Enseignement supérieur et formation professionnelle

25 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans 125 études, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur humaine, une puce électronique ou un marquage aux oreilles, des administrations de médicament jusqu'à deux fois par jour et jusqu'à seize prélèvements sanguins. Le porteur annonce des pertes de poids, des diarrhées, des douleurs postopératoires et des risques d'infection, et précise que les souris chez lesquelles la greffe n'a pas pris sont tuées elles aussi, au motif des nuisances déjà subies. Ces essais alimentent des dossiers d'autorisation de mise sur le marché, le projet étant par ailleurs déclaré au titre de la formation professionnelle.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre le cancer sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils ne soient testés chez l’Homme. Notre collection de modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Les 125 études prévues dans ce projet sont réalisées à un stade avancé du développement des médicaments, elles permettent d’obtenir des résultats fiables sur les traitements les plus prometteurs pour un type de tumeur ou mutation donnée. Elles peuvent également permettre d’étudier les mécanismes d’action des médicaments dans l’organisme. Elles sont nécessaires pour constituer un dossier d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) des médicaments.

Bénéfices attendus

Chaque année, dans le monde, près de 20 millions de personnes sont diagnostiquées atteintes d’un cancer (tous types confondus) dont plus de 400 000 en France, et on recense plus de 10 millions de décès (1/6) dont plus de 150 000 en France. Le nombre de personnes atteintes d’un cancer est en constante évolution, mais les progrès en terme de développement de traitements depuis 25 ans ont permis d’observer une diminution de la mortalité. La recherche de nouvelles solutions thérapeutiques est essentielle pour espérer diminuer la mortalité due au cancer, ainsi que limiter les effets indésirables pour les cancers avec des taux de guérison les plus élevés. Dans ce contexte, ce projet vise à identifier de nouveaux traitements efficaces contre différents types de cancers, à partir de modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris (modèles de PDX). En testant des médicaments présélectionnés lors d’analyses préalables (modélisations informatiques, in vitro), nous pourrons définir les médicaments qui ont un effet anticancéreux prometteur, ainsi que définir les doses et les associations thérapeutiques les plus adaptées. Grâce à la diversité et à la caractérisation approfondie de notre collection de modèles PDX, nous pourrons également mieux comprendre pourquoi certains traitements fonctionnent mieux sur certaines tumeurs ou chez certains patients. À terme, ces travaux devraient permettre de proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients pour lesquels les traitements actuels sont inefficaces ou inexistants, améliorer l’efficacité des traitements disponibles et réduire les effets secondaires associés aux thérapies anticancéreuses actuelles. Ainsi, ce projet participera à réduire la mortalité due aux cancers.

Procédures

Greffe : implantation d’un fragment tumoral sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané au moment de la chirurgie ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : biquotidienne ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute. Prélèvement de sang : préhension des animaux à une fréquence dépendant des besoins en prélèvements, 16 prélèvements seront effectués maximum par animal. La durée de préhension n’excèdera pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

Stress dû à l‘administration de molécules: nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée.

Devenir

Les animaux pour lesquels les tumeurs se seront développées seront euthanasiés pour réaliser les analyses associées (biologiques, histologiques). Les animaux n’ayant pas développé de tumeur malgré la greffe d’un fragment tumoral seront euthanasiés compte tenu des nuisances occasionnées.

Remplacement

Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent le plus efficace. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, une fois les tests préliminaires terminés, et les molécules les plus prometteuses identifiées, il est nécessaire de poursuivre leur évaluation chez l’animal. Ces études sont réalisées sur un nombre d’animaux permettant d’obtenir des résultats fiables sur l’effet antitumoral des molécules testées. C’est une étape nécessaire pour constituer un dossier d’Autorisation de Mise sur le Marché des médicaments.

Réduction

Ce projet utilise le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables lors des étapes avancées d’évaluation des traitements. Les expériences sont réalisées sur des groupes de souris suffisants pour réaliser les tests statistiques adéquats et valider l’effet des médicaments testés avant des essais cliniques chez l’Homme. La croissance des tumeurs est mesurée de manière standardisée pour savoir si le traitement fonctionne : s’il stabilise ou diminue le volume de la tumeur. De plus, les animaux dont les tumeurs ne se développent pas sont utilisés pour la formation en vue de l’acquisition, de l’entretien et de l’amélioration des compétences professionnelles du personnel, ce qui permet de limiter encore l’usage d’animaux supplémentaires. La phase de formation est intégrée dans ce projet.

