Souris

Greffées chirurgicalement de cellules cancéreuses directement dans le pancréas, 432 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut se disséminer dans l'abdomen et provoquer une ascite ainsi qu'une dégradation de l'état général. Chaque animal reçoit ensuite plusieurs traitements, une chimiothérapie puis jusqu'à six injections d'immunothérapie. Les tumeurs sont prélevées après la mise à mort, l'étude portant sur la fibrose qui bloque l'accès des cellules immunitaires à la tumeur.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Le cancer du pancréas est un cancer typiquement très riche en fibrose qui bloque l’accès des cellules immunitaires à la tumeur, contribuant à la résistance au traitement. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette fibrose. Le but du projet est d’évaluer les effets du blocage de la fibrose sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies, dans un modèle de cancer chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas générées en sous-cutané montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats doivent être confirmés sur des tumeurs localisées au sein de l’organe, pour être plus proche de la maladie chez l’Homme. Ainsi, comparer ce modèle nous permettra de savoir si nous pouvons continuer à utiliser le modèle sous-cutané (moins invasif pour la souris) ou en cas de discordance de résultats, nous devons utiliser seulement le modèle intra-pancréatique (plus représentatif de la réalité). Cela nous permettrait à l’avenir de ne plus réaliser des expériences inutiles sur le modèle sous-cutané. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

3 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par immunothérapies, agoniste RXR ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-douleurs : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-inflammatoire : - Geste réalisé sur animal vigil - Quatre injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, plaie, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement par les personnels animaliers. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. L’apparition des points limites sera quotidiennement recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Pour valider un système d'imagerie censé suivre les tumeurs sans les injections de substrat qu'exigent les appareils commerciaux, 120 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis passe sous imagerie sous anesthésie deux fois par semaine pendant six semaines au maximum. Le porteur met en avant l'intérêt technique et le "coût d'achat élevé" des systèmes existants. Les tumeurs et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, au plus tard quarante-deux jours après la greffe.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence in vivo est un outil utilisé en cancérologie préclinique permettant le suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale, de la dissémination métastatique et de la réponse thérapeutique. Les systèmes commerciaux actuels reposent sur des luciférases nécessitant des injections répétées de substrats exogènes, générant des problèmes d'utilisation et un coût d'achat élevé. Notre nouveau système de bioluminescence est optimisé pour être autonome permettant un suivi continu de la croissance tumorale sans injection de substrat. Cette technologie a déjà été validée in vitro dans des lignées cellulaires humaines et murines. Le projet vise à développer et valider, chez la souris, ce nouveau système de bioluminescence autonome. L’objectif de ce projet est de démontrer que ce nouveau système de bioluminescence produit un signal lumineux suffisamment intense pour permettre la détection fiable des tumeurs in vivo en sous-cutané, tout en vérifiant que les tumeurs rendues luminescentes conservent les mêmes caractéristiques biologiques que les tumeurs d’origine (croissance, agressivité).

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une preuve de concept démontrant qu'un système de bioluminescence autonome permet un suivi tumoral in vivo continu, sensible et reproductible, sans administration répétée de substrat exogène. Il établira une corrélation robuste entre l'intensité/dynamique du signal luminescent et la cinétique tumorale, tout en confirmant l'absence d'altération des caractéristiques biologiques essentielles des tumeurs (croissance, morphologie). Sur le plan méthodologique, le projet vise à établir un nouveau standard d’imagerie préclinique en oncologie, en réduisant le recours aux injections répétées de substrat et à certaines procédures invasives tout en améliorant la qualité des données longitudinales (mesures fréquentes sur un même individu).

Procédures

- Injection de cellules tumorales 1 fois, 30 sec - Mesure de la taille de la tumeur : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 1 min - Anesthésie et imagerie de la tumeur (5 min maximum) : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum - Pesée des souris : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 30 sec

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l'injection par voie sous-cutanée sous anesthésie isoflurane de cellules tumorales - Gène potentielle lors du développement de la tumeur. - stress lié aux anesthésies lors de l'imagerie, et aux contentions lors de la mesure du volume tumoral et pesées. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d'injection atteint le point limite.

Devenir

En fin de procédure, soit au maximum 42 jours post-implantation si aucun point limite n'a été atteint avant, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse des tumeurs et ganglions drainants.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, un travail approfondi de sélection et de caractérisation a été effectué in vitro et en bio-impression 3D pour mieux mimer la croissance tumorale et limiter le passage à l’animal aux seuls clones répondant à des critères stricts. L’utilisation de l’animal n’intervient qu’après épuisement des possibilités d’optimisation in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par condition est défini sur la base d’un compromis entre puissance statistique et minimisation des effectifs. Le recours à l’imagerie bioluminescente non invasive, répétée chez les mêmes animaux, augmente la quantité de données recueillies par individu, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux. De plus, l’utilisation d’un logiciel de statistiques nous permet de calculer le nombre de souris strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera injecté lors de la détection des signes de douleur selon la grille de scoring. Chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l'étude des tumeurs. La petite taille des souris est adaptée à l'imager utilisé pour le suivi du signal de bioluminescence. Nous utiliserons de jeunes adultes pour favoriser la prise tumorale soit 6 à 8 semaines.

