Souris

640 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, jusqu'à quarante mesures de la tumeur et jusqu'à trente administrations de chimiothérapie et d'immunothérapie, avant d'être tuée pour analyse des organes. Le projet cherche à valider une protéine comme cible pour rendre l'immunothérapie plus efficace contre le cancer. Les groupes de seize animaux sont justifiés par la robustesse statistique, le bénéfice pour les patients restant une perspective générale.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’effet de l’activation ou de l’inhibition d’un mécanisme biologique impliqué dans le développement des tumeurs et dans le fonctionnement du système immunitaire, dans un modèle murin. Des résultats préalables montrent que l’inhibition de ce mécanisme ralentit la croissance des tumeurs lorsque les défenses immunitaires de l’organisme sont fonctionnelles, ce qui suggère une interaction entre ce mécanisme et le système immunitaire. Cette modulation est également associée à des changements dans l’activité de certaines cellules immunitaires présentes dans la tumeur. L’objectif principal est d’évaluer les effets de cette modulation, seule ou en association avec des traitements anti-tumoraux de référence, dans des conditions où l’activité de ces cellules immunitaires est diminuée. Cela permettra de préciser leur rôle dans le contrôle de la croissance tumorale. Plus largement, ce projet vise à mieux comprendre comment ce mécanisme biologique influence les défenses immunitaires contre les tumeurs et l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Dans le monde, le cancer est la deuxième cause de décès, avec près de 10 millions de morts chaque année. Pour lutter contre cette maladie, les traitements les plus couramment utilisés sont la chimiothérapie et la radiothérapie. Ces thérapies agissent directement sur les cellules cancéreuses pour les détruire. Toutefois, elles peuvent parfois provoquer des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces chez tous les patients. L’immunothérapie représente une approche différente : elle vise à stimuler le système immunitaire du patient afin qu’il reconnaisse et élimine lui-même les cellules cancéreuses. Ces dernières années, cette stratégie a connu de grandes avancées et a permis des succès encourageants. Cependant, l’immunothérapie ne fonctionne pas encore pour tous les types de cancer, et nous ne comprenons pas toujours pourquoi certains patients ne répondent pas à ce traitement. Ce projet de recherche permettra de valider de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de trois minutes par animal, 1 fois). Toutes les souris vigiles seront soumises à l’évaluation de la croissance tumorale par une méthode non invasive (5 minutes par animal, 2 fois par semaine, 40 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des traitements anti-tumoraux administrés sur animaux vigiles (moins d’une minute par souris par administration). Une administration unique de chimiothérapie sera réalisée en début de traitement. Les traitements immunologiques seront ensuite administrés selon les schémas suivants : une administration quotidienne pendant 6 jours consécutifs, puis une administration hebdomadaire, ou une administration hebdomadaire seule selon les groupes expérimentaux. Le nombre total d’administrations ne dépassera pas 30 par animal. A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimio- et immuno-thérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert une induction tumorale, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement stimulant le système immunitaire dans un contexte de thérapie anti-cancéreuse. Notre protéine cible a été identifiée grâce à une étude de transcriptomique. Nous souhaitions évaluer notre hypothèse in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de l’immuno-stimulation et ses mécanismes vu sa complexité.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, des groupes de seize souris (huit femelles et huit mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés pour un total de 640 animaux. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées, dans une pièce dédiée distincte de la zone d’hébergement des animaux. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, etc...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. La souris présente l’avantage de disposer de nombreux modèles génétiquement modifiés permettant d’analyser de façon spécifique le rôle de certains mécanismes biologiques dans les processus étudiés. Cette disponibilité constitue un élément déterminant pour répondre aux objectifs du projet. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de six semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en groupes d'âge de deux à dix-neuf mois. Chacune subit gavages, injections dans le muscle de la cuisse, tests d'effort et prélèvements sanguins, certaines étant transportées entre deux établissements, pour étudier le lien entre la graisse intramusculaire et le métabolisme du muscle. Les retombées pour la santé humaine, fragilité musculaire liée à l'âge ou à l'obésité, sont annoncées "à plus long terme". Le porteur reconnaît qu'aucun calcul de puissance n'a été possible et que l'effectif repose sur ses habitudes expérimentales.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Les souris sont mises à mort dès l'apparition des signes tumoraux, "avant leur mort naturelle", après irradiation, injections répétées et prélèvements sanguins. 828 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et cellules. Le modèle vise à reproduire un lymphome agressif, le lymphome diffus à grandes cellules B, et à tester de nouvelles thérapies. L'effectif de 828 animaux repose sur la gestion externe de l'élevage et des "statistiques prédictives", sans calcul de puissance détaillé dans le résumé.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus fréquent et le sixième cancer le plus fréquent au monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B repose sur la chimiothérapie ou la greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (rechute) ou n’y répondent pas (maladie réfractaire), ce qui a généralement des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles expérimentaux reproduisant fidèlement le lymphome diffus à grandes cellules B. L’objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l’aide d’un nouveau modèle murin permettant de suivre l’initiation et la progression de la maladie. Ce modèle nous permettra d’étudier les causes du développement du lymphome et sera également utilisé pour des applications précliniques, notamment pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies contre ces lymphomes agressifs.

