Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/03/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-152259)
Injectées une fois puis tuées trois jours plus tard pour peser leurs ovaires et leur utérus, 1 200 jeunes rattes de vingt à vingt-trois jours sont utilisées dans des procédures d’un niveau de souffrance léger. Ce dosage biologique suit les protocoles des pharmacopées, que le projet dit précisément vouloir remplacer par un test sur lignée cellulaire, ce qui n’empêche pas de programmer vingt expérimentations de soixante animaux sur quatre ans. Le porteur indique que les rattes arrivent juste après le sevrage, sans semaine d’habituation, parce qu’elles produiraient sinon leurs propres gonadotropines et deviendraient inutilisables pour le dosage. Il compte parmi les bénéfices attendus l’arrêt des prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes, qu’il qualifie d' »évident bénéfice éthique ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans les deux projets , nous sommes amenés à réaliser des dosages biologiques des gonadotropines équines et humaines. Un but commun dans ces deux programmes est de remplacer les dosages in vivo de la pharmacopée par des dosages biologiques in-vitro, extrèmement sensibles et spécifiques, sur une lignée cellulaire établie, bien décrite et facilement disponible.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le premier bénéfice attendu est de réduire, voire éventuellement de remplacer, les dosages in vivo sur rattes des gonadotropines eCG/PMSG et FSH par des dosages biologiques in vitro sur une lignée cellulaire. Le second bénéfice, par le développement de eCG recombinantes monocaténaires originales (produites en cultures de cellules) est de diminuer ou même de cesser les prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes (évident bénéfice éthique). En outre, la production de gonadotropines recombinantes, permettra d’améliorer leurs propriétés physicochimiques et biologiques, plus faciles à exprimer efficacement et à purifier .Ces bénéfices seront donc d’abord éthiques par la réduction, puis éventuellement le remplacement, des dosages in vivo des gonadotropines par des dosages sur lignées cellulaires. Ces bénéfices seront aussi financiers si l’on considère les coûts 1/ des tests in vivo sur rattes par rapport à ceux sur lignées cellulaires et ceux 2/ de la purification en une seule étape des gonadotropines recombinantes par rapport à celles des gonadotropines naturelles provenant des juments gestantes. Ces bénéfices , enfin, seront aussi techniques grâce aux propriétés mieux choisies et mieux contrôlables des hormones recombinantes par rapport aux gonadotropines naturelles.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans la grande majorité de nos dosages (gonadotropines à longue demi-vie dans la circulation sanguine), il n’y aura qu’une seule injection à J1 puis l’euthanasie / nécropsie à J4. Aucune intervention ni prélèvement dans l’intervalle. Très exceptionnellement, nous pourrions être amenés à tester une gonadotropine à courte demi-vie et devoir pratiquer deux injections supplémentaires à J2 et J3. Chaque injection ne dure que quelques secondes entre la prise de l’animal et son retour dans la cage avec ses congénères
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les injections en sous cutanée peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection ainsi qu’un éventuel œdème et la ou les différentes contentions peuvent entrainer du stress pour l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont mis à mort après la stimulation gonadotrope à fin de nécropsie pour prélever les ovaires et utérus qui seront pesés et, occasionnellement, caractérisés plus finement en microscopie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but du premier projet est justement , à terme, de pouvoir remplacer les rattes utilisées dans les protocoles recommandés par les pharmacopées (internationale et européenne) par le dosage in vitro sur lignées cellulaires. A cette fin, un certain nombre d’expérimentations en parallèle sont indispensables pour corréler les deux dosages entre eux en introduisant le facteur d’encombrement moléculaire des hormones qui détermine leur demi-vie dans la circulation sanguine.
2. Réduction
Nous avons prévu, au cours des quatre ans des deux projets, 20 expérimentations de 60 animaux chacun. De manière générale, les 60 animaux par expérimentation se décomposent de la manière suivante: 3 produits x 4 doses x 5 réplicats/dose. Pour réduire le nombre d’animaux, nous dosons au moins deux produits ensemble contre une même gamme de référence et utilisons seulement 5 réplicats / dose au lieu de 7 dans les pharmacopées. Nous suivons ce protocole depuis des années et les calculs d’activités par parallel line assay (PLA) sont statistiquement solides dans ces conditions. Le second projet porte sur le design et la production de nouvelles gonadotropines recombinantes originales dont l’activité biologique in vivo doit être définie avant transfert chez les animaux de rente (saisine complémentaire chez la brebis). Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets. D’autant plus que le premier a précisément pour but de ne plus requérir à l’avenir ces dosages in vivo. Par ailleurs, le second projet bénéficiera des avancées du premier et permettra en cas de réussite, de remplacer l’hormone naturelle par des copies recombinantes obtenues en cultures de cellules et ainsi ne plus saigner de juments gravides. Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets sachant que le premier a, en outre, pour but de se passer à l’avenir de ces dosages in vivo.
3. Raffinement
Les animaux ne séjournent que quatre jours (mardi à vendredi) dans l’animalerie et bénéficient d’un environnement enrichi. Néanmoins, comme lors de nos précédentes demandes, nous ne pouvons pas avoir une semaine d’habituation avant expérimentation. En effet, les rattes doivent être sevrées et encore immatures (20-23 jours) . Or la puberté intervient vers 28-30 jours. Comme les animaux nous sont livrés juste après sevrage, les rattes produiraient leurs gonadotropines endogènes pendant cette période et seraient inutilisables pour nos dosages. L’acquisition de portées avec leur mère conduirait à sacrifier inutilement les mères ainsi que les mâles de la portée (ce qui, évidemment, va à l’encontre de notre but de sacrifier un nombre le plus réduit possible d’animaux). Concernant le stress/angoisse des animaux, nous avons l’habitude de les manipuler avec douceur et ils ne manifestent aucun signe de peur. Le milieu est enrichi et permet aux jeunes rattes de s’entasser dans leur nid (tube carton).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les rattes immatures de 20-23 jours sont les animaux tests de la pharmacopée pour les dosages des gonadotropines car les ovaires de ces animaux y sont sensibles mais les animaux ne produisent pas encore de gonadotropines endogènes (seulement à J28-30 environ).