Protection de l’environnement

Exposés un mois durant à une lumière artificielle nocturne et à un enregistrement de bruit routier montant jusqu'à 60 décibels, 300 têtards de crapaud commun subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À la fin de l'expérience, chaque têtard est posé sur un support froid pour réduire son activité, écouvillonné, puis tué par surdosage d'anesthésique. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de tuer les têtards pour prélever l'intestin, et annonce que le reste des tissus, dont la tête, sera congelé pour "rentabiliser" les échantillons pendant plusieurs années. Le champ de devenir déclare pourtant 45 individus rendus vivants, sans que la narration précise lesquels échappent à la mise à mort.

Objectifs

L’approche « Santé Unique » souligne la nécessité d’une meilleure compréhension des perturbations de la dynamique des interactions entre les populations humaines et animales pour le contrôle des épidémies futures. Dans ce cadre, le système immunitaire est un acteur majeur du contrôle de la composition des espèces bactériennes chez les espèces hôtes. En contrôlant les communautés bactériennes aux interfaces hôte-bactéries (tels que le système digestif ou la peau), il a probablement un fort impact sur la composition des microbiotes des organismes. Or en milieu naturel, la fonction immunitaire, qui permet de lutter contre le challenge constant représenté par les agents pathogènes, est modulée par les conditions environnementales. Chez certaines espèces d’amphibien, les gènes liés à la réponse immunitaire innée de têtards de crapaud commun soumis à de la pollution lumineuse nocturne (ALAN pour Artificial Light At Night) sont sous-exprimés par rapport aux animaux témoins, alors que ceux liés à l’inflammation sont très sur-exprimés. En milieu naturel, les organismes sont exposés à un ensemble de pollutions qui peuvent agir de façon synergique. La pollution sonore (bruit du trafic routier), est souvent concomitante à ALAN. Bien que l’effet de la pollution sonore sur le statut immunitaire d’une espèce d’amphibien anoure adulte ait déjà été démontré, peu d’études concerne l’effet synergique de ces deux stresseurs anthropiques. Ce projet a pour objectif de caractériser fonctionnellement l’impact croisé d’ALAN et de la pollution sonore sur les communautés bactériennes (commensales et pathogéniques) du crapaud commun, espèce considérée comme sentinelle des zones humides. Sachant que l’immunité est responsable de l’état de santé global des organismes (résistance aux maladies infectieuses, bactéries pathogènes, développement de cancers) et que les études multi-stress en milieu naturel sont encore rares, les résultats obtenus permettront de mieux appréhender les effets cocktails de l’exposition croisée de ces deux pollutions anthropiques sur la faune sauvage.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre, pour la première fois, de caractériser l’effet croisé (et non unique) de deux sources de pollutions anthropiques très communément expérimentées par les espèces en milieu naturel, et ce, en utilisant des valeurs d’exposition réalistes retrouvées sur un grand nombre de sites en milieu naturel. L’impact croisé de ces deux stresseurs anthropiques sera évalué sur les communautés bactériennes pathogènes et commensales hébergées par l’hôte. Cette étude s’inscrit donc dans le cadre du concept de Santé Unique qui émerge de plus en plus dans la programmation des politiques de santé publique alors que les données scientifiques sont encore parcellaires. En effet, comprendre les dynamiques d’interactions entre les sources de pollutions anthropiques et les espèces en milieu naturel est indispensable au contrôle des épidémies futures. Par ailleurs, les amphibiens sont le groupe de vertébrés le plus menacé d’extinction actuellement, notamment en raison des perturbations anthropiques. Comprendre l’impact de ces pollutions lumineuse et nocturne sonore sur les têtards de crapauds communs fréquemment rencontrés dans les zones humides urbaines et péri-urbaines permettra d’aider à la préconisation de mesures de conservation des populations à destination des gestionnaires d’espaces naturels. Les résultats attendus du projet seront valorisables au niveau fondamental en écologie microbienne et rapidement exploitables par les politiques publiques notamment pour l’établissement de trames noires et de zones refuges pour la biodiversité.

