Souris
Étude de la biodistribution et tolérance de polymères pour la décontamination selon deux voies d’administration : orale et intranasale
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Motivé par le risque d'attaques radioactives et de bombes sales, ce projet utilise 276 souris saines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des polymères décontaminants par gavage ou par voie intranasale, de une à cinq fois, pour suivre où ces molécules se répartissent dans l'organisme. Le gavage, introduction d'un tube dans l'œsophage, peut provoquer stress et douleur, et les anesthésies répétées pour l'imagerie ajoutent une source de stress. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative, les études in vitro ne reproduisant pas selon lui la complexité de l'environnement digestif ou nasal.
Objectifs
Depuis quelques années, nous observons une montée des risques de radio contaminations. Ces risques proviennent à la fois du contexte géopolitique (conflit nucléaire), de l’augmentation des attaques terroristes (utilisation de bombes sales en raison d’un accès facilité à de nombreuses sources) mais aussi du développement et du renouvellement des parcs nucléaires. Les réponses disponibles aux attaques radioactives sont à ce jour basées sur des technologies anciennes qui nécessitent d’être améliorées et perfectionnées. Lors de contaminations radionucléaires, trois voies d’entrées peuvent être utilisées : la voie orale en cas d’ingestion, l’inhalation et enfin la voie cutanée. Le passage dans le sang de ses éléments radioactifs libres conduit à leur bioaccumulation dans le foie, les reins, les os ou encore la thyroïde. Les traitements aujourd’hui disponibles tels que le Succimer (DMSA), le Dimercaprol (BAL) ou l’Iodure de Potassium lient un nombre limité de métaux lourds, présentent des limites et des effets indésirables. Dans ce contexte, nous avons développés de nouvelles formulations pour la décontamination pour administration orale et nasale pour la prévention et le traitement à large spectre en cas d’incidents nucléaires. Le but de ce projet est d’évaluer la biodistribution des formulations décontaminantes après administration orale et intranasale.
Bénéfices attendus
Le projet vise à étudier la biodistribution d’un médicament radio décontaminant après prise orale ou par voie nasale. Les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer que le médicament à une rétention local du polymère suite aux deux modes d’administration et une absence de passage systémique. Également, ce projet permet de démontrer que la prise simple ou multiple du polymère n’induit pas d’effet iatrogène chez la souris. A la suite de cela, des études plus poussées pourront être envisagées afin de valider l’efficacité des formulations décontaminantes. Enfin, ce nouveau système pourrait être appliqué aux situations de contamination par des métaux lourds, en particulier dans le secteur agroalimentaire, lesquelles représentent un enjeu important de santé publique.
Procédures
Les formulation seront administrées entre 1 et 5 fois par gavage ou 1 et 5 fois par voie intranasale. On estime que la procédure de gavage sera d’environ 30 secondes par souris. Et l’administration intranasale est d’environ 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Le traitement des souris par gavage (introduction d’un tube dans la gorge) peut causer du stress, des douleurs au niveau de l’œsophage. Enfin, le suivi du poids des souris est aussi une autre source potentielle de stress pour elles. L’anesthésie répétées pour l’acquisition d’image totale de la souris peut aussi induire du stress.
Devenir
Après chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des tissus et l’analyse de ceux-ci post mortem.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement digestif ou intranasal. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la biodistribution du polymère au cours dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de la variabilité interindividuelle connue des études de biodistribution, ainsi que de l’expérience antérieure du laboratoire sur ce type de manipulations. Le nombre d’animaux par groupe est en accord avec les effectifs classiquement rapportés dans la littérature pour des études de biodistribution. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Afin d’augmenter la tolérance à l’administration orale par gavage pour la souris, nous utiliserons une canule trempée dans une solution appétissante pour la souris, par exemple une eau sucrée. Des visites journalières des souris seront effectuées pour détecter la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les souris seront observées quotidiennement pendant chaque pesée afin de détecter l’éventuelle apparition de signes de souffrance (points limites). Un traitement anti-douleur sera administrée par voie sous-cutanée dès lors un signe de souffrance détecté
Choix des espèces
Des souris mâles et femelles (répartition 50/50) seront utilisées pour toutes les procédures du projet afin de se rapprocher des caractéristiques générales de la population.
Comprendre l’impact de l’accumulation rénale de lipides dans la progression de la maladie chronique rénale.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Une biopsie de l'oreille vers le dixième jour de vie, un jeûne de six à douze heures, puis la mise à mort entre trois et quatre mois: 240 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reproduisent une maladie rénale liée au diabète, étudiée à un stade précoce où le RNT affirme qu'aucun signe de mal-être n'apparaît encore. Toutes sont tuées pour prélever reins, foie et graisses. Sur les 240 produites, 32 souris sans intérêt pour l'étude serviront à entretenir l'élevage des lignées.
Objectifs
Le diabète peut abîmer, avec le temps, les reins. Cette complication, appelée néphropathie diabétique, est aujourd’hui la première cause de maladie rénale chronique dans le monde. Lorsque les reins sont trop endommagés, la maladie peut évoluer vers une insuffisance rénale sévère obligeant les patients à recourir à la dialyse ou à une greffe. Malgré les traitements existants, de nombreuses personnes diabétiques voient encore leur état s’aggraver, ce qui montre qu’il est urgent de mieux comprendre les mécanismes en jeu pour développer de nouvelles thérapies. Les causes de cette maladie sont multiples et complexes. Ces dernières années, les chercheurs ont mis en évidence un phénomène important : l’accumulation anormale de graisses dans les reins. Cette accumulation devient toxique pour les cellules et contribue à l’aggravation de la maladie rénale. Au niveau mécanistique, lorsque le taux de glucose est trop élevé, une protéine, nommée ChREBP, est fortement activée ce qui favorise la formation de lipides dans le rein et accélère le développement des lésions rénales. Des études chez la souris ont montré que bloquer cette protéine d’intérêt dans le rein réduit l’accumulation de graisses et ralentit la progression de la maladie, soulignant son rôle central. Grâce à de nouvelles technologies, il est désormais possible d’analyser très finement les graisses présentes dans les tissus et d’étudier l’activité des gènes cellule par cellule. Ces outils offrent une occasion unique de mieux comprendre comment la maladie se développe au niveau du rein. L’objectif de ce projet est d’utiliser ces techniques de pointe pour mieux comprendre comment l’excès de sucre et de graisses abîme les reins, et quel rôle exact joue la protéine ChREBP dans ce processus. À terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou ralentir les atteintes rénales liées au diabète et à d’autres maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Les personnes présentant une maladie métabolique comme le diabète ou une glycogénose de type 1 (maladie génétique rare) ont un risque très élevé de développer une maladie rénale chronique. Cette complication est un enjeu majeur de santé publique puisqu’elle touche plus de 30 % des personnes diabétiques (soit environ 1,2 million de personnes en France), et jusqu’à 70 à 80 % des patients atteints de glycogénose de type 1. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement efficace pour empêcher l’aggravation de ces lésions rénales, qui peuvent mener à une insuffisance rénale sévère, nécessitant une dialyse ou une transplantation rénale. L’objectif du projet est de mieux comprendre comment la maladie rénale se développe en étudiant • Les graisses (lipides) qui s’accumulent dans leurs reins, et leur rôle dans l’aggravation de la maladie. • Les mécanismes moléculaires qui déclenchent précocement les lésions rénales. • L’impact de l’alimentation sur l’activité d’une protéine clé qui régule le métabolisme des sucres et des graisses dans le rein. • Le rôle des cellules immunitaires et la communication entre les cellules du rein dans l’évolution de la maladie. dans un modèle de souris transgéniques reproduisant les perturbations métaboliques des reins diabétiques ou de glycogénose de type 1. En identifiant ces mécanismes, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour ralentir, voire stopper, la progression de la maladie rénale chez les patients atteints de glycogénose de type 1 ou de diabète. Cela pourrait améliorer leur qualité de vie et réduire le risque d’insuffisance rénale.
Procédures
Pour identifier les souris porteuses des modifications génétiques nécessaires à l’étude, un petit échantillon de tissu (biopsie) sera rapidement prélevé (en quelques secondes) afin d’analyser leurs gènes. En fin de procédure, 4 lots de 20 souris mâles et 20 souris femelles seront mis à jeun pendant 6h pour contrôler leur état métabolique avant leur mise à mort. Dans une deuxième étude, des lots de 8 souris mâles et de 8 souris femelles seront mis à jeun pendant 12h; ou mis à jeun pendant 12h puis renourris pendant 12h, juste avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée sur tous les animaux, juste avant la mise à mort, pour réaliser des dosages biochimiques. Cette prise de sang unique sera réalisée en environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
1.Biopsie de l’oreille (à 7–10 jours de vie) : Les souriceaux subissent un petit prélèvement (biopsie) au niveau de l’oreille. Cela peut causer une légère douleur passagère et un peu de stress, car ils sont maintenus immobiles pendant l’opération. Le risque de saignement est très faible. 2. Maladie rénale : Dans cette étude, les animaux sont euthanasiés à l’âge de 3 et 4 mois, stade très précoce de la maladie rénale, n’entrainant aucun signe de mal-être puisque la maladie reste silencieuse. Les problèmes graves (perte de fonction des reins) n’apparaissent qu’après 12–15 mois. 3. Jeûne de 12 heures : Quand les animaux ne mangent pas pendant 12 heures, ils deviennent moins actifs, perdent un peu de poids (5–10%), et leur température corporelle baisse légèrement. Leur taux de sucre dans le sang diminue, mais reste dans la normale (entre 70 et 110 mg/dL). 4. Jeûne de 6 heures (avant l’euthanasie) :Un jeûne de 6 heures cause un léger stress : les animaux cherchent plus de nourriture dans leur litière et perdent un peu de poids (moins de 5%). 5. Prélèvement sanguin. Ce prélèvement est rapide (15–20 secondes) et peut provoquer une légère douleur ou un petit saignement.