Ponctionnées chaque semaine à la jugulaire sous anesthésie pendant dix à quatorze semaines, 440 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral, des cellules immunitaires humaines, puis des injections répétées de lipopolysaccharide et d'interleukine pour moduler la réponse immunitaire. Le résumé ne décrit comme atteinte qu'une "légère douleur" au point de piqûre, sans mention des effets des produits inflammatoires injectés. Les animaux sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire anti-AAV semble être dépendante de nombreux facteurs et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. Le profil immunologique du patient peut également être un facteur déterminant dans l’initiation de la réponse immune anti-AAVr. Le modèle ainsi développé va nous permettre de déterminer une signature immunologique pouvant déclencher un rejet du traitement et de développer des stratégies d’immunomodulation ciblée. Ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, différentes signatures immunitaires identifiées chez des donneurs sains et de développer une stratégie pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de mieux comprendre les réponses immunitaires responsables du rejet du traitement et de développer une stratégie pour moduler cette réponse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les cellules immunitaires responsables du rejet du transgène et de développer une stratégie dans le but de prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur. In fine, ce projet permettra de développer des traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr, plus sûrs et plus efficaces.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 10 semaines pour les animaux inclus dans la caractérisation de la réponse immunitaire et 14 semaines pour ceux inclus dans la stratégie d’immunomodulation. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale en vigile. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 3 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide à J+1, J+2, J+3 après l’injection en intraveineuse du vecteur. Une injection en intra-péritonéale se fait en moins d’une minute. Des injections en intra-péritonéale d’interleukine-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 10 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la stratégie d’immunomodulation anti-CD45RC, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse (isoflurane : induction 5% puis 2%)

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins, les animaux seront sous anesthésies gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin due à la pénétration de l’aiguille. Pour les injections en intraveineuse et en Intra péritonéale, les souris seront maintenues en contention pour effectuer l’administration. Les animaux ressentiront une légère douleur au point d’administration due à la pénétration de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de développer un modèle pertinent mimant cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains par stratégie . Au maximum, 440 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autres alternatives). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans les études de thérapie génique et d’immunologie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, en particulier des mammifères, afin d’obtenir des résultats pertinents pour l’humain. La souris est très utilisée, notamment parce qu’il existe des modèles dits « humanisés » qui reproduisent en partie le système immunitaire humain. De plus, il est facile de constituer des groupes suffisamment nombreux pour réaliser des analyses statistiques fiables. Ce modèle est particulièrement adapté au transfert de cellules humaines (appelé transfert adoptif), car ces cellules peuvent survivre et fonctionner correctement chez la souris. Cependant, pour que ces cellules reconnaissent correctement leur environnement, il est indispensable que la souris exprime une molécule spécifique du système immunitaire humain : HLA-A2.1. En effet, les cellules humaines utilisées sont capables de reconnaître uniquement cet allèle. Enfin, comme une réponse immunitaire préexistante contre les vecteurs AAV a déjà été démontrée dans ce modèle de souris NSG HLA-A2, celui-ci est particulièrement pertinent pour tester et développer de nouvelles stratégies visant à moduler ou contrôler la réponse immunitaire. Les souris seront injectées entre 8 et 14 semaines d’âge. A ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie des cellules adoptives transférées sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

Injectées avec des molécules de chimiothérapie, jusqu'à une administration quotidienne pendant cinq jours, 3 840 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie des traitements est infligée à des souriceaux, du cinquième au dixième jour après la naissance. Le résumé annonce une perte de poids "légère et temporaire" de deux à trois jours comme principal effet, sans autre détail sur les atteintes. Les organes sont prélevés après la mise à mort, pour analyser les effets de l'invalidation d'un gène sur la fertilité.

Objectifs

L'objectif est d’étudier le rôle de la protéine PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales des gonades et son rôle dans la reprotoxicité induite par des traitement de chimiothérapie afin d’analyser la survenue des troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : * De mettre en évidence le rôle clé de PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales et leur sensibilité aux traitements anti-cancéreux de chimiothérapies. * Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’infertilité * Décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans les effets secondaires à long terme des médicaments sur la fertilité. * Ouvrir des pistes de traitements pour minimiser les effets reprotoxiques des chimiothérapies

Procédures

Les nuisances pour les animaux seront la préhension par l’expérimentateur et les injections des molécules de chimiothérapie. Au maximum, les souris subiront une injection quotidienne pendant 5 jours. Ces interventions seront réalisées du 5ième jour postnatal jusqu'au 10ième jour pour les traitements en période néonatale, ou bien pendant 5 jours consécutifs à 3 mois pour les traitements à l'âge adulte.

Impact sur les animaux

Les traitements par chimiothérapie chez la souris adulte pourraient conduire à une perte légère et temporaire perte de poids à partir du troisième jour du traitement. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélévement des organes afin d'analyser les impacts de l'invalidation du gène PAXBP1 lors de traitement de chimiothérapie sur la fonction de reproduction.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permet à l'heure actuelle d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois) et d’analyser les impacts sur la santé de la descendance.

Réduction

L’analyse en temps réel des données recueillies à chaque expérience nous permettra, si nécessaire, d’ajuster le protocole : certains timings d’étude pourront être supprimés sur les répétitions prévues, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre stratégie de repose sur différents éléments reprenant les points clés : Nous minimiserons les animaux pouvant présenter des phénotypes dommageables grâce à la génération d’animaux présentant une invalidation ciblée de la protéine d’intérêt dans un seul type cellulaire. Afin de limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum); Les animaux seront hébergés en présence d’environnement contrôlé et enrichi (tunnel, coton…) avec un accès illimité à la nourriture et la boisson. Nous veillerons au bien- être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Pour les transferts des souris d'une cage à l'autre nous utiliserons des méthodes low stress (Cupping). Pour les observations, les souris seront manipulées à la suite de leur entrée dans un petit tube afin d’être déposé sur la grille puis manipulées. Le suivi régulier des animaux nous permettra au mieux d’identifier les signes d’alerte afin de réaliser des mesures visant à minimiser la douleur, souffrance ou angoisse induite par les contraintes liées aux procédures expérimentales. Ce rythme de surveillance sera accru si un animal devait présenter des signes importants de souffrance, douleur. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré. En ce sens, nous avons défini des points limites spécifiques et adaptés pour les expériences menées.