Bénéfices attendus

Nous allons générer des informations importantes sur les gènes et les voies de signalisation impliquées dans l'apparition et la progression du lymphome diffus à grandes cellules B, actuellement inconnus. De plus, ces modèles nous permettront de réaliser des études précliniques, afin d'identifier de nouvelles façons d'activer et de stimuler le système immunitaire de l'hôte, et de tester de nouvelles thérapies afin d'améliorer les traitements contre les cancers du sang.

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront suivies. Elles seront manipulées deux fois par semaine pour être pesées et observer les signes de formation tumorale : perte de poids, diminution de l’activité, posture voûtée, pelage ébouriffé, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Des prélèvements tissulaires seront effectués afin de déterminer les causes de la formation tumorale et de constituer une biobanque. Certaines souris recevront une injection d’une minute pour être immunisées (toutes les 3 semaines, jusqu’à 8 injections). Certaines souris subiront une déplétion de la moelle osseuse par irradiation une seule fois, ce qui peut engendrer une détresse et une agitation. Ils recevront ensuite une injection d'une minute pour transférer des cellules de moelle osseuse, et une prise de sang sera effectuée 3 et 6 semaines plus tard pour vérifier la reconstitution de la moelle osseuse. Et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Des prélèvements sanguins seront effectués sur les souris au début et à la fin du traitement afin d'analyser leur numération sanguine. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 30 max - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 max - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 28 max - Prélèvement sanguin : durée = 1 minute / nombre = 4 - Irradiation : durée 10min / nombre = 1

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou mouvements lents. De plus, la manipulation des souris lors de la surveillance, de l’irradiation ou des injections peut induire du stress. Une inflammation peut également survenir au point d’injection. Les injections et les prélèvements sanguins provoquent aussi du stress et une légère douleur passagère.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des cellules pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.

Réduction

L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.

Raffinement

Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Et si les souris présentent des signes de détresse suite à toute intervention, nous renforcerons la surveillance.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules malignes et pré-malignes dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement du lymphome, les souris seront âgées jusqu'à l'âge de 8 mois, correspondant à la période de latence de cette maladie d'après nos études précédentes. Pour les expériences de transfert cellulaire, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont utilisées comme souris receveuses.

Tuées pour extraire les émetteurs implantés et les renvoyer au fournisseur, 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque souris reçoit un émetteur miniaturisé mesurant l'activité cérébrale, et certaines développent une forme de narcolepsie avant de recevoir des traitements par voie orale. Hébergées seules pour éviter qu'elles n'abîment les implants, elles servent à évaluer de nouveaux candidats médicaments agissant sur le système nerveux. Le porteur annonce ces données comme "indispensables" avant un éventuel passage en clinique, bénéfice renvoyé au long terme.

