Souris
Caractérisation d’un modèle humanisé de myopathie myotubulaire liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris mâles malades atteignent un point limite entre sept et huit semaines, marqué par une paralysie des membres postérieurs et une forte perte de poids. 94 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des mesures hebdomadaires de force, puis un test contractile final sous anesthésie sans réveil, pour caractériser un nouveau modèle humanisé de myopathie myotubulaire. Le porteur reconnaît que les animaux issus du croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu, traité par précaution comme dommageable.
Objectifs
La myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM) appartient à un groupe de maladies génétiques appelées les myopathies centronucléaires (CNM), caractérisées par une altération sévère de la fonction des muscles squelettiques, touchant exclusivement les individus de sexe masculin. Cette pathologie entraîne une atteinte sévère de la qualité de vie des patients, avec un décès prématuré avant l’âge de 18 mois dans environ la moitié des cas, ou plus tardivement au cours de la petite enfance. À ce jour, aucune thérapie curative n’est disponible. Des travaux antérieurs ont mis en évidence deux variations génétiques susceptibles d’être ciblées, présentes chez près de 70 % des patients atteints de myopathies centronucléaires, dont la myopathie myotubulaire. L’objectif de ce projet est de générer un nouveau modèle murin humanisé de la myopathie XLMTM, porteur de ces variations génétiques humaines, afin de permettre le développement ultérieur d’une stratégie thérapeutique applicable chez l’homme. Ce modèle constituerait un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de thérapies géniques dans un contexte de souris humanisée présentant la pathologie.
Bénéfices attendus
La progéniture de ce croisement permettra d’évaluer une preuve de concept thérapeutique ciblant les variations génétiques humaines chez plus de 70 % des patients atteints de CNM, notamment les formes sévères. Ce modèle permettra de valider une approche applicable à diverses formes de CNM.
Procédures
Le projet est divisé en 2 groupes d’animaux : (Groupe 1) : Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la survie des souris. Un suivi non invasif des souris sera mis en place avec la mesure de la force du corps durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaine, un test de mesure de la force des pattes durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaines et une pesée régulière, une fois par semaine de 2 à 4 semaines d’âge, tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines. Ensuite, (Groupe 2) Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la force des souris : Chaque semaine, deux tests seront effectués : un test non invasif de la force du corps et un test non invasif de la force des pattes. Ces tests dureront 3 fois 1 minute et seront répétés une fois par semaine, de la 4ᵉ à la 7ᵉ semaine. Chaque semaine, une mesure de la coordination motrice sera répétée de la 4e à la 7e semaine. Pour finir, un test de mesure contractile du muscle, réalisé une fois sous anesthésie générale à la fin de l’étude, durant au maximum 1 heure. Une pesée régulière sera mise en place une fois par semaine, de 2 à 4 semaines d’âge, puis tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge, et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines d’âge. Le test de mesure de la force contractile est une procédure chirurgicale sans réveil, au terme de laquelle les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques humanisée utilisées pour ce croisement ne présentent pas de phénotype dommageable. En revanche, les souris mâles atteintes du modèle de la maladie développent une atteinte locomotrice progressive à partir de 4 à 5 semaines de vie et atteignent généralement un point limite entre 7 et 8 semaines. Cette atteinte se traduit notamment par une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids importante. Les souris issues du nouveau croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu. Par précaution, ces animaux seront considérés comme potentiellement dommageables dans l’attente des premières données expérimentales et feront l’objet du même protocole de surveillance et des mêmes critères de point limite que les souris malades du modèle. Les nuisances associées aux tests phénotypiques pourront inclure la peur de la chute lors du test de mesure de la force du corps, le stress lié à la contention ainsi qu’une douleur potentielle lors des injections nécessaires à certaines mesures expérimentales (mesure de la force des pattes et de la coordination motrice). Les souris malades présentent des difficultés locomotrices à partir de 4 semaines, entraînant une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids vers 7 à 8 semaines. Il n’est pas exclu que les animaux puissent ressentir de la douleur liée à des problèmes musculaires (comme des crampes). Les nuisances liées aux tests incluent du stress lors des différents tests pour évaluer le phénotype musculaire, et lors de la contention durant les injections, ainsi qu’une douleur lors de l’insertion de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et organes nécessaires aux études histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le modèle murin est physiologiquement et structurellement proche de l’Homme, ce qui nous permettra d’étudier, d’une part, la physiopathologie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne suffirait pas à elle seule, car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossibles à mesurer.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi sur la base des données de la littérature, afin de détecter une différence statistiquement significative entre les différents groupes d’animaux (malades, sains, etc.). Lorsque cela est possible, des animaux de la procédure 2 pourront être utilisés pour réduire le nombre nécessaire à la procédure 3. Les tests de mesure de la force du corps, de la force des pattes et de la coordination motrice sont non invasifs ; ils permettent de réutiliser les mêmes animaux à chaque point dans le temps, et un même animal pourra donc produire des données de force globale et contractile, ainsi que des données histologiques et moléculaires.
Raffinement
Pour prévenir toute malnutrition qui pourrait être due à des difficultés locomotrices, de la nourriture hydratée en gelée sera placée dans la cage dès l’apparition des premiers symptômes à 4 semaines. Lors du test sous anesthésie générale, la température corporelle de l’animal sera maintenue à l’aide d’une plaque chauffante. Pour les nouveau-nés, leur capacité à se mouvoir et le comportement maternel seront observés quotidiennement durant la première semaine de vie À partir de l’âge de 2 semaines, les animaux seront pesés de manière hebdomadaire. La fréquence de pesée sera augmentée à tous les 2 à 3 jours dès l’âge de 4 semaines, correspondant au début d’apparition du phénotype, puis à tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines en raison de l’aggravation progressive du phénotype. En cas d'infection importante, à la suite d’une bagarre par exemple, les animaux seront euthanasiés sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle de souris récapitule fidèlement le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et constitue donc un bon modèle pour l’étude des mécanismes pathologiques et l’évaluation de thérapies. La maladie affectant les hommes, seuls les animaux mâles seront étudiés. Les défauts locomoteurs apparaissent à 4 semaines et progressent jusqu’à 8 semaines. Le suivi longitudinal de force globale sera donc effectué à partir de 4 semaines, avec un test contractile final à 7 semaines, précédant la paralysie des membres postérieurs, dans le cas du groupe 2. Pour les études de survie (groupe 1), le suivi de la force est prolongé jusqu'à atteinte d'un point limite. Tous les animaux sont pesés régulièrement dès 2 semaines d'âge pour détecter toute détresse animale au plus vite
Modulation thérapeutique de l’architecture nucléaire par AAV dans un modèle murin de myopathie centronucléaire et wild type
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Atteintes d'une forme grave de myopathie qui les tue spontanément vers six ou sept semaines, une partie des 224 souris de ce projet développe faiblesse musculaire et perte de poids indépendamment du traitement. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, et toutes les souris, malades comme témoins, sont tuées en fin d'expérience pour analyse des muscles. Elles reçoivent une injection unique de thérapie génique par virus sous anesthésie légère, puis des tests de force et de marche. Seuls des mâles sont utilisés, la maladie étant liée au chromosome X.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester si l’injection d’un traitement génétique peut améliorer le phénotype musculaire de souris atteintes d’une forme grave de myopathie rare. Cette maladie ne dispose actuellement d’aucun traitement curatif. Pour cela, on utilisera des virus inoffensifs capables de transporter soit de petites molécules destinées à bloquer certains gènes susceptibles d’aggraver la maladie, soit des copies complètes de ces mêmes gènes, afin d’en étudier les effets dans des souris contrôles et dans des souris malades. Le traitement sera administré après la naissance afin de corriger le fonctionnement des muscles altérés ou d’analyser les conséquences de cette modulation génétique dans un contexte musculaire sain et pathologique. En complément de ces approches, une étude pilote sera réalisée à l’aide d’une autre méthode de blocage génétique. Cette technique vise à bloquer spécifiquement une molécule d’ARN soupçonnée de jouer un rôle dans la maladie. Ce traitement sera injecté localement dans le muscle afin d’en évaluer l’efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait démontrer qu’il est possible de corriger certains défauts musculaires en ciblant des gènes spécifiques, ou que l’augmentation de l’expression de certains gènes a un effet positif ou négatif sur la fonction musculaire. À terme, cela pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies musculaires génétiques sévères qui ne disposent aujourd’hui d’aucun traitement curatif. Ce projet permettra aussi d’identifier des gènes à privilégier ou à éviter dans une approche thérapeutique.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique par voie systémique ou intramusculaire sous anesthésie légère. L’injection durera moins de cinq minutes par animal. Aucun geste chirurgical lourd ne sera réalisé. Des tests fonctionnels non invasifs (force de préhension, analyse de la démarche, test d’endurance) seront effectués pour évaluer l’effet des traitements. À la fin de l’expérience, après anesthésie et euthanasie, des prélèvements musculaires seront réalisés pour analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent entraîner un léger inconfort transitoire au point d’injection (rougeur, légère inflammation) ou un stress momentané lié à la manipulation. Chez les souris malades, des signes cliniques sévères sont attendus indépendamment du traitement, en lien avec la maladie : perte de poids progressive, faiblesse musculaire marquée, réduction de la mobilité, difficultés d’alimentation et mortalité spontanée entre 6 et 7 semaines d’âge. Chez les animaux sains comme chez les animaux malades, la diminution ou l’augmentation de l’expression de certains gènes candidats pourrait entraîner une faiblesse musculaire, une baisse d’activité, une altération de la marche ou une aggravation du phénotype musculaire. Ces effets, difficiles à prédire, feront l’objet d’une surveillance attentive.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de permettre l’analyse détaillée des muscles et d’autres organes aux niveaux histologique, cellulaire et moléculaire. Ces analyses post-mortem sont indispensables pour évaluer précisément l’effet des traitements et comprendre les mécanismes biologiques impliqués. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
Il n’est pas possible d’utiliser uniquement des cellules en culture à la place des souris, car les phénomènes étudiés (comme la position des noyaux, la force musculaire ou les effets généraux d’une modification de l’expression de certains gènes) nécessitent un organisme entier pour être correctement observés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Des méthodes statistiques seront utilisées pour s’assurer que ce nombre est suffisant, y compris pour les groupes recevant une augmentation de l’expression de certains gènes. Des tests fonctionnels complémentaires (force de préhension, tapis roulant, analyse de la démarche et évaluation de la fonction musculaire) contribueront également à l’évaluation globale des effets du traitement.