Procédures

Durant l’expérimentation, les animaux du groupe ALAN seront soumis à de la pollution lumineuse de 19h à 07h (intensité 0.1lux), les animaux du groupe Pollution sonore seront exposés à une bande enregistrée reproduisant les niveaux de pollution sonore observée sur un cycle circadien (en moyenne 30dB la nuit et avec des pics ponctuels allant jusqu’à un maximum de 60dB la journée. Les animaux du groupe (ALAN + pollution sonore) seront exposés aux deux pollutions selon ces même modalités. A la fin de l’expérimentation (1 mois) et avant la mise à mort par surdosage de MS-222, chaque têtard sera rincé et placé sur un support froid (de manière à réduire son activité) en vue d’un frottis cutané réalisé à l’aide d’un petit écouvillon stérile. Ce prélèvement unique de < 1 minute sera réalisé par une personne expérimentée. L’individu sera ensuite immédiatement euthanasié.

Impact sur les animaux

Aucune étude scientifique ne renseigne pour l’instant les effets physiologiques et comportementaux de l’exposition croisée à ces deux types de pollutions anthropiques chez des stades larvaires d’amphibien, ce que notre étude sera justement en mesure de mieux comprendre. La pollution lumineuse nocturne induit une expression différentielle des gènes des têtards en particulier au niveau du système immunitaire. Sans que le lien fonctionnel ait été encore formellement démontré, il se peut que les têtards soumis à la pollution lumineuse soit immunodéprimés. Une étude récente a étudié les effets de l’exposition à la pollution sonore seule en animalerie sur des têtards d’amphibien nord-américain. Elle reporte une prise alimentaire diminuée et une activité moindre de ces têtards, mais un taux de croissance et une date d’arrivée à la métamorphose similaire. Cependant, cette étude utilise un niveau de pollution sonore supérieur et continu (70 dB) à celui que nous prévoyons d’utiliser.

Devenir

Il est nécessaire d’euthanasier les têtards à la fin de l’expérimentation pour pouvoir prélever les échantillons intestinaux et ainsi caractériser le microbiote intestinal.

Remplacement

La composition des communautés microbiennes des animaux se met en place durant le développement. Elle est complexe, influencée par de multiples drivers (alimentation, immunité, génétique…) et modulée en miroir des conditions environnementales locales (pollution, stress, présence de pathogènes…). Cette composition des microbiotes n’est pas modélisable et la caractérisation de l’effet de stress externes sur son développement nécessite le prélèvement sur organisme vivant et sain. Aucune expérience in vitro ou in silico ne peut permettre d’accéder à ce type de données.

Réduction

La capture et l’échantillonnage réalisés sur les individus adultes ont été optimisés statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’œufs utilisés et prélevés dans la nature et le nombre de têtards élevés en animalerie, tout en obtenant des résultats significatifs. Le nombre de têtards prélevés (N=75 pour chacun des 4 groupes expérimentaux, soit N=300 au total) représente le nombre minimal d’individus nous permettant d’avoir une information réaliste et exploitable statistiquement, compte tenu de la haute variabilité individuelle de la composition des communautés bactériennes intestinales et cutanées. Une autorisation préfectorale est en cours d’obtention pour le site concerné, le nombre d’individus et les prélèvements réalisés. Le reste des tissus, en particulier la tête (cerveau et yeux), sera prélevé et stocké à -80°. Ces tissus pourront servir ultérieurement à l’étude de l’expression génique suite à l’exposition aux différents stresseurs. Ceci permettra de fait de rentabiliser l’ensemble des échantillons pendant plusieurs années. Cette procédure a déjà été utilisée avec succès au laboratoire.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une condition sine qua non de cet élevage. Les conditions d'hébergement, couramment utilisées et maîtrisées dans notre équipe, sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse que pourraient ressentir les animaux. En particulier la température de l’eau (17°C ± 1°C), source de stress importante chez ces animaux sera contrôlés deux fois par jours. L’oxygénation de l’eau se fera en continue par des pompes et bulleurs adaptés aux aquariums. Le nettoyage de fèces par aspiration sera réalisé tous les deux jours (au début de développement) et tous les jours (quand les individus seront plus gros et s’alimenteront plus à ~2 semaines) pour assurer une eau toujours propre et empêcher tout développement bactérien ou fongique dans les aquariums. Enfin, l’élevage des têtards de chaque ponte se fera en petit groupe de 5 individus par aquariums, ce qui permet d’éviter toute pression de densité représentant un fort stress pour ces stades larvaires. Par ailleurs, le bien-être animal sera assuré par la présence de personnel compétent 7J/7J pour l’observation et le soin des animaux.

