Souris
Modèles expérimentaux de cancer de la prostate pour l’évaluation de nouvelles thérapeutiques par imagerie in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 690 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart classées sévère. Elles subissent l'induction de tumeurs de la prostate, parfois une castration chirurgicale, puis un suivi par imagerie jusqu'à seize semaines, les modèles à métastases osseuses atteignant le squelette entier. Le porteur décrit un projet mené "à la demande de chercheurs extérieurs" et pour "nos clients" souhaitant des études d'efficacité thérapeutique. Ce travail relève ainsi d'une prestation commerciale facturée, dont dépend la mise à mort des 2 690 souris.
Objectifs
Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer de la prostate et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou d'évaluation de nouveaux médicaments. Il s’agit d’une nouvelle demande faisant suite à la fin de validité de la précédente autorisation. Dans le projet précédent, nous avons réalisé 18 études qui nous ont permis de proposer des modèles tumoraux de cancer de la prostate. Les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents avec une publication scientifique et une autre en cours de rédaction. Nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique. Avec 60 000 nouveaux cas en France tous les ans, le cancer de la prostate représente aujourd’hui la première cause de mortalité chez l’homme après 70 ans. On compte actuellement 9 000 décès par an pour ce cancer qui touche 1 homme sur 8. Actuellement, le Docetaxel est le traitement de référence des cancers de la prostate métastatiques résistants au traitement hormonal (CRPC). Cette chimiothérapie apporte un réel bénéfice au niveau de la survie des malades. Malheureusement, on sait qu’une grande partie des malades traités par ce médicament développent une résistance à la chimiothérapie. C’est pourquoi aujourd’hui, l’enjeu majeur consiste à trouver à la fois des méthodes pour prédire cette résistance et de nouvelles combinaisons de traitements pour surmonter cette résistance et éviter les traitements inutiles et toxiques. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer de la prostate à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments. Dans le projet précédent, les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents, nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques impliqués dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique qui mettent en œuvre ces canaux ioniques. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication scientifique et une autre en cours de rédaction.
Procédures
Induction du modèle de cancer : - par chirurgie : 1 acte par animal (15min max d’intervention sous anesthésie générale) - sans chirurgie : injection intracardiaque (quelques secondes sous anesthésie générale) - par injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) par injection intra tibiale (5min sous anesthésie générale avec radiologie). Castration : 1 acte par animal par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale). Non systématique. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 16 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 16 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire ou sur animal anesthésié en rétro-orbitaire : (en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque sur souris endormie en fin d’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables potentiels sur les animaux sont: -pour le modèle sous-cutané (SC) : taille de la tumeur importante en fin d'étude entrainant une gêne pour la locomotion, nécrose de la tumeur (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle orthotopique : taille de la tumeur importante en fin d'étude provoquant une gêne dans la mobilité, les fonctions urinaires et digestives. (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intracardiaque : développement de métastases osseuses ostéolytiques ou ostéoblastiques sur tout le squelette (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intra tibia : développement d’une tumeur osseuse ostéolytique ou ostéoblastique au niveau du tibia et fémur (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -dans les cas d’administrations répétées de traitements : effets indésirables tels que rougeur au niveau du site d’injection ou une légère perte de poids. Les nuisances décrites ci-dessus (certaines sévères) sont potentielles car il ne sera pas nécessaire d’atteindre ces effets pour les besoins expérimentaux. Lors de notre précédent projet, nous avons pu tester les modèles : - Sous cutané : Nous n’avons pas observé de problème particulier, le suivi permet d’éviter l’atteinte des points limites. - Intraprostatique : Nous avons pu observer sur 50% des souris, une perte de poids comprise d’entre 5 et 10%, 5 jours après la chirurgie. Elles ont repris leur poids à J11 grâce aux mesures de raffinement. - Intracardiaque : Nous avons pu observer sur 11% des souris de ce modèle des difficultés de locomotion associé à une perte de poids supérieure à 10%, sur 21% des souris une perte de poids supérieure à 10% sans autres signes apparents. Ces difficultés apparaissent en fin d’expérimentation, elles ont duré moins de 5 jours pendant lesquelles des mesures de raffinement ont été prises avant mise à mort.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car des prélèvements d'organes seront effectués par la suite.
Remplacement
Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études précliniques sont nécessaires et ne peuvent être réalisées que chez l'animal pour tenir compte de la complexité de la physiologie d'un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en œuvre de l'imagerie permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre à 10 par lot. Des tests non paramétriques (type Test de Mann-Whitney ou test de Kruskal-Wallis) seront utilisés par nos clients.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite le stress infligé au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin de limiter la souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées et chauffées (tapis chauffant pour la chirurgie ou plateau chauffant pour l’imagerie). La douleur liée à la chirurgie sera également prise en charge par l'utilisation d'analgésiques. Par ailleurs, nous donnons du gel nutritif (adapté à la récupération après chirurgie) 7 jours avant la chirurgie pour habituation et une fois la chirurgie réalisée, pour assurer un meilleur rétablissement post-opératoire. Pour garantir le statut sanitaire des souris immunodéficientes, elles seront hébergées en portoir ventilé et des procédures strictes seront respectées durant les différentes séances d’imagerie (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (6 à 8 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 570 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le paludisme et développer un vaccin. Chacune peut recevoir des infections par Plasmodium, par injection ou par piqûres de moustiques infectés, des prélèvements sanguins quotidiens sur près de trois semaines, et pour certaines des chirurgies comme l'implantation d'un anneau de titane, une ablation de la rate ou une greffe de peau humaine. Le RNT classe ces manipulations répétées en souffrance légère. Les souris sont mises à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme, que le porteur cherche à devancer.