Devenir
Les animaux transgéniques seront produits en zone d’élevage et seront mis à mort en fin d’expérimentation pour le prélèvement des tissus (rein, foie et graisses au minimum) qui seront analysés au niveau structurel et moléculaire
Remplacement
Aujourd’hui, les scientifiques savent créer en laboratoire de mini-organes (appelés organoïdes) qui reproduisent certaines cellules du rein. Cependant, ces modèles restent trop simplistes : ils ne permettent pas d’étudier comment le rein interagit avec le reste du corps, comme le foie, ou comment l’alimentation et le métabolisme influencent la maladie. Or, la maladie rénale chronique étudiée ici est étroitement liée à des déséquilibres métaboliques, comme ceux observés chez les patients diabétiques ou atteints de certaines maladies génétiques (comme la glycogénose de type 1). La souris est le modèle le plus adapté pour plusieurs raisons : -Un métabolisme proche de l’humain : Elle permet d’étudier comment le rein réagit dans un contexte global, en tenant compte des interactions entre organes. -Un modèle unique : La souris atteinte de glycogénose dans les reins développe une maladie rénale chronique similaire à celle des patients, causée par une surcharge métabolique (comme dans le diabète). -Des outils scientifiques robustes : Les chercheurs disposent de nombreuses données et d’outils génétiques pour étudier précisément le rôle d’un facteur d’intérêt dans le rein.
Réduction
Pour obtenir des résultats fiables, il faut analyser un nombre suffisant d’échantillons afin de réaliser des analyses statistiques permettant de comparer les différents groupes analysés. Une méthode statistique robuste sera utilisée. La connaissance des modèles animaux et des approches moléculaires utilisées nous a permis de définir un nombre d’animaux minimum par groupe. Comme les reins de souris sont très petits, nous avons prévu d’augmenter le nombre d’animaux pour avoir assez de matériel biologique pour pouvoir réaliser toutes les analyses. Les maladies métaboliques (comme le diabète) peuvent se développer différemment chez les mâles et les femelles. Il est donc essentiel d’inclure les deux sexes pour obtenir des résultats complets. Au total, 240 souris transgéniques (mâles et femelles) seront produites et 208 souris d’intérêt seront étudiées. Parmi les 32 souris produites mais sans intérêt pour le projet, certaines pourront être utilisées pour maintenir l’élevage de ces lignées transgéniques utilisées dans différents projets. Les reproductions seront arrêtées dès que ce nombre sera atteint, pour éviter d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. La maladie est ciblée uniquement dans les reins, ce qui évite les hypoglycémies graves grâce à la production de glucose par le foie. Lors des mises à jeun, les souris sont placées dans de grandes cages avec des maisons en plastique pour limiter l’agressivité et le stress. Pour assurer leur confort thermique, une partie des cages est posée sur une plaque chauffante pour qu’elles puissent se réchauffer si besoin. Grâce à la bonne connaissance de ce modèle animal, des critères précis ont été définis pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront euthanasiées précocement (entre 3 et 4 mois), avant que la maladie rénale entraine des signes de mal-être. La surveillance du bien-être des souris est basée sur le contrôle de leur poids et l’observation de leur comportement : Des points limites ont été clairement définis (perte de poids conséquente, mal être non résolu malgré la prise en charge des animaux) nécessitant la mise à mort de l’animal. En cas d’alopécie (perte de poils) ou d’agressivité, l’enrichissement du milieu sera renforcé : Ajout de jouets ou d’accessoires pour limiter le stress et permettre l’isolement vis-à-vis de leur congénère. La cage pourra être divisée en deux dès l’apparition des premiers signes pour éviter les conflits entre individus.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation du métabolisme similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans les reins grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris imite très fidèlement la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type 1, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, les expérimentations seront réalisées à l’âge de 3 à 4 mois, juste avant l’euthanasie des souris.
Utilisation de souris transgéniques pour étudier des interactions protéiques dans la régulation du métabolisme énergétique en physiologie et en physiopathologie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 664 souris génétiquement modifiées, privées d'un à trois facteurs dans le foie, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est nourrie quinze semaines avec un régime hypercalorique jusqu'à développer diabète et accumulation de graisse dans le foie, l'autre suivie un an avec des tests de glycémie répétés. Toutes sont tuées pour prélever sang et organes. Le projet étudie la coopération entre facteurs de transcription du métabolisme, présentés comme des cibles thérapeutiques contre les maladies liées à l'obésité.
Objectifs
L’obésité est en constante augmentation et représente un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2 et d’autres maladies telles que la stéatose hépatique métabolique. Le foie est un organe majeur pour la régulation de l’homéostasie énergétique et contrôle de nombreuses fonctions métaboliques et des réponses inflammatoires. De nombreuses fonctions hépatiques sont assurées par des facteurs de transcription qui coopèrent pour réguler l’expression de gènes. La dérégulation de ces processus est l’un des mécanismes observés lors du diabète de type 2 et de la stéatose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les rôles respectifs et les coopérations potentielles entre plusieurs facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme en condition physiologique et dans l’obésité induite par l’alimentation. Nous disposons au laboratoire de souris spécifiquement délétées pour un ou plusieurs facteurs de transcription dans les hépatocytes. Ces animaux, hébergés pour certains d'entre eux à thermoneutralité, seront soit nourris avec un régime standard et suivis au cours du temps, soit nourris avec un régime hypercalorique pendant 15 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer les rôles spécifiques ainsi que les potentielles interactions ou redondances entre différents facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme hépatique, en condition physiologique et physiopathologique.Les facteurs de transcription étudiés sont des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité et il existe actuellement un intérêt croissant pour le développement de molécules ciblant simultanément plusieurs de ces facteurs. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.
Procédures
Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard et suivis pendant 1 an (512 animaux). D’autres groupes, hébergés à thermoneutralité, seront nourris à volonté avec un régime standard ou hypercalorique pendant 15 semaines (1152 animaux). -pesées hebdomadaires - 6 mesures de la glycémie (tous les 2 mois sur 1 année) pour 512 animaux à partir d’une goutte de sang . La mesure ne nécessite pas de contention et prend moins de 5 secondes. - 2 mesures de la glycémie pour 1152 animaux - 3 tests de tolérance au glucose et 3 tests de tolérance à l’insuline sur une année pour 512 animaux, consistant en 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie (temps 0) puis administration orale de glucose ou injection d'insuline prenant moins de 30 secondes, puis de mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2 h (6 prélèvements de moins de 5 secondes). - 1 test de tolérance au glucose et 1 test de tolérance à l’insuline sur 1152 animaux - un dernier prélèvement sanguin avant la fin de l’étude pour tous les animaux
Impact sur les animaux
Les animaux nourris avec le régime hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète (hyperglycémie, intolérance au glucose, résistance à l’insuline) et d’une stéatose (accumulation de lipides dans le foie). Ces altérations s’installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d’intensité modérée, sans altération brutale de l’état général des animaux. La piqûre pour obtenir la goutte de sang peut entraîner une douleur ponctuelle de faible intensité (quelques secondes), sans effet persistant. Le dernier prélèvement de sang peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une brève douleur d’intensité très modérée. L'administration de glucose ou d'insuline peut également entraîner un stress de quelques minutes lié essentiellement à la contention. Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ce geste n'entraîne pas de douleur significative ni de complication.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des méthodes alternatives utilisant des cellules de foie par exemple pourraientt être envisagées. Néanmoins, le métabolisme énergétique est un processus complexe qui met en jeu des interactions entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, muscle, cerveau) qui sont difficiles à reproduire avec des cellules en culture. L’utilisation d'un organisme vivant, dans lequel tous les organes fonctionnent ensemble, est donc nécessaire. De plus, l’utilisation de souris transgéniques rend possible la délétion d’une protéine d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier son rôle et il est possible d’induire une obésité chez la souris grâce à un régime hypercalorique.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). L’hébergement à thermo-neutralité permet de limiter le stress dû au froid. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Les modèles utilisés dans ce projet (délétés pour 1, 2 ou 3 protéines dans le foie) existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Analyse d’un modèle souris de la maladie de Charcot exprimant une activité inhibitrice cérébrale génétiquement augmentée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si renforcer certaines connexions nerveuses ralentit la maladie de Charcot, 560 souris vont être utilisées, 140 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces 140 souris développent une paralysie progressive et une perte de poids pouvant atteindre 40 pour cent, tout en subissant deux tests moteurs par semaine que le RNT reconnaît fatigants pour des animaux déjà affaiblis. Les 420 autres sont tuées avant l'apparition des symptômes pour des prélèvements. La mise à mort intervient avant la paralysie complète, selon des seuils fixés à l'avance.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également appelée maladie de Charcot, est une maladie grave du système nerveux qui affecte les cellules responsables du contrôle des muscles. Elle apparaît généralement à l’âge adulte et provoque une paralysie progressive incurable. La plupart des recherches se concentrent sur les stades avancés de la maladie, lorsque les symptômes sont déjà apparus. En revanche, on connaît encore mal ce qui se passe aux tout débuts de la maladie, bien avant l’apparition des premiers signes. Des études récentes ont montré que, chez des modèles animaux de la SLA, certaines connexions nerveuses qui freinent l’activité musculaire fonctionnaient moins bien dès les premières étapes de la vie. Ce projet part de l'hypothèse que la maladie pourrait débuter très tôt, durant le développement du système nerveux, mais que le corps met en place des mécanismes de compensation qui retardent l'apparition des symptômes. Avec le temps, ces mécanismes finiraient par s'épuiser, déclenchant ainsi la maladie. L’objectif est donc de renforcer ces connexions nerveuses protectrices chez l’animal afin de voir si cela permet de ralentir ou de limiter le développement de la maladie à l’âge adulte. Cette approche pourrait permettre de mieux comprendre la SLA et, à terme, d'envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématurée du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer les traitements actuels.