Choix des espèces

Les amphibiens présentent un état de conservation défavorable dans la plupart des régions du monde. Le crapaud commun, espèce sentinelle des zones humides, est présent dans les zones péri-urbaines et urbaines régulièrement soumise à la pollution nocturne et sonore. Ainsi, dans son environnement naturel, cette espèce expérimente des éclairements nocturnes et des niveaux sonores important pouvant affecter sa physiologie et son comportement. De plus, ce taxa étant particulièrement sensible aux épidémies bactériennes et fongiques, les résultats obtenus seront susceptibles d’avoir une grande portée de conservation afin d’établir des préconisations de gestion auprès des gestionnaires des territoires qui promeuvent la présence de zones humides en ville pour améliorer le bien-être des citadins. Nous avons choisi de travailler sur le stade larvaire car un nombre grandissant d’études reporte l’importance de perturbations environnementales subies pendant les stades juvéniles sur l’état de santé des individus, et plus particulièrement sur le développement du microbiote. Nous savons déjà que l’exposition à de faibles valeurs de pollution lumineuse nocturne est responsable de modifications de l’expression des gènes du système immunitaire chez les têtards, il est donc fort probable que ces modifications immunitaires de l’hôte aient un effet direct sur leur capacité à contrôler leurs communautés bactériennes aux interfaces telles que les intestins ou la peau.

Tous relâchés sur leur site de capture, 2 400 passereaux sauvages de onze espèces sont pris au filet et maintenus jusqu'à cinq minutes en main, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Sur cinq ans, 1 320 adultes et 660 jeunes à l'envol subissent un prélèvement sanguin, 200 oiseaux un lavement cloacal et 220 mâles un massage cloacal pour récupérer leur sperme, tous ces gestes étant pratiqués sur animaux vigiles. Le porteur nomme les espèces concernées, du rouge-gorge familier à la mésange charbonnière, et retient les plus grosses pour pouvoir prélever du sang sans dommage. Il présente lui-même l'effectif de 2 400 comme un maximum qui ne sera pas atteint, et admet que la comparaison entre espèces resterait valable "avec seulement quelques individus".

Objectifs

Depuis plusieurs décennies, l’utilisation massive et croissante de pesticides de synthèse dans l’agriculture conventionnelle a permis une augmentation considérable des rendements agricoles mais elle a également eu des effets sur la biodiversité et notamment sur les populations d’oiseaux, même si la magnitude de ceux-ci reste l’objet de controverses. La conversion à l’Agriculture Biologique, dans le cadre de la politique agricole commune et soutenue par l’État français, permet de proposer un ensemble de mesures permettant la restauration des écosystèmes agricoles et ainsi de promouvoir la biodiversité. A ce jour, beaucoup d’études se sont intéressées à la comparaison entre l’agriculture conventionnelle et agriculture biologique avec pour résultats principaux que les densités et abondances des espèces et des individus sont plus importantes dans les paysages en agriculture biologique. En revanche, un effet positif sur la dynamique des populations évoluant en agriculture biologique, reste encore à démontrer, d’autant qu’identifier les processus et mécanismes impliqués reste aussi à l’ordre du jour. Une des hypothèses principales serait le relâchement de la pression en produits phytosanitaires en agriculture biologique, dont les impacts négatifs sur la dynamique des populations concerneraient avant tout les effets sublétaux. L’objectif de ce projet est d’apporter des connaissances cruciales au regard des effets sublétaux (c'est à dire des effets n'entrainant pas directement la mort de l'individu mais une dégradation de son état de santé général) de l’agriculture conventionnelle par rapport à l'agriculture biologique, sur différentes espèces de passereaux nichant dans les haies au sein de ces agrosystèmes, en comparant en conditions naturelles et à l’échelle d’un vaste territoire agricole, plusieurs marqueurs de la « santé » des oiseaux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu de ce projet sera de comprendre comment l’agriculture biologique peut être un levier pour préserver la biodiversité aviaire en diminuant l’exposition aux pesticides des individus et si l’état de santé des oiseaux et de leurs populations s’améliorent par rapport à des paysages dominés par l’agriculture conventionnelle.

Procédures

Les animaux seront capturés dans la nature et différentes mesures seront réalisées. Ces mesures sont des mesures classiquement réalisées sur les oiseaux dans les programmes de recherche in natura. Tous les animaux subiront 1 capture et 1 contention d'une durée maximale de 5 minutes. Durant la contention et pour les 5 années du programme, 1320 oiseaux adultes et 660 jeunes à l'envol subiront un prélèvement de sang sans effraction (durée de moins de 1 minutes), 200 oiseaux subiront un lavement cloacal (durée de 1 minute) et 220 mâles subiront un massage cloacal (durée de 1 minute) pour récupération du sperme. Tous ces gestes (prélèvement de sang, lavement et massage) seront réalisés sur les animaux vigiles. Chaque animal ne subira qu'un seul acte par an. Si un individu est recapturé pendant deux années consécutives, il pourra alors rentrer dans deux procédures différentes (une procédure par an). S’il est recapturé une troisième année, il ne subira pas de nouvelle procédure.