Raffinement
Les procédures susceptibles de provoquer de la douleur ou du stress sont réalisées sous anesthésie afin de limiter au maximum la souffrance. Les cages sont enrichies (abris, nourriture en gel facilement accessible) et les animaux sont surveillés régulièrement. Des critères précis ont été définis pour repérer rapidement tout signe de souffrance. Si nécessaire, la procédure est interrompue et l’animal est euthanasié sans délai afin d’éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Le modèle choisi reproduit de manière pertinente la maladie humaine étudiée (une forme grave de myopathie) : les souris présentent des noyaux mal positionnés dans leurs muscles (au centre plutôt qu’en périphérie), une faiblesse musculaire et une mort précoce, ce qui permet d’étudier la maladie dans des conditions réalistes. Seuls les mâles seront utilisés car cette maladie génétique touche principalement les mâles (elle est liée au chromosome X). L’utilisation de femelles n’aurait donc pas d’intérêt scientifique dans cette étude. Les souris seront traitées entre 2 et 5 semaines d’âge, ce qui correspond à une période où les muscles sont encore en cours de développement. Cela permet une bonne efficacité du traitement. Les souris malades ne vivent généralement que jusqu’à 6 ou 7 semaines ; il est donc important d’intervenir tôt pour évaluer les effets du traitement avant que la maladie ne soit trop avancée. Les souris contrôles (WT), y compris celles recevant des vecteurs de surexpression, suivront le même protocole d’injection afin que les groupes soient comparables.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris. MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur les souriceaux, injections répétées, chirurgie de quarante-cinq minutes sur des femelles gestantes, injection sur les embryons, puis induction de crises d'épilepsie : 4 084 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 672 en gravité sévère. Le test d'induction de l'épilepsie provoque une détresse chez l'animal, et la biopsie une douleur modérée. Une partie des souris est gardée vivante pour la reproduction, dont cinquante-deux femelles réengagées dans une autre procédure, le reste étant tué pour prélèvement. Le projet teste une protéine censée réduire la sévérité de l'épilepsie, avec des objectifs décrits en deux phrases très brèves.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance. En outre la modification apportée à cette demande vise à tester une protéine en particulier dans sa capacité à rèduire la sévérité de l'épilepsie.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.
Etude de la modulation des circuits du cortex piriforme et des performances olfactives par les projections du télencéphale basal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées du crâne sous anesthésie pendant une à deux heures pour recevoir une injection virale, 1 410 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, quarante d'entre elles tuées sans réveil. Un dispositif est implanté sur le crâne, puis les animaux réalisent une tâche olfactive jusqu'à trois heures par jour pendant six à sept semaines. Pour les motiver, le porteur impose une restriction d'accès à l'eau pouvant entraîner une déshydratation modérée et une perte de poids. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement, l'étude portant sur le filtrage des odeurs par le cerveau.
Objectifs
Notre cerveau est capable de détecter des milliers d’odeurs, mais il ne traite pas toutes ces informations de la même façon. Par exemple, quand nous avons faim, l’odeur d’un plat cuisiné devient bien plus attrayante que lorsque nous sortons d’un bon repas. Un autre exemple est celui de certaines odeurs que nous ne "sentons" pas mais qui deviennent détectables si nous y prêtons attention. Comment le cerveau fait-il pour "mettre en avant" certaines odeurs plutôt que d’autres ? Nous pensons qu’une région cérébrale appelée télencéphale basal joue un rôle clé dans ce processus. Elle envoie des signaux chimiques vers une autre zone, le cortex piriforme, qui est le "centre de traitement" des odeurs. Ces signaux agiraient comme un filtre : ils renforcent la perception des odeurs importantes dans un contexte donné (comme la faim ou l’attention) et atténuent celle des autres. Pour vérifier cette hypothèse nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Grâce à des techniques de pointe, nous pourrons activer ou désactiver spécifiquement les neurones du télencéphale basal et observer comment cela influence la perception des odeurs. Nous enregistrerons aussi l’activité cérébrale des souris pendant qu’elles réalisent des tâches olfactives, pour comprendre l’impact de ces signaux sur le fonctionnement de leur cerveau. L’ensemble de notre projet sera mis en œuvre dans l’application des 3 Rs et le nombre d’animaux utilisé sera le plus faible possible.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation et la fonction des interactions entre deux régions du cerveau, le télencéphale basal et le cortex olfactif. Il nous permettra aussi de mieux comprendre quand et comment le télencéphale basal est mis en jeux et communique avec le cortex olfactif pour moduler la perception des odeurs. Par ailleurs, ce projet examine pour la première fois deux voies issues du télencéphale basal. Elles utilisent des messagers chimiques différents mais pourraient agir ensemble pour moduler notre odorat. Comprendre les interactions entre ces deux voies permettrait d’éclairer les mécanismes cérébraux de l’attention. Chez l’humain, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter notre vie quotidienne. Ces troubles sont aussi parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives. Pourtant, le lien entre odorat et ces pathologies n’est pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies issues du télencéphale basal qui modulensont parmi les premières touchées dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer. En étudiant ces voies chez l’animal, nous pourrions mieux détecter et comprendre l'origine des troubles de l'olfaction chez l’humain.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale (durée 1 à 2 heures) réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde. Certains animaux réaliseront une tâche comportementale de détection olfactive 3 semaines après la chirurgie. Cette tâche dure au maximum 3h/jour pendant au maximum 6 à 7 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement liés aux chirurgies réalisées sous anesthésie. Les chirurgies peuvent induire des douleurs aigües, inflammations, hypothermies, sécheresses oculaires et déshydratations. De faibles pertes de poids peuvent survenir les jours suivants la chirurgie. Les souris auront un dispositif implanté sur le crâne pendant qu'elles réalisent un test comportemental. Cela n’est pas douloureux mais peut être une source de stress pour l’animal et nécessite une phase d’habituation au dispositif. Afin de garantir une motivation comportementale indispensable à l’apprentissage des tests olfactifs, les animaux concernés subiront des périodes de restriction hydrique. Une déshydratation modérée peut survenir et avoir un léger impact sur la prise alimentaire et entrainer une perte de poids.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Notre étude porte sur des circuits cérébraux complexes impliqués dans la perception des odeurs. Malheureusement, il n’existe aujourd’hui aucune alternative (comme des cultures cellulaires ou des modèles informatiques) capable de reproduire fidèlement ces mécanismes et ces circuits. Notre projet inclut aussi des tests comportementaux (comme la réaction des souris à des odeurs dans différents contextes). Ces expériences ne peuvent être réalisées que sur des animaux vigiles et actifs, afin d’étudier leurs performances olfactives et comment leur cerveau traite les informations olfactives en temps réel. Les souris sont le meilleur modèle pour notre recherche, car les outils d’ingénierie génétique y sont les plus avancés, ce qui nous permet de cibler précisément les circuits cérébraux à étudier. De plus, les découvertes faites chez la souris ont déjà démontré leur pertinence pour comprendre des mécanismes similaires chez l’humain, notamment en neurosciences.
Réduction
Même si nous ne pouvons pas remplacer totalement les souris par des modèles artificiels, nous faisons tout pour réduire leur nombre au maximum. Dans notre projet, le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement déterminé pour concilier rigueur scientifique, validité statistique et respect du bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été estimé à partir de protocoles similaires déjà validés dans nos travaux antérieurs, de façon à atteindre des résultats statistiquement fiables, sans excès. Nous utilisons des individus mâles et femelles pour limiter la production globale d’animaux tout en tenant compte des variations biologiques. Comme nous explorons des circuits cérébraux qui n’ont jamais été décrits, le nombre exact d’expériences dépendra des résultats obtenus. Nous ne pouvons pas prédire statistiquement ces découvertes, mais les expériences seront arrêtées dès qu’un résultat significatif et original est obtenu, pour éviter d’utiliser des animaux inutiles. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour confirmer que nos résultats sont fiables. Enfin, grâce à des techniques de pointe qui nous permettent de manipuler uniquement les neurones et circuits cérébraux d’intérêt, nous réduisons de moitié le nombre d’animaux nécessaires par rapport à des méthodes classiques qui stimulent à l’aveugle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (avec bâton à ronger, matériaux de nidification, tube de change). Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants, leurs yeux sont protégés avec du gel, et les conditions d’anesthésie générale avec analgésiques sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après les chirurgies, les animaux retourneront dans leur cage avec leurs congénères sauf dérogation pour les animaux destinés aux tests comportementaux. En phase post-opératoire, de la nourriture sous forme de gel est placée dans les cages afin de minimiser les efforts des animaux pour se nourrir et accélérer leur convalescence. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec la vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Être des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptée des animaux. Les animaux devant effectuer une tâche comportementale ont des phases de récupération de minimum 3 semaines après la chirurgie. Ils sont progressivement habitués à être manipulés par l’expérimentateur, à la pièce et au dispositif expérimental. Cette phase d’habituation vise à minimiser la peur et les réactions émotionnelles des animaux. La restriction à l’accès à l’eau, avec habituation progressive, n’affectera pas leur santé ou leur bien-être, car les animaux auront accès à l’eau deux fois dans la journée (pendant les tests, puis après les tests pendant 1-2h) pour compenser leurs besoins.