Raffinement

Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical et lors de prélèvements invasifs, les animaux recevront une anesthésie générale. Les produits d’anesthésie générale proposés sont suffisants pour obtenir un effet anti-douleur en plus de l’effet anesthésique profond pour le temps et le type d’intervention réalisée. Un point de compression sera réalisé sur le site de prélèvement pour éviter l’hémorragie. Si une perte de poids est observée, un supplément nutritionnel sera proposé à l’animal. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire. Si ces points de raffinement ne sont pas suffisants, les mesures associées aux points limites de ce projet seront appliquées.

Choix des espèces

Nous utilisons des souches murines immunodéficientes qui sont classiquement utilisées pour des greffes de fragments tumoraux issus de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines afin d'homogénéiser les conditions de croissance entre les différentes études.

18 000 souris, 2 000 rats et 2 050 hamsters dorés vont recevoir pendant jusqu'à soixante semaines une nourriture riche en graisses et en sucres, et une eau sucrée, afin de développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 240 piqûres de la veine caudale par animal pour mesurer la glycémie, et le porteur reconnaît que la maladie induite peut aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. La majorité de ces 22 050 rongeurs part ensuite vers le laboratoire d'un client qui les utilisera dans son propre projet, les cinquante hamsters servant à entraîner le personnel au prélèvement sanguin étant, eux, tués. Rendre malades des rongeurs par lots pour les livrer comme modèles d'évaluation de médicaments : le porteur compte ce travail parmi les bénéfices pour l'animal, au titre de "l'amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non- alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés chez nos clients pour évaluer les effets de médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesurer la glycémie pourront être faits, et consisteront en un prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale, avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum), sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements sur toute la durée du protocole). La durée du prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucres et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les animaux qui auront servi à l’entrainement au prélèvement sanguin seront mis à mort, ne pouvant être utilisés dans une autre procédure.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Le nombre d’animaux pour chaque espèce est estimé selon un prévisionnel de demandes basé sur les années précédentes. Les animaux dédiés à l’entraînement ne concernent que les hamsters, car la maîtrise du prélèvement sur la veine saphène nécessite une phase d’apprentissage préalable avant toute manipulation sur les animaux du protocole.Un nombre de 5 hamsters pourra être utilisé pour l’entrainement des personnes au prélèvement à la veine saphène avant chaque lot. Avec 2 lots par an, il sera utilisé 50 hamsters sur les 5 ans.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle.

Nourries pendant quatre mois d'un régime riche en sucres et en graisses jusqu'à devenir obèses, une partie des 664 souris de ce projet passe ensuite sur la table d'opération pour un arrêt puis une reprise de la circulation sanguine dans le foie, sous anesthésie, pendant quatre-vingt-dix minutes. Toutes subissent trois à quatre prélèvements sanguins, certaines reçoivent deux administrations de molécules agissant sur les lipides, et les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. L'enjeu déclaré est de rendre greffables des foies stéatosiques aujourd'hui écartés, et le projet sert aussi à la formation professionnelle. Toutes les souris sont tuées, le porteur précisant que les prélèvements d'organes prévus sont "incompatibles avec le maintien en vie des animaux".

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients lorsqu'un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé comme l’obésité ou le diabète. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion, inévitable en transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Les organes dits marginaux, comme les foies avec stéatose, sont encore plus sensibles à ces lésions d’ischémie reperfusion, d’où la nécessité d’évaluer des molécules pour les protéger et pouvoir les utiliser en transplantation. Des recherches récentes ont montré une altération précoce du métabolisme des lipides après une ischémie dans le foie avec apparition de lipides toxiques. Le but de notre projet est de déterminer si l'ischémie du foie sain ou avec stéatose conduit aussi à l'apparition de lipides dits toxiques et s'il est possible de limiter les lésions du foie après ischémie reperfusion en utilisant des molécules qui agissent sur les lipides toxiques.

