Souris

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau puis prélevée de façon répétée par biopsies sous anesthésie, jusqu'à un volume tumoral de 2 000 mm3 déclenchant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans d'autres études. Il reconnaît des risques d'hémorragie, de nécrose et de dissémination tumorale liés aux biopsies.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de la Santé a établi en 2020 que le cancer était, selon les pays et leur développement socio-économique, la 1e ou la 2e cause de mortalité avant l’âge de 70 ans, avec 10 millions de décès par an dans le monde. En France, les cancers représentent la première cause de décès chez l’homme et la deuxième chez la femme. En 2040, il est estimé que 28.4 millions de cancers seront nouvellement diagnostiqués chaque année dans le monde, soit une augmentation de 47% par rapport à 2020 (19.3 millions de nouveaux cas). Cette augmentation est principalement liée au vieillissement des populations, mais aussi à d’autres facteurs de risque (tabagisme, habitudes alimentaires, expositions aux UV, sédentarité, pollution…). Actuellement les traitements conventionnels du cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie qui sont associés à des effets secondaires importants et pour lesquels les patients peuvent développer des résistances. Il est donc important de pouvoir développer de nouveaux traitements ciblant spécifiquement les cellules tumorales et limitant les effets secondaires associés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, l’efficacité anti-tumorale des composés, issus de pré-sélections grâce à des tests in vitro, est évaluée in vivo chez des souris greffées avec des cellules tumorales. Les mécanismes d’action, pharmacocinétique ou biomarqueurs, sont évalués au cours de ces études à partir de prélèvements des tumeurs. Une des limites majeures actuelles à ces prélèvements de tumeur pour caractériser les effets des traitements est qu’ils ne peuvent être effectués qu’en procédure terminale pour l’animal. Pour pallier cela, il est souvent prévu d’inclure plusieurs cohortes d’animaux qui sont alors euthanasiées à différents temps de l’étude afin d’accéder à des analyses longitudinales d’efficacité du traitement. Ces études n’étant pas menées sur les mêmes animaux, elles peuvent être biaisées par des variabilités interindividuelles et rendre difficile l’interprétation ou imposer une augmentation du nombre d’animaux par groupe pour compenser ces variabilités. Ce projet a pour but de développer une technique de biopsie longitudinale de tumeur greffée chez la souris. Ce prélèvement régulier d’un très petit échantillon de tumeur permettra de caractériser au cours du temps et sur un même animal l’évolution de la tumeur par l’étude de paramètres histologiques, pharmacocinétiques, géniques et/ou protéiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de définir la technique la plus appropriée pour réaliser des prélèvements répétés de tumeur tout en ayant un impact minimal sur la morphologie et la croissance de la tumeur, l’évolution de la pathologie et le bien-être animal. La mise en place de biopsies longitudinales dans les études d’efficacité de traitements anti-tumoraux présente de nombreux intérêts : -Etant donné que le prélèvement est réalisé sur le même animal, nous pourrons ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études futures pour faire les analyses de biomarqueurs dans la tumeur. En effet, il ne sera plus nécessaire d’ajouter des cohortes d’animaux supplémentaires pour réaliser des prélèvements terminaux au cours du temps. -Chaque souris étant son propre contrôle, nous pouvons mieux caractériser le mécanisme d’action d’un traitement et ainsi mieux en définir l’efficacité puisque nous réduisons la variabilité interindividuelle associée aux prélèvements terminaux. -L’évolution de biomarqueurs spécifiques en réponse à un traitement peut être plus précisément définie puisque suivie sur le même animal. Ainsi les bénéfices associés à ces mises au point sont à la fois de réduction du nombre de souris utilisées et à la fois scientifiques (caractérisation des mécanismes d’action, diminution de la variabilité, suivi de biomarqueurs plus spécifiques)

Procédures

-Greffe de cellules tumorales : pour chaque animal, une injection unique sous la peau du flanc sur animal vigile. Ce geste est réalisé sans anesthésie car une contention maitrisée et un geste rapide (