Impact sur les animaux

1) Tout d’abord, il y aura un stress léger lié à la capture. En effet, la capture par des filets maillants est la procédure habituelle pour capturer des passereaux et n’engendre pas de traumatisme ni de mortalité quand elle est réalisée dans des conditions météorologiques favorables. 2) Il y aura ensuite un stress léger lié à la contention des oiseaux pendant les mesures (mesures de comportement, mesures morphométriques, mesure du parasitisme) qui durera moins de 5 minutes. 3) En fonction des procédures, il pourra y avoir une gêne légère et passagère lors du lavement cloacal, du prélèvement de sperme et lors de la prise de quelques microlitres de sang sans effraction. Chacun de ces gestes (lavement, sperme et sang) durera moins d'une minute (compris dans les 5 minutes).

Devenir

Tous les individus seront relachés sur le site de capture après les manipulations et chaque individu ne subira qu'une seule procédure par an. Si un individu est recapturé une seconde année, il rentrera dans une nouvelle procédure. Si il est recapturé une troisième année, il ne rentrera pas dans une nouvelle procédure. Chaque individu subira alors deux gestes aux maximum.

Remplacement

S’agissant de suivi populationnel pour comprendre des mécanismes complexes en milieu naturel, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de remplacer les animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'individus pour chaque procédure est réduit à son maximum et est celui qui permettra de réaliser des analyses statistiques avec une puissance suffisante pour détecter des effets sublétaux qui sont par définition subtils à mettre en évidence. Comme notre projet se focalisera sur 11 espèces différentes afin de pouvoir relier l'écologie de l'espèce à l'exposition aux pesticides, il faut un nombre suffisant d'individus capturés dans les 2 modes d'agriculture (biologique et conventionnelle). Nous voulons également déterminer si le sexe des individus adultes peut jouer un rôle sur les conséquences de l’exposition aux pesticides. 10 individus par sexe, espèce et paramètre seront nécessaires pour obtenir des résultats robustes. Un individu ne rentrera que dans une seule procédure dans la même année mais pourra rentrer dans deux procédures différentes sur deux années différentes. Au total, des prélèvements et des mesures seront réalisés sur 2400 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre doit être considéré comme un maximum car (i) il est certain que nous ne pourrons pas atteindre 20 individus pour chaque espèce pour chaque procédure et (ii) que certains individus seront recapturés plusieurs années et donc rentreront dans deux procédures différentes, même si ce nombre de recapture devrait être relativement faible. Des modèles statistiques adaptés (modèle linéaire généralisé avec effets mixtes) seront utilisés afin de pouvoir détecter les effets des produits phytosanitaires sur l'état de santé des oiseaux. Même si nous n’atteignons pas ce nombre, les résultats ne seront absolument pas remis en cause car une analyse interspécifique (comparaison des effets entre espèces en lien avec leur écologie) pourra être réaliser avec seulement quelques individus et elle restera parfaitement valable. En revanche, les analyses intraspécifiques seront réalisées que pour les espèces où nous aurons un nombre suffisant d’individus.

Raffinement

L’ensemble des manipulations est réalisé dans le respect de l’animal aussi bien pour les adultes que les jeunes à l'envol. Les manipulations sont faites de façon à minimiser le stress, dans un temps limité et toujours à proximité du site de capture. Les oiseaux seront relâchés sur le site précis de capture. Les expérimentations sont réalisées avec des conditions météorologiques optimales (température supérieure à 10°C, absence de pluie et de vent) afin de minimiser le stress et l'impact de la manipulation. Les manipulations seront réalisées par des personnes expérimentées uniquement et des points limites stricts ont été déterminés afin de préserver le bien-être de l'animal pendant la durée de la capture. Les manipulations seront réalisées dans le respect du protocole sanitaire. Le matériel de prélèvement sera stérile et à usage unique. En cas de stress marqué, l'expérience sera immédiatement arrêtée et l'animal sera isolé dans son sac jusqu'à retour au calme avant d’être relâché. Les individus recapturés sur deux années différentes rentreront dans deux procédures différentes. Les sacs seront nettoyés entre chaque session.