Choix des espèces
La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier et manipuler des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris qui seront utilisées dans ce projet permettent ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L'utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l'interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux utilisés dans ce projet entreront en procédure à un âge minimum de 2 mois et maximum de 4 mois. A cet âge le développement est terminé et la souris est considérée comme adulte. La fin de la procédure sera au maximum à 6-7 mois.
Évaluation de trois inhibiteurs chez des souris sauvages et modèles de myopathie constitutionnelle : analyse fonctionnelle, électrophysiologique et histologique du muscle squelettique (3-7 semaines).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
80 souris, la moitié atteintes d'une myopathie congénitale, sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection hebdomadaire de l'âge de trois à sept semaines, subissent des tests de force et de démarche, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie profonde d'une heure suivie de la mise à mort. Les souris myopathiques, plus vulnérables, peuvent développer une faiblesse progressive et des complications respiratoires. Le porteur qualifie ce protocole de conforme aux 3R et destiné à minimiser la souffrance, alors qu'il programme la mise à mort de quarante animaux en gravité sévère.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d’évaluer de manière préclinique l’effet de trois inhibiteurs d’une cible protéique clé de la dynamique membranaire sur le phénotype neuromusculaire de souris sauvages et de souris présentant une myopathie congénitale de type X, dans un schéma de traitement précoce débutant au sevrage, et de caractériser l’impact de ces molécules sur la fonction locomotrice, la force musculaire, l'activité électrique des muscles, la structure microscopique, du muscle tibial antérieur afin d’identifier des candidats thérapeutiques prometteurs pour les myopathies congénitales associées à cette voie moléculaire. Il s’agit également de définir un protocole expérimental standardisé, reproductible et conforme aux principes des 3R, qui pourra servir de base à des études ultérieures, tout en produisant des données scientifiques robustes sur l’efficacité et la tolérance de ces inhibiteurs, tout en minimisant la souffrance animale et en garantissant la qualité méthodologique des résultats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’approfondir la compréhension du rôle d’une cible protéique clé de la dynamique membranaire dans la physiopathologie des myopathies congénitales de type X, ainsi que des mécanismes par lesquels son inhibition peut moduler la fonction neuromusculaire et la structure musculaire. Il vise également à identifier, parmi les trois inhibiteurs testés, ceux qui présentent un effet bénéfique sur la fonction locomotrice, la force musculaire, l’électrophysiologie et l’architecture histologique du muscle tibial antérieur, en vue de leur éventuelle valorisation comme candidats thérapeutiques. Le projet contribuera à définir un protocole expérimental standardisé, reproductible et conforme aux principes des 3R, qui pourra servir de référence pour des études futures, tout en minimisant la souffrance animale. Les données produites pourront alimenter des publications scientifiques, des collaborations avec d’autres laboratoires ou des partenariats avec l’industrie pharmaceutique, dans une logique de transfert de connaissances et de technologies. À plus long terme, ce projet pourra contribuer à l’amélioration des perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de myopathies congénitales, en apportant des preuves précliniques solides sur l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches pharmacologiques.
Procédures
Chaque animal sera pesé et une fois par semaine de 3 à 7 semaines. Les animaux recevront une injection intrapéritonéale hebdomadaire de l'âge de 3 semaines jusqu'à l'âge de 7 semaines. L’analyse de la démarche sera réalisée à 3, 5 et 7 semaines, avec une séance de marche d’environ 1 minute par animal. Le test de la grille retournée sera effectué à 3, 5 et 7 semaines, avec 3 essais de 60 secondes maximum chacun, espacés de 15 minutes de repos entre essais. L'enregistrement de l’activité musculaire sera réalisé une fois à 7 semaines, sous anesthésie, avec une durée maximale d’environ 15 minutes par animal. La mesure de force musculaire sera réalisée à 7 semaines sous anesthésie générale profonde, avec une durée totale de procédure d’environ 1 heure par animal, suivie d’une mise à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement liés aux manipulations, aux injections et aux procédures fonctionnelles. Les prises en main répétées, les pesées et les tests comportementaux peuvent induire un stress modéré transitoire, limité par une acclimatation préalable et des conditions de travail standardisées. Les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur ou un inconfort local minime, ainsi qu’un stress lié à la contention, mais ces effets sont limités par l’utilisation d’aiguilles fines, de volumes faibles et d’un geste rapide. Les tests fonctionnels sont non invasifs ou peu invasifs mais peuvent entraîner une fatigue ou un stress modéré transitoire, en particulier chez les souris présentant une myopathie congénitale de type X, plus vulnérables. Ces tests commencent au sevrage à 3 semaines d’âge et se répètent jusqu’à 7 semaines pour la démarche et le test de la grille retournée et à 7 semaines pour la mesure de force musculaire. La mesure de force musculaire sous anesthésie générale profonde comporte des risques de dépression respiratoire et d’hypothermie, limités par un monitoring et une gestion adaptée réalisé à 7 semaines.
Devenir
Le protocole prévoit des prélèvements terminaux de tissus musculaires (tibial antérieur) et, le cas échéant, d’autres organes, nécessaires pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Ces prélèvements entraînent la mise à mort de l’animal, réalisée sous anesthésie profonde immédiatement après la dernière procédure fonctionnelle à 7 semaines. Cette approche permet de limiter la durée de souffrance potentielle et d’éviter toute détérioration clinique ultérieure, en particulier chez les souris myopathiques susceptibles de développer une faiblesse progressive et des complications respiratoires. La collecte terminale de muscles et d’organes est indispensable pour corréler le phénotype fonctionnel avec les analyses moléculaires et histologiques, et pour évaluer l’impact bénéfique potentiel des traitements sur le phénotype musculaire. Les prélèvements étant réalisés après la mise à mort, ils ne s’accompagnent d’aucune douleur supplémentaire pour l’animal.
Remplacement
Les tests précliniques in vitro et in cellulo (culture cellulaire, modèles cellulaires de myotubes) ont été utilisés en amont pour identifier les trois molécules testées, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à la phase de criblage. Les analyses histologiques, moléculaires et ultrastructurales seront réalisées sur un même lot de tissus musculaires (tibial antérieur), permettant de répondre à plusieurs questions scientifiques avec un même prélèvement et d’éviter des expérimentations supplémentaires sur de nouveaux animaux. Le recours à un modèle animal est justifié par l’objectif de tester l’effet des molécules sur un organisme entier, afin d’évaluer la biodistribution, la tolérance systémique, l’impact sur la fonction musculaire globale et les interactions entre tissus, ce que les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d’appréhender de manière satisfaisante. Des approches alternatives (cultures cellulaires, modèles bio‑informatiques) sont utilisées en amont ou en parallèle lorsque cela est pertinent, mais ne remplacent pas la nécessité d’un modèle murin vivant pour l’étude de la myopathie congénitale et de l’effet des traitements.
Réduction
Les procédures de phénotypage non invasif (pesée, mesure de la longueur corporelle, analyse de la démarche sur Digigait, test de la grille retournée) et les mesures de force musculaire in situ sont regroupées autant que possible sur les mêmes animaux, afin d’obtenir un maximum d’informations fonctionnelles par individu. Les prélèvements terminaux de muscles et d’organes sont réalisés sur chaque animal à la fin de la période de traitement ou de survie, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Le nombre d’animaux est calculé de façon statistique afin d’obtenir des résultats scientifiquement robustes avec le minimum d’individus nécessaires, en évitant les répétitions inutiles. Les mêmes animaux servent pour l’ensemble des tests fonctionnels et pour les prélèvements terminaux, ce qui maximise l’information obtenue par animal et limite le recours à de nouvelles expérimentations. Les analyses histologiques, moléculaires et ultrastructurales seront réalisées sur un même lot de tissus musculaires Tibialis Antérior (TA), permettant de répondre à plusieurs questions scientifiques avec un même prélèvement et d’éviter des expérimentations supplémentaires sur de nouveaux animaux.
Raffinement
Au sevrage vers 3–4 semaines, les animaux sont pesés une fois par semaine afin de surveiller leur état général ; en cas de perte de poids, la pesée est effectuée quotidiennement pour suivre l’évolution et adapter rapidement la prise en charge. En cas de difficultés de locomotion ou de prise alimentaire, de la nourriture en gel est ajoutée dans les cages pour faciliter l’accès à la nourriture, améliorer l’hydratation et prévenir la dénutrition. Les animaux sont progressivement habitués aux manipulations et aux tests comportementaux non invasifs (pesée, mesure, Digigait, grille retournée) au cours des semaines précédant l'expérience, afin de minimiser le stress et d'améliorer la fiabilité des mesures. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur (grille retournée, analyse de la démarche) et l’enregistrement de l’EMG sont non invasifs ou peu invasifs et réalisés chez l’animal vigile ou sous anesthésie, avec une durée de test strictement limitée et une fréquence régulée pour éviter la fatigue et le stress cumulatif. Les mesures de force musculaire in situ sont réalisées sous anesthésie générale profonde et anti‑douleur, avec une durée d’anesthésie minimale, une surveillance respiratoire continue et un maintien de la température corporelle afin de préserver le bien‑être de l’animal. Pour l'électromyographie (EMG) et la mesure in situ de la force musculaire, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux afin de prévenir le dessèchement cornéen pendant l’anesthésie. Les injections intrapéritonéales (anesthésie et traitement) sont réalisées avec une contention douce et une manipulation rapide. Enfin, la mise à mort en fin de procédure, suivie de prélèvements terminaux, évite la poursuite de l’expérience au‑delà d’un stade où la progression de la myopathie pourrait entraîner une détérioration importante de l’état des animaux. Des points limites clairs ont été définis et seront strictement appliqués afin d'assurer le bien-être animal conformément aux principes des 3R.