Procédures
420 animaux, à phénotype dommageable, seront euthanasiés avant le développement des symptômes de la maladie SLA afin de procéder à des prélèvements. 140 autres subiront des tests de motricité. Ainsi, de l'âge de 8 semaines (stade postnatal P60) jusqu'à 18-20 semaines (P120-P140), ils seront soumis à des tests moteurs ayant pour but de déterminer avec précision le déclin de leur force musculaire. Les deux tests utilisés seront le test d’endurance sur roue et le test d'opposition à la gravité. Ils seront réalisés deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Deux types de nuisances sont attendus au cours de cette étude : 1- Le développement d'atteintes motrices et d'une mort précoce, typiques de la SLA, avec une perte de poids qui commence aux alentours de 75 jours et peut atteindre 40 % au fil du temps, ainsi que l'apparition de symptômes moteurs aux alentours de 90 jours, sous forme de problèmes d'extension des pattes arrière, suivis d'une paralysie progressive qui touche d'abord les pattes arrière, puis les pattes avant, et qui évolue vers une paralysie totale et une mort prématurée aux alentours de 130 jours. 2- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux par le biais de tests de locomotion et de force motrice, qui peut s'avérer fatiguant et stressant pour des animaux présentant une faiblesse musculaire et une paralysie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux modèles de la maladie de Charcot seront euthanasiés avant la paralysie complète, conformément aux seuils établis, et les animaux contrôles ayant servi de contrôle seront euthanasiés aux mêmes âges.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale liée à dysfonctionnement de la transmission synaptique inhibitrice. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in silico permettant de modéliser la maladie et donc d’éviter l’utilisation d’animaux.
Réduction
La taille des groupes est déterminée afin de réaliser des tests statistiques pertinents. Pour rappel, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles afin d’analyser l’effet sexe. Ceci nous permettra de ne pas avoir à mettre à mort d’animaux n’ayant pas le sexe d’intérêt.
Raffinement
Les mesures de raffinements pour améliorer le bien-être des animaux ont été pensées pour chaque étape de la vie des animaux transgéniques exprimant un phénotype dommageable sévère.
Choix des espèces
Parmi les modèles de la maladie de Charcot, les souris sont les plus appropriées à notre étude, car elles présentent : 1) un niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat ; 2) un développement comparable à celui de l’homme ; 3) plusieurs lignées exprimant une mutation d’un gène causatif de la maladie, dont certaines reproduisent les symptômes observés chez l’homme et sont donc adaptées à l’évaluation préclinique de traitements médicamenteux.
Rôle d’un canal ionique permettant la production de chaleur par certaines cellules graisseuse pour l’adaptation au froid et pour limiter le développement de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Exposées au froid à 5 degrés, soumises à des mesures répétées de température rectale et à un régime gras pendant seize semaines, 736 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines passent 48 heures isolées en cage métabolique, d'autres reçoivent des injections quotidiennes puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever organes et sang. L'objectif est de savoir si une protéine des cellules graisseuses contrôle la combustion des graisses, piste avancée contre l'obésité.
Objectifs
Il existe dans notre organisme deux grands types de cellules graisseuses appelées adipocytes : les adipocytes blancs qui stockent les graisses que nous mangeons et les adipocytes bruns et beiges qui brulent ces graisses. L'activation de ces adipocytes bruleurs de graisse contribue au maintien de la température corporelle lors d'une exposition au froid et permet de dissiper l'excédent calorique après un repas. Ainsi favoriser la fonction de ces adipocytes bruleurs de graisse diminuerait la prise de poids. Nous avons récemment découvert que ces adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse expriment en grande quantité d'un canal ionique donc l’activation est contrôlée par des forces mécaniques qui s'excersent sur les cellules. Elle fait partie de la famille des protéines dites mécano-sensible. L'objectif de ce projet est de déterminer si cette protéine mécano-sensible contrôle la capacité des adipocytes bruns et beiges à bruler des graisses lors de l'exposition au froid et après la prise d'un repas et si elle joue un rôle dans ces adipocytes pour moduler le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine mécano-sensible dans les mécanismes d'activation des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer cette protéine comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Les souris (48) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (96) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (96) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (96) seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection intrapéritonéale par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Le prélevement nécessitera de faire une petite incision sur la queue de la souris au début du test. Les tests seront espacés de 2 semaines. Des souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale pendant 7 jours d'un composé activant le tissu adipeux brun (144 souris) ou de NaCl en contrôle (144 souris). A la fin de certaines procédures, des souris (448) seront immédiatement mise à mort après un prélevement d'un volume de sang d'environ 200 µl à la veine temporale. Pour les experiences à thermoneutralité, des souris (144 souris) seront hébergées à 30 °C pendant 5 semaines maximimum. Des souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (192 souris) ou 10 jours (80 souris) et seront pour ces durées soit en hébergement individuel (5°C 6h) soit 2 dans la cage (5 °C 10 jours) afin d’éviter ou de limiter le comportement de thermorégulation sociale qui consiste au regroupement d’animaux les uns contre les autres afin de se réchauffer, comportement qui pourrait fausser les résultats de la mesure de la variation de température corporelle par mesure de la température rectale. Une mesure de la température rectale sera faite sur des souris vigiles (352 souris) comme dans l'espèce humaine à l'aide d'un thermomètre dont la sonde à un diamètre adapté à la souris pour une insertion sans trop d'inconfort dans son anus. 7 mesures espacées d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(80 souris).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique necessite de faire une petite incision à la queue au debut du test qui peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur de courte durée car une piqure avec une aiguille de 20-23G est réalisée pour provoquer le saignement. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une periode d'adaptation. Lors de l'exposition au froid la mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. Nous surveillerons cependant ces souris pour détecter tous signes d'hypothermie sévère comme une perte du réflexe de redressement, une prostration ou une léthargie et une température réctale inférieure à 32°C.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études sur des cellules d'adipocytaires brunes et nous avons ainsi montré que Piezo1 est fortement exprimé dans ces adipocytes et nos expériences cellulaires suggèrent que Piezo1 contrôle la capacité des adipocytes thermogéniques à bruler des calories et pourrait donc impacter la prise de poids. Les mécanismes du developpement d'une prise de poids excessive lors de l’obésité sont complexes faisant intervenir un dialogue entre plusieurs organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de cette proteine mécano-sensible Piezo1 dans les adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement signficatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié.
Raffinement
Nous avons généré des souris avec une invalidation de la protéine étudiée restreinte au adipocytes bruns et beiges pour limiter le risque d'apparition d'un phénotype dommageable. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un maximum de 4-5 souris/cage sur des portoirs ventilés. L’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique et pour l'exposition au froid. L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre (isolement de l'animale pour soins si blessure pas trop grave avec application de solutions antiseptiques, mise à mort si blessure importante ou signes de souffrance ou hypothermie ou perte de poids sévère).
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a beaucoup d'adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse qui contribuent à la dépense énergétique et à la capacité d'adaptation au froid. Les souris sont donc un modèle de choix pour identifier de nouvelles protéines régulant la fonction de ces adipocytes et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsque des souris adultes mais relativement jeunes (age 7-8 semaines) sont nourries avec un régime riche en lipide, elles deviennent rapidement obèses. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (âge 12-23 semaines selon les procédures).