Choix des espèces

Choix des espèces. Nous utiliserons des souris car les modèles génétiquement modifiés pour PAXBP1 sont disponibles permettant ainsi l'analyse de l'impact de la perte du gène PAXBP1 lors de traitement anti-cancéreux sur la fertilité et la physiologie des gonades. La souris présente une physiologie testiculaire proche de l’espèce humaine et elle est un modèle mammifère de choix pour réaliser des études au cours du développement de la gonade et pour l'analyse de la fertilité. Ainsi, ce travail se base sur les points communs de la physiologie des cellules germinales entre les espèces : dans la mise en place des cellules souches dans la période prépubère, l’entrée en méiose à la puberté et la production des spermatozoïdes de la puberté à la mort de l’individu. De plus, le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre différentes espèces notamment l’homme et la souris. Choix des stades: Pour l'analyse de l'impact des chimiothérapies, nous travaillerons sur des souris mâles traités aux chimiothérapies lors de la période néonatale (traitement de 5 à 10 jours). Pour l'analyse des impacts sur la physiologie testiculaire, nous suivrons les souris mâles à différents âges. Cela aura pour but d'analyser la mise en place des cellules germinales (de P5 à P15 post-natal), leur maintien de la puberté à l'âge adulte (de 20 jours à 365 jours), dans le but de définir l'impact sur la fertilité. Pour cela, nous mettrons à mort des souris à P6, P10, P15, P20, P40, P60, P90, P180. Pour l’analyse chez les souris adultes, ces dernières seront mises à mort à différents temps après traitement afin de définir l'impact de PAXBP1 dans la réponse aux molécules de chimiothérapie sur la perte des cellules germinales et de la fertilité puis pour l'analyse des capacités régénératives de cellules germinales et le retour de la fertilité. AInsi, nous mettrons à mort des souris 1jour, 4 jours, 7 jours, 10 jours, 20 jours, 60 jours, 90 jours et 180 jours après le début du traitement.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à soixante-huit injections sur un mois. Elles servent à tester deux substances censées bloquer une molécule impliquée dans la mémoire, contre la maladie d'Alzheimer. Les tests comportementaux mesurent la mémoire et l'anxiété, l'un d'eux pouvant provoquer une douleur modérée de quelques secondes. La mise à mort permet de prélever des tissus, dont certains à l'état frais pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester des substances pouvant agir comme traitement dans le cerveau de la souris, afin de lutter contre la maladie d’Alzheimer, en particulier contre les troubles de la mémoire. Deux substances ont été choisies car elles sont capables de bloquer l’action d’une petite molécule naturellement produite par le cerveau. Cette molécule peut modifier l’activité des neurones (les cellules du cerveau) ainsi que la structure des connexions entre ces cellules. Elle agit en se fixant sur un type particulier de “récepteur” (une sorte de capteur situé sur les neurones), qui joue un rôle important dans la transmission des informations et la mémoire. On a observé que cette molécule est présente en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer, et qu’elle contribue à certains symptômes, comme les pertes de mémoire et les perturbations de l’activité du cerveau. Le but de ce projet est donc de vérifier si les deux substances sélectionnées peuvent devenir des traitements efficaces contre la maladie d’Alzheimer, en les testant sur trois modèles de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Dans le monde, environ 50 millions de personnes sont touchées par des troubles importants de la mémoire et du raisonnement, dont la maladie d’Alzheimer est la forme la plus fréquente. Cette maladie concerne environ une personne sur trois après 80 ans, et le nombre de personnes touchées augmente avec le vieillissement de la population. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement permettant de guérir cette maladie. Trouver de nouvelles solutions est donc une priorité majeure pour la santé publique. Notre équipe de recherche s’intéresse à une petite molécule présente dans le cerveau qui semble jouer un rôle important dans la communication entre les cellules du cerveau. Cette molécule est retrouvée en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, nous allons tester deux substances pour voir si elles peuvent corriger les problèmes de communication entre les cellules du cerveau et améliorer les troubles de la mémoire liés à cette maladie. Les résultats obtenus seront très importants pour savoir si ces substances pourraient, à l’avenir, être développées comme traitements chez l’être humain.

Procédures

Certaines souris seront entrainées pour des analyses de comportement afin de comprendre leurs capacités de mémorisation et leurs niveaux d'anxiété. Ces analyses de comportement dureront quelques minutes par jour par souris sur une durée d'un mois. D'autres souris seront traitées avec un composé thérapeutique dans le but de développer un traitement pour la maladie d’Alzheimer. Certaines souris traitées le seront pendant toute la durée du comportement (1 mois donc 68 injections) et certaines souris seront traitées uniquement 4 jours (8 injections). Chaque injection ne durera que quelques secondes par jour. Les injections seront faite 2 fois par jour et peuvent aussi induire une nuisance.

Impact sur les animaux

Le projet s’intéresse à la mémoire. Par conséquent les effets indésirables principaux pourront se manifester par des troubles de la mémoire. Les tests comportementaux seront majoritairement sans douleur (un seul test peut entrainer une douleur modérée transitoire de quelques secondes). Il pourrait y avoir une douleur transitoire lors de l'injections des composés.