Impact sur les animaux

Au cours de cette mise au point, nous serons vigilants sur les effets indésirables suivants qui peuvent survenir chez la souris : -Une perte de poids qui pourrait excéder 20% du poids initial. Le poids des animaux sera donc mesuré tout au long de l’étude (y compris avant et après biopsie) afin d’évaluer, entre autres, le rétablissement des animaux. Une biopsie ne pourra être envisagée que si la souris a récupéré son poids d’avant la biopsie précédente. Si une perte de poids d’au moins 20% du poids initial est observée, les animaux seront euthanasiés. -Il se peut que nous voyions apparaitre des nécroses soit au niveau de la tumeur, soit au niveau des points de prélèvements. Une surveillance particulière sera apportée, et les animaux présentant des tumeurs creusées, exsudatives ou des lésions/nécroses >8mm de diamètre seront euthanasiés. -Lors de la biopsie de la tumeur, l’incision faite dans la tumeur (par l’aiguille ou par le prélèvement chirurgical) pourrait entraîner une libération des cellules tumorales et provoquer une dissémination de la tumeur, entrainant la formation potentielle de métastases. Une palpation autour de la tumeur et de l'abdomen sera réalisée pour détecter l’apparition de ces métastases. La présence de métastase sera confirmée après euthanasie de la souris par une autopsie. -Enfin, un risque inhérent à toute biopsie est le risque d’induire une hémorragie. Les tumeurs étant vascularisées, il est possible d’endommager un vaisseau lors du prélèvement à l’aiguille. Aussi une vigilance particulière sera apportée au cours de l’étude et une surveillance accrue sera exercée au cours du prélèvement et pendant quelques heures suivant la biopsie.

Devenir

Lorsque la tumeur atteint un volume de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tumeur (que ce soit pour le groupe ayant eu des biopsies ou le groupe sans biopsie).

Remplacement

L’effet de traitements anti-cancéreux ciblant le système immunitaire ou spécifiquement les cellules cancéreuses ne peut être évalué qu’après un traitement aigu ou chronique de plusieurs semaines (selon le candidat médicament à tester) chez l’animal car il résulte de l’intégration de toutes les interactions métaboliques, hormonales, immunitaires et vasculaires impliquées dans le développement des cancers et de la pathologie. Une telle intégration n’existe pas pour des cellules ou organes isolés. Il n’y a donc pas à ce jour de méthodes in vitro substitutives.

Réduction

Ce projet a pour but de définir les conditions optimales de biopsie de tumeurs greffées en sous-cutanée. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans les futures études d’efficacité de traitement et de pharmacodynamie en permettant de réaliser des prélèvements répétés de tumeur sur le même animal. Ainsi la variabilité interindividuelle est réduite et la caractérisation des effets du candidat médicament est améliorée. Ces études seront réalisées sur des modèles déjà optimisés en termes de conditions de greffe. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est ainsi réduit. Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour définir les conditions optimales de biopsie et estimer la variabilité des paramètres mesurés. Cette étape permettra in fine d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les études d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. Les prélèvements répétés de tumeurs permettront d’évaluer des paramètres morphologiques (par des techniques d’histologie), des paramètres protéiques (par Western Blot ou par les techniques d’immunohistochimie), des paramètres géniques ou biochimiques.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour surveiller l’atteinte éventuelle de points limites. En cas de volume tumoral supérieur à 1500 mm3, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel pour leur permettre d’exprimer leur instinct de nidification (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est dispersé dans la cage pour favoriser le fouissage. Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et du comité d’éthique, et les points limites, seront appliquées. Quelle que soit la méthode utilisée (prélèvement transcutané ou chirurgie), la procédure de biopsie est réalisée sur animal anesthésié et s’accompagne toujours au préalable de l’administration d’un analgésique afin de prévenir la douleur. A l’issue de la biopsie, l’animal est placé dans une enceinte chauffée pendant la phase de réveil, et surveillé pour s’assurer qu’il ne présente pas de signe de douleur. Nous nous assurerons du rétablissement de l’animal après chaque biopsie et tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. Et la recherche en oncologie est réalisée dans sa grande majorité sur des modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

3 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'une maladie de calcification, elles reçoivent un régime gras, des gavages, des injections et une cryolésion cardiaque, avant prélèvement de tissus. Le porteur qualifie le phénotype de "non dommageable" tout en reconnaissant qu'une association testée n'a jamais été évaluée et pourrait entraîner une mortalité. L'étude cherche des pistes thérapeutiques contre le pseudoxanthome élastique.