Objectifs

L'électroencéphalographie (EEG), technique permettant de mesurer l’activité électrique du cerveau, s'est très largement répandue au sein des laboratoires pour différencier précisément les effets des molécules actives sur le système nerveux et aider ainsi à leur classification thérapeutique (hypnotiques, sédatifs, tranquilisants, psychotropes, anti-épileptiques...). Vers les années 2000, la technique a fortement évolué avec l'apparition d’émetteurs miniaturisés implantables (télémétrie), permettant de mesurer, chez la souris et sans contrainte filaire, les activités électriques cérébrales et musculaires, la température corporelle, l’activité motrice ; soit en condition basale, soit en réactivité à des stimulations. Ainsi, en étudiant les modifications des signaux EEG, il est possible d’en déduire l’état de vigilance de l’animal : par exemple, en éveil (actif / passif) ou endormi (sommeils léger / profond / rêves). Ce projet vise à poursuivre nos travaux de recherches en évaluant les effets de nouveaux candidats médicaments sur les enregistrements EEG/Température/Activité, chez la souris normale ou développant des pathologies proches de certaines pathologies humaines rares altérant la vigilance comme la narcolepsie à l'origine d'endormissements anormaux arrivant alors que la personne est active durant sa journée. Bien qu’il soit nécessaire d’individualiser les souris, la télémétrie permet de réaliser ces mesures, à distance, sans présence humaine, sur des animaux non contraints et gardés dans leur environnement d’hébergement, limitant ainsi les facteurs de stress et d’anxiété liés aux manipulations expérimentales.

Bénéfices attendus

En comparaison aux effets connus sur l'activité cérébrale chez la souris de produits déjà commercialisés, ce projet permettra d’évaluer de nouvelles molécules issues de la recherche agissant sur le Système Nerveux Central. Dans le cadre d’une évaluation sur la souris narcoleptique, ce projet permettra d'évaluer la capacité des composés à diminuer la survenue des épisodes de somnolence. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques indispensables au processus de recherche de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de développement d’un candidat pour des tests cliniques réalisés chez l'homme.

Procédures

Jeunes adultes, sous anesthésie générale, les animaux recevront un émetteur miniaturisé pour enregistrer le fonctionnement du cerveau selon les méthodes établies pour l'espèce. Certains animaux développeront en grandissant une pathologie proche de la pathologie humaine – envie de dormir, apparition de rêves pendant leur activité, perte de tonus, parfois obésité - dont les symptômes seront évalués et potentiellement diminués par les traitements (donnés oralement, de façon aigue, à une fréquence d'une administration tous les 3 à 4 jours et une semaine sans traitement chaque mois). L'expérience nous a montré qu'il était préférable que les animaux restent hébergés individuellement pour limiter l'agressivité entre eux.

Impact sur les animaux

A réception dans nos locaux, les nuisances attendues sur les animaux soumis à ce projet seront les nuisances liées au développement spontané de la pathologie pour les souris narcoleptiques, les problèmes potentiels de tolérance aux produits qui seront administrés (amertume, acidité, fréquence et répétition des traitements), le stress lié à l'individualisation de l'hébergement ou encore celui provoqué lors de la manipulation des cages, la contention puis l'administration orale des produits.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour extraire les télémètres et les retourner chez le fournisseur en vue de leur reconditionnemnt pour réutilisation.

Remplacement

L'étude des mécanismes impliqués lors des phases d'éveil/sommeil et les transitions anormales d’un état vers un autre ne peut se faire que sur des animaux vivants et ayant développé la pathologie étudiée. A ce jour, la littérature ne fournit pas de méthode alternative suffisamment développée pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Au départ, une cohorte implantée comprend un effectif maximum de 18 animaux opérés. Environ 4-5 semaines après la chirurgie, les effets de nombreux composés à différentes doses pourront être étudiés sur une durée maximale de 12 mois. Ce nombre d'animaux permet par ailleurs d'obtenir des tests statistiques robustes. Les produits testés seront comparés entre eux et aux mêmes références pour limiter le nombre d’expériences. La détection des vigilances est entièrement automatisée pour gagner en rapidité d’analyse et supprimer toute subjectivité de l’opérateur quant aux résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement en cage ouverte dans une pièce qui leur est dédiée (avec température et hygrométrie contrôlées). Hors période d’acquisition et pour réduire le stress de l’individualisation, les cages sont rapprochées les unes des autres sur le portoir afin de favoriser les contacts olfactifs et visuels entre individus. Après livraison dans nos locaux, une période de quelques semaines d'acclimatation est prévue pour s’assurer de la reprise d’un cycle éveil/sommeil régulier avant toute expérimentation ; durant cette phase, les souris sont aussi habituées à être manipulées fréquemment par l’expérimentateur chargé des traitements. Tout au long de l’étude, les animaux disposent d'un milieu fortement enrichi (tunnel suspendu ou pas, igloo surmonté d’une roue d’activité, bûchette en bois, lambeaux de papier absorbant, croquettes au sol avec quelques graines de tournesol, papier ciselé pour constituer leur nid) avec accès libre à l'eau et à la nourriture. Cet environnement n’est renouvelé en totalité qu’une fois tous les 15 jours pour limiter le stress lié aux changements trop répétés. Les animaux sont observés tous les jours (week-end compris) et leur poids est suivi au moins une fois par semaine. Une fiche de contrôle du bien-être animal est renseignée de façon hebdomadaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent de leur côté une observation mensuelle de tous les animaux sur site et leur avis quant au statut sanitaire et le devenir d’un animal sera considéré comme prioritaire au choix scientifique de l’expérimentateur. En cas de nécessité d'une administration de deux composés, ils seront d’abord mélangés entre eux pour n’être donnés qu’une seule fois, tout en conservant un même volume d’administration.