Effets d’une consommation chronique d’édulcorants et de sucrose sur la fragilité cutanée et la fonction vasculaire chez des souris saines ou présentant un diabète de type 2 (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Des plaies de compression provoquées par deux aimants pincés sur un pli de peau, plusieurs heures par jour: 576 des 1 296 souris subissent ce protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les autres sont dépilées, anesthésiées à répétition, soumises à des piqûres au bout de la queue pour mesurer la glycémie, et 120 reçoivent un implant sous le crâne. Toutes sont ensuite tuées pour prélever peau et organes, l'étude portant sur l'effet des édulcorants et du sucre sur la cicatrisation chez des souris diabétiques. Les souris blessées sont isolées jusqu'à la fin de l'expérience pour éviter que leurs congénères n'aggravent les plaies.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension des processus de cicatrisation et des réponses vasculaires de la peau dans un état pathologique tel que le diabète. Les plaies chroniques sont généralement des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques. Ces plaies persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque, pouvant entraîner de graves complications voire un décès. L’objectif de ce projet est de caractériser la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après application d’une pression chez des souris diabétiques, mâles et femelles en fonction des différents régimes alimentaires que l’on peut rencontrer dans les populations humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension de l’impact de la consommation d’édulcorants sur la fragilité cutanée ainsi que les différences de réponses vasculaires de la peau chez des personnes obèses et/ou diabétiques.
Procédures
Toutes les souris seront pesées vigiles au moment de leur arrivée à l’animalerie, puis toutes les semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation. Durée de la manipulation : 30 secondes. Toutes les souris seront dépilées au moins une fois durant la période de l’expérimentation. Afin d’éliminer les poils à la surface de la peau, les souris seront anesthésiées pendant 5 minutes. Toutes les souris recevront une injection lors de chaque test du sucre dans le sang (moins de 10 secondes). Toutes les souris subiront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie, lors des tests du sucre dans le sang (5 gouttes de sang par test). Chaque prélèvement dure moins de 5 secondes. Pour 576 souris, des plaies de compression seront réalisées, sous anesthésie générale gazeuse, par application de deux aimants en face en face sur un pli de peau du dos (3h par jour durant 3 jours pour les compressions chroniques et 3 x 2h dans une journée pour les compressions aiguës). Une mise en cage isolée des souris est nécessaire pour préserver les plaies induites et éviter des sur-blessures liées à ses congénères. 720 souris seront anesthésiées 2 fois durant toute la période de l’expérimentation. La première anesthésie durera 5 minutes pour la dépilation et la seconde anesthésie durera 50 minutes environ pour réaliser des mesures physiologiques non invasives au niveau de la peau du dos. Afin de faciliter l’entrée des molécules dans la peau des 720 souris, l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Pour 120 souris, il est nécessaire de poser un implant sous la peau du crâne ; cette pose d’implant sera réalisée sous anesthésie en même temps que la dépilation.
Impact sur les animaux
La pesée des souris pour le suivi du poids ou avant anesthésie n’induira qu’un stress minime. La manipulation des souris lors de la dépilation et de la pose d’un implant est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Les nuisances pour l’animal lors de la dépilation sont minimes. Pour les 120 souris nécessitant la pose d’un implant, une petite incision est réalisée et refermée par 2 points de suture pouvant engendrer une douleur. Lors du test de sucre dans le sang, les souris recevront une injection pouvant engendrer une légère douleur au point d’injection. Les souris auront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie (5 gouttes de sang par test du sucre dans le sang). Ces prélèvements peuvent engendrer une légère irritation au point de prélèvement. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à deux plaies de compression (3h de compression par jour durant 3 jours pour les plaies chroniques ou 3 x 2h dans une journée pour les plaies aiguës). L’induction des plaies peut engendrer une douleur. La répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de compression et le suivi des plaies par photo (5min) peut fragiliser les souris. L’induction des plaies peut engendrer une douleur et une légère perte de poids. La mise en cage isolée suite à l’induction des plaies engendre une perte d’interaction sociale, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Les souris sont isolées juste après la dépilation et jusqu’à la fin de l’expérimentation pour éviter toute sur-blessure. L’anesthésie générale par injection peut générer une douleur modérée au point d’injection. Aucune nuisance n’est attendue lors des différentes mesures réalisées sous anesthésie durant l’expérimentation. Seule la réponse à l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Ce faible courant électrique est nécessaire pour faciliter l’entrée des molécules dans la peau.
Devenir
Il sera réalisé une mise à mort en fin d’expérimentations et un prélèvement des tissus cutanés et d’organes. Cette étude vise à étudier le processus de cicatrisation selon le régime suivi (régime alimentaire contrôle associé à différents « sucres » ou régime alimentaire riche en lipides associé à différents « sucres ») ainsi que les différences de réponses de la peau en fonction de ces régimes alimentaires. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet des différents régimes alimentaires sur la peau (peau, tissus adipeux, foie, estomac, vaisseaux, plasma).
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime alimentaire enrichi en sucre/gras), notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1296 incluant les 2 sexes. Le nombre d'animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs mesures seront couplées sur chaque animal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les anesthésies seront gazeuses à l’exception de l’anesthésie pour l’étude des réponses de la peau nécessitant une anesthésie plus longue. Des analgésiques seront administrés avant toute induction de plaies et au minimum 24h après. Pour les manipulations sous anesthésie générale, les souris seront placées dans une enceinte chauffée pour maintenir un confort thermique.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous réaliserons les manipulations sur des souris âgées de 26 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé.
Etude de la voie de l’hypusination dans le cancer de la prostate (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
1 152 souris vont être utilisées dans une étude sur le cancer de la prostate, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leurs organes. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales puis subissent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe diffusant en continu un inhibiteur. Les tumeurs se développent pendant plusieurs mois avant l'analyse, sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les mutations du cancer prostatique humain. L'équipe affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses, concluant à la nécessité de l'expérience sur l'animal.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue et en maitrisant la dose délivrée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigénèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois. Modification : Ce projet permettra également de déterminer le rôle de l'hypusination en fonction de l'agressivité de la tumeur et du stade de la tumeur ainsi que sur la formation des métastases.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe. Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile. Modification : Après réévaluation et observation du geste chirurgicale, l'implantation de la pompe ne durera que 10 minutes. La durée totale des interventions sera de 5 minutes pour les 5 injections et 10 minutes pour l'implantation de la pompe pour un total de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous asepsie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites. Modification : Les tumeurs ne sont pas cliniquement palpables jusqu'à 9 mois après l'injection du composé qui déclenche la formation des tumeurs. L'évolution de la tumeur sera suivie et des mesures seront prises en cas de douleur due à une évolution plus rapide de la tumeur.
Devenir
Modification :tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organes suivis d'analyses.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Modification : En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques (FACS) et 5 souris pour l'analyse des transcrits (RNA). Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (t-tests). Etant donné la variabilité inter-individuelle observée dans nos études précédentes (d'environ 15%), nous avons estimé que 18 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement avec une p-valeur de 5%.
Raffinement
Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée pourra être mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées à partir de 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques. Nous aurons 4 temps au bout desquels un groupe de souris sera mis à mort pour étudier l'effet du composé à différents temps : 1, 3, 6 ,10 semaines après implantation de la pompe. Modification : Les animaux seront injectés entre 8 et 12 semaines de vie afin d'élaborer des groupes expérimentaux plus conséquents et afin de réaliser les implantations des pompes simultanément. Ces injections ne peuvent se faire qu'au moment de la puberté qui se déroule entre 8 et 12 semaines car le système d'invalidation des gènes permettant la formation des tumeurs ne peut être induit qu'au moment de la puberté. Les mini pompes seront également implantées à partir de 5 mois après injection de tamoxifène soit à 7 mois de vie. A ce stade les souris présentent des adénocarcinomes.