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
[MODIFICATION] IMMUNISATIONS POUR VOIE INTRANASALE et DUREE DU PROJET Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou plateformes d’administration et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles avec des sporozoïtes, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction de la veine caudale de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection les prélèvements seront réalisés quotidiennement. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive par bioluminescence, ou par microscopie/ RT-PCR dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de P. falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements d’un volume sanguin de 25 µL à 50 µL au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera 20 µL par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par la dislocation cervicale ou par exposition au CO2, avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les réutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité étique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide d'un logiciel développé à l'Institut Pasteur (shade.pasteur.fr) qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test paramétrique ANOVA non jumelé, si nécessaire, ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Nous utiliserons la grille comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l'état de santé des souris. Les souris avec plus de 1% de parasitémie seront observées quotidiennement, les autres seront suivies hebdomadairement. Les animaux obtenant un score de deux points (ex : poil hérissé, prostration) bénéficieront de mesures d'amélioration des conditions d'hébergement (enrichissement, chaufferette), de l'aliment (gel diététique) ou de traitements médicamenteux (analgésie). Les souris présentant un score supérieur à deux seront mises à mort par exposition au CO2.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modifiées pour perdre une protéine musculaire, elles développent une myopathie qui les affaiblit jusqu'à la perte de mobilité et la mort vers treize semaines, et subissent des tests répétés de force, de course sur tapis et de motricité. Le porteur affirme que la maladie ne provoque pas de douleur, tout en décrivant une dégradation musculaire qui mène à la mort. Les bénéfices thérapeutiques restent suspendus à de futurs essais, quand la dissection des muscles après mise à mort, elle, est programmée.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Elevage et caractérisation génétique par prélèvement, d’un modèle de rongeur permettant l’étude et l’évaluation de composés thérapeutiques ciblant une maladie neurodégénérative (Projet multi-sites : 1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Génétiquement modifiées pour modéliser la sclérose en plaques, 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le cadre d'un élevage et d'un génotypage par biopsie. De 3,5 à 4 % d'entre elles peuvent développer spontanément une paralysie, et environ 13,5 % un lymphome comprimant les poumons. Le RNT justifie l'élevage par le besoin de fournir ces animaux à d'autres projets de recherche. Une partie des souris est expédiée vers un autre établissement ou maintenue pour l'élevage, le reste mis à mort, notamment les animaux sans génotype d'intérêt ou atteignant les points limites.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune (le corps attaque ses propres constituants) chronique du système nerveux central (cerveau, moëlle épinière et nerfs optiques). Elle se manifeste par des troubles moteurs, sensitifs, de l’équilibre, visuels… responsables à long terme d'un handicap. Elle touche 120000 personnes en France dont 3000 nouveaux cas par an. Dans la majorité des cas, les premiers symptômes apparaissent entre 25 et 35 ans. Des facteurs génétiques mais également des facteurs environnementaux prédisposent à la maladie. Les causes exactes de la sclérose en plaques restent inconnues à ce jour. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de cette pathologie. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition et le développement de la sclérose en plaques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition et du développement de la sclérose en plaques mais également le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les animaux présentent un phénotype dommageable (modèle de sclérose en plaque). Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Cette procédure ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une biopsie suffit pour établir le génotype de l’animal.
Impact sur les animaux
Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. 3,5 à 4% des animaux de la lignée peuvent développer à tout âge de façon spontanée une maladie neurodégénérative dont les signes cliniques vont d’une paralysie partielle ou légère de la queue (principalement à l'extrémité) ou des membres à une paralysie complète de la queue ou des membres. Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt développent un lymphome dont l’apparition se fait à environ 7-8 mois. Ces lymphomes touchent environ 13,5% des animaux et sont caractérisés par un gonflement du thymus induisant une constriction des poumons à l’intérieur du thorax.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de maladies neurodégénératives, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux par nos collaborateurs. Le nombre d’animaux est déterminé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt sont susceptibles de développer une maladie neurodégénérative de façon spontanée. L’apparition des symptômes signe du développement sous-jacent d’une maladie neurodégénérative entrainera la mise à mort de l’animal concerné. De plus, à partir de l’âge de 7-8 mois, ces animaux peuvent également développer un lymphome. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, les animaux porteurs de la mutation d’intérêt seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 6-7 mois. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d’observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Nouvelle immunothérapie dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral dans le poumon chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Soumises à une inoculation de tumeur par injection ou par chirurgie, 1 864 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la grande majorité classée sévère. Elles reçoivent ensuite des injections de traitements plusieurs fois par semaine pendant deux à quatre semaines, les tumeurs pouvant provoquer douleurs, perte de poids et gêne respiratoire. Le RNT range tous ces modèles parmi les plus sévères et prévoit une surveillance quotidienne aux moments critiques. À la fin de chaque procédure, les souris sont mises à mort et des organes prélevés.