Devenir

Après les tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus et réaliser des études post-mortem. Certains animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus afin de maintenir les circuits neuronaux actifs mais aussi pour effectuer certaines analyses ex-vivo qui nécessitent des préparations à partir de tissus frais.

Remplacement

Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier cette maladie.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. De plus, chaque souris participe à plusieurs étapes de l’étude lorsque cela est possible, afin de limiter le nombre total d’animaux. L’organisation des groupes est aussi optimisée pour utiliser au maximum les animaux élevés dans ce projet. Avant de faire ces tests sur les animaux, nous avons d’abord réalisé des expériences en laboratoire (sur des cellules) pour sélectionner les substances les plus prometteuses. Cela nous a permis de réduire le nombre de substances testées sur les animaux, en ne gardant que deux substances actives et une substance de comparaison.

Raffinement

Tout au long de l’étude, le bien-être des animaux est une priorité. Les chercheurs surveillent attentivement tout signe de souffrance (comme une perte de poids, un manque d’activité ou un mauvais état du pelage). Si un problème apparaît, l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est pris en charge, voir euthanasié si les moyens mis en oeuvre pour diminuer sa souffrance sont insuffisants. Avant les tests, les souris sont habituées progressivement à être manipulées par les chercheurs afin de réduire leur stress. Elles sont également placées dans un environnement calme avant chaque test pour qu’elles s’y acclimatent. Les expériences sont organisées de manière à augmenter progressivement le niveau d’inconfort, afin de ne pas perturber les résultats.

Choix des espèces

Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L’élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier la maladie d'Alzheimer. Cette étude permettra de développer une approche thérapeutique de la maladie d'Alzheimer. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, où les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer peuvent être observés dans les lignées murines.

Menée par une société qui a mis au point sa propre technologie de vectorisation, l'étude soumet 600 souris à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la peau, puis deux à quatre administrations des molécules à tester et jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort en urgence, les autres à la fin du protocole. L'objectif est d'évaluer l'efficacité et la distribution de molécules conjuguées destinées à cibler les cellules cancéreuses.

Objectifs

Les cancers demeurent la première cause de mortalité en France et nécessitent le développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et plus efficaces. L’identification de récepteurs ou transporteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales constitue une approche prometteuse pour améliorer la spécificité des agents thérapeutiques et diagnostiques. Notre société a mis au point une technologie qui associe des vecteurs biologiques à différentes molécules d’intérêt. Cette approche exploite les mécanismes naturels de passage des cellules pour permettre aux molécules de franchir certaines barrières biologiques et d’atteindre les tissus ciblés. Le projet vise à évaluer l’efficacité et la distribution dans l’organisme de ces molécules conjuguées (molécules-C) en oncologie, en ciblant des récepteurs ou transporteurs surexprimés par les cellules cancéreuses. Les résultats attendus permettront d’apprécier le potentiel de cette approche de vectorisation pour le développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de molécules vectorisées pour délivrer de manière ciblée des agents thérapeutiques et diagnostiques vers des tumeurs. Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension de la distribution et des effets biologiques de ces molécules, ainsi que la validation de modèles précliniques pertinents pour l’oncologie. Ces connaissances pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques et potentiellement moins toxiques, et orienter la conception de futures approches ciblées en oncologie.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La mise en contention (avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 2 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances ou effets indésirables sont liés au stress physique et à l’inconfort des animaux : - Lors des manipulations expérimentales : stress lié à la mise en contention, aux différentes administrations (induction tumorale par injection sous-cutanée (100µl), administration des molécules-C par voie intraveineuse ou sous-cutanée (une à trois maximum par individu), administration intrapéritonéale lors de la mise à mort (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris) et aux prélèvements sanguins intermédiaires (maximum 4 prélèvements ≤50 µl par individu, ne dépassant pas 10 % de la volémie sur 14 jours). - Lors de l’implantation et croissance tumorale : inconfort ou gêne locale liée à l’implantation des cellules tumorales et au développement des tumeurs. Les souris athymiques, en raison de leur phénotype immunodéprimé, peuvent présenter une sensibilité aux infections et une altération de l’état général ; ces nuisances potentielles sont toutefois limitées par les conditions d’hébergement (cages individuellement ventilées) et la surveillance régulière appliquées à l’ensemble des souris.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Si, au cours de l’expérimentation, un animal atteint un point limite, il sera euthanasié en urgence après validation par le vétérinaire et le porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont une première série de tests in vitro afin de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires (SPR, mesure d’affinité cellulaire). Cependant, ces tests ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des paramètres physiologiques (mécaniques, immunitaires, métaboliques et d’élimination) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour évaluer ces paramètres complexes, il est nécessaire de recourir à un modèle vivant, ici la souris, premier modèle animal disponible proche de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Aucun modèle informatique ou in vitro n’est actuellement capable d’intégrer toutes les interactions physiologiques requises pour étudier la pharmacocinétique et l’efficacité pharmacologique de nos vecteurs. La souris reste donc, à ce jour, le système le plus pertinent pour étudier de manière complète la pharmacologie des molécules conjuguées chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs permet d’utiliser des doses réduites, limitant ainsi les effets secondaires indésirables (Raffinement) et le nombre d’animaux nécessaires (Réduction). Le nombre d’animaux par groupe (15) a été défini pour garantir une puissance statistique suffisante, en tenant compte de l’effet biologique attendu, de la variabilité individuelle. Chaque étude comporte 2 groupes expérimentaux (1 contrôle et 1 traité), permettant de tester chaque molécule avec un minimum d’animaux. La planification annuelle et quinquennale a été optimisée pour que le nombre total sur 5 ans ne dépasse pas 600, tout en assurant des données fiables. Enfin, une sélection ciblée des tissus à prélever permet d’éviter des prélèvements inutiles et d’optimiser l’utilisation des animaux pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 5 individus maximum par cage et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. De plus, une observation quotidienne des animaux porteurs de tumeurs, avec mesure régulière des volumes tumoraux, permettra d’établir quotidiennement un score prenant en considération la perte de poids, la présence de signes de douleur ou de souffrance notable (cardiaque, respiratoire). Toutes les administrations (iv, ip et sc) sont réalisées par un personnel formé, expérimenté pratiquant en routine ce type d’études chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Lorsqu’ils ont lieu, les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : un volume tumoral supérieur à 1000 mm³, une perte de poids supérieure ou égale à 20 % par rapport au poids corporel maximal, ou un score de souffrance supérieur à 10 avec analgésie inefficace après 2 h. A la fin du projet tous les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Des essais in vitro sont réalisés en amont pour vérifier l’interaction des vecteurs avec leurs récepteurs cellulaires. Ces approches ne permettent cependant pas d’évaluer l’ensemble des paramètres physiologiques complexes impliqués in vivo, tels que la distribution dans l’organisme, la pharmacocinétique ou l’efficacité tumorale. À ce jour, aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet de prédire de manière fiable ces paramètres. Le recours à des modèles murins est donc indispensable pour l’évaluation de vecteurs à visée thérapeutique ou diagnostique dans un contexte tumoral. La souris constitue un modèle mammifère pertinent, intégrant l’ensemble des mécanismes physiologiques nécessaires à l’étude de l’efficacité pharmacologique. Pour cette procédure, des animaux dits « jeunes adultes » seront utilisés, âgés d’environ 6 semaines et pesant en moyenne 24g à 28g, ce qui permet d’optimiser les posologies et la standardisation des expérimentations. Deux souches seront employées selon les besoins expérimentaux : - Une souche déficiente en système immunitaire, permettant l’implantation et la croissance reproductible de tumeurs solides humaines sous-cutanées, facilitant la prise tumorale et le suivi de la croissance tumorale. - Une souche sauvage présentant un système immunitaire fonctionnel, permettant l’évaluation des vecteurs dans un environnement tumoral incluant la réponse immunitaire.