Choix des espèces

Les passereaux sont un modèle parfaitement adapté à notre questionnement puisque pendant la période de reproduction, ils restent à proximité de la haie où ils nidifient (dans un rayon de 150 mètres pour la plupart des espèces) nous permettant ainsi d'être certains que les individus seront confrontés à une exposition aux pesticides en agriculture conventionnelle. Les différentes espèces de notre projet seront les plus abondantes dans notre d’étude afin de disposer d'un échantillon statistique suffisant et ce seront les espèces les plus grosses nous permettant de pouvoir prendre un échantillon de sang sans dommage. Nous travaillerons sur 11 espèces : l'accenteur mouchet, le bruant zizi, la fauvette à tête noire, la fauvette grisette, l'hypolaïs polyglotte, le merle noir, la mésange charbonnière, le moineau domestique, le pinson des arbres, le rossignol philomèle et le rouge-gorge familier. Les études seront faites sur les adultes et sur les jeunes volants (c'est à dire les individus ayant quitté les nids et qui seront donc déjà autonomes au même titre que les adultes)

Relâchées dans le milieu naturel à l'issue de l'expérience, 900 civelles sont capturées en estuaire, marquées par immersion dans un colorant fluorescent puis maintenues 180 jours en aquarium et en bassin, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. 300 d'entre elles sont anesthésiées, mesurées et passées au lecteur portatif à 60 et 180 jours. Le porteur indique que la mise à mort restera "anecdotique", limitée aux cas d'atteinte des points limites, et compte sur une mortalité en captivité pouvant atteindre 40 à 50 %. L'objectif déclaré est de valider une détection externe des marques, ce qui éviterait à l'avenir de tuer les civelles pour lire leurs otolithes.

Objectifs

Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). L’observation de ces structures nécessite toutefois la mise à mort des individus. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés en 2022 puis 2023 ont confirmé la présence de marques dans la mâchoire et les nageoires des civelles, détectable après 180 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de rendre opérationnel le protocole de marquage en réduisant les quantités de colorant utilisé et en validant la procédure de détection sur des individus vivants après 6 mois.

Bénéfices attendus

La lecture externe des marques sur individus vivants permettrait en premier lieu la préservation des civelles analysées (pas de mise à mort), une simplification du protocole de détection, la réduction du temps de lecture des marques et l’augmentation de la taille de l’échantillon analysé dans un soucis de représentativité statistique.

Procédures

Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent, selon 4 traitements et un contrôle. La durée des interventions sera de 13.5 minutes (balnéations "flash"). Puis 60 individus seront prélevés, anesthésiés, mesurés, pesés et leur fluorescence observée à l’aide du lecteur portatif. La durée totale de l’intervention hors d’eau sera de 1 minute.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage, le maintien en captivité et l’anesthésie avant lecture de fluorescence. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.

Devenir

900 civelles seront capturées, transportées, marquées puis stabulées pendant 180 jours en aquarium puis en bassins (mésocosmes). A 60 et 180 jours, 150 individus seront anesthésiés, mesurés, analysés (mesure de fluorescence), puis remis en liberté. Tous les autres individus seront remis en liberté en fin d’expérience. La mise à mort restera anecdotique, uniquement en cas d’atteinte des points limites.

Remplacement

La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).

Réduction

L’effectif de 900 individus (3 lots de 50 individus pour chacun des 5 traitements + 1 lot contrôle de 150 individus) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 40-50%, en fonction de la qualité des civelles récupérées chez le mareyeur, variables selon la période de pêche). A 2 occasions au cours du suivi (60 et 180 jours), un effectif de 30 individus par traitement sera analysé. Ainsi, au total 300 individus seront anesthésiés et analysés, afin de prendre en compte la variabilité inter-individuelle du niveau de fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère aux résultats des études réalisées en 2022. Tous les individus (analysés ou non) seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 900 individus).

Raffinement

Lors du transport, les civelles seront réparties dans deux sacs de transport gonflés à l’O2 et contenant un volume d’eau adapté. La densité de civelles sera très faible comparé aux densités de stockage observées chez les mareyeurs et lors des opérations standards de marquages effectuées depuis 2011 pour les repeuplements. La durée de transport est limitée au minimum et estimée à environ 1 heure, ce qui permet de garantir le maintien d’un niveau d’oxygénation très élevé dans les sacs (très faible consommation par les civelles). Pour le marquage, l’oxygénation des solutions sera maintenue à 100% à l’aide de diffuseurs d’oxygène, point essentiel en raison des fortes densités d’individus. Les aquariums seront enrichis à l’aide caches constituées de tubes PVC puis des flottangs seront utilisés dans les mésocosmes, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival. Lors des contrôles de fluorescence (à 60 et 180 jours), les civelles seront anesthésiées individuellement puis au moment de la lecture de fluorescence, leur tête sera protégée des rayonnements laser à l’aide d’un cache opaque. La durée totale de la manipulation hors d’eau n’excèdera pas 1 minute.