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d’une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d’auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Dans le cas du cancer, les molécules ciblant des points de blocage à la surface des cellules immunitaires ont eu de très bons résultats en essais cliniques. Ces essais ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques chez la souris. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Ce projet s’inscrit ainsi afin d’étudier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules de type protéique dans des modèles de cancer. Nous aimerions donc tester différents traitements de l’immunité capables d’activer un ou plusieurs types cellulaires et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur via injection (5min), ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (10-15min). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections (1min) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection d'une molécule "traceur" de la tumeur lors du suivi de la croissance tumorale par "scanner" (1 à 2 fois par semaine). Les animaux pourront être soumis à des injections (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines) vigiles ou sous anesthésie (5min). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang des animaux pourra être effectué sous anesthésie (intervention sans réveil). Certains animaux seront prélevés en sang en vigile (4 fois par jour le premier jour, puis une fois par jour la première semaine puis une fois par semaine, 20sec).
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Une altération de la respiration peut être observée (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanés) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée, et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules humaines en culture ont permis d’identifier une activité biologique de ces nouveaux traitements et donc, ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude de la molécule chez l'animal.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces se verront évalués lors des étapes suivantes, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin à décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en mettant à mort les animaux selon un score clinique vétérinaire ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements supplémentaires du fait de son isolement (frisottis et dôme/tunnel). L’analgésie, quant à elle, dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance, l’animal se verra administrer une injection d'analgésique deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie un analgésique local. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Radiothérapie interne vectorisée sur deux modèles murins de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester une radiothérapie interne ciblée sur deux modèles de glioblastome, 660 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales cérébrales puis un suivi par IRM jusqu'à six fois, la tumeur pouvant entraîner la mort en une trentaine de jours sans traitement. Le RNT annonce un bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel et repoussé "ultérieurement". Toutes les souris sont mises à mort, une issue présentée comme évitant la souffrance liée à la croissance de la tumeur.
Objectifs
Le projet consiste à mettre en place une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur une molécule qui a déjà été testé en clinique et qui mérite une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents. Il s’agit d’une molécule ayant une faible pénétration dans les tissus, ce qui permettrait de proposer une thérapie plus précise dont la toxicité auprès des tissus sains serait moindre. L’objectif sera de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique sur 2 souches de souris différentes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes) telles que l'injection de cellules tumorales, de thérapies spécifiques, de suivi par imagerie IRM. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Le nombre d'IRM maximal réalisé sur un même animal est de 6.
Impact sur les animaux
L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détoriation de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours. Il n'y a pas d'autres nuisances ou d'effet indésirables attendus sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des cellules tumorales) et celle d’élimination (traitements sur tumeur en place), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernières validations dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par le SBEA local. Pour chaque protocole, un suivi quotidien du comportement, de la perte de poids de l'animal et de sa cicatrisation est effectué. Un suivi IRM est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM hebdomadaire.
Choix des espèces
La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser deux types de cellules dans deux souches différentes de souris est de pouvoir réaliser les tests sur des cellules humaines de glioblastome dans un cas et dans l'autre cas de pouvoir étudier le rôle de l’immunité.
Programme de tutorat pour l’acquisition des gestes techniques courants en expérimentation animale sur rats et souris
- Formation professionnelle
Rats : 173
Tous tués à l'issue, 863 souris et 173 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnes aux gestes techniques de l'expérimentation. Chaque animal sert de support à des injections, à des prises de sang répétées et parfois à des chirurgies, avant d'être endormi puis tué. Le RNT indique que certains animaux proviennent de surplus d'élevage ou d'autres protocoles, une origine présentée comme leur donnant "une utilité". La finalité reste la formation de personnels, réglementairement obligatoire avant toute intervention autonome.
Objectifs
Ce projet a pour but de former, de manière encadrée et progressive, les personnes amenées à manipuler des rats et des souris dans le cadre de la recherche scientifique. Il s’agit d’un programme de formation pratique qui permet aux nouveaux arrivants d’apprendre les gestes techniques nécessaires, comme les prises de sang ou les injections, dans des conditions sécurisées et respectueuses des animaux. Ce type de formation est obligatoire en France et en Europe avant de pouvoir intervenir sur des animaux à des fins scientifiques. Le projet vise à garantir que chaque personne soit bien préparée, accompagnée, et évaluée avant de travailler de façon autonome. Il contribue ainsi à améliorer la qualité des soins aux animaux et la fiabilité des expériences. Ce programme de formation participe également à une démarche éthique plus large, en veillant à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire au maximum leur stress ou leur douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet de formation permet aux personnes qui travaillent en recherche d’apprendre à manipuler correctement les animaux de laboratoire, en particulier les rats et les souris. Il est important que ces gestes soient bien maîtrisés, car une erreur technique peut faire souffrir l’animal ou fausser les résultats d’une étude scientifique. Pour apprendre, les participants doivent s’entraîner directement sur des animaux vivants, car certains gestes ne peuvent pas être reproduits correctement sur des modèles artificiels. Toutefois, tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et pour réduire au maximum leur stress ou leur douleur. Cette formation encadrée permet ainsi d’assurer une meilleure prise en charge des animaux dans les futurs projets de recherche, en garantissant que les personnes soient compétentes, formées et responsables. C’est une étape indispensable pour améliorer les pratiques scientifiques tout en respectant les animaux.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet de formation seront principalement des rats et des souris. Ils seront soumis à différents gestes techniques que les participants doivent apprendre à maîtriser. Ces gestes incluent par exemple des injections (sous la peau, dans le ventre ou dans une veine), des prises de sang à différents endroits du corps, ou des gestes plus complexes comme ceux réalisés lors d'une chirurgie. Chaque animal suivra un parcours progressif avec plusieurs gestes différents, adaptés au niveau du stagiaire. Tous les gestes sont réalisés dans un cadre très encadré, avec des limites strictes sur le nombre d’interventions par animal. À la fin de leur participation, les animaux seront endormis profondément puis euthanasiés sans réveil. L’apprentissage est organisé de manière à limiter au maximum les manipulations inutiles et à garantir le respect du bien-être animal tout au long du programme. La durée de chaque geste est volontairement limitée et adaptée au niveau de formation, afin de réduire au maximum le temps de manipulation et l’impact sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les gestes que les participants apprennent à réaliser sur les rats et les souris peuvent parfois provoquer un léger inconfort, voire une douleur temporaire. Cela dépend du type de geste (prise de sang, injection, etc.), de la fréquence à laquelle il est réalisé, et du niveau d’expérience de la personne en formation. Parmi les effets indésirables possibles, on peut citer : un stress passager lié à la manipulation de l’animal ou à la contention (tenir l’animal immobile pour le geste) ; de petites inflammations ou hématomes au point d’injection ou de prélèvement sanguin ; des réactions à l’anesthésie, comme une respiration ralentie ou un réveil plus long que prévu ; des complications rares comme une infection locale ou une fausse route lors de l’administration par la bouche ou le nez. Certaines chirurgies sont simulées, mais si une intervention réelle est nécessaire, elle est faite sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. Dans tous les cas, les gestes sont réalisés de manière encadrée, avec des mesures de prévention de la douleur et un suivi attentif de l’état de santé de chaque animal.