Evaluation de la tolérance et de la sécurité d’un candidat médicament pour le traitement de la mucopolysaccharidose de type IIIA (MPS IIIA), syndrome de Sanfilippo de type A sur le modèle murin transgénique SGSHD31N x hTfR1
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Ces études répondent à une obligation réglementaire avant le premier essai chez l'enfant: 2 708 souris transgéniques du syndrome de Sanfilippo vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent chaque semaine, pendant quatre à vingt-six semaines, un candidat médicament par voie intraveineuse, précédé d'un antihistaminique contre les réactions allergiques. Les souris porteuses de la mutation seront tuées pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation. Plus de deux mille autres, hétérozygotes ou non mutées, seront réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes expérimentaux.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires non cliniques nécessaires pour permettre la première administration à l’homme du candidat médicament pour le traitement d’une maladie génétique sans traitement actuellement et touchant les jeunes enfants, la mucopolysaccharidose MPSIII de type IIIA ou syndrome de Sanfilippo. Cette maladie provoque une neurodégénérescence progressive, chez les jeunes enfants, avec complications neurologiques sévères, perte de la mobilité et de la communication et une espérance de vie réduite (adolescence ou début d’âge adulte. Ce projet sera conduit sur le modèle de souris transgénique Sgsh D31N x hTfR afin de répliquer les caractéristiques physiopathologiques de la maladie. Des études preuves de concept ont déjà été réalisées chez le laboratoire développant le candidat médicament et les résultats concluant permettent d’avancer dans les étapes suivantes de développement Les études de ce projet permettront d’avoir les données de sécurité suffisantes pour démarrer les premiers essais cliniques chez les jeunes enfantsdés l’âge de 2 ans.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance et de la sécurité du candidat médicament dans l’espèce rongeur transgénique la plus adaptée. - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez le patient dés l’âge de 2 ans avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la disponibilité pour les patients d’un médicament pour le traitement de la MPSIII ou syndrome de Sanfilippo, maladie génétique avec espérance de vie courte, très invalidante et sans traitement actuellement en dehors de traitements symptomatiques
Procédures
Ces études consistent en l’administration hebdomadaire pendant 4 à 26 semaines, du candidat médicament. L’administration est une injection bolus, donc rapide, dans la veine de la queue qui ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les animaux recevront une injection (courte intraveineuse ou sous cutanée) d’un antihistaminique préalablement à chaque traitement pour limiter le risque de réactions allergique. Des prélèvements de sang seront réalisés pour dosage des concentrations et recherche d’anticorps, 2 à 3 occasions par étude. Les animaux pourront subir des anesthésies de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie. Des test neuro comportementaux (incluant mais non limités aux tests d’apprentissage et mémoire, sensoriales [ex: auditif], activité locomotrice et batterie d’observations fonctionnelles [FOB]) peuvent être réalisé (durée du test de quelques minutes à 1 heure).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes: - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang (pouvant être réalisée sous anesthésie) ou lors des tests de maturation sexuelle et/ou frottis vaginaux. Des effets liés au modèle spécifique de cette souche de souris transgénique et pouvant arriver potentiellement avec l’âge, principalement neurocomportementaux, seront surveillés par les vétérinaires. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament (perte de poids, baisse d’activité, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Stress lors de changement d’environnement, confrontation à une situation inconnue et modification des conditions de luminosité (obscurité partielle ou totale avec utilisation possible d’une lumière rouge) et de température lors d’évaluations neurocomportementales. Des signes d’hypersensibilité possible notés dans les études préalables chez le sponsor et si confirmés dans les études en cours seront prises en charges par l’administration préalable systématique d’un antihistaminique.
Devenir
Les animaux homozygotes mutés seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes, de sang ou de tissus, tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles. Les animaux hétérozygotes ou Wild Types pourront être éventuellement réutilisés dans un autre projet pour la formation du personnel aux procédures expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances sur un organisme entier, ni de déterminer sa distribution et la dose sans effet adverse. Dans ces études sur les animaux adultes ou juvéniles, un relevé de poids, des signes cliniques et observation spécifique du développement d’animaux jeunes est requise par les lignes directrices en vigueur (ICH S11), ainsi que l’examen histologique complet des animaux en fin d’étude et en relation avec leur exposition dans le sang (ICH M3 (R2) et ICH S6) et dans le cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des recommandations des lignes directrices en vigueur, des objectifs de l’étude, de la spécificité de la souche qui va demander 2 groupes contrôle dans les études chroniques pour obtenir une quantité de données suffisante pour l’évaluation des groupes traités (demande FDA). La possibilité de réaliser l’étude chronique 26 semaines en démarrant sur des animaux juvéniles de 3 semaines d’âge, permet d’éviter de dupliquer deux études chroniques et de limiter ainsi le nombre d’animaux dans le programme. La possibilité de livrer les animaux juvéniles homozygote sera privilégiée et le process sera validé dans l’étude préliminaire. Ceci permettra de laisser à disposition de l’éleveur les animaux hétérozygotes pour continuer leur phase d’amplification. L’option de la livraison de la portée entière ne sera utilisée qu’en cas de retard des résultats génétique, afin de ne pas perdre la portée entière. Le nombre d’animaux utilisés pourra donc être nettement réduit et l’élevage optimisé.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, mouchoirs, tunnel, …). Le traitement des animaux par voie intraveineuse engendre peu de stress ou d’inconfort et sur une durée la plus courte possible (quelques secondes). La fréquence de traitement hebdomadaire est limitée. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Une observation minimum sera faite les jours de traitement Une information spécifique sera apportée aux techniciens et sur le modèle pathologique pour identifier les signes liés au modèle et faire un suivi adapté. Un examen vétérinaire adapté à réception des animaux et à une fréquence régulière pourra être mis en place, compte-tenu du modèle pathologique spécifique. En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. Les femelles seront hébergées socialisées. Au sevrage, les males seront hébergés isolément selon les procédures en vigueur, avec ajout de balles de bois comme enrichissement Afin de limiter les nuisances pour les animaux en cas de réaction d'hypersensibilité qui ont été reportées occasionnellement dans le laboratoire ayant effectué des études de pharmacologie, une administration préalable d'anti-histaminique pourra être réalisée . Le volume d’administration et de prélèvement de sang de cette étude se basent sur les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rongeur est une espèce acceptée par les agences réglementaires. La sélection de la souche de souris transgénique du modèle exprimant le gène déficient permet d’avoir le modèle pharmacologique le plus adapté et proche de l’homme pour répondre aux objectifs d’évaluation de la sécurité. L’âge des animaux au démarrage des études permettra de couvrir le traitement des patients dès l’âge de 2 ans.
Élucider le rôle du canal central de la moelle épinière dans la neuro-inflammation au cours de la sclérose en plaques, dans un modèle murin d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des injections d'une émulsion activant le système immunitaire, une toxine, puis des tests d'équilibre et de course sur tapis: 1 360 souris traversent ce protocole de sclérose en plaques, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chez les nouveau-nées, des outils génétiques sont injectés dans la moelle épinière après trois heures de séparation d'avec la mère. L'inflammation induite provoque des déficits moteurs progressifs dont la sévérité varie selon les individus. Toutes les souris seront tuées pour prélever leur moelle épinière, l'équipe présentant la souris comme "indispensable" faute de pouvoir reproduire ces mécanismes en culture.
Objectifs
Le canal central de la moelle épinière est bordé par une barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant. Cette barrière est en contact avec différentes cellules spécialisées qui participent au bon fonctionnement du système nerveux. Lors d’épisodes neuro-inflammatoires, la structure et la perméabilité de la barrière peuvent être altérées, ce qui risque de modifier la composition du LCR, de perturber la communication entre les cellules nerveuses, et d’entraîner des troubles des fonctions sensorimotrices et autonomes, par exemple le contrôle de la vessie. Les mécanismes de plasticité de cette barrière restent encore largement méconnus, en particulier dans un contexte inflammatoire. Mieux comprendre son fonctionnement et ses modifications en situation de maladie est essentiel pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Notre projet a pour objectif de déterminer comment une neuro-inflammation chronique comme celle observée dans la sclérose en plaques modifie cette barrière et son fonctionnement. Nous chercherons à déterminer quels changements surviennent dans les cellules et quelles sont les conséquences sur la dynamique du LCR et la régulation des fonctions sensorimotrices et autonomes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre la plasticité de la barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant en contexte neuro-inflammatoire. À court terme, les travaux permettront de caractériser les modifications cellulaires, moléculaires et fonctionnelles (miction (action d'uriner), locomotion) liées à l’inflammation, grâce à plusieurs approches complémentaires. À moyen terme, les résultats permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour restaurer ou protéger l’intégrité de la barrière. L’étude des conséquences fonctionnelles, notamment urinaires et locomotrices, apportera des éléments déterminants pour comprendre l’origine de certains symptômes observés dans les pathologies inflammatoires de la moelle épinière. À long terme, ce projet contribuera à identifier des biomarqueurs mesurables dans le LCR permettant de suivre l’évolution et la réponse aux traitements. Les connaissances acquises ouvriront également la voie à des stratégies thérapeutiques visant à limiter les effets de l’inflammation et à favoriser la régénération tissulaire.
Procédures
Selon les cas, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : # Trois injections sous-cutanées d’une émulsion composée d’une protéine et d’une substance qui active le système immunitaire, sous anesthésie : 10 minutes. # Deux injection intrapéritonéales ou sous-cutanées d’une toxine : moins d’une minute. # Cinq injections sous-cutanées d’un composé pharmacologique une fois par jour pendant 5 jours : moins d’une minute. # Injection dans la moelle épinière d’outils génétiques chez la souris nouveau-née sous anesthésie → induction anesthésie : 10 min - chirurgie : 10 min - surveillance post-op : 20 min - séparation de la mère : 3h. # Injection dans les ventricules du cerveau d’un virus (non pathogène) chez la souris adulte sous anesthésie → induction anesthésie : 5 min - chirurgie : 30 minutes - surveillance post-op : 1h - l’animal est en dehors de la zone de stabulation pendant 2 à 4h. # Prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Injection d’un traceur dans les ventricules du cerveau sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Test comportementaux : - Etude la miction : 4h. - Activité locomotrice spontanée : 40 minutes. - Poutre d’équilibre : 3/5 x 5 minutes. - Tapis roulant : 30 minutes.