Objectifs

Le pseudoxanthome élastique (PXE) est une maladie métabolique rare causée par des mutations du gène ABCC6 exprimé majoritairement dans les hépatocytes. Elle est caractérisée par un processus de perte d'élasticité et de calcification touchant principalement la peau, la rétine et les artères. La peau (récepteur) est le seul tissu accessible chez l’humain alors que le foie (émetteur) reste accessible uniquement chez la souris Abcc6-/- du fait de l’absence d’hépatopathie chez les patients. Du fait des connaissances partielles de sa physiopathologie, le PXE reste une maladie incurable. De façon notable ABCC6 n’est pas exprimé significativement dans les organes atteints par la maladie. Dans le plasma des patients PXE, il a été montré une diminution des taux de pyrophosphate inorganique (PPi), molécule endogène aux propriétés anti-calcifiantes. L’objectif général est de comprendre les mécanismes du PXE, puis de tester l’efficacité et la sécurité de stratégies thérapeutiques (Diètes, Médicaments, Thérapies géniques) afin d’aboutir à des essais cliniques chez les patients et améliorer leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Sur le PXE: Aspects Cognitifs : Physiopathologie, rôle de l’hépatocyte, cibles thérapeutiques Aspects Cliniques : Amélioration de la prise en charge des patients, prévention des complications, thérapie génique Au dela du PXE: Pathologies vasculaires calcifiantes chroniques liées au diabète et à l’insuffisance rénale chronique. Amélioration des connaissances sur les pathologies liées à l'âge.

Procédures

1) Évaluation de la composition corporelle, 2 minutes sur animaux vigiles 2) Administration du régime athérogène HFD. 3) Administration de molécules par gavage oral, sous-cutanée et intrapéritonéale, quelques secondes sur animaux vigiles 4) Prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale, quelques secondes sur animaux vigiles 5) Mesure de la dépense énergétique, du comportement alimentaire et de l'activité physique, 5 jours sur animaux vigiles 6) Injection intra-péritonéale de LPS, quelques secondes 7) Cryolésion cardiaque sous anesthésie. 8) Imagerie In-vivo sous anesthésie, cela peut aller de 1 minute à 1heure.

Impact sur les animaux

La souris Abcc6-/- a une durée de vie équivalente à celle d'une souris WT. Son phénotype est non dommageable. L’association HFD+LPS n'a jamais été testée dans le modèle Abcc6-/- et nous n'avons aucune donnée sur l'impact en termes de mortalité. Cette association est donc exploratoire. Si nous constatons une létalité trop importante, cette association sera abandonnée. Les données de la littérature de cette association dans d'autres modèles murins sont rassurantes. Même si l'extropolation au modèle Abcc6-/- ne peut se faire sur le plan scientifique, nous faisons l'hypothèse que le phénotype ne sera pas dommageable compte tenu de la durée de vie de la souris Abcc6-/-.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus pour analyse complémentaire.

Remplacement

Ces expériences sont indispensables car nous voulons d’une part mieux comprendre la physiopathologie du PXE en la recentrant sur le foie, de caractériser le ou les substrats endogènes transportés par Abcc6 en réponse à différentes diètes et de thérapeutiques permettant de bloquer la fragmentation et la calcification des fibres élastiques. D’autre part, nous espérons que ce projet apportera des connaissances qui permettront de fournir des résultats précliniques transposables dans des essais cliniques chez les patients. Le PXE est le prototype d'une maladie métabolique "endocrine" où le foie (l'émetteur), principale source d'expression d'Abcc6, n'est pas touché par la pathologie et les cibles sont les organes périphériques n'exprimant pas ou peu la protéine Abcc6. La substitution totale et complète d'un tel système physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est pas possible. Enfin, comme il n'existe pas d'hépatopathie chez les patients, il est non éthique de proposer aux patients une biopsie de foie.