Devenir
Dans le cadre de ce projet de formation, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur participation. Cela s’explique par le fait que certains gestes techniques réalisés sont potentiellement invasifs ou causent un stress ou un inconfort temporaire. De plus, le projet a une visée pédagogique, ce qui implique des manipulations répétées sur un même animal. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance prolongée, et de respecter les règles de bien-être animal, chaque animal sera endormi profondément lorsque cela est nécessaire, puis euthanasié de manière conforme aux réglementations en vigueur, sans qu’il ne se réveille. Cette décision permet de garantir à la fois une formation de qualité et un traitement respectueux des animaux utilisés.
Remplacement
Dans ce projet de formation, l’utilisation d’animaux vivants n’a lieu qu’en dernier recours, lorsque cela est vraiment nécessaire pour apprendre correctement un geste. Avant cela, les participants passent par une phase de préparation théorique, avec des documents, des vidéos pédagogiques et des explications détaillées. Ensuite, lorsque c’est possible, ils s’entraînent sans utiliser d’animal vivant. Par exemple, ils peuvent manipuler des cadavres d’animaux déjà euthanasiés pour d’autres raisons, ou utiliser des morceaux de tissus animaux (comme de la peau de poulet) ou encore des modèles en plastique conçus pour simuler des gestes. Ces étapes permettent d’apprendre les bons réflexes et de s’habituer au matériel sans faire souffrir d’animaux. L’usage d’animaux vivants est donc limité à ce qui est strictement nécessaire pour valider les compétences dans des conditions proches de la réalité.
Réduction
Ce projet de formation a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en permettant aux participants d’apprendre correctement les gestes nécessaires à leur travail. Chaque personne formée apprend plusieurs gestes sur un seul animal, ce qui permet de mutualiser les apprentissages et d’éviter d’utiliser un animal différent pour chaque geste. En moyenne, une personne réalise une seule procédure de formation qui nécessite cinq animaux. Au total, pour l’ensemble du projet, cela représente environ 863 souris et 173 rats sur cinq ans, en comptant une marge de sécurité pour les imprévus. Quand cela est possible, les animaux utilisés ne sont pas élevés spécifiquement pour ce projet : ce sont par exemple des animaux surnuméraires, des animaux non utilisés dans d’autres expériences ou des animaux de contrôle en fin de suivi. Cela permet de réduire encore davantage le nombre d’animaux produits et de donner une utilité à des animaux qui auraient été euthanasiés sans avoir servi. Cette organisation permet donc de former les professionnels de manière efficace, tout en respectant les principes de réduction fixés par la réglementation européenne.