Bénéfices attendus

A court terme, cette étude permettra de mieux comprendre les modulations précoces du métabolisme lipidique après ischémie sur foies sains et stéatosiques et leurs implications dans la genèse des lésions hépatiques. A long terme, ce projet vise à réhabiliter des greffons stéatosiques aujourd’hui récusés pour la transplantation en mettant au point des stratégies thérapeutiques limitant la production d’espèces lipotoxiques, dont le nombre va croitre massivement dans les années à venir en raison de la pandémie d’obésité, et ainsi répondre à la pénurie de greffons que subit aujourd’hui la France.

Procédures

Certains animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois pour provoquer une stéatose hépatique. Tous les animaux subiront 3 à 4 prélèvements de sang (durée de moins de 5 minutes) faits sous anesthésie pour mesurer différents paramètres biologiques et une chirurgie pour réaliser l'ischémie-reperfusion du foie (durée de 90 minutes) sous anesthésie également. Les prélèvements de sang seront espacés d'un minimum de 20 heures. Parmi la totalité des souris, une partie n’aura aucune administration de molécules et d’autres souris auront 2 administrations de molécules agissant sur le métabolisme lipidique (durée de moins de 5 minutes). Les 2 administrations seront espacées au moins de 90 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre une obésité. Les prélèvements sanguin (acte

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles de foie in silico ou in vitro, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la complexité cellulaire du foie, le métabolisme des lipides et les lésions d’ischémie reperfusion. De plus, les modèles de perfusion de foies ex vivo ne nous permettent pas non plus d’étudier le remodelage du lipidome hépatique et plasmatique.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition sera de 3 à 5 souris par cage. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie, sous anesthésie générale, avec un maintien de la température corporelle.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène chez la souris, qui mime une obésité environnementale chez l’homme, est validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité chez cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques déjà présents au laboratoire. 4) La souche de souris sélectionnée offre moins de variabilité dans la réponse au régime occidental que d'autres souches de souris et développe moins de shunt porto-systémique comme mis en évidence dans notre précédente saisine

Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale pendant trente minutes pour qu'un produit soit injecté dans le cerveau de leurs embryons, à treize jours de gestation. Les souriceaux de zéro à trois jours reçoivent à leur tour une injection intracérébrale sous anesthésie. 450 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'objet déclaré étant de former de nouveaux chercheurs à ces gestes puis à l'imagerie des circuits synaptiques. Le porteur mentionne des douleurs abdominales après l'opération, un risque de fausse couche et des cas où la mère refuse de s'occuper des souriceaux injectés. Tous les animaux sont tués à la fin, leur cerveau prélevé.

Objectifs

Le système nerveux central est composé de différents types de neurones dont la morphologie et la physiologie varient considérablement. Cette diversité commence au cours du développement embryonnaire et est déjà observable dans les cellules immatures qui donneront naissance à des neurones. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant la différenciation et la maturation des cellules à différents stades du développement, nous procéderons au transfert de gènes dans le cerveau embryonnaire ainsi que durant les trois premiers jours de vie. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs aux méthodes, qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement. Une meilleure maîtrise de ces techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d'expérimentations pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs à ces deux méthodes, qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement. Une meilleure maîtrise de ces techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d'expérimentations pour leurs besoins de recherche. Le projet de cette formation est également de présenter des techniques d’imagerie à haute résolution, permettant d’observer et d’étudier la dynamique des circuits synaptiques dans des tranches du cerveau.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, au cours de laquelle une injection sera réalisée chez les embryons (durée approximative : 30 minutes, intervention unique). Les nouveau-nés (âgés de 0 à 3 jours) recevront également une injection sous anesthésie (durée inférieure à 5 minutes, intervention unique).

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur abdominale post opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice. Dans de très rares cas, les souris enceintes pourraient avoir des problèmes de mobilité après la chirurgie ou une fausse couche. Nuisances liées aux injections : stress liée à l’anesthésie. Dans de très rares cas, la mère des souriceaux n’accepte pas de s’occuper des nouveau-nés injectés.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.