Choix des espèces

L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.

32 xénopes (Xenopus laevis) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis remis dans les bacs d'élevage. Chaque individu reçoit deux injections d'hormone hCG dans les sacs lymphatiques à trois jours d'intervalle pour déclencher la reproduction et fournir œufs ou têtards aux tests OCDE 231 et 241, qui dépistent les perturbateurs endocriniens. Le porteur indique une douleur légère et temporaire liée aux injections, et prévoit un repos de six mois pour les femelles et trois mois pour les mâles avant toute nouvelle stimulation. Il affirme que la cryoconservation des ovocytes ne fonctionne pas encore, ce qui rend selon lui l'animal vivant "indispensable".

Objectifs

L’objectif est de provoquer artificiellement la reproduction de couples de Xenopus laevis par injection d’hormone HCG (Human Chorionic Gonadotropin) dans le cadre des tests OCDE 231 et OCDE 241 afin d'obtenir des oeufs ou des tétards utilisés dans ces essais. Ces tests permettent de dépister les effets perturbateurs endocriniens de substances chez les larves d’amphibiens. Les résultats obtenus sont utilisés dans les dossiers d'homologation, permettent l’étiquetage des substances et la réalisation de l’évaluation des risques des substances introduites dans l’environnement.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre d’obtenir les larves nécessaires à la réalisation des tests OCDE 231 et 241 relatifs aux effets perturbateurs endocriniens potentiels des substances

Procédures

2 Injections d'HCG dans les sacs lymphatiques espacées de 3 jours. L'injection pratiquée par du personnel qualifié dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

- Légère douleur suite aux injections (durée temporaire)

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront remis dans les bacs d'élevage.

Remplacement

La cryoconservation des gamètes pourrait être une solution alternative en permettant de faire des fécondations in-vitro. Malheureusement, bien que la cryopréservation fonctionne avec les spermatozoïdes, ce n’est pas encore le cas avec les ovocytes. L’utilisation d’organismes vivants reste donc indispensables et l’injection d’HCG permet d’éviter de sacrifier des animaux pour prélever leurs gonades. Dans le cas du puçage, cette méthode est une alternative au sectionnement des phalanges utilisé jusqu'à présent pour identifier les amphibiens.

Réduction

Dans le cadre de l’injection hormonale, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en optimisant les chances que la reproduction fonctionne. Ainsi, les normes recommandent de ne pas injecter plus de 3 couples à la fois. De plus une veille bibliographique est réalisée régulièrement pour se tenir informer de toutes nouvelles méthodes alternatives (exemple : amélioration des procéder de cryopréservation).

Raffinement

Dans le cas de l’injection hormonale, un temps de repos de minium 6 mois pour les femelles, et de 3 mois pour les mâles, est respecté avant de réaliser toute nouvelle injection d’HCG pour éviter d’user les organismes et de limiter l’apparition du syndrôme d’hyperstimulation ovarienne chez les femelles. De plus, toute manipulation du xénope se fait avec des gants humides pour limiter le stress et les lésions sur la peau des organismes. Les xénopes peuvent être placés dans un bain de tricaïne à 300-500 mg.L-1 jusqu’à atteindre le stade d’anesthésie légère.

Choix des espèces

Il s’agit d’une espèce modèle des amphibiens anoures. Cette espèce est demandée par les guidelines OCDE. car elle possède de nombreux avantages : - Elle est facile à obtenir, entretenir et à observer ; - Elle est très résistante aux maladies et aux parasites ; - Les différents stades de développement sont facilement observables à l’œil nu, ou à la loupe binoculaire, et sont bien décrits dans la table de Nieuwkop et Faber (1994) ; - Il est possible d’induire une reproduction tout au long de l’année grâce à l’injection d’hormone HCG. De plus, un grand nombre d’œufs est produit à chaque reproduction. Les individus utilisés dans les procédures seront des individus adultes sexuellement actifs.