Raffinement
Dans ce projet de formation, tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress ou l’inconfort que pourraient ressentir les rats et les souris. Les participants commencent toujours leur apprentissage sans utiliser d’animaux vivants, en s’exerçant d’abord sur des modèles ou des animaux déjà décédés. Ce n’est qu’une fois ces étapes franchies qu’ils manipulent un animal vivant, sous la supervision d’un formateur expérimenté. Quand un geste est potentiellement douloureux, un médicament antidouleur (buprénorphine) peut être donné à l’animal avant l’intervention. Si un geste s’avère trop difficile à réaliser sans gêne pour l’animal, une anesthésie temporaire peut être utilisée pour éviter toute souffrance. Les chirurgies, lorsqu’elles sont nécessaires, sont toujours faites sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. L’état de chaque animal est suivi à l’aide d’une grille d’observation (cf. Annexe 4) qui permet de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si un animal atteint un seuil critique (appelé « point limite »), il est euthanasié sans souffrance. Des soins supplémentaires sont apportés, comme le maintien au chaud, la mise à disposition d’aliments faciles à manger après une anesthésie, et la surveillance régulière de leur état. Toutes ces mesures sont mises en place pour respecter les principes de protection animale définis par la réglementation européenne, et garantir une formation de qualité sans exposer inutilement les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisées dans la recherche scientifique. En France, elles représentent environ 70 % des animaux utilisés dans les laboratoires. Ce sont donc les espèces que les participants à cette formation seront amenés à manipuler dans leur travail. Les animaux utilisés sont tous adultes, en bonne santé, et sans maladie. Ce choix est important : les animaux adultes sont plus faciles à manipuler, leur taille permet de bien voir les gestes à effectuer, et cela correspond aux conditions réelles dans lesquelles les chercheurs travaillent. Aucun animal jeune ou âgé n’est utilisé pour la formation. Utiliser des rats et des souris adultes permet donc d’apprendre dans de bonnes conditions, tout en limitant les risques pour l’animal et en respectant les règles éthiques.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus Influenza de type A : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, infectées par des virus Influenza A avec, pour une partie, une co-infection au SARS-CoV-2. Les animaux peuvent développer perte de poids, détresse respiratoire et fièvre, avant d'être mis à mort pour le prélèvement des organes. Le protocole prévoit de ne leur administrer aucun anti-inflammatoire, pour ne pas altérer la réponse immunitaire étudiée. Le RNT décrit par ailleurs un projet garantissant "le meilleur niveau possible de bien-être animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les virus Influenza de type A responsables de la grippe provoquent la maladie, et de tester de nouvelles façons de la prévenir ou de la traiter. Pour cela, nous utiliserons des modèles de souris qui permettent de reproduire certains aspects de la maladie observés chez l’être humain. L’étude s’intéressera d’abord à la manière dont le virus se multiplie et se propage dans le corps, puis à la façon dont l’organisme réagit pour se défendre. Le système immunitaire peut être comparé à une armée de défense : il est constitué de cellules et de molécules qui reconnaissent le virus et essaient de l’éliminer. Cependant, si cette réponse est trop forte ou mal contrôlée, elle peut provoquer une inflammation importante et abîmer certains organes. Comprendre cet équilibre est essentiel pour savoir pourquoi certaines personnes guérissent facilement, alors que d’autres développent des formes plus graves ou durables de la maladie. Différentes stratégies thérapeutiques seront testées notamment des molécules capables de réguler la réponse immunitaire afin de limiter la multiplication du virus, réduire les symptômes et prévenir les complications. Pour anticiper les conséquences d'une potentielle co-circulation saisonnière du virus Influenza de type A et du SARS-CoV-2, nous réaliserons des doubles infections séquentielles chez l'animal. Cette approche déterminera si la primo-infection exerce un effet protecteur ou aggravant sur la pathologie consécutive au second challenge viral. Ce projet respectera strictement le principe des 3R, qui sont au cœur de la recherche animale responsable : - Remplacer : Utiliser des méthodes alternatives chaque fois que cela est possible, telles que la culture cellulaire ou encore la modélisation informatique. - Réduire : Limiter le nombre d’animaux utilisés en ne réalisant que les expériences indispensables. - Raffiner : Adapter les techniques et assurer un suivi attentif des animaux pour réduire au maximum leur douleur, stress et inconfort. L’objectif global est d’améliorer la compréhension de la maladie afin de développer plus rapidement des traitements sûrs et efficaces pour l’être humain, tout en garantisant le meilleur niveau possible de bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre au point de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre comment la grippe causée par les virus Influenza de type A se développe et évolue. Ces modèles permettront aussi de savoir pourquoi certains modèles de souris, et par corrélation certaines personnes tombent plus gravement malades que d’autres. Une fois ces modèles établis, ils serviront à tester de nouvelles stratégies de prévention et de traitement, comme des vaccins, des anticorps ou des médicaments destinés à bloquer le virus ou à aider le corps à mieux se défendre. Les résultats attendus permettront d’améliorer les étapes de recherche avant les essais chez l’humain et de favoriser le développement de traitements plus sûrs et plus efficaces contre la grippe. A terme, ce projet contribuera à mieux protéger la santé humaine tout en respectant le bien-être animal.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par le muscle : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par le nez : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par voie intraveineuse : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
A la suite de l’infection des animaux par les virus Influenza de type A, plusieurs effets indésirables peuvent être observés. Les principaux signes attendus incluent une perte de poids, des altérations comportementales (ex. baisse d’activité), ainsi que des signes de détresse respiratoire (respiration rapide, irrégulière ou superficielle). Des réactions locales peuvent également survenir au niveau des sites d’injection, se manifestant par une irritation, une légère inflammation ou un saignement transitoire. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer une gêne légère et passagère au point de ponction, rapidement résolue après compression locale. Les manipulations répétées, telles que les mesures de fonction respiratoire ou les anesthésies, peuvent induire un stress léger à modéré lié à la restriction de mouvement et à l’isolement temporaire. La récupération post-anesthésie chimique est plutôt lente s’accompagnant d’une baisse d’activité temporaire, de frissions, d’une diminution de l’appétit et plus rarement d’une respiration ralentie. Chez les animaux génétiquement modifiés, les réponses inflammatoires ou les troubles respiratoires peuvent être plus marqués ou durer plus longtemps. Un épisode de fièvre est possible ; en l’absence de mesure directe, un soutien thermique est assuré par l’enrichissement des cages (ajout de coton) au moment de l’anesthésie et de l’infection. L’état des animaux sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi qui inclue l’état respiratoire, l’apparence générale, des yeux et des poils ainsi que des comportements spontanés. Tout changement significatif sera consigné et les individus présentant des signes d’alerte feront l’objet d’une surveillance accrue assurée conjointement par le personnel animalier et les ingénieurs responsables des protocoles expérimentaux.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront sacrifiés par euthanasie conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme en carton, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des mesures appropriées, y compris la mise à mort lorsque nécessaire, seront mises en œuvre sans délai afin d’éviter toute aggravation de l’état des animaux. Etant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d’anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l’expression de marqueurs d’intérêt ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser le modèle murin (la souris) car c’est un mammifère dont 99% des gènes sont similaires à ceux de l’Homme. La souris un animal de petite taille, se reproduisant rapidement et facile à élever. De plus, son anatomie, sa physiologie et sa biologie sont aujourd’hui très bien connues, ce qui en fait un modèle de référence pour la recherche scientifique. La souris est particulièrement adaptée à l’étude du système immunitaire grâce aux nombreuses connaissances déjà acquises et aux outils largement disponibles pour ce modèle. Pour nos expérimentations nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Ce critère garantit que les animaux possèdent un système immunitaire pleinement développé, ce qui permet de limiter les variations naturelles qui ne seraient pas liées à l’étude elle-même.