Réduction

le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables pour valider les données obtenues à la fin de la procédure. Un test statistique ANOVA, étudiant la significativité des résultats nous permettra de traiter les données tout en prenant en considération la mortalité possible des souris en cours d’expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agrée qui tient compte de l' éthique animale. L'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté dans chaque cage afin de minimiser le stress induit par l'hébergement. Le raffinement sera complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien être sont respectées. De plus, le suivi hebdomadaire du poids des souris et de leur comportement constitueront les principaux points limites. Pour réduire la douleur nous utiliserons un antalgique. Pour notre protocole, une grille de score avec des points limites adapatés a été mise en place.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée sera la souris C57BL/6J KO pour le gène Abcc6 et WT. La souris est un bon modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme (95% du patrimoine génétique identique). Notre travail se base sur l’étude de lignées de souris génétiquement modifiées. L’absence ou la sélectivité relative des outils pharmacologiques disponibles pour étudier la signalisation d’intérêt fait de ces animaux un outil d’étude approprié et puissant. Pour élucider cette maladie complexe qu'est le PXE, une souris transgénique a été générée par ablation du gène Abcc6 chez la souris. Les souris Abcc6-/- développent des calcifications de la peau, des vaisseaux et de la rétine, reproduisant ainsi le phénotype humain du PXE non dommageable. La minéralisation des vibrisses débute dès l'âge de 5 semaines et progresse jusqu'à l'âge de 2 ans. Nos investigations débuteront sur des animaux adultes de 6 semaines étant donné que le phénotype PXE débute à 6 semaines d'âge jusqu'aux âges de 3, 6, 12 et 18mois, soit 16,5 mois de traitement au maximum. Les différentes interventions auront pour but de comparer le phénotype des souris et d'identifier les molécules susceptibles d'inhiber ou de moduler favorablement le phénotype.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un allergène leur est appliqué sur les oreilles sous anesthésie gazeuse, provoquant un eczéma, avant mise à mort pour prélèvement des oreilles et des ganglions. Le porteur décrit un léger épaississement et des rougeurs avec démangeaisons lors de la phase allergique. L'étude porte sur des molécules impliquées dans la dermatite atopique et vise l'identification de cibles thérapeutiques.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d'autres affections telles que l'asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par l'apparition d'eczéma, affecte 20% des enfants et 3% des adultes. Un allergène est une molécule inoffensive contre laquelle l'organisme déclenche une réponse immunitaire disproportionnée menant à la mise en place d'une inflammation localisé au niveau du point de contact (la peau dans le cas de la dermatite atopique). La mise en place de la réponse immunitaire allergique induit l'activation des cellules immunitaires et la production d'anticorps spécifique de l'allergène. Si l'animal est réexposé à l'allergène, les anticorps reconnaissant spécifiquement l'allergène vont engendrer la mise en place d'une réponse immunitaire rapide provoquant l'inflammation de la peau caractérisée par des rougeurs et démangeaisons. En utilisant un protocole permettant d'induire une allergie à un allergène expérimental connu, nous pensons montrer que deux molécules (IL-3 et TSLP) produitent par les cellules de la peau jouent un rôle important dans la mise en place de la production d'anticorps spécifiques de l'allergène et donc dans la mise en place de l'allergie. En effet des données préliminaires du laboratoire montrent que ces deux molécules jouent un rôle clef dans le recrutement au niveau de la peau des cellules immunitaires (tel que les basophiles) impliquées dans la mise en place de la réponse inflammatoire lors d'une allergie cutanée. D'autres données préliminaires du laboratoire suggèrent qu'une nouvelle population de cellules dendritiques activées par TSLP est impliquée dans l'induction de lymphocyte T régulateur ayant un rôle anti-inflammatoire, représentant ainsi une potentielle cible thérapeutique de choix pour traiter les maladies inflammatoires de la peau. Nous souhaitons identifier les réseaux cellulaires et moléculaires à l'oeuvre dans ce modèle.

Bénéfices attendus

La charactérisation d'une voie de signalisation impliqué dans le recrutements des cellules pro-inflammatoires au niveau de la peau dans le contexte de l'allergie constituerais une nouvelle cible thérapeutique de choix pour traiter la dermatie atopique affectant 20% des enfants et 3% des adultes. L'identification d'une population de cellule immunitaire induisant des lymphocytes anti-inflammatoires constituerait également une nouvelle cible thérapeutique de premier choix dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi d'autres pathologies impliquant le système immunitaire (maladie autoimmune et cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou auto-immunes, ou à l'inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.

Procédures

Aucun prélévement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales ne sont prévues dans le cadre de cette demande de projet. Pour la procédure d'application topique d'un allergène : l'application de l'allergène au niveau de l'oreille gauche des animaux durant trois jours (jour 0, 1 et 2) permettra de mimer la phase de sensibilisation à l'allergène. Quatre jours plus tard, au jour 6, une application d'allergène sera effectuée au niveau de l'oreille droite afin de mimer la phase effectrice de l'allergie. Cette application est réalisée sous anesthésie gazeuse légére. Chaque application d'allergène dure 30 secondes, soit 4 traitements de 30 sec chacun = 2 min au total). Pour la procédure d'application topique de l'allergène et application d'un dérivé de la vitamine A : En plus du traitement avec l'allergène décrit ci-dessus, nous appliquerons un dérivé de la vitamine A sur l'oreille droite. Cette application, réalisée sous anesthésie gazeuse est effectuée 2 heures avant le dernier traitements avec l'allergène (correspondant au jour 6 du protocole d'application de l'allergène). Chaque application de ce dérivé de la vitamine A dure 30 secondes, soit 1 traitements de 30 sec chacun = 30 sec au total).