Choix des espèces
La souris est choisie comme espèce car elle constitue le modèle mammifère de référence pour l’étude des myopathies génétiques, avec une physiologie musculaire, une organisation du système neuromusculaire et une génétique très proche de celles de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les données fonctionnelles et moléculaires aux patients. Les animaux sont utilisés du sevrage (3–4 semaines) jusqu’à 7 semaines, stade correspondant à la jeune souris adulte où le phénotype musculaire est suffisamment exprimé pour permettre l’évaluation de la myopathie et de l’effet des traitements. Cet intervalle couvre la période où la progression de la myopathie est mesurable par tests comportementaux et locomoteurs (grille retournée, analyse de la démarche, électromyographie (EMG) ) et où les prélèvements terminaux de muscles et d’organes fournissent des tissus de qualité pour les analyses histologiques et moléculaires. Ce choix d’espèce et de stade de développement est considéré comme le plus raffiné et pertinent pour atteindre les objectifs du projet : tester des molécules sur un organisme entier, corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires, et minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant la robustesse des données.
Développement de nouvelles approches thérapeutiques contre le virus de la Dengue
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou présentent des troubles neurologiques sont tuées. 7 800 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes mises à mort à l'issue. Infectées par le virus de la dengue, certaines très sensibles faute de défenses immunitaires, elles peuvent développer fièvre, paralysie ou tremblements avant l'atteinte du point limite. Le prélèvement final se fait par ponction intracardiaque sous anesthésie, pour tester de nouveaux composés antiviraux.
Objectifs
La dengue reste aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Chaque année, plus de 400 millions de personnes sont infectées par ce virus transmis principalement par le moustique Aedes aegypti. Environ 100 millions développent des symptômes : fièvre, douleurs, fatigue, et parfois des formes graves comme la dengue hémorragique ou le choc dengue, qui peuvent être mortels. Le virus de la dengue existe sous cinq formes différentes (appelées sérotypes). Cette diversité complique la protection à long terme : être infecté une première fois ne protège pas toujours des infections suivantes (surtout des sérotypes différents), qui peuvent même être plus sévères. Un vaccin est disponible mais son utilisation est limitée. Il fonctionne seulement chez les personnes ayant déjà été exposées au virus et pourrait augmenter les risques chez celles qui ne l’ont jamais été. Par ailleurs, il n’existe actuellement aucun traitement antiviral spécifique contre la dengue. Les médecins peuvent seulement traiter les symptômes et surveiller les complications. Dans ce projet, nous souhaitons tester de nouveaux composés capables d’empêcher le virus de progresser. Nous chercherons à bloquer différentes étapes clés : l’entrée du virus dans les cellules, sa capacité à reproduire son matériel génétique, ou encore d’autres mécanismes essentiels à son cycle infectieux. Nous étudierons également la réponse immunitaire déclenchée par la dengue et vérifierons si des composés thérapeutiques peuvent aider l’organisme à éliminer le virus plus rapidement et plus efficacement. L’objectif final est d’identifier des pistes prometteuses pour le développement de futurs traitements contre la dengue, afin de mieux protéger les populations exposées.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de tester l’efficacité de nouveaux traitements susceptibles de bloquer le virus de la dengue ou de renforcer les défenses immunitaires chez l’homme. Pour cela, nous utiliseront différents types de souris, car chacune réagit au virus d’une manière particulière. Certaines sont très sensibles et aident à comprendre les formes les plus graves de la maladie, d’autres permettent surtout d’observer la façon dont le virus se multiplie et comment l’organisme réagit. Enfin, des souris possédant un système immunitaire complet donnent des indications précieuses sur la production d’anticorps et l’activation des cellules immunitaires. En combinant ces modèles, le projet offrira une vision plus complète de ce qui se passe lors d’une infection : l’évolution du virus, les réactions immunitaires et les effets sur l’organisme. Cette approche permettra de repérer les candidats thérapeutiques les plus prometteurs et d’évaluer leur action, que ce soit en prévention ou en traitement. À long terme, ce projet contribuera à accélérer le développement de nouvelles stratégies contre la dengue. L’utilisation de modèles variés, allant de souris très sensibles au virus à d’autres possédant un système immunitaire entièrement fonctionnel, aidera à mieux comprendre les interactions entre le virus et l’hôte. Elle permettra également d’identifier les mécanismes qui protègent l’organisme ainsi que les raisons pour lesquelles certains patients développent des formes graves. Les connaissances obtenues serviront de base pour créer des traitements plus précis et plus efficaces. À terme, ces avancées pourraient améliorer considérablement la prise en charge de la dengue et réduire son impact sur les populations exposées, en diminuant la gravité des infections et la charge que représente cette maladie dans les régions touchées.
Procédures
Selon les procédures appliquées : - Infection des souris par le virus de la Dengue : Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Sous cutanée : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Intradermique : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection intrapéritonéale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 8 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 3 fois par jour par animal, 1 minute OU Par voie sous-cutanée : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire : anesthésie générale, 1 fois par patte arrière et par semaine, soit 2 fois par animal max, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale : vigile, 1 fois par jour maximum, durée 1minute (pendant 8 jours max) - Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude (30 jours), sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. - Prélèvement sanguin : A la veine submandibulaire (1x/2semaines) ou à la queue (50uL max/jour), vigile, pendant 2 semaines maximum tout du long de l’étude ; pendant 30 jours max Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet
Impact sur les animaux
Lorsqu’on infecte les souches de souris utilisées avec le virus de la dengue, certains effets sur leur santé peuvent apparaître. Ces souris sont très sensibles au virus parce qu’elles n’ont pas certains types de défenses immunitaires. Elles peuvent donc perdre du poids, parfois plus de 10 %, avoir de la fièvre ou au contraire une baisse de température, et montrer des changements de comportement comme une diminution de l’activité ou un état de fatigue marqué. Dans certains cas particuliers, surtout quand l’infection touche directement le cerveau, des signes neurologiques peuvent apparaître, comme des problèmes d’équilibre, des tremblements ou une paralysie. Des effets indésirables peuvent aussi apparaître selon les produits testés, en fonction de leur nature et de leur éventuelle toxicité. Pour protéger au mieux les animaux, des critères stricts sont établis afin d’arrêter l’expérience si leur état se dégrade trop fortement : par exemple une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de troubles neurologiques importants ou une altération générale de leur état de santé. Une surveillance quotidienne permet de repérer rapidement tout signe inquiétant et d’intervenir si nécessaire.
Devenir
Tous les animaux dans cette procédure sont euthanasiés en fin d’étude en raison des prélèvements de fin d'études nécessaires, et pour des raisons de sécurité biologique.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas de méthode entièrement alternative qui permettrait d’éviter totalement l’utilisation d’animaux pour les expériences prévues, car les exigences scientifiques et réglementaires nécessitent encore des études en organisme vivant. Les méthodes In Vitro (sur cellules cultivées en laboratoire) sont utiles pour comprendre certaines étapes du cycle du virus et tester des pistes de traitements. Toutefois, elles restent limitées : elles ne reproduisent pas toute la complexité du corps humain, par exemple la réponse immunitaire complète, les réactions entre différents organes ou encore la structure 3D d’un organisme vivant. C’est pourquoi des études In Vivo, réalisées chez l’animal, restent indispensables pour comprendre comment l’infection se développe, comment le virus se propage, comment le système immunitaire réagit, et pour évaluer la toxicité et l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme complet.
Réduction
Le schéma expérimental du projet repose sur des données bibliographiques robustes préalables permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Seuls les modèles et conditions présentant un intérêt scientifique clairement démontré seront retenus. Les études In Vitro réalisées en amont permettront de réduire le nombre de molécules ou approches à tester In Vivo, limitant ainsi l’utilisation d’animaux aux candidats les plus prometteurs. Le nombre d’animaux sera strictement limité grâce à plusieurs critères. Les différents modèles murins disponibles seront utilisés de manière complémentaire, permettant de sélectionner pour chaque question scientifique le modèle le plus pertinent, évitant toute expérimentation redondante. Par ailleurs, chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (virologie, immunologie, histologie), maximisant l'information obtenue par individu et réduisant le recours à de nouvelles cohortes.
Raffinement
Enfin, en ce qui concerne le Raffinement pour les expériences : A. Raffinement des manipulations pour limiter le stress des animaux : les expérimentateurs sont formés afin d’appliquer les méthodes dans les conditions les moins contraignantes pour les animaux (préhension adaptée). Toute manipulation considérée comme invasive et/ou stressante pour l’animal sera faite sous anesthésie. B. Les signes cliniques seront observés quotidiennement : perte de poids, érection des poils et altération de la posture, isolement, vocalisation lors de la manipulation, positionnement des vibrisses, température. Si les animaux présentent une perte de poids jusqu’à 10% par rapport à leur poids initial, une observation renforcée sera faite et un gel nutritif sera mis dans la cage afin de faciliter l’ingestion de liquides et nutriments. Si les animaux présentent différents signes cliniques, ou une perte de poids jusqu’à 20%, l’animal sera sacrifié en accord avec les points limites définis en amont de chaque procédure.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris constitue l’option la plus appropriée pour étudier l’infection par le virus de la dengue (DENV), car elle offre un modèle fiable, bien caractérisé et largement validé dans la littérature. Les lignées transgéniques présentent des niveaux contrôlés et prédictibles de sensibilité au DENV, permettant d’explorer de manière progressive la dissémination virale, la réponse antivirale précoce et les atteintes systémiques, tout en limitant l’exposition à des procédures plus invasives. Les lignées immunocompétentes, permettent d’analyser la réponse immunitaire dans un cadre physiologique. Le recours à ces modèles établis maximise la pertinence scientifique des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Les procédures sont conçues pour minimiser la douleur, le stress et tout dommage durable, conformément aux exigences réglementaires, en privilégiant les conditions expérimentales les moins contraignantes compatibles avec les objectifs de recherche.