Rôle d’un métabolite (D-sérine) produit par l’intestin et le microbiote dans le dialogue intestin–cerveau au cours des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises à une inflammation intestinale induite, à un gavage quotidien et à une distension colorectale répétée, 1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le RNT classe le test de la nage forcée comme sévère et décrit une inflammation pouvant provoquer perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles. Ce travail de recherche fondamentale explore le rôle d'un métabolite dans le dialogue intestin-cerveau, les perspectives thérapeutiques étant repoussées au "long terme". Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement de tissus.
Objectifs
La finalité de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inflammation intestinale et les douleurs abdominales associées, dans le cadre de l’axe reliant le microbiote intestinal et le fonctionnement de l’organisme. Ce travail relève de la recherche fondamentale. Il vise à identifier comment certaines bactéries intestinales et certaines molécules naturellement présentes dans le corps peuvent influencer l’inflammation et la sensibilité de l’intestin. À court terme, le projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’apparition et le maintien de l’inflammation intestinale et des douleurs associées. À moyen terme, il permettra d’évaluer le potentiel de certaines bactéries dites « probiotiques » pour moduler l’inflammation et limiter les douleurs dans un modèle expérimental. À long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote intestinal afin d’améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires intestinales et des douleurs abdominales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes de communication entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau, en identifiant le rôle spécifique du métabolisme de la D-sérine et des acides aminés de configuration D dans les troubles inflammatoires intestinaux. Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des liens entre inflammation intestinale, dysbiose du microbiote et altérations des fonctions cérébrales associées (comportements anxio-dépressifs et troubles cognitifs). Ce projet fournira également des données translationales originales issues de modèles animaux et d’échantillons de patients, susceptibles d’identifier de nouveaux biomarqueurs liés au métabolisme de la D-sérine dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Enfin, l’évaluation de stratégies innovantes de modulation du métabolisme intestinal de la D-sérine, notamment via l’utilisation de probiotiques ciblés, ouvrira des perspectives thérapeutiques nouvelles pour la prise en charge des troubles intestinaux et de leurs comorbidités neuropsychiques.
Procédures
Les animaux peuvent être soumis aux interventions suivantes : Administration d’une substance dans l’eau de boisson afin d’induire une inflammation intestinale temporaire. Administration quotidienne par gavage oral d’une préparation probiotique pendant 7 jours. Réalisation de tests comportementaux (test de la nage forcée et test du labyrinthe en croix surélevé). Mesure de la sensibilité intestinale par distension colorectale. Prélèvements de selles. Mise à mort réglementaire en fin de procédure suivie du prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Inflammation intestinale induite : nuisance modérée, pouvant entraîner perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles pendant quelques jours (durée limitée à la période d’exposition). Gavage oral quotidien : nuisance légère à modérée, correspondant à un stress transitoire lié à la manipulation (quelques minutes par jour pendant 7 jours). Test du labyrinthe en croix surélevé : nuisance modérée, liée à un stress et une anxiété transitoires (durée du test : quelques minutes). Test de la nage forcée : procédure classée sévère, induisant un stress aigu lors de l’exposition à l’eau (durée limitée au temps du test). Distension colorectale : nuisance modérée à sévère, correspondant à un inconfort intestinal bref et répété (quelques secondes à quelques minutes lors de la mesure). Prélèvements de selles : nuisance faible, car réalisés sans geste invasif.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Les mécanismes étudiés impliquent des interactions complexes entre l’intestin, le microbiote et l’organisme entier. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un modèle in vitro ou informatique. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les différentes analyses sont réalisées sur les mêmes animaux afin d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Les procédures ont été conçues pour limiter le stress et l’inconfort. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation, d’un suivi clinique régulier et de points limites prédictifs permettant l’arrêt immédiat de la procédure si nécessaire. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinale et métabolique et immunitaire
Nouvelles thérapies antitumorales médiées par le système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à huit injections et un suivi de la tumeur au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Les tumeurs peuvent provoquer douleurs locales, perte d'appétit et baisse de température corporelle. Le projet vise à confirmer in vivo des composés déjà repérés in vitro pour activer une réponse immunitaire antitumorale. Les bénéfices pour les patients, des chimiothérapies "plus efficaces", sont annoncés à long terme, quand la mise à mort des 3 920 souris pour analyse post-mortem, elle, est certaine.