Pour évaluer si une lumière rouge ou infrarouge réduit les lésions de la peau et de la bouche causées par la radiothérapie, 3 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des séances d'irradiation sous anesthésie générale et, pour certains groupes, des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant trois semaines. Les atteintes attendues, perte de poids, irritations de la peau et de la muqueuse buccale, viennent surtout de l'irradiation et de la tumeur. La mise à mort permet des examens sur tissus, et l'effectif de plus de trois mille animaux n'est pas justifié dans le résumé.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer la capacité de la photobiomodulation, utilisant une lumière rouge ou proche infrarouge, à réduire les toxicités induites par la radiothérapie et/ou la chimiothérapie au niveau de la muqueuse buccale et de la peau. La photobiomodulation est déjà largement utilisée en clinique pour la prise en charge des effets secondaires liés aux traitements anticancéreux, ainsi que dans d’autres indications telles que l’alopécie ou la cicatrisation post-chirurgicale. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de la photobiomodulation dans des modèles murins de toxicités radio-induites, en particulier la radiodermite et la mucite orale, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse induite par la photobiomodulation elle-même. Un objectif secondaire est de vérifier que la photobiomodulation n’induit pas de protection tumorale vis-à-vis de la radiothérapie. À ce titre, le projet vise également à évaluer l’impact de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, et à explorer la possibilité d’un effet radiosensibilisant de la photobiomodulation.

Bénéfices attendus

Bien que l’efficacité clinique de la photobiomodulation soit aujourd’hui bien établie dans la prévention et le traitement de la mucite orale, l’analyse de son effet sur les toxicités cutanées et muqueuses radio-induites permettra de mieux comprendre comment la photobiomodulation agit au niveau cellulaire et moléculaire pour limiter l’inflammation et favoriser la réparation des tissus sains exposés aux irradiations. Certaines études précliniques ont déjà démontré une réduction de la mucite orale par l’utilisation de lasers de faible intensité chez l’animal. Toutefois, ce projet vise à confirmer ces résultats à l’aide de techniques complémentaires, permettant d’étudier précisément les mécanismes biologiques impliqués dans la réduction des effets secondaires, et surtout à étendre cette démonstration au contexte de la radiodermite, dont la diminution n’a pas encore été démontrée de manière robuste en préclinique, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse propre à la photobiomodulation. Par ailleurs, les paramètres d’utilisation de la photobiomodulation (doses, longueurs d’onde, durée d’exposition) étant actuellement très hétérogènes en préclinique et en clinique, ce projet contribuera à leur optimisation et standardisation dans le cadre des soins de support en oncologie. Dans la littérature préclinique, l’impact de la photobiomodulation associée à la radiothérapie sur la tumeur reste controversé. Ce projet vise à clarifier ces effets en explorant de manière rigoureuse l’influence de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, dans différents modèles tumoraux. La mise en évidence, à l’aide de preuves précliniques solides et de techniques d’analyse avancées, d’un effet radiosensibilisant, d’une modulation du microenvironnement tumoral, ou d’un ralentissement de la croissance tumorale constituerait une avancée majeure dans la compréhension des interactions entre la photobiomodulation et les traitements anticancéreux. Ces données permettront de mieux caractériser les mécanismes biologiques impliqués, notamment en termes de vascularisation tumorale, d’inflammation et de réponse immunitaire, et de trancher les divergences actuelles de la littérature.

