Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-930379)
4 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des nouveau-nés reçoivent des injections de dexaméthasone pour reproduire un stress précoce, puis à l’âge adulte une partie subit des colites induites au DSS ou à l’oxazolone, un test de comportement non précisé et des prélèvements sanguins, pour étudier l’effet du stress néonatal sur l’intestin et le poumon. Le porteur annonce une possible baisse de prise de poids et, pour les colites, une mise à mort à 15 à 20 % de perte de poids. Il affirme qu’il reste « impossible » de reconstituer in vitro les conditions de la réponse au stress, tout en décrivant des expériences sur organoïdes menées en parallèle.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de comprendre comment le stress néonatal influence la réaction de sevrage et impacte le fonctionnement physiologique de l’intestin chez l’adulte. Notre but est de comprendre comment le stress au jeune âge cause des modifications épigénétiques et transcriptionnels dans le tissu intestinal qui perdurent au cours du temps, induisant une prédisposition accrue aux maladies inflammatoires intestinales, comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie de Crohn, ou des allergies ou infections bactériennes dans le poumon, chez les adultes. L’objectif ultime de ce projet est d’étudier quelles sont les cellules, les voies de signalisation et les molécules ciblées, au niveau de l’intestin et au niveau systémique, par la réponse au stress durant la période néonatale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le stress est un facteur environnemental qui a un impact majeur sur la physiologie du corps. Bien que bénéfique dans certaines situations, le stress peut avoir un effet très négatif sur le fonctionnement de l’organisme. Par exemple le stress est associé à des troubles psychologiques comme la dépression ou l’anxiété, mais il est aussi associé à un risque accru de développement de tumeurs et de maladies inflammatoires. L’intestin et le poumon sont des organes particulièrement sensibles au stress. Plusieurs études ont montré que des maladies inflammatoires comme la maladie de Crohn ou la rectocolite ulcérative, sont associées au stress chronique. D’autres syndromes intestinaux, comme le syndrome du côlon irritable ont été associés au stress, en particulier au stress durant le jeune âge. De même des études ont montré que la repose au stress a un impact important sur la physiologie et le développement du poumon. Dans ce projet nous voulons comprendre l’impact à long terme du stress sur le fonctionnement de l’intestin et du poumon. En particulier, nous voulons comprendre comment le stress peut influencer le développement des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires ainsi que le fonctionnement du système immunitaire. L’objectif est de découvrir des voies de signalisation ciblées par le stress qui sont à l’origine des différentes maladies intestinales et pulmonaires associées au stress chez l’adulte. .
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
4116 souris : injection intra-péritonéale(30 secondes): 3 jours consécutifs ou une seule fois. 288 souris : traitements intra-nasale(5 minutes) : 2 fois. 240 souris : gavage oral(30 secondes ) : 1 seule fois. 390 souris : test de comportement (15 mins) : une seule fois. 690 souris : traitement au DSS par voie orale dans l’eau de boisson ( 5 jours traitment, 5 jours eau normal, 5jours traitment ). 300 souris :traitment Oxazolone par voie orale dans l’eau de boisson(7 jours) : une seule fois. 480 souris : administrations d’antibiotique par voie orale dans l’eau de boisson : 3 semaines. 3648 souris: pélèvement de sang sinus-retromandibulaire : 2 mins 1 ou 2 fois selon la procédure.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle utilisé dans ce projet se base sur un protocole publié en 2018) dans le préstigieu journal Cell. Dans cette étude, les auteurs traitent des souris avec de la dexaméthasone à différents moments du développement embryonnaire ainsi que durant les premiers stades de la vie postnatale. Aucun effett nocif ou toxique pour les souris n’a été reporté. Cependant, des modèles de stress précoce, tel que la séparation maternelle, qui sont plus sévères, peuvent entraîner une réduction du gain de poids corporel au cours des premières semaines de vie. Il est donc possible que dans notre modèle nous puissions observer un impact sur la prise de poids des souris traitées à la dexaméthasone pendant les premières semaines de vie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Suite à chaque procédure les souris seront mise à mort dans le but de faire de prélévement des tissues biologiques dans le but d’étudier l’effet du stress sur la physiologie et anatomie de l’intestin, le poumon et le cerveau.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude proposée ici, implique l’analyse de l’interaction complexe entre le microbiote intestinal, l’activation de l’axe Hipothalamo-pituito-surrenale (HPS), un circuit multi-organe qui inclue le système neveux centrale, la glande pituitaire et la glande surrénale et qui s’active lors de la réponse au stress. L’impact de cette activation affecte plusieurs types de cellules intestinales et immunitaires au cours du temps (pendant plusieurs semaines). Il est à ce jour encore impossible de reconstituer in vitro toutes les conditions nécessaires pour pouvoir établir les conclusions qui nous permettrons de comprendre l’impact du stress sur l’intestin et ses effets sur la prédisposition à développer des maladies intestinales inflammatoires. Cependant, dans l’effort de diminuer la souffrance animale, certaines expériences seront réalisées in vitro. En particulier nous allons utiliser des nouvelles techniques pour développer des organoïdes intestinaux afin d’étudier l’impact du stress sur l’épithélium intestinal. De plus nous allons générer une bases de données en faisant des experiences de sequencage de l’ARN ce qui permettra d’avoir un grand nombre d’information tout en réduisant la quantité d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser des bases de données déjà existantes ( sequencage d’ARN des cellules d’interet qui sont accessible au public) pour faire des analyses in silico qui permettrons d’émettre des hypothèses et obtenir des résultats avec l’utilisation d’un nombre limité d’animaux.
2. Réduction
D’après la littérature , l, les effectifs par groupe prévus permettent d’atteindre des tailles d’effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et le caractère doublement emboité du plan d’expérience (via les effets portée et cage). Le calcul de ce nombre tient compte d’un minimum de sang, de cellules et d’organes à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Nous avons utilisé l’outil statistique afin de déterminer le nombre minimal de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs en tenant compte de la variabilité inhérente à l’expérimentation. Les données obtenues, seront analysées grâce à des modèles statistiques ajustés sur plusieurs facteurs (sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet répétition de l’expérience.
3. Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences menant à une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être facilement suivie de manière quotidienne et non invasive. En particulier dans le cadre de l’inflammatoin intestinale les aniamux seront suivi par un examen quotidien des selles ( presence de sang), ainsi qu’une mesure du niveaux de lipocaline 2 par un test ELISA. En effet il a été montré dans literature que la mesure de lipocaline 2 est une methode non invasive permettant de surveillé l’état d’inflammation intestinale des souris. De plus, nous allons faire un suivie quotiden du poids des souris. En cas de perte importante de poids( entre 15 à 20% du poids initiale) et d’un augmentation significative de niveau de lipocaline 2 dans les selles, les souris seront mis à mort et l’expérience sera terminée. Dans le cadre de l’inflammation pulmonaires ou des allergies, nous allons faire un suivi des capacité respiratoires de souris tous les 30 mins durant les 4h qui suivent le traitment de l’allergène . De plus, nous allons surveiller, de manière quotidienne, l’état de l’animale tout au long des procédures à fin de contrôler toute modification dans son comportement (posture, poile herisé ) .
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le but de ce projet est de comprendre les effets du stress néonatal sur la physiologie de l’intestin chez l’adulte. La souris est un modèle animal idéal pour cette étude. La communauté scientifique a une connaissance importante de la biologie du stress chez la souris. De plus, chez la souris, des outils génétiques pourront être utilisés pour cibler des voies spécifiques du stress. Afin de d’étudier l’impact du stress neonatale chez l’adulte nous utiliserons des nouveau-nés et des souris adultes.