Remplacement

Plusieurs phases de ce projet ont été effectuées in vitro sur différentes lignées cellulaires. Actuellement, nous souhaitons étudier le développement embryonnaire de différents types de neurones et leur intégration dans les circuits neuronaux in vivo. Cela nous permettra de mieux comprendre la physiologie des circuits neuronaux du cortex cérébral. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Notre formation repose sur une approche pédagogique de type hands-on training, c’est-à-dire un apprentissage par la pratique. Les compétences techniques et analytiques visées dans cette formation ne peuvent être pleinement acquises qu’à travers une mise en pratique directe. Les étudiants doivent pouvoir effectuer les expériences afin de recueillir des échantillons biologiques viables, nécessaires pour les étapes ultérieures du programme de formation, notamment l’imagerie à haute résolution et les analyses de biologie moléculaire. Ces étapes requièrent des matériaux biologiques d’une qualité et d’une intégrité qui ne peuvent être obtenues à partir de modèles in silico, de cadavres ou de démonstrations filmées.

Réduction

Nous faisons un effort particulier pour faire intervenir, lors de ces formations, des spécialistes expérimentés dans les techniques enseignées. Leur haut niveau d’expertise garantit une démonstration précise et efficace, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’apprentissage. Grâce à la transmission rigoureuse de leur savoir-faire, les étudiants acquièrent rapidement les compétences requises, réduisant ainsi le besoin de répétition inutile des procédures. Nous utilisons le nombre minimal de souris permettant à la fois de démontrer correctement les techniques et d’offrir aux étudiants une opportunité d’entraînement pratique suffisante pour atteindre les objectifs pédagogiques fixés. Cette approche assure un équilibre entre la qualité de la formation et le respect du principe de réduction dans l’utilisation d’animaux vivants.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie et une installation tout au long des procédures chirurgicales d’un contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux injectés et/ou opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souris pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront définis et appliqués.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette formation car elle correspond à l’espèce la plus couramment utilisée dans les laboratoires de recherche en neurosciences, notamment pour les études portant sur le système nerveux central. Les techniques enseignées lors de cette formation sont directement applicables aux modèles murins utilisés dans la grande majorité des projets de recherche académique et préclinique. De plus, la souris présente des avantages pratiques et scientifiques importants : elle est bien caractérisée sur le plan neuroanatomique et génétique, de nombreux outils et lignées transgéniques sont disponibles, et son utilisation est conforme aux standards internationaux en recherche biomédicale. Ainsi, le recours à la souris permet d’assurer la pertinence, la reproductibilité et le transfert direct des compétences acquises par les étudiants vers leurs futures activités professionnelles Nous devons cibler les cellules progénitrices en une période embryonnaire précise, nous utiliserons des gestantes à 13 jours de gestation. Il s’agit d’un stade où les embryons sont facilement accessibles pour l'intervention. L’injection chez les souriceaux permet de moduler l’expression génétique des neurones et des autres types cellulaires dans toutes les régions cérébrales, grâce à une technique simple et rapide.

840 femelles, 756 souris et 84 rates, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées dès la fin de l'opération sans attendre le réveil. Chaque animal reçoit deux injections en étant conscient, puis subit une ovariectomie de quarante-cinq minutes, laparotomie, dissection, ligature des vaisseaux, ablation des ovaires et sutures, avec un risque d'hémorragie si l'hémostase du stagiaire est insuffisante. Un animal par participant, quarante participants par session, quatre sessions par an pendant cinq ans : le compte est celui d'une obligation réglementaire de formation, pas d'une recherche. Le porteur indique que les stagiaires s'entraînent d'abord sur des substituts synthétiques, des pièces de boucherie et des cadavres de rongeurs, avant de conclure que la maîtrise du geste "nécessite" un animal vivant.