Procédures

Il y aura une injection des cellules tumorales sous anesthésie locale (durée 10 secondes). Pour chaque procédure, la photobiomodulation sera délivrée pendant au maximum 10 min sans contact direct à une distance de 40 mm. Elle sera délivré pour chaque groupe sous anesthésie générale après une séance de radiothérapie pour les groupes irradiés ou pour les groupes témoins. Pour chaque procédure, les souris seront également irradiées sous anesthésie générale (durée: 15 minutes max) . Dans certains groupes, elles seront traitées 3 fois par semaine avec un anticorps en injection durant trois semaines (durée de l'injection 10 secondes). Cette injection se fera sous anesthésie locale. Certains groupes recevront un produit de contraste pour voir la vascularisation sous micro-CT juste avant le prélèvement final sous anesthésie générale (une injection, durée 10 secondes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les nuisances qui surviennent à l’animal sont principalement dues à l’irradiation et à la tumeur. Les effets indésirables attendues liés à l’implantation de la tumeur, le développement progressif de la tumeur pouvant entraîner une gêne légère à modérée et une perte de poids. Les nuisances que l’animal peut également rencontrer sont les irritations cutanée ou muqueuse légère et transitoire et la perte de poids modérée, liée à l’irradiation dans les modèles de radiodermites et de mucite orale radio-induites. L’association de la photobiomodulation à la radiothérapie ne génère pas de nuisance supplémentaire pour l’animal. Aucun effet indésirable spécifiquement lié à la photobiomodulation n’est attendu sachant qu’elle non ionisante, non invasive et appliquée en surface à des doses ne causant aucune élévation thermique mesurable. Dans ce contexte, la photobiomodulation est susceptible de réduire certaines toxicités radio-induites, telles que la radiodermite et la mucite orale, et pourrait ainsi contribuer à une amélioration du bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des études et examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal est justifié par l’impossibilité de reproduire in vitro l’ensemble des phénomènes biologiques étudiés dans ce projet. Les effets de la photobiomodulation sur les toxicités radio-induites et sur la réponse tumorale impliquent des interactions complexes entre plusieurs compartiments cellulaires, microenvironnement tissulaire de la tumeur , et la dynamique tumorale avec certains types de cellules ou médiateurs chimiques est très important, qui ne peuvent être modélisées de manière pertinente par des systèmes cellulaires isolés. D’autant plus que les données issues de la littérature basée majoritairement sur des études in vitro sont très limitées dans l’analyses sur les mécanismes d’actions de la photobiomodulation sur la réparation tissulaire ou sur la réponse tumorale, manquant d’aller plus loins dans la recherche ou dans les conclusions. Ils démontrent par ailleurs que les effets de la photobiomodulation diffèrent significativement entre les modèles in vitro et in vivo. Ainsi, l’utilisation de modèles murins reste indispensable si on veut étudier de manière intègre les effets de la photobiomodulation sur les tissus développant la mucite orale et la radiodermite proche de celui des patients et sur la tumeur, dans un contexte de radiothérapie, et pour produire des résultats transposables à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet sera strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été définis sur la base : d’une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant dans chaque procédure pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Sur des données précliniques existantes, les modèles de radiodermite et de mucite orale utilisés dans ce projet sont très développés dans le laboratoire et décrits dans la littérature. Mais également la création de modèle avec des tumeurs ou il y a un contrôle tumoral par la radiothérapie est également très développé dans le laboratoire. Du fait de ce recul important, nous n’avons pas besoin de mettre en place nos modèles d'irradiations et de tumeurs. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales et donc le nombre de souris.

Raffinement

La photobiomodulation constitue une approche non invasive, non ionisante, appliquée à des paramètres n’induisant aucune élévation thermique mesurable, et ne générant pas de douleur directe chez l’animal. Toutefois, un appareil d'imagerie thermique (Ti20 thermal imager) peut être utilisé pour vérification. Les animaux seront pesés trois fois par semaine, et un examen clinique biquotidien sera réalisé afin d’évaluer l’état général, le développement des effets radio-induits cutanés et/ou muqueuses. Le scoring de ces effets se fera avec le score de Parkins ou CTCAE. Le développement tumoral sera suivi trois fois par semaine par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse, ou par une imagerie IVIS (Système d’imagerie in vivo basé sur la luminescence), permettant un suivi longitudinal non invasif. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués, conduisant si nécessaire à une euthanasie immédiate, réalisée conformément aux recommandations réglementaires en vigueur. Les souris seront hébergées en groupe afin de limiter le stress lié à l’isolement. Leur environnement sera enrichi (coton, nids en carton, papier) pour favoriser les comportements naturels et réduire l’anxiété. En cas de besoin, des compléments alimentaires riches en énergie et facilement accessibles seront mis à disposition, et des traitements analgésiques pourront être administrés conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, en raison de la bonne caractérisation de ses réponses tissulaires et immunitaires aux rayonnements ionisants. Les lignées choisies ont été sélectionnées car ce sont des modèles largement utilisés et validés pour l’étude du développement tumoral et des effets secondaires de la radiothérapie. Leur homogénéité génétique (souris congéniques) garantit une bonne reproductibilité des résultats. Par ailleurs, ces lignées ont déjà été utilisées dans le laboratoire pour l’étude des mucites buccales et de la radiodermite, assurant ainsi une continuité scientifique avec les travaux similaires. Les souris jeunes seront âgées de 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. Elles représenteront les souris jeunes. Sur la base des résultats obtenus, certains résultats clés peuvent être confirmés sur des souris âgées de 15 à 18 mois pour voir si l’âge joue dans les résultats.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection stéréotaxique d'un traceur dans le cerveau, suivie de sept jours d'observation puis d'une mise à mort au CO2. L'exercice n'a pas de finalité de recherche, il sert à former des étudiants de Master aux gestes de stéréotaxie et à la dissection du cerveau. Le porteur retient un ratio d'un animal pour trois étudiants et juge la formation pratique impossible à remplacer par une vidéo ou un simulateur.