24 petites roussettes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, douze réintroduites en mer et douze, nées en captivité, tuées à l'issue. Chaque individu passe seize heures en chambre de respirométrie pour mesurer sa consommation d'oxygène puis subit une biométrie sous anesthésie courte, pour calibrer un modèle qui doit prédire la taille des populations de requins et raies ovipares en 2100 selon deux scénarios climatiques. Le porteur décrit une méthode non invasive et revendique un projet destiné à terme à remplacer l'expérimentation animale par la modélisation. Il indique que les individus capturés en mer ont de fortes chances de survivre au relâcher, les jeunes éclos en captivité étant tués selon la réglementation.

Objectifs

A partir d’un nombre très limité d’individus (24 au total) et d’une procédure légère (respirométrie statique à flux intermittent, méthode non invasive communément employée chez les poissons), le projet doit permettre la mise au point d’une approche couplée de bioénergétique et de modélisation qui doit permettre de prédire la taille des populations de petite roussette (Scyliorhinus canicula) en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques : (i) les émissions de CO2 se maintiennent aux niveaux actuels jusqu'en 2050, puis diminuent sans atteindre l'objectif de zéro net d'ici 2100 et (ii) les émissions de CO2 triplent d'ici 2075.

Bénéfices attendus

Une fois le modèle calibré sur la petite roussette (Scyliorhinus canicula), il pourra être utilisé pour prédire la taille des population de d'autres espèces d'élasmobranches ovipares tempérées ayant les mêmes dépenses énergétiques, c’est-à-dire que la taille des populations de d’autres espèces pourra être connue sans avoir à réaliser d’expérimentation animale. Ces estimations pourront servir à guider les mesures de gestion de ces espèces dont près de la moitié sont menacés d’extinction en Atlantique Nord-Est, le changement climatique pouvant exacerber les pressions anthropiques directes existantes.

Procédures

Après stabulation aux températures désirées (15,5°C; 17,5°C, 19,0°C) pendant 1 mois, les capacités métaboliques des individus seront mesurés gràce à une méthode non invasive. Les individus seront placés dans des chambres de respirométrie pendant 16h et surveillés toutes les heures. Le test alternera des phases de mesure de consommation d’oxygène (20 à 60 minutes en fonction de la température) et de 60 minutes de renouvellement d’oxygène (i.e. 10-12 mesures en tout pour un individus). L’estimation des capacités métaboliques étant rapportés au poids de chaque individu, une biométrie (longueur totale et standard, masse) sous anesthésie courte sera réalisée après chaque test.

Impact sur les animaux

Le transport des individus subadultes et adultes (2h) pourra engendrer un stress qui sera diminué en transportant les individus dans des mésocosmes oxygénée et dans lesquels les animaux seront dans le noir. Les températures appliquées (15.5°C; 17,5°C; 19°C) sont des températures rencontrés par l'espèce (gamme de température allant de 10 à 20°C), par conséquent les conditions d'élevage ne représenteront pas de nuisance supérieures à celles rencontrées dans le milieu naturel. La nuisance associée à la découverte d'un nouvel environnement sera atténuée par une heure consacrée à l'acclimatation des individus aux chambres de respirométrie enrichie d'une cachette et de pierres. L'isolement pendant la procédure pouvant entrainer une nuisance légère (animaux non grégaires), les chambres de respirométrie transparentes seront placées par paires dans des mésocosmes. Le stress associé à la biométrie sera réduit grâce à une anesthésie courte.

Devenir

Tous les animaux prélevées en milieu naturel seront réintroduits. Les individus n'ayant été qu’acclimatés au maximum pendant 3 semaines, placés en stabulation pendant un mois puis 18h dans des chambres de respirométrie, pesés et mesurés, ils ont de fortes probabilité de survivre lors de leur réintroduction dans leur milieu naturel. La réintroduction de juvéniles en milieu naturel est couramment employée en conservation des raies et requins ovipares. Ceux nés en captivité seront euthanasiés conformément à la réglementation.

Remplacement

A ce jour il est impossible de quantifier la consommation en dioxygène en fonction de la température autrement que par respirométrie statique à flux intermittent (méthode non invasive communément employée). Toutefois, à partir d’un nombre très limité d’individus (24 au total) d’une espèce modèle (Scyliorhinus canicula) et d’une procédure légère, le projet doit permettre de calibrer un modèle permettant de prédire la taille des populations de nombreuses espèces de raies et de requins ovipares en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques. Ce projet a donc pour but final d’utiliser la modélisation en remplacement de l'expérimentation animale.