Impact sur les animaux
1\ L’injection de l’émulsion composée d’une protéine et d’une substance qui active le système immunitaire associée à l’injection de la toxine entraîne un état inflammatoire chronique, associé à des déficits moteurs progressifs dont la sévérité peut varier selon les animaux. 2\ Les injections sous-cutanées quotidiennes d’un composé pharmacologique pendant cinq jours consécutifs peuvent provoquer du stress lié aux manipulations répétées. 3\ Les interventions chirurgicales sont susceptibles de générer des douleurs et un inconfort après l’intervention. 4\ Les tests comportementaux peuvent induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. Certains tests sont peu contraignants (étude de la miction ou locomotion spontanée), tandis que d’autres demandent plus d’effort aux animaux (poutre d’équilibre, tapis roulant).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de la moelle épinière et analyses.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier la plasticité de la zone de la moelle épinière en contact avec le LCR en contexte neuro-inflammatoire chronique et ses conséquences sur différentes fonctions de l’organisme. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre cellules et circulation du LCR qui ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire ou par des modèles informatiques. De plus, certaines fonctions comme la miction ou la locomotion nécessitent l’étude d’un organisme entier. Ce projet ne peut pas être réalisé chez l’humain car il implique l’analyse des extractions de moelle épinière. L’utilisation de la souris est indispensable car elle permet d’utiliser des outils génétiques précis adaptés aux objectifs du projet.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés soit à partir de notre expérience, soit à partir d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire. Pour les tests comportementaux (miction et locomotion), les mêmes animaux seront suivis à différents temps post-inflammation, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Ces animaux seront ensuite utilisés pour des analyses post-mortem, ce qui maximise les informations obtenues à partir de chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-4 animaux par cage) et enrichies (maison, buchettes, tunnel, …). Nous leur fournirons une grande quantité de matériel de nidification quelques jours avant l’induction de la neuro-inflammation afin qu’ils puissent avoir des zones de température différentes au sein de la cage. Après l’induction, ils auront accès à des friandises et/ou du gel nourrissant et/ou des croquettes mouillées en plus de leur nourriture habituelle. Toutes les injections (hormis les injections dans les ventricules du cerveau et dans la moelle épinière) se feront par voie sous-cutanée afin d’éviter la voie intrapéritonéale, plus douloureuse et moins reproductible. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie appropriée avec analgésie systématique par du personnel expérimenté. Pour limiter le stress et l’inconfort liés aux injections sous-cutanées quotidiennes de composés pharmacologiques sur cinq jours, nous essaierons de mettre en place l’administration volontaire par micro-pipette (composé dilué dans une solution appétente). Pour les tests comportementaux, les animaux seront habitués à la pièce / cage d’expérimentation la semaine précédant l’induction de la neuro-inflammation (3 séances de 30 min – 1h). Nous ferons attention à ce que les animaux soient toujours en présence d’odeurs familières (litière de leur cage d’origine).
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus pertinente pour notre étude car ce modèle est maîtrisé au sein de notre équipe et permet l’utilisation de lignées génétiquement modifiées. Ces modèles permettent de cibler précisément certains types de cellules. Les animaux utilisés seront des souris femelles adultes (8-14 semaines), car à cet âge le modèle de neuro-inflammation chronique est fiable et reproductible. Les injections chez les nouveau-nés seront réalisées précocement car les outils utilisés sont plus efficaces à ce stade.
Etude de l’effet du toucher social pendant l’enfance sur la résilience au stress: implication de la voie PVNOT-VTA
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
496 souris vont être utilisées dans une étude sur le toucher social pendant l'enfance, 320 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un isolement social de quatorze jours après le sevrage, une chirurgie du cerveau, puis jusqu'à six heures d'électrophysiologie sous anesthésie et des séances de contention. Toutes sont tuées à la fin pour vérifier les injections et analyser le cerveau, hormis les souris démonstratrices, réutilisées jusqu'à deux fois puis gardées pour d'autres expériences. Le projet cherche à comprendre comment une caresse sur la peau au stade juvénile modifie les circuits de l'anxiété.
Objectifs
Les troubles anxieux touchent entre 15 et 20% de la population, les femmes plus que les hommes, et peuvent avoir des conséquences parfois invalidantes pour les personnes qui en souffrent. La qualité de l’environnement psychosocial (présence d’une cellule familiale solide sans violence physique/psychologique/sexuelle) et émotionnel (relation parents/enfant, cercle familial et amical) dans lequel un individu grandit et évolue constitue un des éléments clés favorisant sa capacité à faire face à un épisode de stress, sans développer de troubles anxieux en réponse à cet épisode. Ce phénomène de « résistance » au stress est appelé résilience. De l’enfance à l'adolescence, chaque individu traverse une période charnière permettant la maturation et le bon fonctionnement des régions du cerveau participant à la régulation émotionnelle. Des recherches récentes menées chez l’humain ont montré que les thérapies basées sur le toucher donnaient des résultats encourageant sur la diminution du sentiment d’anxiété, suggérant un rôle important, bien que très peu compris, du toucher dit social/affectif (TS/A) dans la régulation émotionnelle. En stimulant les neurones à ocytocine, une molécule clé de la régulation émotionnelle, le TS/A entraîne l’activation de l’aire tegmentale ventrale, une région dopaminergique régulatrice de l’anxiété. Ce projet de recherche, conduit sur un modèle murin, vise ainsi à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels le TS/A, via l’activation des neurones ocytocinergiques, régule la réponse au stress de l'aire tegmentale ventrale et favorise la résilience. Les régions cérébrales ciblées dans ce projet étant connues pour montrer des différences en fonction du sexe des individus, la prise en compte de ce paramètre est un point central de ce projet, et apportera de nouvelles connaissances qui permettront de mieux comprendre la surreprésentation des femmes parmi la population de personnes affectées par des troubles anxieux.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux font partis des troubles psychiatriques les plus communs mais leurs causes complexes et variées rendent ces troubles encore difficiles à soigner. Les approches thérapeutiques actuelles (psychothérapie couplée ou non à traitement pharmacologique de type anxiolytiques/antidépresseurs) imposent une mise au point longue et fastidieuse pour trouver une approche adaptée aux besoins de chaque patient, et nécessite donc une prise en charge de longue durée, aux résultats variables. Bien que les études chez l’humain apportent des connaissances essentielles quant à l’importance des liens sociaux dans la santé mentale et la résilience, l’essentiel des recherches se sont plutôt concentrées sur les effets délétères de l’absence de lien social (notamment les interactions parents/enfants), et ont laissé de côté l’étude des effets bénéfiques et protecteurs des liens sociaux sur la santé mentale. En identifiant les mécanismes biologiques de l’anxiété sensibles au TS/A, ce projet de recherche ouvrira de nouvelles perspectives aussi bien préventives que thérapeutiques sur la prise en charge des troubles anxieux.
Procédures
Protocole d'isolement social : 14 jours consécutifs - Chirurgie stéréotaxique : 1h30-2h - Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié: 4-6h - Stress de contention : 30 min - Tests comportementaux: 20 min répétés 7 fois maximum
Impact sur les animaux
Plusieurs types d’effets indésirables pourraient être observés chez les animaux de cette étude. Ces effets comprennent : 1) un risque de douleur au moment de la chirurgie et dans les jours post-opératoire ; 2) un risque d’infection lié aux chirurgies ; 3) un stress induit par les tests de comportements choisi ; 4) un stress induit par le protocole d’isolement social; 5) le stress de contention.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, soit pour vérifier la qualité des injections stéréotaxiques/pose d'implant, soit pour procéder à des analyses post-mortem de type immunohistochimie ou quantification des projections neuronales. Les animaux démonstrateurs seront en partis utilisés à plusieurs reprises (2 fois maximum) lors des tests. Les animaux démonstrateurs pourront être réutilisés ultérieurement.
Remplacement
Ce projet se base sur une approche intégrative développementale, permettant de comprendre comment un stimulus périphérique tel que le TS/A (qui correspond à une caresse sur la peau) au stade juvénile peut remodeler à long terme les circuits neuronaux en charge de la régulation du stress et de l’anxiété sur le long-terme. Ainsi, cet objectif et les techniques nécessaires pour y répondre (injections pour du traçage neuronal/marqueur de population neuronale/biocapteur ; comportement ; enregistrements électrophysiologique) ne peuvent se faire que sur animal se comportant, à plusieurs stades de sa vie, et ne peut donc pas être remplacé par un modèle « in vitro ».