Étude des mécanismes de contrôle des tumeurs dans le cadre d’immunothérapies innovantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 612 souris vont être utilisées dans ce projet sur les cellules CAR T, chacune recevant d'abord une greffe de cellules tumorales. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées en fin de protocole, sans réutilisation ni adoption possibles puisqu'elles portent une tumeur. Une partie subit la pose chirurgicale d'une fenêtre d'observation, puis des séances d'imagerie sous anesthésie de deux à huit heures. Le porteur présente l'imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, argument qui coexiste avec un total de plus de six mille souris.
Objectifs
Le cancer est une maladie qui touche de nombreuses personnes et dont certains types restent très difficiles à traiter. Ces dernières années, un nouveau type de traitement a été développé : les immunothérapies. Plutôt que d’agir uniquement sur la tumeur, ces traitements aident le système immunitaire du patient à reconnaître et à éliminer les cellules cancéreuses. Parmi ces traitements, les cellules CAR T sont une approche prometteuse. Il s’agit de cellules du système immunitaire du patient, modifiées en laboratoire pour mieux cibler la tumeur. Elles ont déjà permis de soigner certains cancers du sang, mais leur efficacité est encore limitée. L’objectif de notre projet est donc de mieux comprendre comment ces cellules CAR T agissent et pourquoi elles ne fonctionnent pas toujours de manière optimale. Pour ce faire, nous comparerons l’efficacité des cellules CAR T dans des modèles de tumeurs liquides répondant à ce traitement, par rapport à celle obtenue dans des modèles de tumeur solides. En particulier, nous allons étudier : - Par quels mécanismes ces cellules CAR T impactent-elles la croissance des tumeurs ? - Quels sont les obstacles qui empêchent les cellules CAR T d’éliminer efficacement les cellules cancéreuses ? - Comment optimiser ces traitements en favorisant une coopération des cellules CAR T et le système immunitaire du patient Pour répondre à ces questions, nous devons observer en temps réel ce qui se passe dans la tumeur lorsque l’on administre le traitement, et comment le système immunitaire est recruté au site tumoral. Comme c’est impossible chez l’humain, nous utilisons des modèles animaux, en particulier la souris, dont le système immunitaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Nous avons recours à des techniques d’imagerie avancée qui nous permettent de suivre le comportement des cellules dans la durée en minimisant les perturbations pour l’animal et en diminuant le nombre de souris nécessaires aux expériences. En comprenant mieux ces mécanismes, notre objectif est d’améliorer ces thérapies, en les rendant plus efficaces et plus accessibles aux patients, tout en respectant au maximum le bien-être animal, et en limitant l’utilisation d’animaux aux expériences strictement nécessaires.
Bénéfices attendus
Le développement des immunothérapies a profondément transformé la prise en charge du cancer, offrant de nouvelles perspectives aux patients pour lesquels les traitements conventionnels sont inefficaces. Cependant, malgré des succès notables, ces thérapies présentent encore des limites, en particulier dans le traitement des tumeurs solides. Notre projet vise à lever ces freins en approfondissant la compréhension des mécanismes d’action de certaines cellules et en explorant des stratégies pour améliorer leur efficacité. Les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont multiples : 1. Améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels ces cellules limitent la progression tumorale : en étudiant à la fois leur capacité à détruire les cellules cancéreuses et leur potentiel à stopper la croissance tumorale, nous pourrons mieux anticiper les mécanismes de résistance et identifier des leviers pour renforcer l’action thérapeutique de ces cellules. 2. Développer des stratégies innovantes pour mobiliser le système immunitaire naturel : nous chercherons à exploiter la capacité de ces cellules à recruter et activer d’autres cellules immunitaires pour amplifier leur efficacité. 3. Identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse au traitement : en mettant en lumière de nouveaux mécanismes de contrôle tumoraux et en précisant leur contribution relative, nous pourrons identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de ces cellules. Sur le plan clinique, ces avancées pourraient contribuer à accélérer l’intégration des nouvelles immunothérapies en clinique, en fournissant des données précises sur leur fonctionnement et en optimisant leur utilisation pour un plus grand nombre de patients. En outre, notre étude vise à proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques basées sur le mode d’action des cellules que nous allons explorer. À terme, il pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces, mieux tolérées et accessibles pour un plus large éventail de patients atteints de cancers résistants aux traitements actuels. .
Procédures
Les animaux recevront au début du protocole une injection de quelques secondes pour implanter la tumeur. Ils seront ensuite manipulés trois fois par semaine pendant moins de cinq minutes pour mesurer la taille de la tumeur dans le cas des tumeurs solides. Les animaux seront observés tous les jours pour évaluer leur état général. Certains animaux recevront une injection de traitement d’une durée de quelques secondes, réalisée une à plusieurs fois selon le protocole. Pour les études nécessitant une observation en temps réel, certains animaux subiront une intervention chirurgicale d’environ 30 minutes à 1 heure afin de poser une fenêtre d’observation. Les animaux concernés par les séances d’imagerie seront anesthésiés puis maintenus endormis entre deux et huit heures selon la durée d’acquisition. Cette séance d’imagerie sera sans réveil pour la plupart des animaux hormis ceux ayant une fenêtre d’observation. Dans les études de tumeurs liquides, certains animaux recevront une injection intraveineuse ou intrapéritonéale de quelques secondes pour transférer les cellules tumorales ou les cellules thérapeutiques ou les autres thérapies. Ces animaux seront ensuite manipulés brièvement une à deux fois par semaine pour un suivi clinique. En fin de protocole, tous les animaux feront l’objet d’une euthanasie d’une durée de quelques minutes pour permettre les analyses cellulaires, protéiques ou génomiques prévues.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être exposés à divers effets indésirables liés aux tumeurs, aux traitements administrés et aux procédures expérimentales. Si on se base sur la définition des libertés individuelles de l’animal, les effets indésirables pourraient être les suivants : Faim, soif, malnutrition : certaines tumeurs solides peuvent induire une perte de poids progressive lors d’un développement tumoral avancé, et la fatigue des animaux peut occasionner des difficultés d’accès à la nourriture. Peur, détresse : les manipulations, la contention, constituent des sources potentielles de stress et de détresse. Douleur, lésions, maladie : la croissance tumorale peut être à l’origine de douleurs, notamment en cas de rupture
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
Les hypothèses seront validées préalablement sur des modèles in vitro avant toute expérimentation animale. En outre, les différentes doses de traitement seront testées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Nous utiliserons la littérature scientifique et les bases de données existantes pour optimiser la conception des expériences et réduire la nécessité d’expérimentations in vivo. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. Par exemple, la composition du microenvironnement de chaque organe est très différente et peut difficilement être reproduit in vitro. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, plusieurs analyses seront effectuées sur les mêmes animaux. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront de tirer des conclusions scientifiques robustes pouvant directement bénéficier le développement thérapeutique en clinique. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables avec des effets attendus plus ou moins forts. En fonction de notre question le nombre de groupes peut être variables. Ils sont optimisés et réduits au maximum tout en conservant une forte puissance statistique. Nous pourrons donc obtenir des résultats significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux de ce projet ne seront pas réutilisés car ils ont reçu de la tumeur.
Raffinement
Des points limites précoces seront appliqués afin de détecter rapidement toute altération de l’état général (baisse d’activité, début de déshydratation, diminution de prise alimentaire, taille de la tumeur). Dès l’apparition de ces signes, des mesures de soutien simples seront mises en place : - Mise à disposition précoce de gel hydrique et de nourriture humide, pour faciliter l’hydratation et l’alimentation des animaux. - Regroupement des manipulations pour réduire la fréquence de contention et limiter le stress associé. - Réhydratation par injection lors des anesthésies profondes prolongées, notamment lors des procédures d’imagerie intravitale - Maintien thermique systématique lors des anesthésies et des procédures d’imagerie pour éviter les variations de température. - Litière douce et soins si ulcération des tumeurs Ces mesures permettront de limiter la douleur et l’inconfort et d’améliorer la qualité de vie des animaux tout au long du protocole.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté à notre étude, car son système immunitaire est proche de l’humain et permet d’évaluer l’efficacité des cellules étudiées dans un environnement tumoral réaliste. Par ailleurs, c’est un modèle très utilisé ce qui permet d’avoir une bibliographie importante. Contrairement aux modèles in vitro, le modèle murin permet d’analyser les dynamiques cellulaires en temps réel. Les interactions entre cellules évoluent au fil du temps, et ces changements ne peuvent pas être reproduits en culture. De plus, nous étudions le recrutement du système immunitaire par certaines cellules, un processus impliquant de nombreuses cellules et signaux provenant d'autres organes qui ne peuvent pas être reproduit en dehors d’un organisme vivant. Enfin, le modèle murin permet d’utiliser des techniques d’imagerie intravitale, qui offrent une observation directe, précise et longitudinale, ce qui réduit ainsi le nombre d’animaux nécessaires en maximisant les données obtenues par individu. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.