Objectifs
La chimiothérapie est aujourd’hui le traitement de référence pour la majorité des cancers. Un certain nombre limité d’agents tels que les anthracyclines (Mitoxantrone) ont la capacité de déclencher des signaux de stress qui induisent la mort cellulaire immunogène (MCI). Cette dernière permet le recrutement des cellules dendritiques, qui va induire la stimulation d’une réponse immunitaire antitumorale immédiate, et créer une protection à long terme. Nous avons donc réalisé, in vitro, des tests sur un grand nombre de molécules afin de mettre en lumière de nouveaux composés capable d’induire cette MCI. A présent, nous souhaitons vérifier in vivo que ces molécules ont un effet antitumorale, que cet effet est bien lié au système immunitaire et que cette protection anti-cancéreuse est conservée sur le long terme.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mettre en lumière de nouveaux composés antitumoraux activateur du système immunitaire. A long terme, il permettra ainsi de proposer de nouvelles chimiothérapies plus efficaces pour les patients.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux à 8 injections sous anesthésie locale (vigile,
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements par injection, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse 2 à 3 fois par semaine (tous les trois jours). Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et légères, et un eperte d'appétit modérée. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée ou des diarrhées et donc une perte de poids chez la souris. Il est aussi possible d’observer une baisse de la température corporelle de l’animal.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse post-mortem des tumeurs et du système immunitaire.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude sur la souris est nécessaire car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.
Réduction
La première procédure nous permettant de voir quels composés (et à quelle concentration) induisent une baisse de la croissance tumorale et si la combinaison avec du Cisplatine peut la potentialiser, nous le strict minimum de souris par groupe (procédure go/no go). Et nous ne réaliserons les combinaisons de traintements que sur les conditions qui induisent une baisse de la croissance tumorale. Puis, pour les autres procédures, une analyse statistique nous a permis de déterminer un nombre minimum de souris par groupe. Pour prendre en compte de possibles exclusions, une souris supplémentaire a été ajoutée au calcul par groupe (cause possible d'exclusion. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale ne conforte pas l’hypothèse de travail. Nous réaliserons toutes les expériences avec des mâles et des femelles car il a été prouvé que le sexe influence l’immunité adaptative et innée.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un sytème immunitaire mature.
Analyse, chez la souris, d’un gène responsable de maladie auto-immune chez l’Homme 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Pour analyser un gène associé à une maladie auto-immune humaine, 360 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent prélèvements sanguins, injections et vaccinations, et passent sept jours isolées en cage métabolique, une contrainte que le RNT classe lui-même comme stress modéré. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées à un éventuel "à terme", l'objectif immédiat restant l'avancée de connaissances fondamentales. Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement des tissus.
Objectifs
Nous avons identifié chez des patients des mutations d’un gène associé à l’actine, une protéine majeure de la structure et de l’activité cellulaire. Ces patients présentent des manifestations pathologies immunitaires précoces et sévères. Les mécanismes sont complexes et les pistes thérapeutiques sont limitées. Dans un modèle de délétion génétiques de ce gène chez la souris nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes de ces pathologies afin d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles efficaces.Ce projet est multisite et se déroulera dans deux EU.
Bénéfices attendus
L’analyse de ce modèle de souris permettra d’étudier le rôle de la délétion d'un gène impliqué dans des maladies métaboliques et immunitaires. Ce projet permettra l'avancée des connaissances fondamentales. Et, à terme ce projet pourrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les patients porteurs de mutation ou présentant des maladies similaires.
Procédures
Prélèvement de sang (de 6 à 10 x 30secondes), Injections (de 3 à 5 x 30 secondes), vaccinations (4x 1 minute), prélèvement urinaire et fèces en cage métabolique (pendant 7 jours).
Impact sur les animaux
Le transfert des animaux entre les deux EU peut entrainer un léger stress. Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les vaccinations sont une source de stress modéré chez la souris avec une douleur légère de courte durée. L’isolation des souris en cage métabolique pendant 7 jours est la source d’un stress modéré chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser la complexité du système immunitaire, du métabolisme énergétique et des comportements associées. Il est nécessaire de comprendre l’organisation et la coopération de différents tissus métaboliquement actifs.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées. Le nombre de souris par groupe a été déterminé pour permettre de détecter des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des expériences pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Des grilles de score et des points limites strict et spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les gestes décrits dans les procédures se font sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les mécanismes immunitaires et métaboliques sont similaires entre l'homme et la souris, qui représente donc un modèle pertinent pour mimer ce qui survient chez des patients présentant des maladies avec des effets sur le métabolisme. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes, à partir de 6-8 semaines pour lesquelles le système immunitaire est mature.
Étude d’un modèle murin d’infection à Tropheryma whipplei et du rôle du facteur de transcription FoxP1 dans la réponse immunitaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre pourquoi certaines personnes développent la maladie de Whipple, 60 souris porteuses d'une mutation d'un gène immunitaire sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par voie orale par la bactérie Tropheryma whipplei, après un prélèvement de sang et une habituation à boire une solution sucrée à la micropipette. Le porteur attend des effets modérés et transitoires, perte de poids et baisse d'activité, sans mortalité liée à l'infection. Toutes les souris sont tuées pour prélever fluides et organes, l'étude comparant des animaux mutés à des témoins.