Réduction
L’essentiel des protocoles expérimentaux nécessaires à la réalisation de ce projet reposent sur des techniques utilisées en routine dans l’équipe. Cette expérience permet une estimation précise de la taille des échantillons nécessaires pour l’obtention de résultats fiables, et d’analyses statitisques robustes sans surestimation. Par ailleurs, la taille des groupes a été confirmé grâce à des analyses statistiques basées sur des calculs de puissance. Par ailleurs, pour chaque expérience l’échantillon d’animaux prévu sera divisé en plusieurs lots. Les résultats obtenus à partir de chaque lot seront analysés dans la foulée, ce qui permettra d’ajuster à la baisse la taille du lot suivant (et donc le nombre d’animaux nécessaires) si besoin. Par ailleurs, les femelles et les mâles seront utilisés, limitant la production d’animaux non-utilisés. Si les résultats préliminaires ne montraient aucun différence entre les mâles et les femelles, ce facteur d'analyse serait alors abandonné, entrainant une reduction drastique du nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Plusieurs procédures de raffinement seront mis en place pour maximiser le bien-être des animaux, dans le cadre des contraintes de ce projet : 1) l’établissement de points limites précis et de procédures de prises en charge associés misent en place dès que les points limites sont atteints ; 2) chaque animal bénéficiera de suivi post-opératoire pour assurer la mise en place de soins adéquats pendant et après les opérations et chaque interventions invasives sera réalisée sous anesthésies/analgésie ; 3) l’hébergement en cage collective sera privilégié, sauf pour les animaux soumis au protocole d’isolement social ; 4) ; la mise a disposition systématique d’enrichissement (tube en carton) et de matériel pour le nid dans chaque cage ; 5) afin de diminuer le stress lié à chaque manipulation, les animaux seront habitués à être sorti de la cage et posé dans la main de l’expérimentateur avant chaque procédure comportementale ; 6) un temps de repos de minimum une semaine sera assuré après intervention chirurgicale avant de poursuivre le protocole expérimental afin de laisser les animaux se reposer et minimiser le stress ; 7) un délai de 24h sera établi entre chaque tests comportementaux afin de maximiser le temps passer chaque jour par les souris dans leur cage d’hébergement et de minimiser le temps de solicitation afin de réduire le stress. Par ailleurs, les souris seront hébergées en cycle inversé de façon à ce que chaque étape des protocoles soient réalisées en phase nocturne, c’est-à-dire pendant la phase naturelle active des animaux. L’utilisation du cycle inversé permettra donc d’éviter de perturber les animaux pendant leur phase de sommeil. Les animaux bénéficieront du suivi journalier par les zootechniciens ce qui permettra de détecter rapidement l’apparition de symptômes négatifs, et donc une prise en charge rapide. Ce suivi sera encore plus poussé pendant la période péri-opératoire, lors de laquelle des analgésiques pourront être administrés en cas de douleur, et renouveller 24h plus tard si besoin. Si au bout de 3 jours, malgré l’administration répétée d’analgésiques, les signes de douleurs persistent, l’animal sera euthanasié. Par ailleurs, avant le début de chaque procédure, le poids et la taille des animaux sera contrôlé : tout animal qui trop petit ou trop faible sera exclu de facto de l’échantillon.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré une grande convergence anatomique et fonctionnelle du système nerveux à l’origine de la détection cutanée du TS/A, et des zones cérébrales activées suite au TS/A chez l’humain et la souris. Par ailleurs, le système ocytocinergique, qui est au coeur de notre étude, montre un niveau de conservation très important chez les mammifères. Ces similarités entre la souris et l’humain assureront la validité translationnelle des résultats obtenus dans notre étude et apporteront donc des connaissances nouvelles bénéfiques aux améliorations de la prise en charges des troubles anxieux. Par ailleurs, la souris est un modèle animal permettant la mise en place de méthodes invasives bien maitrisées par l’équipe. Ce projet se concentre sur le rôle du TS/A pendant l'enfance sur la capacité, à l'adolescence, de développer une résilience au stress. En effet, l'enfance et l'adolescence/début de l’âge adulte sont des périodes clé dans le développement cérébral et sont donc particulièrement sensibles au stress. Cette sensibilité au stress et donc au développement de troubles anxieux est vrai aussi bien chez la souris que l'humain. Ce projet cherche se concentre donc sur ces deux périodes développementales. Le protocole de TS/A, selon le protocole préalablement établi et publié, est effectué chez des souris juvéniles (P15-P19). Quant au protocole d’isolement social, il intervient au premier jour de sevrage des souris juvéniles (P21), et ce pour une durée de 14 jours. Les procédures de chirurgie stéréotaxique nécessitent d'être réalisées avant les tests comportementaux, et sont donc réalisées chez des souris de 6-10 semaines. Les tests comportementaux sont quant à eux faits chez des souris de 8-12 semaines.
Cartographie 3D de l’innervation des cancers du pancréas et de leurs métastases hépatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Les souris porteuses de tumeurs sont tuées avant l'apparition des signes cliniques terminaux. 160 souris génétiquement modifiées, qui développent spontanément un cancer du pancréas, sont utilisées dans ce projet, 133 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et les autres tuées sous anesthésie sans réveil. Leurs organes sont prélevés pour reconstituer en 3D les réseaux nerveux de la tumeur et de ses métastases dans le foie. L'équipe affirme qu'aucune méthode sans animal ne recrée un environnement tumoral complet ni la dissémination spontanée des métastases.
Objectifs
L’adénocarcinome canalaire du pancréas est un cancer particulièrement agressif, pour lequel les chances de survie restent faibles. Il se développe dans un environnement tumoral complexe, composé de nombreuses cellules et structures non cancéreuses. Parmi celles-ci, la présence de fibres nerveuses est fréquemment observée et associée à une évolution défavorable de la maladie, suggérant que les nerfs jouent un rôle actif dans sa progression. Les méthodes actuellement utilisées pour étudier les tissus tumoraux reposent principalement sur l’observation de fines coupes au microscope. Elles permettent de détecter la présence de fibres nerveuses, mais ne donnent pas une vision globale de l’organisation des réseaux nerveux à l’échelle de la tumeur entière et ne permettent pas de déterminer avec quelles structures et cellules ces fibres interagissent. Pour dépasser ces limites, nous avons développé une méthode d’imagerie tridimensionnelle (3D) appliquée à des pancréas entiers rendus transparents. Cette approche permet de visualiser les structures internes du tissu sans le découper et d’obtenir une reconstruction complète et détaillée des réseaux nerveux et de leurs connexions. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent spontanément des cancers du pancréas. Le premier objectif est de dresser une carte 3D précise des différents types de fibres nerveuses présentes dans les tumeurs pancréatiques et d’identifier leurs contacts avec les cellules cancéreuses et les autres composants de l’environnement tumoral. Le second objectif est d’adapter ces techniques d’imagerie 3D à d’autres organes, en particulier le foie, afin de visualiser les métastases issues du cancer du pancréas et de déterminer si elles sont, elles aussi, associées à des fibres nerveuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, une visualisation en 3D des réseaux nerveux présents dans les tumeurs du pancréas et dans leurs métastases au niveau du foie. Ces résultats contribueront à une meilleure compréhension du rôle des nerfs dans le développement et la dissémination du cancer du pancréas. À plus long terme, ces connaissances pourront favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les interactions entre les nerfs et les tumeurs, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux sont d’abord entièrement endormis grâce à une anesthésie générale, afin qu’ils ne ressentent ni douleur ni stress. Une fois profondément endormis, ils sont euthanasiés de manière contrôlée, ce qui permet de prélever et de préserver correctement leurs organes pour les analyses en microscopie 3D.
Impact sur les animaux
Ce projet utilise des souris qui développent spontanément des tumeurs pancréatiques. Durant les premières phases de développement tumoral, aucun signe clinique de douleur ou de détresse n’est observé, bien qu’une gêne localisée au niveau de la tumeur puisse apparaître. En phase terminale, l’état général des animaux se dégrade rapidement. Dans ce projet, les animaux porteurs de tumeurs seront étudiés avant l’apparition de ces signes cliniques associés aux stades terminaux de la maladie.
Devenir
Les animaux seront endormis puis euthanasiés afin de prélever leurs organes
Remplacement
Il n’existe actuellement aucun moyen de remplacer l’utilisation des animaux pour ce projet. Pour comprendre comment les nerfs s’organisent à l’intérieur des tumeurs du pancréas et des métastases qui se développent dans le foie, il est indispensable d’étudier des organes entiers dans leur environnement naturel. Les méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires, les mini-tumeurs en 3D ou les systèmes artificiels, ne permettent ni de recréer l’ensemble de l’environnement tumoral, ni de former des réseaux nerveux matures, ni d’observer la dissémination spontanée des cellules cancéreuses d’un organe à l’autre, comme cela se produit lors de la formation de métastases.
Réduction
Chaque organe prélevé sera analysé pour plusieurs marqueurs simultanément, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires a été estimé à l’aide de méthodes statistiques adaptées aux études exploratoires et descriptives.