Choix des espèces

Il est scientifiquement reconnu que les effets des molécules agissant sur l’activité cérébrale recueillis chez la souris sont pertinents par rapport à ceux décrits chez l’homme et que les enregistrements des paramètres dans cette espèce sont robustes et fiables. D’autre part, les modèles transgéniques développés chez la souris sont particulièrement proches de la pathologie humaine. La pertinence de l’espèce souris s’applique aussi quant à la quantité de produit nécessaire à synthétiser. Les animaux sont utilisés au stade de jeunes adultes.

Toutes tuées pour prélever leur tissu nerveux à plusieurs stades de la maladie, 1 095 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris porteuses d'une mutation liée à l'ataxie de Friedreich subissent des chirurgies cérébrales de 45 minutes à 3 heures, pose de fenêtre crânienne ou injections virales, puis des séances d'imagerie tête immobilisée de 30 à 45 minutes et des tests de coordination motrice, de marche et de force. Le projet prolonge un travail antérieur sur le même modèle et vise à explorer les circuits cérébelleux et à tester des thérapies géniques. Le porteur qualifie d'"indispensable" le suivi des protéines d'intérêt à plusieurs temps, ce qui justifie la mise à mort échelonnée des animaux.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative rare et héréditaire qui provoque une perte progressive de la coordination motrice. Elle est causée par une perte de fonction de la frataxine, protéine clé du métabolisme du fer mitochondrial. Récemment, un nouveau modèle murin porteur d’une mutation ponctuelle dans le gène FXN (Fxn G127V KI/KI) a été généré (Fil et al., 2020). Cette mutation ayant été identifiée pour la première fois chez des patients atteints d’AF, ce modèle représente un outil préclinique particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous visons à caractériser de manière approfondie les altérations du circuit cérébelleux aux stades pré-symptomatique et symptomatique, en utilisant l’imagerie in vivo. Cette approche constitue le seul moyen d’évaluer dynamiquement l’activité neuronale en tenant compte des interactions synaptiques, mais également d’explorer la fonction mitochondriale et les interactions neurones–glie au sein du cortex cérébelleux. Sur la base de ces données, nous mettrons en place des stratégies de modulation du circuit cérébelleux par des approches chimiogénétiques et de thérapie génique ciblée, afin d’évaluer leur potentiel pour restaurer les déficits comportementaux. Enfin, l’étude des modifications moléculaires associées permettra d’identifier des mécanismes d’intérêt pour le développement de futures thérapies chez les patients atteints d’AF. Ce projet prolonge et complète le projet déjà approuvé consacré à la première caractérisation du modèle G127V KI/KI, en apportant une analyse plus fine des dysfonctionnements mitochondriaux, des interactions cellulaires et des altérations des circuits cérébelleux. ous chercherons à comprendre comment l’activité et le métabolisme des neurones et des cellules gliales fonctionnent à la fois chez les animaux contrôles et G127V. L’accent sera mis sur les interactions neurones–glie et sur le partage de voies métaboliques essentielles, dont la perturbation pourrait contribuer aux dysfonctionnements observés dans l’AF. Les approches de modulation et de protéomique offriront l’opportunité d’identifier les voies clés nécessaires au maintien de l’activité neuronale, de l’homéostasie gliale et d’un état métabolique correct, et permettront de mieux comprendre les altérations propres à l’AF.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à caractériser l’activité neuronale et gliale ainsi que la dynamique mitochondriale au sein du circuit cérébelleux dans un modèle préclinique de l’ataxie de Friedreich. Il fournira de nouvelles connaissances sur le rôle de la frataxine et les conséquences de sa perte de fonction, tout en permettant d’évaluer, d’un point de vue comportemental et moléculaire, la réintroduction de la frataxine dans des populations neuronales spécifiques affectées par la maladie. De plus, les voies ciblées identifiées mettront en évidence de nouvelles voies potentielles pour le développement d’interventions thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin d’évaluer la coordination motrice, la marche et la force musculaire. Chaque test dure entre 30 secondes et 5 minutes, pour un maximum de 15 minutes par session et par animal. Avant le début des tests, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant 7 jours (10 à 20 minutes par jour et par animal) par des manipulations douces et progressives, afin de réduire le stress et d’assurer la fiabilité des observations. Au total, 120 animaux seront concernés par ces tests. Des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’implanter des fenêtres ou des lentilles permettant l’observation directe du cerveau, ou pour injecter des vecteurs rendant certaines cellules visibles. Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur pendant et après l’intervention. La durée des interventions varie de 45 minutes (injections dans le cerveau) à 3 heures (implantation de fenêtre crânienne). Après la chirurgie, une période de récupération avec surveillance rapprochée et soins adaptés est prévue. Lorsque nécessaire pour garantir la sécurité des animaux et une récupération optimale, ceux-ci pourront être hébergés individuellement pendant la phase postopératoire. Après la phase de récupération, certains animaux participeront à des séances d’imagerie afin d’enregistrer l’activité cérébrale à l’état éveillé, au repos ou lors de tâches comportementales. Lors de ces sessions, la tête de l’animal est maintenue stable pendant 30 à 45 minutes. Une habituation progressive de 7 à 10 jours est mise en place, avec une augmentation graduelle de la durée, afin de limiter le stress et l’inconfort. Ces procédures concernent 720 animaux. Des injections ciblées dans le cerveau seront également réalisées pour moduler l’activité des cellules nerveuses ou de soutien, parfois en combinaison avec l’imagerie. Ces interventions concernent 160 animaux. Enfin, des analyses après le décès des animaux seront effectuées pour des études moléculaires et protéomiques, concernant 45 animaux. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, tout en assurant un suivi attentif et continu de leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les données recueillies par notre laboratoire et par nos collaborateurs montrent que le modèle de souris utilisé pour l’ataxie de Friedreich ne présente pas de troubles moteurs marqués avant l’âge de 9 mois. Des signes légers de manque de coordination peuvent toutefois apparaître dès l’âge de 4 à 5 mois. Les tests de comportement réalisés chez les animaux sont non invasifs et n’entraînent pas de douleur. Ils peuvent cependant provoquer un stress léger et de courte durée, lié à la manipulation des animaux et à leur exposition à un environnement nouveau. Les séances d’imagerie nécessitent une immobilisation temporaire de l’animal, ce qui peut également générer un inconfort ou un stress transitoire, sans effet durable attendu. La chirurgie d’injection dans le cerveau et la pose d’une fenêtre crânienne constituent une intervention importante. Elles peuvent provoquer une douleur au moment de l’intervention ainsi qu’une gêne dans les jours suivants. Comme pour toute chirurgie, des complications post-opératoires telles qu’un saignement, une infection ou un gonflement peuvent survenir, mais elles restent rares et font l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures ont été mises en place. Tout d’abord, les mêmes animaux sont utilisés pour différentes expériences lorsqu’il est possible, en combinant des analyses comportementales, de microscopie in vivo, et des études histologiques ou moléculaires. Cela permet de réduire le nombre total de sujets nécessaires tout en conservant la pertinence scientifique des données. Les effectifs ont été calculés pour garantir une puissance statistique adéquate, en tenant compte de la variabilité attendue entre individus. Pour chaque groupe expérimental, des mâles et des femelles sont utilisés afin de tenir compte des différences sexuelles potentielles dans les phénotypes et les réponses aux interventions, avec un équilibre idéal de 50 % de chaque sexe. De plus, les animaux non utilisés pour certaines analyses sont réservés pour des expériences complémentaires ou des validations ultérieures, évitant ainsi la répétition inutile d’expériences. Les tissus collectés lors des interventions chirurgicales ou des euthanasies sont également exploités de manière optimale pour plusieurs types d’analyses (histologie, biologie moléculaire, protéomique), réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Enfin, des stratégies alternatives, telles que l’utilisation d’animaux transgéniques combinées à des injections virales ciblées, permettent de limiter le recours à des croisements complexes ou à de grandes cohortes d’animaux, tout en obtenant des résultats comparables. Ces approches contribuent à une utilisation plus efficace des animaux et à une réduction significative du nombre total de sujets nécessaires pour ce projet, tout en garantissant la représentativité des deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations afin de réduire leur stress. Des méthodes de manipulation douces et peu stressantes seront utilisées, comme l’utilisation de tunnels ou la prise des souris dans la main, plutôt que par la queue. La prise en charge de la douleur pendant et après l’intervention chirurgicale repose sur un protocole antidouleur complet, mis en place en collaboration avec la vétérinaire référente de la structure. Après la chirurgie, les animaux pourront être hébergés individuellement lorsque cela est nécessaire pour assurer leur sécurité et une surveillance adaptée durant la période de récupération. Pendant cette période, un enrichissement supplémentaire de l’environnement sera fourni (matériel de nidification, éléments à explorer) afin de limiter le stress et de prévenir l’apparition de comportements anormaux. Un suivi vétérinaire quotidien sera réalisé pendant 10 jours à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de douleur. Plusieurs traitements antidouleur sont disponibles et pourront être ajustés si nécessaire. Des critères d’arrêt adaptés à cette chirurgie ont été définis afin de prévenir toute souffrance inutile. Ils incluent notamment l’observation de la prise de nourriture et d’eau, de l’état général, du toilettage et des déplacements de chaque animal. Les traitements seront administrés via l’eau de boisson, légèrement sucrée pour en faciliter la prise, ce qui permet d’éviter toute manipulation supplémentaire et limite le stress des animaux.

