultats sur leur capacité de différenciation en myofibroblastes, ainsi que sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas à modéliser le processus de fibrose dans son ensemble. Le passage par l'in vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose hépatique, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique.
Réduction
Réduction du nombre : Le développement d’une fibrose par le CCL4 ayant déjà été publié, nous n’avons pas besoin de réaliser une étude pilote et le nombre d’animaux a de ce fait pu être réduit. Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les groupes d'animaux entre eux.
Raffinement
Les souris seront dans des cages adaptées à 5 individus, avec une litière adaptée, de la nourriture et de l’eau en continue, de quoi se cacher et de quoi ronger, en quantité suffisante pour ne pas générer de comportements agressifs. En cas d’agressivité la taille des groupes d’animaux sera ramenée à trois individus par cage. Les souris seront observées quotidiennement, pour suivre leur état clinique et déceler d’éventuels problèmes (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque (1mL) sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. Les injections se feront avec une bonne contention de l’animal par du personnels formés et entrainés. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analgésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections.
Choix des espèces
Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont largement utilisées comme modèle pour la formation de fibrose hépatique induite par le CCl4. Par de nombreux aspects, ce modèle reproduit la maladie chronique du foie humaine. Il reproduit la phase aigüe de la maladie humaine caractérisée par l’induction d’une réponse inflammatoire suivie par le développement de la fibrose hépatique chronique. Souris adultes de 6 à 8 semaines
Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques murins présentant des tumeurs sous-cutanées, intrapéritonéales ou pulmonaires orthotopiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour prélever leurs tumeurs et analyser les cellules immunitaires qui les infiltrent, 1 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine, pour faire pousser des tumeurs sous la peau, dans le péritoine ou dans les poumons, puis elles reçoivent des virus oncolytiques armés de chimiokines, dans la tumeur ou par le nez sous anesthésie, et peuvent passer en imagerie deux fois par semaine. Une tumeur qui dépasse 2 000 mm3 déclenche la mise à mort. Le porteur ne décrit pourtant qu'une "gêne physique", des "difficultés à la mobilité" et une "gêne respiratoire", et juge "primordial d'utiliser des modèles in vivo" pour valider ses virus.
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives in situ souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines chimiokines pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces chimiokines, exprimées in situ par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques, armés avec des chimiokines, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec un inhibiteur d’immune checkpoints.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction de TLS dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L'intervention n'aura lieu qu'une fois, durera moins d'une minute et sera réalisée sur souris vigile. L'administration du traitement par voie intratumorale sera aussi réalisé sur souris vigile, ne durera pas plus d'une minute et sera répété au maximum 3 fois (un jour sur deux). L'administration du traitement pas instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L'opération durera environ 5 min par souris et sera répétée 1 fois par jour pendant 3 jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane à 2% durant une quinzaine de minute.Toute injection intrapéritonéale d'anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les actes d'injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques pourront procurer un stress ponctuel (quelques minutes) dû à la contention des animaux mais sont normalement indolores et auront lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 1632 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (5 souris maximum/cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations >15 jours est appliqué. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum/cage de type-IIL, température de 22 °C ± 2 °C, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 6 h à 18 h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants: tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire; toute modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté); toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance: perte de poids supérieur ou égale à 15% du poids initial pour un animal qui ne porte pas de tumeur et supérieur ou égale à 20 % pour animal portant une tumeur (car en principe, une tumeur sous-cutanée de moins de 2000 mm3 n'excède pas 5 % du poids initial de l'animal), plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d'essoufflement, tumeurs excédent 2000 mm3 (=(pi/6) x (longueur/2) x (largeur/2) x (épaisseur/2)). Les instillations intra-nasales (i.n.) seront réalisées sur des souris anesthésiées (kétamine par voie i.p.) puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 % + exposition à une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 %.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.
Elevage de tiques « Pathogen-Free » en laboratoire (Ixodes ricinus et autres espèces)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Lapins : 60
260 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 230 tués à l'issue et 30 lapins proposés à l'adoption. Des tiques sont placées sur leur dos dans des capsules pour se nourrir de leur sang, ce que le porteur reconnaît provoquer une gêne et des démangeaisons. Chaque animal ne sert qu'une fois en raison de l'immunité développée contre les tiques. L'élevage vise à maintenir des colonies de tiques saines pour des expériences d'infection.
Objectifs
Le présent projet vise au maintien, en laboratoire, de colonies de tiques, dont les tiques de l’espèce Ixodes ricinus, « sans agent pathogène» afin de pouvoir réaliser des expériences d’infection expérimentale avec divers agents pathogènes pour analyser leur transmission par cet arthropode. Les tiques étant des hématophages stricts(ne mangent que du sang), il est nécessaire de les nourrir régulièrement avec du sang, ce qui est réalisé suivant les stades concernés sur souris vigiles (pour les larves et les nymphes) ou sur lapin vigile (pour les nymphes et les adultes). Pour cela les différents stades de tiques sont placés sur les animaux (dans une capsule fixée sur le dos des souris ou capsules fixées sur le dos des lapins) afin de permettre leur gorgement. Une fois gorgées, les tiques se détachent toutes seules, sont récupérées puis placées en flasque de culture cellulaire en attendant leur métamorphose.
Bénéfices attendus
Le maintien d'un élevage de tiques saines permet de pouvoir développer des projets de recherche portant sur les tiques elle-mêmes : étude du microbiote des tiques, développement de vaccin antimicrobiote de tique, neurophysiologie des tiques ; mais également sur les interactions entre les tiques et les agents pathogènes qu'elles vectorisent (bactéries, parasites et virus) afin de mieux comprendre ces systèmes et de trouver des moyens de lutte contre les tiques et les agents pathogènes qu'elles transmettent.
Procédures
Il n'y aura aucun prélèvement réalisé sur les animaux, juste la récupération des tiques gorgées présentes dans les capsules.
Impact sur les animaux
Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris ou les lapins utilisés mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques (larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez le lapin ou la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort du lapin/souris.
Devenir
Pour les souris, tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les lapins: environ la moitié (30) seront mis à mort si les tiques gorgées avaient des agents pathogènes (tiques collectées en forêt) , et l'autre moitié (30) seront proposés à l'adoption via une association. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé au sein de notre équipe, il est utilisé lors des essais de transmission des agents pathogènes. Cependant son efficacité ne permettant pas toujours de maintenir un assez grand nombre de tiques, il est donc necessaire de maintenir l’élevage de tiques sur lapins et souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. Pour chaque élevage, les gorgements seront réalisés au rythme de 1 par stade de tiques (3 stades) tous les 3 mois nécessitant à chaque fois 4 lapins et 5 souris. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.
Raffinement
Les souris et les lapins sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des lapins et souris avec pour les souris : un maison en plastique par cage, un support pour grimper ; pour les lapins : une balle en plastique dure, un baton de bois à ronger. Les souris sont hebergées à raison de une souris par cage pour éviter le retrait de la capsule par ses congénères.
Choix des espèces
Les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et n'acceptent de se gorger que sur certains animaux dont les souris (larves et nymphes) et les lapins (nymphes et adultes). De plus, afin de maintenir un élevage, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade. Les tiques adultes et nymphes prélevant un volume de sang important, le gorgement sur lapin évite (1) la spoliation sanguine de l’animal hôte contrairement au gorgement sur souris, et (2) le recours à plus d’animaux. Adultes pour les souris et les lapins Age Minimum 5 semaines pour les souris pour pose des capsules Age indifférent pour les lapins