Etude du rôle de la protéine CD276 dans la modulation du microenvironnement immunitaire tumoral du corticosurrénalome chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Génétiquement modifiées pour développer un cancer de la glande surrénale, 504 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. La tumeur progresse d'une hyperplasie à deux mois jusqu'à un cancer invasif à six mois, avec des métastases pulmonaires chez une souris sur cinq. Le seul geste décrit sur animal vigile est un poinçonnage des oreilles, la souffrance venant surtout du développement tumoral lui-même. Le porteur compte sortir les animaux de l'étude à l'atteinte d'un point limite, seuil censé borner une souffrance déclarée sévère.
Objectifs
Le cancer de la glande surrénale (CCS), organe situé au dessus de chaque rein, est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic du CCS peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de CCS à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme (médiane à 14,8 mois). Le microenvironnement immunitaire tumoral (TME), qui correspond aux cellules du système immunitaire infiltrant la tumeur, joue un rôle crucial dans le développement du cancer et sa compréhension a abouti au développement de nombreuses immunothérapies qui ont révolutionnées le traitement du cancer. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence qu’une protéine est surexprimée dans les cancers de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. De manière intéressante, il a été montré dans d’autres cancers que cette protéine est capable d’agir comme un point de contrôle immunitaire et d’altérer le TME. Ainsi ce projet vise à comprendre, dans ce cancer, le rôle exercé par cette protéine sur le microenvironnement immunitaire tumoral, prérequis nécessaire afin de proposer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de contourner les résistances aux traitements actuels. Pour répondre à cette question nous allons comparer le TME dans un modèle murin de CCS exprimant la protéine d’intérêt, un modèle avec une délétion à l’état hétérozygote de cette dernière dans la surrénale et un modèle avec une délétion à l’état homozygote. Cette caractérisation sera réalisée à 3 stades de la maladie : hyperplasie massive (2 mois), larges adénomes (4 mois) et cancers invasifs associé à la présence de métastases pulmonaires chez 20% des souris (6 mois). Le microenvironnement immunitaire tumoral sera caractérisé par des approches de cytométrie en flux (technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative, de cellules en suspension dans un liquide), d’immunohistochimie (technique visant à localiser une protéine donnée dans les cellules d'une coupe de tissu), et de biologie moléculaire (étude des acides ribonucléiques (ARN) et désoxyribonucléique (ADN)) dans la surrénale et les poumons.
Bénéfices attendus
Le microenvironnement immunitaire tumoral joue un rôle crucial dans le développement du cancer et sa compréhension a abouti au développement de nombreuses immunothérapies qui ont révolutionnées le traitement du cancer. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence qu’une protéine est surexprimée dans les corticosurrénalomes de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. De manière intéressante, il a été montré dans d’autres cancers que cette protéine est capable d’agir comme un point de contrôle immunitaire et d’altérer le microenvironnement immunitaire tumoral. Ainsi ce projet vise à comprendre, dans le corticosurrénalome, le rôle exercé par la protéine sur le microenvironnement immunitaire tumoral, prérequis nécessaire afin de proposer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de contourner les résistances aux traitements actuels.
Procédures
Poinçonnage des oreilles réalisé à l’âge de 28 jours sur la totalité des individus (animaux vigiles, durée de réalisation 1 min).
Impact sur les animaux
Les modèles murins de corticosurrénalome avancé utilisés présentent un développement tumoral et éventuellement des métastases. Afin d’éviter les nuisances associées au développement tumoral, tous les animaux seront étroitement surveillés par du personnel qualifié et sortis de l’expérience lorsqu’un point limite sera atteint.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt sur la composition du microenvironnement immunitaire tumoral du corticosurrénalome.
Remplacement
Notre étude porte sur le rôle d’un point de contrôle immunitaire dans la modulation du microenvironnement immunitaire tumoral (qui correspond aux cellules du système immunitaire infiltrant la tumeur), et in fine la progression du cancer. Malheureusement, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de reconstituer le microenvironnement immunitaire tumoral et ses interactions avec la tumeur. L’utilisation de modèles animaux est la seule alternative possible à ce jour.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des expériences de cytométrie en flux (technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative, de cellules en suspension dans un liquide) et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie (technique visant à mettre en évidence et à localiser une protéine donnée dans les cellules d'une coupe de tissu). De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests tels que Mann Whitney et Kruskal-Wallis.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de bâtons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 6 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la glande surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Les modèles précliniques murins de cancer de la glande surrénale que nous utilisons reproduisent des altérations géniques observées chez les patients. Les souris développent progressivement des corticosurrénalomes, avec l’apparition d’une hyperplasie massive à 2 mois, suivie de larges adénomes à 4 mois puis de cancers invasifs à 6 mois, associés à la présence de métastases pulmonaires chez 20% des souris.
Programme de tutorat pour l’acquisition des gestes techniques courants en expérimentation animale sur rats et souris
- Formation professionnelle
Rats : 173
Non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnes aux gestes techniques, 863 souris et 173 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal sert de support à plusieurs gestes, injections, prises de sang, parfois chirurgie, avant d'être tué. Le porteur décrit une formation obligatoire en Europe et affirme limiter le recours aux animaux vivants, une partie venant d'animaux surnuméraires ou en fin d'autres protocoles. Tous sont endormis puis tués sans réveil au terme de leur participation, faute de pouvoir être réutilisés après des manipulations répétées.
Objectifs
Ce projet a pour but de former, de manière encadrée et progressive, les personnes amenées à manipuler des rats et des souris dans le cadre de la recherche scientifique. Il s’agit d’un programme de formation pratique qui permet aux nouveaux arrivants d’apprendre les gestes techniques nécessaires, comme les prises de sang ou les injections, dans des conditions sécurisées et respectueuses des animaux. Ce type de formation est obligatoire en France et en Europe avant de pouvoir intervenir sur des animaux à des fins scientifiques. Le projet vise à garantir que chaque personne soit bien préparée, accompagnée, et évaluée avant de travailler de façon autonome. Il contribue ainsi à améliorer la qualité des soins aux animaux et la fiabilité des expériences. Ce programme de formation participe également à une démarche éthique plus large, en veillant à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire au maximum leur stress ou leur douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet de formation permet aux personnes qui travaillent en recherche d’apprendre à manipuler correctement les animaux de laboratoire, en particulier les rats et les souris. Il est important que ces gestes soient bien maîtrisés, car une erreur technique peut faire souffrir l’animal ou fausser les résultats d’une étude scientifique. Pour apprendre, les participants doivent s’entraîner directement sur des animaux vivants, car certains gestes ne peuvent pas être reproduits correctement sur des modèles artificiels. Toutefois, tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et pour réduire au maximum leur stress ou leur douleur. Cette formation encadrée permet ainsi d’assurer une meilleure prise en charge des animaux dans les futurs projets de recherche, en garantissant que les personnes soient compétentes, formées et responsables. C’est une étape indispensable pour améliorer les pratiques scientifiques tout en respectant les animaux.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet de formation seront principalement des rats et des souris. Ils seront soumis à différents gestes techniques que les participants doivent apprendre à maîtriser. Ces gestes incluent par exemple des injections (sous la peau, dans le ventre ou dans une veine), des prises de sang à différents endroits du corps, ou des gestes plus complexes comme ceux réalisés lors d'une chirurgie. Chaque animal suivra un parcours progressif avec plusieurs gestes différents, adaptés au niveau du stagiaire. Tous les gestes sont réalisés dans un cadre très encadré, avec des limites strictes sur le nombre d’interventions par animal. À la fin de leur participation, les animaux seront endormis profondément puis euthanasiés sans réveil. L’apprentissage est organisé de manière à limiter au maximum les manipulations inutiles et à garantir le respect du bien-être animal tout au long du programme. La durée de chaque geste est volontairement limitée et adaptée au niveau de formation, afin de réduire au maximum le temps de manipulation et l’impact sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les gestes que les participants apprennent à réaliser sur les rats et les souris peuvent parfois provoquer un léger inconfort, voire une douleur temporaire. Cela dépend du type de geste (prise de sang, injection, etc.), de la fréquence à laquelle il est réalisé, et du niveau d’expérience de la personne en formation. Parmi les effets indésirables possibles, on peut citer : un stress passager lié à la manipulation de l’animal ou à la contention (tenir l’animal immobile pour le geste) ; de petites inflammations ou hématomes au point d’injection ou de prélèvement sanguin ; des réactions à l’anesthésie, comme une respiration ralentie ou un réveil plus long que prévu ; des complications rares comme une infection locale ou une fausse route lors de l’administration par la bouche ou le nez. Certaines chirurgies sont simulées, mais si une intervention réelle est nécessaire, elle est faite sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. Dans tous les cas, les gestes sont réalisés de manière encadrée, avec des mesures de prévention de la douleur et un suivi attentif de l’état de santé de chaque animal.
Devenir
Dans le cadre de ce projet de formation, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur participation. Cela s’explique par le fait que certains gestes techniques réalisés sont potentiellement invasifs ou causent un stress ou un inconfort temporaire. De plus, le projet a une visée pédagogique, ce qui implique des manipulations répétées sur un même animal. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance prolongée, et de respecter les règles de bien-être animal, chaque animal sera endormi profondément lorsque cela est nécessaire, puis euthanasié de manière conforme aux réglementations en vigueur, sans qu’il ne se réveille. Cette décision permet de garantir à la fois une formation de qualité et un traitement respectueux des animaux utilisés.