Impact sur les animaux

Les trois premiers traitements avec l'allergène vont induires la sensibilisation des animaux à l'allergène, aucun effet indésirable n'est attendu à ce moment la. Les animaux développeront un léger eczéma au niveau du site d'application de l'allergène lors du dernier traitement avec l'allergène correspondant à la phase de "challenge" allergique.

Devenir

A l'issue des procédures "application topique de FITC/DBP" et "application topique de FITC/DBP et application topique d'acide rétinoique" les animaux seront mis à mort pour dose croissante de CO2 puis les oreilles ainsi que les ganglions lymphatiques drainants la peau seront prélevés pour des analyses histologiques, de cytométrie en flux, de rt-qPCR et ELISA.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d'autres laboratoires. Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées afin d'identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes serviront à l'analyse de l'expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d'effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. Dans le cas de IL3-KO, une seconde cohorte de 24 animaux est prévu pour étudier le rôle de l'acide rétinoique. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le challenge allergique au niveau de l'oreille droite des souris nous permettra d'utiliser l'oreille gauche non challengé en tant que contrôle (contrôle sans inflammation de la peau). (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traité au FITC/DBP ou non.)

Raffinement

Les souris seront maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences. L'application de du mélange FITC/DBP se fait par application cutanée, ce qui nécessite une anesthésie gazeuse légère. Lors du challenger allergique au FITC au jour 6 on observe un léger épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris dépasse les points limites fixées par la grille de score propre à chaque procédure expérimentale, elle sera retirée de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Le système immunitaire de la souris est relativement similaire à celui de l'être humain, avec notamment la présence d'un système immunitaire adaptatif. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris étant très proche de celui de l'Homme. De plus, la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d'étudier le système immunitaire mature à l'âge adulte.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles subissent des échocardiographies sous anesthésie et des tests d'effort sur tapis roulant, avant prélèvement terminal du coeur. Le porteur indique un déficit de poids dès la naissance et des points limites déclenchant la mise à mort en cas d'anomalie cardiaque. Cette caractérisation prépare un futur projet de test de candidats médicaments.

Objectifs

Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.

Procédures

pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés

Impact sur les animaux

Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.

71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).

Bénéfices attendus

A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.

Procédures

Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.

Choix des espèces

Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées quinze jours puis placées en cages métaboliques, le porteur reconnaissant que l'isolement et le passage en analyseur de masse corporelle provoquent un stress modéré. L'étude vise à caractériser le comportement alimentaire et la dépense énergétique de souris porteuses d'une mutation liée à l'obésité. Le porteur affirme que l'exploration du métabolisme énergétique ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

Lors des dernières décennies, l'obésité et le surpoids ont atteint les proportions d’une épidémie mondiale impactant 1.9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Plusieurs études ont clairement montré que les voies de l’immunité innée sont impliquées, notamment via leur activation par les bactéries du microbiote intestinal, dans la mise en place de l’obésité et des maladies métaboliques qui y sont associées. Récemment une nouvelle voie de l’immunité innée a été identifiée. Cette voie implique un récepteur intestinal. Chez l’homme, des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l’obésité, à la prise de poids et au diabète de type 2. Une lignée de souris mutées pour ce récepteur a donc été développée afin de mieux caractériser les effets de cette voie de signalisation sur la mise en place de l'obésité et afin de comprendre les mécanismes sous-jacents liant cette voie à l’obésité. Par rapport à des souris contrôles issues de la même fratrie, la prise de poids de ces souris en réponse à un régime riche en lipides est réduite de 20%. Cependant aucune mesure de la structure détaillée des repas ainsi que des données sur la balance énergétique ne sont disponibles à ce jour. Or il a clairement été montré que la structure des repas (quantités d'aliments ingérés, taille, heure et fréquence des repas) ainsi que le statut de la balance énergétique sont déterminants dans la prise de poids. Afin d’identifier les mécanismes liant ce récepteur et la prise de poids il est nécessaire de caractériser précisément la structure des repas, de même que la dépense énergétique des animaux et leur composition corporelle précise. L’ensemble de ces paramètres peuvent être obtenus de manière non invasive via l’utilisation de cages métaboliques et d'un analyseur de la composition de la masse corporelle.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes régulant le comportement alimentaire et la dépense énergétique est essentiel dans le cadre de la lutte contre les maladies métaboliques telles que l’obésité. En effet l’obésité, pandémie mondiale aux conséquences médicales et économiques multiples et dévastatrices, est une pathologie résultant d'une dérégulation de la balance énergétique et implique notamment une dérégulation de la prise alimentaire et/ou de la dépense énergétique. Le modèle de souris portant une modification du recepteur intestinal, compte tenu de la résistance à l'obésité qu'elles développent indique que l'étude de cette voie de signalisation et de son lien avec le comportement alimentaire et/ou la dépense énergétique peut permettre la découverte de nouvelles cibles therapeutiques utiles dans la lutte contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement durant 15 jours. L’analyse métabolique ( 8 jours) n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne necessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélévement n'auront lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jours (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition coporelle analysée (3 minutes/animal) de maniére non invasive 1 fois au debut de l'individualisation puis à l'entrée, lors du changement de régime et à la sortie des cages calorimétriques, soit 4 fois durant l'expérience.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée totale de l'isolement des animaux est de 15 jours. De même les souris seront placées pendant 2 minutes dans un analyseur de masse corporelle. Cette technique bien qu'étant non invasive peut entrainer un stress modéré durant le temps de l'analyse. Aucune douleur n'est attendue durant le protocole. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 10% du poids initial. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal.