Raffinement
Les souris développant des tumeurs sont générées uniquement en nombre strictement nécessaire aux besoins de l’expérimentation. Les animaux sont élevés en petits groupes dans des cages enrichies avec des tunnels, du coton et des dômes afin de favoriser leur bien-être. Une attention particulière est portée à la détection des signes cliniques de douleur. Dès l’apparition de tels signes, une surveillance renforcée est mise en place et les seuils de points limites prédéfinis sont strictement respectés. Lors de la procédure finale destinée au prélèvement des organes, les animaux reçoivent d’abord un traitement antidouleur, puis un anesthésique. La procédure est réalisée uniquement lorsque l’animal est complètement endormi et ne présente plus de réaction. Elle est effectuée dans une salle dédiée, séparée de la zone d’hébergement des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux utilisés dans ce projet ont été largement étudiés et reproduisent de manière fiable les principales étapes du développement du cancer du pancréas chez l’humain. Ils sont couramment utilisés en recherche préclinique. Les organes seront prélevés à des stades précisément définis de la maladie, caractérisés par la présence de tumeurs et d’éventuelles métastases, mais avant l’apparition de signes cliniques de douleur. Ces stades ont été déterminés sur la base de nos données préliminaires.
Nouvelles thérapies anti-inflammatoires et pro-résolutives dans des modèles d’inflammation aigue et chronique de l’intestin chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une colite est provoquée chez 832 souris par un agent chimique irritant administré dans l'eau de boisson ou par voie intra-rectale, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré. Le RNT décrit pourtant une perte de poids supérieure à 10 pour cent, des diarrhées, une prostration et des signes de douleur au plus fort de l'inflammation. Toutes les souris seront tuées par dislocation cervicale pour prélèvements, certaines plus tôt si les points limites sont atteints. Le projet teste des molécules censées activer la résolution de l'inflammation, un essai chez l'humain restant une perspective lointaine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation, tout en limitant l’inflammation persistante et la fibrose, dans des pathologies caractérisées par un déficit de ces mécanismes. Depuis quelques années, il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), sont liées à un échec de la résolution de l’inflammation. Les traitements actuels (corticoïdes, immunomodulateurs) agissent principalement en bloquant l’initiation de l’inflammation, ce qui entraîne des effets secondaires importants. De plus, près de 60 % des patients présentent un échappement primaire ou secondaire à ces traitements, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients résistants ou en échec. Chez les patients atteints de MICI l’absence de résolution de l’inflammation en dépit des traitements existant est la première cause d’échec thérapeutique, ce qui entraine une persistance de l’inflammation, un développement de fibrose et à des symptômes invalidants comme la douleur, les diarrhées chroniques ou un impact sur la qualité de vie et la santé mentale. Notre projet vise à tester, chez la souris, des molécules innovantes capables d’activer ces voies de résolution lorsque celles-ci sont défaillantes, tout en réduisant l’inflammation chronique et en limitant la fibrose, qui constitue une complication majeure des MICI et d’autres pathologies inflammatoires. Les molécules sélectionnées auront été validées in vitro au préalable. Nous comparerons ensuite nos traitements à des références établies dans chaque modèle, où l’efficacité sera mesurée par une accélération de la résolution de l’inflammation, une réduction des lésions tissulaires et une diminution des marqueurs de fibrose, par rapport à un groupe contrôle. 832 animaux pourront être utilisés, ce qui garantit une puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux conformément aux principes des 3R.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont actuellement traitées principalement par trois types de médicaments : les corticoïdes, les traitements qui diminuent l’activité du système immunitaire et des thérapies ciblées plus récentes. Les corticoïdes permettent de réduire rapidement l’inflammation, mais leur utilisation prolongée peut entraîner des effets indésirables importants, tels qu’une prise de poids, une augmentation de la pression artérielle, des perturbations hormonales et des troubles du métabolisme du sucre. Les traitements immunosuppresseurs, qui réduisent de façon globale les défenses immunitaires, exposent quant à eux les patients à un risque accru d’infections. Les thérapies ciblées, utilisées lorsque les traitements précédents ne sont plus efficaces, agissent sur des mécanismes précis de l’inflammation intestinale et permettent de ralentir l’évolution de la maladie. Toutefois, environ six patients sur dix ne répondent pas durablement à ces approches, un phénomène également observé dans les modèles animaux. De plus, ces traitements peuvent eux aussi augmenter la sensibilité aux infections. Afin de répondre à ces limites, nous avons développé une nouvelle molécule innovante visant à stimuler les mécanismes naturels de résolution de l’inflammation plutôt qu’à inhiber globalement le système immunitaire. Dans des modèles expérimentaux de colite chez l’animal, nous espérons observer une récupération plus rapide du poids, une amélioration des symptômes digestifs, ainsi qu’une amélioration de l’aspect du côlon, indicateur d’une inflammation réduite. L’objectif est de restaurer une morphologie intestinale proche de la normale. Si ces résultats sont confirmés chez l’animal, nous envisageons à terme un essai clinique chez l’Homme, destiné aux patients pour lesquels les traitements actuels ne sont plus efficaces, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Procédures
Chirurgie : Pas de chirurgie ni sutures. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés à J0 pour induire le modèle (protocole 3) par injection intra-rectale à raison d’un maximum de 280 souris. Un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sur des animaux vigiles à hauteur d'une fois par semaine maximum pourra être envisagé (50µL par prélèvement). Cette procédure peut concerner l’ensemble des animaux à savoir un maximum de 832 souris. Les traitements
Impact sur les animaux
Modèle 1 : colite induite par un polysaccharide administré dans l’eau de boisson L’administration orale d’un agent chimique irritant entraîne une augmentation de la perméabilité de la paroi du tube digestif, provoquant une inflammation localisée du côlon, comparable à la rectocolite hémorragique observée chez l’Homme. Ce modèle se traduit par une perte de poids et l’apparition de diarrhée, évaluée à l’aide d’un score compris entre 0 et 4. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë de l’inflammation, puis tous les deux jours par la suite. Lorsque le score de diarrhée atteint 3, celle‑ci s’accompagne généralement d’une prostration, d’une diminution de l’activité et de signes de douleur. Ces manifestations cliniques, associées à la perte de poids, apparaissent généralement entre le septième et le dixième jour après le début de l’induction, avant une récupération rapide, les animaux retrouvant leur poids initial vers le vingtième jour. Le score de diarrhée égal à 3 correspond à un épisode transitoire, observé sur une courte période, avec une amélioration progressive. Durant la phase la plus sévère, les animaux sont suivis quotidiennement et un traitement analgésique est administré afin de limiter la souffrance. Modèle 2 : colite induite par administration locale d’un agent inflammatoire L’administration locale d’un agent inflammatoire associé à un solvant provoque une augmentation de la perméabilité de la paroi colique et un recrutement important de cellules immunitaires. Ce modèle induit une perte de poids supérieure à 10 % ainsi qu’une diarrhée modérée. Les symptômes apparaissent dès le lendemain de l’administration et s’améliorent rapidement à partir du troisième jour. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’étude et un traitement analgésique est administré du jour de l’induction jusqu’au troisième jour afin de limiter la douleur.
Devenir
L’ensemble des 832 souris seront mis à mort par dislocation cervicale en fin d’expérimentation pour effectuer des prélèvements biologiques à des fin d’analyse cellulaire ou tissulaire. Au cours d’une des procédures décrites ci-dessus il se peut également que des animaux soient mis à mort précocement si des points limites sont atteints, que ce soit lié à la pathologie elle-même ou aux traitements si leur efficacité s’avère futile.
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal. Les études pilotes sur un nombre restreintes d’animaux et sans traitements thérapeutiques permette de valider la mise en place du modèle dans les conditions d’hébergement de l’animalerie. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons tout d'abord déterminé la différence attendue entre le groupe contrôle et le groupe traité ainsi que l'écart-type des échantillons grâce à des expériences précédentes. Ceci nous a permis d'obtenir la variante d= 0.79. Pour un test statistique bilatéral n=22 animaux sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. Les protocoles sont planifiés afin d’éviter le stress à l’animal et les points limites définis sont bien intégrés afin d’anticiper toute souffrance inutile. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de la buprénorphine dans l’eau de biberon (0.003mg/mL). Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie par un mélange d’air/isoflurane 4%. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur souffrance. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton. Pour finir, si des animaux montrent des difficultés pour s'alimenter, des croquettes mouillées seront mise au fond de la cage.
Choix des espèces
Afin d’étudier différents mécanismes de l’inflammation chez l’animal vivant, nous utiliserons des souris appartenant à plusieurs lignées connues pour leur sensibilité aux modèles de colite induite chimiquement. Ces lignées présentent des niveaux d’inflammation plus ou moins marqués, ce qui permet d’adapter la sévérité du modèle aux objectifs de l’étude. Le choix de la lignée dépend également du traitement testé, certains agissant uniquement chez des animaux exprimant la cible biologique concernée. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.