Objectifs

La réalisation de cette procédure expérimentale s’inscrit dans un objectif strictement pédagogique visant à permettre aux étudiants de Master de comprendre concrètement les bases anatomiques, méthodologiques et techniques des approches neuroanatomiques utilisées en recherche biomédicale. L’objectif est précisément de former les étudiants aux techniques de stéréotaxie et de neuroanatomie chez la souris, compétences indispensables à leur formation en neurosciences expérimentales. Environ 2/3 des étudiants de Master pratiquent l’expérimentation animale dans le cadre de leur stage obligatoire en 1ère année et cette proportion augmente en 2e année, la grande majorité des étudiants travailleront avec le rongeur. La stéréotaxie est une méthode de référence permettant la localisation tridimensionnelle précise de structures cérébrales chez un animal anesthésié, à partir de coordonnées issues d’un atlas neuroanatomique standardisé. Ces coordonnées sont reportées sur un appareil stéréotaxique afin de cibler une région d’intérêt et d’y injecter un traceur. L’utilisation d’un animal vivant est indispensable, la diffusion du traceur au sein des réseaux neuronaux nécessitant l’intégrité anatomique et fonctionnelle des circuits cérébraux. Aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des connexions neuronales à l’échelle de l’organisme entier dans un objectif d’apprentissage pratique. La maîtrise de ces techniques ne peut être acquise de manière exclusivement théorique : elle requiert l’apprentissage encadré des gestes techniques, du positionnement sur cadre stéréotaxique, de la gestion de l’anesthésie et du respect des coordonnées anatomiques. Cette formation contribue à améliorer la rigueur méthodologique, la reproductibilité scientifique et, à terme, à limiter les échecs expérimentaux et l’utilisation d’animaux dans les projets futurs. Elle garantit également l’acquisition de compétences conformes aux exigences scientifiques et réglementaires encadrant l’expérimentation animale.

Bénéfices attendus

La compréhension des méthodes de stéréotaxie et d’injection de traceur cérébraux est indispensable pour l’interprétation des données issues de modèles pré-cliniques et pour la conception de futurs protocoles expérimentaux. Au cours de ces travaux pratiques, les étudiants acquièrent une compréhension concrète des principes méthodologiques, des contraintes techniques ; des exigences réglementaires et des mesures de raffinement mises en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux, sans réalisation directe d’actes invasifs. Le bénéfice attendu est principalement pédagogique et formatif. Cette formation permet aux étudiants d’acquérir des compétences essentielles à leur insertion professionnelle dans le domaine de la recherche biomédicale, académique ou industrielle. Elle contribue également à leur sensibilisation approfondie aux principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), aux exigences réglementaires et aux responsabilités éthiques associées à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. La compréhension des contraintes expérimentales et des mesures de bien-être animal participe à la formation de futurs professionnels capables de concevoir et de conduire des projets respectueux des exigences scientifiques et éthiques.

Procédures

Chaque animal suivra une seule procédure en 6 principales étapes : 1. Pesée (durée 1 minute). 2. Administration en injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire 30 minutes avant la chirurgie. 3. Anesthésie générale gazeuse d’une durée d’environ 15 à 20 minutes. 4. injection stéréotaxique dans le cerveau d’une molécule (appelée traceur) visant à identifier les réseaux de neurones. 5. Suivi post-opératoire pendant 7 jours avec pesées, évaluations du comportement, de l’apparence du pelage et de l’état de la suture. 6. Mise à mort par inhalation croissante de CO2.

Impact sur les animaux

Un stress peut être induit par la manipulation et la pesée individuelle des animaux L’acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale est susceptible d’induire un inconfort, un stress ou encore une perte de poids.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. Le cerveau sera ensuite prélevé par les étudiants dans le but de les former sur ce geste et sur les expériences permettant la visualisation et l’identification des réseaux neuronaux.

Remplacement

L’objectif du projet est de caractériser l’organisation anatomique des réseaux neuronaux dans le cerveau de souris. A l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet de reproduire de manière équivalente la complexité des interactions cellulaires, l’intégrité structurale du tissu nerveux ni la dynamique de migration des traceurs neuronaux au sein d’un cerveau dans son environnement physiologique. Les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d’observer la distribution anatomique des traceurs dans un contexte tridimensionnel intégrant les connexions neuronales fonctionnelles. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de logiciel de réalité virtuelle permettant l’injection cérébrale stéréotaxique chez le rongeur de manière réaliste. Ces travaux pratiques consistent à observer l’animal vivant lors de la chirurgie afin de contrôler ses paramètres vitaux ainsi que son endormissement à l’anesthésie et son réveil et d’appréhender les techniques d’asepsie. Enfin, une vidéo de la chirurgie n’est pas envisageable car l’acte chirurgical n’est pas l’unique finalité de ces travaux pratiques, c’est une étape dans l’étude globale des projections motrices du cerveau, les étudiants ont donc besoin aussi d’apprendre les manipulations post-mortem comme la dissection du cerveau, et d’appréhender les techniques de traitement du tissu cérébral très fréquemment utilisées en neurosciences (perfusion cardiaque, coupes du cerveau, visualisation du traceur). Par conséquent, l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques et pédagogiques du projet. Néanmoins, l’utilisation du modèle animal est strictement limitée au minimum nécessaire, et l’ensemble des procédures est conçu de manière à limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Des méthodes alternatives sont utilisées lorsque cela est possible, notamment pour la formation théorique des étudiants, l’analyse des données et l’interprétation des résultats expérimentaux.