Remplacement
Dans ce projet de formation, l’utilisation d’animaux vivants n’a lieu qu’en dernier recours, lorsque cela est vraiment nécessaire pour apprendre correctement un geste. Avant cela, les participants passent par une phase de préparation théorique, avec des documents, des vidéos pédagogiques et des explications détaillées. Ensuite, lorsque c’est possible, ils s’entraînent sans utiliser d’animal vivant. Par exemple, ils peuvent manipuler des cadavres d’animaux déjà euthanasiés pour d’autres raisons, ou utiliser des morceaux de tissus animaux (comme de la peau de poulet) ou encore des modèles en plastique conçus pour simuler des gestes. Ces étapes permettent d’apprendre les bons réflexes et de s’habituer au matériel sans faire souffrir d’animaux. L’usage d’animaux vivants est donc limité à ce qui est strictement nécessaire pour valider les compétences dans des conditions proches de la réalité.
Réduction
Ce projet de formation a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en permettant aux participants d’apprendre correctement les gestes nécessaires à leur travail. Chaque personne formée apprend plusieurs gestes sur un seul animal, ce qui permet de mutualiser les apprentissages et d’éviter d’utiliser un animal différent pour chaque geste. En moyenne, une personne réalise une seule procédure de formation qui nécessite cinq animaux. Au total, pour l’ensemble du projet, cela représente environ 863 souris et 173 rats sur cinq ans, en comptant une marge de sécurité pour les imprévus. Quand cela est possible, les animaux utilisés ne sont pas élevés spécifiquement pour ce projet : ce sont par exemple des animaux surnuméraires, des animaux non utilisés dans d’autres expériences ou des animaux de contrôle en fin de suivi. Cela permet de réduire encore davantage le nombre d’animaux produits et de donner une utilité à des animaux qui auraient été euthanasiés sans avoir servi. Cette organisation permet donc de former les professionnels de manière efficace, tout en respectant les principes de réduction fixés par la réglementation européenne.
Raffinement
Dans ce projet de formation, tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress ou l’inconfort que pourraient ressentir les rats et les souris. Les participants commencent toujours leur apprentissage sans utiliser d’animaux vivants, en s’exerçant d’abord sur des modèles ou des animaux déjà décédés. Ce n’est qu’une fois ces étapes franchies qu’ils manipulent un animal vivant, sous la supervision d’un formateur expérimenté. Quand un geste est potentiellement douloureux, un médicament antidouleur (buprénorphine) peut être donné à l’animal avant l’intervention. Si un geste s’avère trop difficile à réaliser sans gêne pour l’animal, une anesthésie temporaire peut être utilisée pour éviter toute souffrance. Les chirurgies, lorsqu’elles sont nécessaires, sont toujours faites sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. L’état de chaque animal est suivi à l’aide d’une grille d’observation (cf. Annexe 4) qui permet de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si un animal atteint un seuil critique (appelé « point limite »), il est euthanasié sans souffrance. Des soins supplémentaires sont apportés, comme le maintien au chaud, la mise à disposition d’aliments faciles à manger après une anesthésie, et la surveillance régulière de leur état. Toutes ces mesures sont mises en place pour respecter les principes de protection animale définis par la réglementation européenne, et garantir une formation de qualité sans exposer inutilement les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisées dans la recherche scientifique. En France, elles représentent environ 70 % des animaux utilisés dans les laboratoires. Ce sont donc les espèces que les participants à cette formation seront amenés à manipuler dans leur travail. Les animaux utilisés sont tous adultes, en bonne santé, et sans maladie. Ce choix est important : les animaux adultes sont plus faciles à manipuler, leur taille permet de bien voir les gestes à effectuer, et cela correspond aux conditions réelles dans lesquelles les chercheurs travaillent. Aucun animal jeune ou âgé n’est utilisé pour la formation. Utiliser des rats et des souris adultes permet donc d’apprendre dans de bonnes conditions, tout en limitant les risques pour l’animal et en respectant les règles éthiques.
Résilience et adaptation des îlots pancréatiques en vue de leur transplantation 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
1 844 souris sont utilisées dans ce projet sur le diabète de type 1, dont 1 784 subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires et 1 504 une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques. Le niveau de souffrance déclaré va de léger à modéré, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour prélever les tissus. Une partie des animaux est rendue diabétique, par induction ou génétiquement, et certains sont immunodéficients pour permettre la greffe de cellules humaines. Le porteur transporte les souris d'un établissement à l'autre et conclut que seule la transplantation chez l'animal permet d'étudier la fonction des cellules sur la durée.
Objectifs
Certains récepteurs sont des modulateurs du métabolisme et de l'inflammation notamment des cellules du pancréas. Leurs actions ciblent la viabilité et de la fonction des cellules pancréatiques. Notre hypothèse est qu'en modulant leur activité respective dans les cellules du pancréas produisant l'insuline, on pourrait prévenir les processus inflammatoires qui se produisent lors du diabète de type 1 et entrainerait une sécrétion d'hormone défaillante. Leur possible modulation pourrait donc jouer un role majeur. Le projet sera mené dans deux établissements-utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les résultats escomptés sont l'identification de cibles spécifiques dans la création d'ilots pancréatiques résilients capables de survie et d'adaptation à long terme. De plus, il pourra montré l'intérêt de certaines molécules anti- diabètiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1/ des injections quotidiennes au maximum en respectant les volumes maximum (280 animaux en EU1 et 60 animaux dans EU2), 2/ ainsi qu'à des prélèvements sanguins hebdomadaires en respectant les volumes (1784 animaux dans EU 1) , 3/ une unique transplantation d'ilots pancréatiques pour certains animaux (1504 animaux au sein de EU 1).
Impact sur les animaux
Les nuisances induites dans ce projet seront de plusieurs types : Nous utiliserons des modèles de souris diabétiques (induits ou génétiques) qui créera un inconfort pour les animaux (palié par la gestion de leur environnement). Certains animaux subiront une transplantation de cellules qui sera faite par voie chirurgicale qui induit une ouverture des parois cutanée et musculaire qui engendrera une douleur modérée (paliée par traitements associés). Des traitements avec des molécules seront faits par injection intrapéritonéale (douleur légère très transitoire) ou intravasculaire sous anesthésie. Les molécules utilisées n'ont pas d'effets néfastes connus. Les virus utilisés sont sans impact direct sur le phénotype et bien-être murin. Les prélèvements sanguins faits à la queue lors notamment des tests au glucose engendreront une douleur légère paliée par les anti-douleurs locaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les tissus et les étudier ensuite (histologie).
Remplacement
Le diabète est un maladie qui affecte tous les organes. Aussi les expériences de culture cellulaire et études ex vivo ne sont pas appropriées dans ce contexte. La nécessité de l'étude de la réponse auto-immune nécessite l'usage des animaux. A l"heure actuelle, il n'existe pas de méthode alternative à l'usage des animaux pour étudier la fonction des cellules au long court. Le seul moyen est de les transplanter chez l'animal.
Réduction
1844 animaux sont inclus dans ce protocole. Nous avons estimé un nombre moyen de 3 à 10 souris par groupe pour avoir des résulatsts statistiquement satisfaisants (confiance 95% et puissance 80%). Aprés étude, l'analyse statistique se fera par test Two way anova.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en portoir ventilé, en cage de 5 maximum. Les animaux diabètiques seront changés plus régulièrement que les congénères sains. Ils seront traités avec soin avec visite quotidienne; enrichissement de l'environnement et traitement anti-douleur le cas échéant. Pour les animaux subissant une chirurgie, des granulés de nourriture seront disposés au sol, avec une portion de nourriture gélifiée pour une meilleure récupération post-opératoire. Le bien-être animal sera observé au quotidien et un arbre décisionnel permettra de guider le personnel quant à la démarche de soin pour éviter d'atteindre un point-limite non réversible. Les animaux immunodéficients seront hébergés dans des portoirs ventilés clos afin de préserver leur environnement. Le transport des animaux d'un EU à l'autre se fera dans des cages spécifiques comportant de la litière, de l'eau gélifiée, des croquettes et de l'enrichissement (cocon et tunnel) dans un véhicule à température adéquate (22 +/_ 2 °C).
Choix des espèces
Nous disposons de l'ensemble des outils adaptés aux modèles "souris". De plus, sa petite taille permet un hébergement aisé. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes (maturité sexuelle atteinte). Des souris avec une immunité affaiblie seront utilisées pour permettre la greffe de cellules humaines et ainsi éviter le rejet.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies oligonucléotidiques dans la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
1 500 souris porteuses du gène humain vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une seule molécule par injection dans le sang ou sous la peau, répétée chaque semaine jusqu'à six mois, pour tester des stratégies contre la dystrophie musculaire de Duchenne. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer un organisme vivant et conclut à la "nécessité" de la souris. Les bénéfices attendus, la sélection de molécules pour de futurs essais cliniques, restent au conditionnel, alors que les injections hebdomadaires et la mise à mort sont certaines.
Objectifs
Notre équipe mène des travaux visant à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une maladie génétique rare et sévère, la dystrophie musculaire de Duchenne, caractérisée par une perte progressive de la force musculaire. Cette pathologie est causée par une altération d’un gène essentiel au bon fonctionnement des fibres musculaires. En raison de cette anomalie génétique, l’organisme ne produit plus correctement une protéine indispensable à la stabilité et à l’intégrité des muscles, affectant notamment la marche, la respiration et le coeur. L’une des approches thérapeutiques étudiées consiste à favoriser la production d’une version plus courte mais fonctionnelle de cette protéine pour ralentir la dégénérescence musculaire. Dans ce cadre, nous évaluons deux stratégies complémentaires visant à modifier le message génétique transmis aux cellules afin de produire une protéine fonctionnelle. Avant toute application chez l’être humain, ces approches sont testées dans un modèle murin exprimant le gène humain entier.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules efficaces et qui pourraient ensuite être testées sur des patients.