Objectifs
Tropheryma whipplei est l’agent responsable de la maladie de Whipple, une maladie chronique rare pouvant être grave en l’absence de traitement. Bien que cette bactérie soit relativement fréquente dans la population générale et souvent portée sans symptôme, seule une minorité de personnes développe la maladie. Cela suggère l’existence de facteurs individuels de susceptibilité. Des études récentes ont mis en évidence l’implication possible d’un gène, FOXP1, qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, notamment dans certaines cellules impliquées dans la défense contre les infections. Toutefois, son rôle précis dans la réponse immunitaire contre Tropheryma whipplei reste encore mal compris. Nous faisons l’hypothèse qu’une altération de ce gène pourrait perturber la réponse immunitaire et favoriser l’installation ou la persistance de l’infection. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cette altération génétique sur les mécanismes de défense de l’organisme à l’aide d’un modèle expérimental d’infection. Cette approche repose sur l’identification de variations rares de ce gène chez des patients atteints de la maladie de Whipple. Nous analyserons le développement de l’infection, son évolution dans le temps ainsi que les différentes étapes de la réponse immunitaire, en comparant des modèles porteurs de cette altération génétique à des modèles témoins. L’utilisation de ce type de modèle est essentielle pour étudier de manière intégrée la complexité des interactions immunitaires et la dynamique de l’infection à l’échelle de l’organisme, ce qui ne peut être reproduit par des systèmes simplifiés. Ce projet vise ainsi à mieux comprendre le rôle de FOXP1 dans l’immunité contre Tropheryma whipplei et à éclairer les mécanismes expliquant la susceptibilité à la maladie de Whipple.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie de la maladie de Whipple. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et de prise en charge des patients atteints de maladie de Whipple. Les résultats de ce projet permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans l’infection à T. whipplei et du rôle de FoxP1 dans la régulation de la réponse immunitaire. Ces données pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques associés aux infections chroniques et aux dysfonctionnements de la réponse immunitaire.
Procédures
Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué une seule fois avant l’infection sur souris vigile à l'aide d'une lancette (Golden Rod4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts. La durée de ce geste par le personnel formé et expérimenté n’excèdera pas 1 minute. Le gavage et le MDA font partis des nuisances possibles bien que nous ne pratiquerons le gavage qu’en cas de problème d’habituation à la méthode MDA « Micropipette-guided Drug Administration ». L’habituation au MDA consiste à présenter la solution sucrée à la souris (500microL) le jour 1 en état de contention. La durée de la prise de ce petit volume et la mise sous contention (maintien par le cou) ne devrait pas excéder 1 minute. Le deuxième jour, la souris est légèrement immobilisée en lui maintenant la queue et en lui présentant la boisson. La durée peut être légèrement variable d’un animal à l’autre. L’estimation est de 1 à 2 minutes maximum. A J3, d’après les auteurs de ce processus, la souris boit sans contrainte la boisson. La durée dépendra de chaque souris comme précédemment mais ne devrait pas excéder 2 minutes. Chaque souris se verra proposer seulement le jour de l’infection, cette eau de boisson avec soit du PBS soit la bactérie T. whipplei.
Impact sur les animaux
L’infection orogastrique par T. whipplei est susceptible d’induire des effets indésirables faibles à modérés chez les animaux. Les effets attendus incluent principalement une altération transitoire de l’état général, une légère perte de poids ou un ralentissement de la prise de poids, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité. Des effets digestifs légers, tels qu’une modification transitoire du transit, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement modérés, transitoires et réversibles. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu, notamment en termes de douleur intense, de détresse respiratoire, de signes neurologiques ou de mortalité liée à l’infection. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance et de mettre en œuvre, si nécessaire, des mesures adaptées. En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’infection, un analgésique (buprenorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.
Remplacement
Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle murin afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de l’infection par T. whipplei et de comprendre les mécanismes immunitaires sous-jacents, dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques pour la prise en charge des patients. En particulier, ce modèle permet d’évaluer l’impact d’une perte de fonction hétérozygote de Foxp1 sur l’installation de l’infection, sa persistance et la qualité de la réponse immunitaire au niveau de l’organisme entier. À ce jour, aucune lignée cellulaire ni modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité des interactions entre T. whipplei et les différentes populations immunitaires, notamment les cellules T CD4+ et les macrophages, ni leur coordination dans le contrôle de l’infection. Les approches in vitro ne permettent pas non plus d’étudier la cinétique de l’infection, sa dissémination tissulaire, ni les mécanismes intégrés impliquant plusieurs organes et compartiments immunitaires. De plus, FOXP1 étant un facteur de transcription impliqué dans la régulation de multiples types cellulaires, son rôle ne peut être pleinement compris qu’à l’échelle d’un organisme intact. Le modèle murin constitue donc une approche indispensable et complémentaire aux études génétiques humaines ayant identifié FOXP1 comme gène de susceptibilité à la maladie de Whipple. Il permet de valider fonctionnellement ces observations, d’établir un lien de causalité entre le déficit en Foxp1 et l’altération de l’immunité anti-T. whipplei, et d’identifier les mécanismes impliqués. Ces données sont essentielles pour améliorer l’identification des individus à risque et orienter le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe/temps sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire.L’étude de l’infection à Tropheryma whipplei implique des interactions complexes entre l’agent infectieux, le système immunitaire et différents tissus, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. Le recours à un modèle animal est indispensable pour étudier la dynamique de l’infection, la dissémination bactérienne et la réponse immunitaire dans un organisme entier. La souris a été choisie en raison : • de la disponibilité de modèles génétiques pertinents, notamment les souris porteuses d’une mutation hétérozygote perte de fonction du gène FoxP1, • de la bonne caractérisation de son système immunitaire, • de l’existence de données bibliographiques soutenant son utilisation dans l’étude des infections bactériennes. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.