Réduction

Les méthodes expérimentales utilisées dans ce projet pédagogique sont des techniques déjà validées et maitrisées par les enseignants intervenants dans ces travaux pratiques, ce qui permet de limiter les phases de mise au point et donc d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires à des fins de calibration technique. L’ensemble des procédures est réalisé par un enseignant habilité et formé à l’expérimentation animale, ainsi qu’à la chirurgie, garantissant ainsi la reproductibilité des gestes, limitant les variations expérimentales susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires, respectueux des contraintes réglementaires, et des mesures de raffinement. Le nombre d'animaux est déterminé en fonction des besoins pédagogiques du module d’enseignement, tout en étant réduit au minimum pour que cela reste compatible avec un apprentissage efficace des étudiants et avec la bonne réalisation des observations scientifiques. La promotion de Master comprend environ 20 étudiants par an. Afin de limiter le nombre d’animaux tout en permettant un encadrement pédagogique efficace, un ratio d’1 animal pour 3 étudiants est appliqué pour les travaux pratiques, ce qui correspond à 7 animaux par an. S’ajoute à cela un animal supplémentaire prévu à des fins de raffinement en cas d’atteinte des points limites et de nécessité d’arrêt anticipé de la procédure. Ainsi, le projet nécessite 8 souris par an, soit un maximum de 24 animaux sur la durée totale du projet de 3 ans. Cette stratégie permet de garantir un équilibre entre les exigences pédagogiques, la qualité de la formation dispensée aux étudiants et le respect du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes éthiques et réglementaires en vigueur.

Raffinement

L’ensemble des procédures est conçu de manière à réduire au maximum la douleur, la souffrance, et l’angoisse des animaux. Les animaux sont hébergés dans des salles d’animalerie dédiées, éloignées des sources de bruit et des perturbations liées à l’activité d’enseignement. Ces locaux sont agréés pour l’hébergement des rongeurs de laboratoire et l’hébergement comprend une période d’acclimatation de 10 jours. De plus, les animaux sont hébergés en groupe afin de limiter le stress lié à l’isolement avec au moins un matériau de nidification permettant la construction de nids et l’expression de comportements naturels. Les manipulations expérimentales sont réalisées par un enseignant formé et habilité à l’expérimentation animale ainsi qu’aux gestes chirurgicaux, garantissant la maîtrise des procédures, la réduction du temps d’exposition des animaux à la procédure expérimentale et une contention adaptée et de courte durée. Ainsi le stress et l’inconfort qui pourraient survenir pendant la pesée des animaux et durant les manipulations sont réduits. Une anesthésie générale gazeuse est systématiquement utilisée, associée à l’administration d’un traitement anti-inflammatoire et anti-douleur adapté en pré- et post-opératoire afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur. Le bien-être des animaux est contrôlé à chaque étape de la procédure chirurgicale. Pendant l’acte chirurgical, la température corporelle est maintenue à l’aide d’un dispositif de tapis thermorégulé contrôlé par sonde thermique afin de prévenir l’hypothermie associée à l’anesthésie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés par les étudiants immédiatement après la procédure, puis quotidiennement par l’enseignant responsable afin de détecter précocement tout signe de douleur ou de complication. Après euthanasie et prélèvement du cerveau, les autres organes seront proposés à la communauté universitaire. Concernant l’animal surnuméraire prévu dans le protocole, celui-ci sera utilisé uniquement en cas d’atteinte anticipée des points limites. S’il n’est pas utilisé, il pourra être replacé à d’autres projets de recherche ou d’enseignement, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés.

Choix des espèces

Les souris de souche Swiss sont utilisées dans le cadre de ce projet car elles constituent un modèle animal de référence largement utilisé en recherche biomédicale et en enseignement en neurosciences. Cette espèce présente une organisation anatomique et fonctionnelle du système nerveux bien caractérisée, permettant l’étude des structures cérébrales et des réseaux neuronaux d’intérêt. L’utilisation de cette espèce facilite également l’interprétation des résultats et la comparaison avec les données scientifiques disponibles dans la littérature spécialisée. Le choix de cette souche permet ainsi de garantir une standardisation des conditions expérimentales et d’assurer un apprentissage fiable des techniques par les étudiants, tout en limitant les variations expérimentales susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires. Cela s’inscrit dans le respect du principe des 3R, pour atteindre les objectifs pédagogiques. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées d’environ 8 semaines. Ce choix d’animaux adultes est justifié par les caractéristiques techniques des procédures expérimentales prévues, la visualisation des réseaux de neurones nécessitant un animal dont le développement cérébral est achevé et dont l’anatomie cérébrale est stable. L’utilisation d’animaux adultes permet en effet l’utilisation d’atlas cérébraux de référence établis chez la souris adulte, facilitant la reproductibilité des expériences. De plus, le choix d’animaux adultes ne présentant donc pas de vulnérabilité particulière liée au développement ou au vieillissement, est adapté aux procédures prévues dans le protocole. Enfin, la taille du cerveau adulte permet d’obtenir un nombre plus important de coupes histologiques par animal, augmentant ainsi la quantité de données analytiques exploitables par individu et contribuant au principe de réduction du nombre total d’animaux utilisés.