Réduction

Un nombre très limité d’individus (24 au total) d’une espèce commerciale (Scyliorhinus canicula), classée > sur la liste rouge de l’Union International pour la Conservation de la Nature (UICN) est nécessaire et suffisant pour calibrer un modèle permettant de prédire la taille des populations de nombreuses espèces de raies et de requins ovipares en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques sans avoir à utiliser d’animaux en expérimentation animale. Ce petit nombre d'individus a déjà permis d’obtenir la relation recherchée pour calibrer le modèle sur d’autres espèces. Par ailleurs, l’hébergement et la procédure légère mis en place doivent permettre la réintroduction des animaux en milieu naturel. La réintroduction est couramment réalisée pour la conservation des raies et requins qui pondent des œufs.

Raffinement

Le stress associé au transport des individus (2h) sera diminué en transportant les individus dans des mésocosmes oxygénée et dans lesquels les animaux seront dans le noir. Chacun des aquariums de 700 L permettra d’héberger des groupes de 8 individus (4 juvéniles séparés de 2 subadultes et 2 adultes par une cage grillagée en plastique). Les bassins seront alimentés par de l’eau de mer pompée directement en Manches afin de proposer une eau dont la composition chimique est la plus proche du milieu naturel et équipés indépendamment d’un système de filtration externe (limitation des champs électrique), mécanique et biologique. La température sera mesurée en continu et ajustée automatiquement. La salinité, l’oxygène et les nitrates seront mesurés hebdomadairement tandis que l'ammonium et les nitrites seront mesurés quotidiennement. L'eau des aquariums sera renouvelée d'un tiers quotidiennement. Les individus seront nourris ad libitum, deux fois par semaine (digestion très longue) avec des calmars et du merlu préalablement décongelées (limitation des risque d’infection parasitaire). L'alimentation avec des aliments ayant des valeurs nutritives variées (merlu et calmar) augmentera la probabilité que la plupart des éléments essentiels soient ingérés. L’alimentation sera complétée si nécessaire par un supplément en vitamines (C) et minéraux pour éviter toute carence chez les animaux hébergés. Une surveillance quotidienne sera assurée en plus des périodes de nourrissage afin de détecter des modifications de l’aspect physique et du comportement des poissons. Des abris en plastique permettront de fournir des cachettes tandis que des tunnels offriront des possibilités de jeu. L'anesthésie courte permettra de limiter le stress lié à la biométrie.

Choix des espèces

Les élasmobranches (raies et requins) constituent la deuxième classe de vertébrés la plus menacée d’extinction à ce jour (près de 50% des espèces sont menacés d’extinction en Atlantique Nord-Est). Le réchauffement des eaux représente un défi supplémentaire pour la survie de ces espèces qui ne régulent pas leur température interne. L’approche couplée de bioénergétique et de modélisation a déjà permis de prédire la taille des populations de Rhinoptera bonasus. Cependant, le modèle développé n'a pas été construit pour qu'il soit transposable à une autre espèce et en particulier à une espèce tempérée et ovipare. A l'heure actuelle, il est donc impossible de prédire la taille des populations des différentes espèces de raies et requins ovipares tempérés. La petite roussette (Scyliorhinus canicula), classée « préoccupation mineure » selon la liste rouge de l’UICN, couramment rencontrée au sein des aquariums (conditions optimales de développement connues) est un organisme modèle pour l'étude des raies et des requins en Atlantique Nord-Est, c'est donc cette espèce qui a été choisie pour calibrer le modèle développé pour les raies et requins tempérée ovipares. Le modèle doit être calibré sur des individus de différentes tailles (i.e. stades de développement) pour correctement décrire la consommation en dioxygène en fonction de la taille des individus. Une plus grande variabilité étant attendu chez les juvéniles, leur nombre est plus grand. Le nombre de subadultes et adultes est quant à lui limité par les capacités d’accueil des animaux dans des conditions optimales (déterminées par la capacité de filtration des pompes). La dynamique des populations est contrainte par la fécondité des femelles, par conséquent, l’approche mise en place est basée sur les femelles. La taille à maturité des femelles n’est pas précisément décrite, ce qui implique d’inclure des individus selon une fourchette de taille assez grande, c’est pourquoi le projet comptera 6 subadultes femelles (maturité non certaine) et 6 adultes femelles (maturité certaine). Enfin, il est impossible de déterminer le sexe des embryons dont la durée d’incubation est de 6 mois avant leur éclosion. Par conséquent, nous avons valorisé tous les individus éclos (6 femelles et 6 mâles) sachant que l'énergie allouée pour l'investissement reproducteur est nul la première année pour les petites roussettes et donc n’entrainera pas d’erreur pour la calibration du modèle.