Procédures
Chaque animal ne reçoit qu’un seul type d’injection (dans le sang ou sous la peau) avec une seule molécule, pour voir si elle est efficace. Ces deux voies d'injections sont rapides (moins d’une minute) et peuvent être répétées toutes les semaines, jusqu’à 6 mois.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent entraîner chez les animaux : une douleur modérée sur de courte période, et de faibles pertes de poids et présentent un risque d’infection au point d’injection.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser, au niveau des organes, les effets des molécules injectées.
Remplacement
La recherche en bioinformatique de candidats et les analyses réalisées sur modèles cellulaires permettent d’effectuer un premier criblage des molécules. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, qui permet d’évaluer l'efficacité de la molécule.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une efficacité suffisante de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anesthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce).
Choix des espèces
L’utilisation de souris portant le gène humain nous permettra d’évaluer l'efficacité de nos molécules sur le gène humain à l’échelle d’un organisme entier. La souris étant l’un des modèles les plus utilisés et les mieux documentés en recherche préclinique, ce modèle est particulièrement pertinent pour ce type d’étude.
Organisation sociale, stratégies individuelles et adaptation dans des environnement complexes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Soumises à une chirurgie stéréotaxique du crâne pour recevoir une injection virale dans le cerveau, parfois complétée par l'implantation de fibres optiques, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une puce RFID est insérée sous la peau pour suivre chaque individu dans un environnement semi-naturel, où le groupe est observé plusieurs semaines. Le projet vise à comprendre comment la vie en groupe façonne le comportement et le cerveau, avec des retombées annoncées sur la santé mentale renvoyées au long terme. Toutes les souris sont tuées à l'issue, une partie aussitôt après les tests comportementaux, l'autre pour extraire le cerveau et vérifier l'emplacement des virus et des électrodes.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment la vie en groupe influence le comportement individuel et le fonctionnement du cerveau. Pour cela, nous étudions des groupes de souris vivant ensemble dans des environnements proches de leurs conditions naturelles, afin d’observer comment ils s’organisent au quotidien. Nous étudions comment les individus s’organisent au sein d’un groupe, comment des règles et des rôles apparaissent, et comment chacun s’adapte à ces contraintes collectives. En suivant sur plusieurs semaines le comportement de chaque souris, nous cherchons à comprendre comment les interactions sociales façonnent progressivement les comportements individuels, tout en permettant à chaque individu de développer des caractéristiques propres. Ces recherches permettront de mieux identifier les situations dans lesquelles l’organisation sociale favorise l’adaptation et et la spécialisation des individus, mais aussi celles pouvant rendre certains plus vulnérables face aux changements de leur environnement. À terme, ces résultats contribueront à une meilleure compréhension du lien entre environnement social, comportement et santé mentale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels l’organisation sociale influence le comportement individuel et le fonctionnement des circuits neuronaux. En étudiant des microsociétés de souris dans un environnement riche et proche de leurs conditions naturelles, il permettra de caractériser l’émergence de dynamiques collectives telles que la coordination, la répartition des rôles et le partage des tâches au sein d’un groupe. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre la variabilité inter-individuelle au sein des groupes sociaux, en identifiant des profils comportementaux distincts et des processus de spécialisation, ainsi que leurs liens avec des différences neurophysiologiques analysées a posteriori. L’approche longitudinale permettra d’étudier comment les rôles évoluent dans le temps et en fonction du contexte social. La manipulation contrôlée de l’environnement social et des réseaux neuronaux offrira également des informations sur les capacités d’adaptation des individus et des groupes face à des changements de règles ou de composition sociale, ainsi que sur les mécanismes de transmission des comportements au sein d’une microsociété. À plus long terme, ce projet apportera des connaissances fondamentales en neurosciences et en éthologie, en proposant des approches expérimentales innovantes pour l’étude du comportement social. Ces travaux pourront également contribuer, de manière indirecte, à une meilleure compréhension de l’influence de l’environnement social sur le bien-être individuel et sur la vulnérabilité aux troubles du comportement.
Procédures
Les souris subiront une chirurgie stéréotaxique pour injecter un virus, couplée ou non à l'implantation de fibres optiques (1 heure). Des puces RFID seront insérées en sous-cutané (5 min) pour permettre de suivre la position de chaque animal au sein de l'environnement dans lequel leur comportement de groupe sera évalué . En fin de procédures, certains animaux seront anesthésiés profondément et l'activité neuronale des régions d'intérêt sera réalisée , sans réveil de la souris qui sera ensuite mise à mort.
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales avec réveil entraînent des douleurs modérées. Lors de l'insertion de la puce, une infection peut advenir au niveau de l'ouverture de la peau. Un déplacement de la puce peut aussi occasionner une gêne à la motricité . Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs modérées associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir. Durant la période immédiate de récupération post-chirurgicale les animaux sont seuls (5 min à 1 heure). La réintroduction dans la cage des animaux passés en chirurgie peut aussi être un moment délicat pouvant entrainer des aggressions entre congénères. La stimulation optogénétique peut troubler transitoirement l'activité locomotrice. Les traitements par voie orale (eau de boisson) ne causent pas d’effets indésirables. L'introduction dans l'environnement ou un changement de règle peut occasionner une nuisance émotionnelle très légère (anxiété) et une baisse de poids transitoire sur une journée.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort. - Soit directement à la fin de la procédure si aucune autre procédure n'est nécessaire à effectuer sur ces animaux (animaux n'ayant effectué que du comportement) - Soit pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous devons confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée.
Remplacement
Notre projet vise à étudier la complexité du comportement de la souris en utilisant des grands environnements automatisés afin d’analyser l’organisation sociale, les comportements individuels, leur adaptation aux contraintes sociales et environnementales, ainsi que leur transmission. Ces phénomènes reposent sur des interactions dynamiques entre individus, sur des contextes sociaux variables et sur des mécanismes neurophysiologiques intégrés, qui ne peuvent être reproduits par des modèles in vitro, in silico ou par d’autres approches alternatives non animales. L’étude du découplage et de la corrélation entre comportement et neurophysiologie constitue une composante centrale du projet et nécessite l’observation d’animaux vivants évoluant au sein d’un environnement social. De ce fait, cette étude ne peut être réalisée qu’à l’aide de modèles animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans ce projet a été soigneusement déterminé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux. Ce choix s’appuie sur une littérature scientifique solide et sur l’expérience acquise lors de projets similaires. Afin de réduire le nombre total de souris, le protocole a été conçu pour permettre le suivi d’un même animal sur une période prolongée. Chaque souris peut ainsi participer à plusieurs phases de l’étude, ce qui évite d’utiliser de nouveaux animaux pour chaque expérience. L’observation longitudinale d’un même individu permet d’obtenir davantage d’informations tout en diminuant le nombre global de souris nécessaires. Le nombre d’animaux requis a été estimé à partir de données issues d’un groupe pilote et d’analyses statistiques adaptées permettant de garantir la fiabilité des résultats. Il sera réévalué au cours du projet et réduit si des résultats robustes sont obtenus avec moins d’animaux, conformément au principe de réduction et à une utilisation raisonnée des modèles animaux.
Raffinement
Le bien-être des souris est une priorité tout au long de ce projet. Les animaux sont hébergés dans un environnement beaucoup plus spacieux et enrichi que les cages conventionnelles. Cet environnement semi-naturalistique comprend plusieurs zones accessibles, des tunnels, des espaces de repos avec du matériel de nidification, ainsi qu’un dispositif permettant aux souris d’obtenir volontairement leur nourriture. Cette organisation favorise l’exploration, l’activité physique et les interactions sociales, et contribue à réduire le stress et l’agressivité entre congénères. Les souris sont suivies quotidiennement et leur comportement est observé en continu grâce à des caméras infrarouges, ce qui permet de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir sans manipulation inutile. Des protocoles spécifiques sont mis en place pour prévenir et soulager la douleur, notamment par l’administration systématique d’antalgiques lors des interventions chirurgicales ou en cas de blessure. Lorsque cela est possible, les traitements sont administrés par voie orale afin de limiter les injections. Pour les interventions neurochirurgicales, le matériel utilisé est conçu pour être le plus léger et le moins encombrant possible, afin de réduire l’inconfort des animaux. Après la chirurgie, les souris sont étroitement surveillées durant la phase de récupération et réintroduites dans leur groupe une fois leur état stabilisé. Des critères d’arrêt précis sont définis pour chaque procédure; si l’état d’un animal se dégrade ou s’il ne récupère pas correctement, des soins adaptés sont apportés ou l’animal est euthanasié afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le système dopaminergique, impliqué dans les stratégies sociales, est relativement bien conservé chez les rongeurs et l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Enfin, l'environnement complexe a été spécifiquement développé et adapté à l'étude des rongeurs. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. Avant 8 semaines, les souris sont considérées comme étant au stade adolescent. Sachant que le comportement à cet âge est différent de l'âge adulte, et que notre étude porte sur l'âge adulte uniquement, nous éviterons d'étudier le comportement de souris avant 8 semaines. Les procédures qui nécessitent des injections virales avec ou non l'implantation de fibres se feront sur l'animal après 6-7 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression) et le branchement de la fibre après 8 semaines. Les expériences comportementales de plusieurs semaines se feront aussi à partir de 8-10 semaines d'âge, à un stade adulte sans crainte de troubles liés au vieillissement.