Devenir

Aprés que les animaux sont retirés des cages métaboliques, leurs poids et leurs composition corporelle évaluées. Il n 'y a pas de nécéssité de conserver les animaux, ainsi les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre immunité innée/régime alimentaire et comportement alimentaire/dépense énergétique/composition corporelle. Enfin, l’exploration du métabolisme énergétique et des comportements attenants ne peut se faire que sur un organisme entier, en raison de l’organisation et de la coopération des tissus métaboliques actifs.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire, la dépense énergétique et le composition corporelle sur les mêmes animaux. D’après les études de comportement déjà menées en laboratoire, nous estimons que 8 souris par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin le changement de régime au cours de l'analyse et sur les mêmes animaux permettra aussi d'évaluer les capacités adaptatives de l'animal lors d'un changement de régime.

Raffinement

L'analyse calorimétrique et la mesure de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. -L’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. -Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, un abri en propylène rouge ainsi que deux carrés de coton et une nacelle pour faire leur nid. -les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal, -l’air des cages est renouvelé à un taux de 2litres/min (débit calibré pour une mesure précise de la consommation de O2 et la production de CO2). Le mal-être a des conséquences directes sur les paramètres de la balance énergétique (prise alimentaire, activité locomotrice, dépense énergétique) et in fine sur la qualité et la validité des données obtenues. Pour cela, les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de la prise alimentaire et hydrique et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés et calculés quotidiennement au moyen du système de calorimétrie, le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévu en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Si un de ces paramètres affiche une valeur anormale, l'opérateur/responsable en recherchera l'origine.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude du métabolisme et est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris et du transport intestinal du fructose sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les animaux adultes (entre 10-12 semaines) seront utilisés. c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.

Objectifs

En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.

Bénéfices attendus

L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.

Procédures

Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.

Réduction

Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.

Raffinement

Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.

Choix des espèces

En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une irradiation localisée du côlon à dose unique pour provoquer des lésions tardives, puis sont tuées afin de prélever le côlon. Le porteur indique une dépilation de l'abdomen et affirme qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier ces séquelles des radiothérapies pelviennes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers. L’objectif des médecins est la recherche d’un compromis entre le contrôle des tumeurs et la limitation des dommages aux tissus sains autour de la tumeur. En effet, dans le cas du traitement des cancers en zone abdominale, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon ou le rectum qui sont des « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement de leur épithélium muqueux. La toxicité induite par la radiothérapie du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, et donc impacter fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans sa globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. Les options thérapeutiques disponibles pour le traitement des complications des radiothérapies sont insuffisantes. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes, permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et de déterminer des nouvelles voies de traitement.

Procédures

Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane pour la réalisation de l’irradiation localisée (max 20 min)

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du colon à la dose unique de 26 Gy, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés

Devenir

Les animaux seront euthanasiés, les colons seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vaisseaux, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaire (Cytométrie en flux, single cell, culture et co-culture) et moléculaires des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues : utilisation de la dose de 26 Gy qui ne génère pas d’ulcères tardifs graves du colon mais de la fibrose comme les patients qui ont bénéficié d’une radiothérapie fractionnée. - Hébergement en groupe (5 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) -Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration) - Les animaux seront pesés régulièrement.

Choix des espèces

Le modèle d’irradiation de la souris permet de reproduire des lésions colorectales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8 semaines).