Choix des espèces

Le projet utilise exclusivement des souris-modèles génétiquement altérées présentant une diminution de la frataxine, ainsi que des animaux témoins de type naturel. Ce modèle reproduit de manière fidèle les déficits cellulaires et comportementaux observés chez les patients atteints d’ataxie de Friedreich, tout en permettant l’étude in vivo de l’activité cérébrale et de la progression de la maladie. Les stades de développement ont été choisis en fonction des objectifs expérimentaux : 40 à 50 jours post-natal (jeunes adultes pré-symptomatiques) : étude des altérations précoces de l’activité cérébelleuse, avant l’apparition des symptômes moteurs. 70 à 150 jours post-natal (stades précoce à symptomatique) : suivi de la progression de la maladie à travers l’analyse de l’activité cérébrale et des premiers signes d’incoordination. 180 à 270 jours post-natal (adultes symptomatiques) : évaluation de l’effet des approches thérapeutiques et étude des circuits cérébraux à un stade avancé de la maladie. L’utilisation de ces différents stades permet une couverture complète de l’évolution de la pathologie, de la phase présymptomatique à la phase symptomatique, tout en optimisant le nombre d’animaux grâce à la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties sur cinq ans, elles subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins, une mise à jeun de seize heures puis un gavage quotidien de calcium pendant un mois, pour étudier le rôle de plusieurs gènes dans le métabolisme phosphocalcique et l'effet d'un composé. Les retombées annoncées pour les patients restent limitées à la compréhension des mécanismes, sans application clinique décrite. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas la complexité de l'homéostasie calcique dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Pour étudier l'effet de la rigidité des tissus sur des cellules immunitaires liées au cancer, 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une matrice de collagène implantée par chirurgie, refermée par des agrafes, puis un prélèvement de sang terminal. Le porteur minimise l'inconfort, qu'il attribue à l'incision et aux agrafes plutôt qu'au collagène. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement des macrophages dans un organisme entier et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.

Procédures

Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..