Objectifs

Les personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales sur des animaux dans le cadre des projets scientifiques, ont l’obligation réglementaire de suivre un enseignement théorique et pratique à la chirurgie expérimentale. Le projet concerne les travaux pratiques d’une formation aux bases de la chirurgie expérimentale à destination de ces personnes. Elle s’adresse à des personnes ayant validé préalablement une formation initiale à l’expérimentation animale (niveau applicateur ou concepteur). Chaque session de formation totale (formation théorique + formation pratique) dure 22h. Au cours de celle-ci, les participants sont préalablement sensibilisés à tous les aspects théoriques à l’occasion des cours et travaux dirigés. La formation pratique vise en particulier, sur un exemple pratique d’ovariectomie réalisée chez le rongeur, 1/ à leur dispenser les moyens de raffiner les procédures chirurgicales et à réduire le nombre d’animaux nécessaires, 2/ à acquérir les gestes nécessaires au bon déroulement d’une intervention chirurgicale réalisée dans le respect du bien-être animal. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux). Elle enseigne ainsi dans le respect des 3R les différentes étapes d’une intervention chirurgicale incluant la préparation de l’animal, l’anesthésie, les soins péri- et post-opératoires, la bonne conduite de l’analgésie, la maitrise de la technique opératoire.

Bénéfices attendus

Chaque participant recevra ainsi une formation pratique pour mener à bien une intervention chirurgicale prenant en compte le respect du bien-être animal et la règle des 3R. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes chirurgicaux permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles tout en réduisant au maximum le stress et la souffrance des animaux et leur nombre.

Procédures

Chaque animal recevra en vigile une injection sous-cutanée (analgésique) 15s, puis une injection intrapéritonéale (anesthésique)15s. Ces gestes induisent un stress/et ou douleur légère de courte durée (15s) chez les animaux. L'anesthésie peut également être réalisée par anesthésie gazeuse. Il subira ensuite une intervention chirurgicale (ovariectomie) réalisée sous anesthésie d'une durée totale de 45 minutes de douleur modérée consistant en une laparotomie, une dissection atraumatique, une ligature vasculaire, une exérèse d’organes et des sutures dans le plan musculaire et cutané. La mise à mort des rates sera réalisée par injection intrapéritonéale réalisée sous sédation (15s)

Impact sur les animaux

Chaque animal recevra en vigile une injection sous-cutanée (15s) puis une injection intrapéritonéale (15s). Ces gestes induisent un stress/et ou douleur légère de courte durée chez les animaux. L'anesthésie peut également être réalisée par anesthésie gazeuse à l'isofluorane ( 3-4% en induction 30 secones à 2 min pour les souris et 1 à 3 minutes pour les rates puis 1,5-2% ). Il subira ensuite une intervention chirurgicale (ovariectomie) réalisée sous anesthésie d'une durée totale de 45 minutes au maximun.. L’animal peut être victime d’une hémorragie en cas d’une hémostase insuffisante. La couverture analgésique proposée permet de réduire au maximum la douleur liée à l’intervention chirurgicale.

Devenir

42 animaux mis à mort par session de formation soit au total 840 animaux sur 5 ans Un seul animal par participant permettra la réalisation d’une chirurgie complète (rat ou souris). L’utilisation d’animaux supplémentaires sera de 2 animaux/session grâce à l’entrainement préalable que les participants recevront en amont, diminuant ainsi le risque d’échecs. Au maximum, 4 sessions de cette formation réglementaire seront réalisées par an dans cet établissement et le nombre de stagiaires par session de formation est limité à 40 participants. Le nombre d’animaux pour la durée du projet sera donc de (1 animal /participant X 40 participants/session X 4 sessions/an X 5 ans) + 2 animaux supplémentaires/session X 4 sessions/an X 5 ans) = 800+40 soit 840 animaux pour la durée du projet.

Remplacement

La formation est réalisée de telle façon que les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant en utilisant des substituts synthétiques inertes, des pièces de boucherie ou des cadavres de rongeurs euthanasiés indépendamment des besoins de la formation. Cela favorise la sérénité́ et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. La maitrise des gestes associés à une procédure chirurgicale nécessite cependant dans l’état actuel des connaissances un entrainement pratique sur modèle animal.

Réduction

De notre expérience, 75 à 95% des animaux nécessaires à cette formation sont couverts par des animaux de surplus et donc destinés à être euthanasiés dans l’établissement utilisateur accueillant cette formation. Seuls 5 à 25% maximum des animaux nécessaires à cette formation nécessiteront une provenance d’un fournisseur. Ce qui contribue à la réduction. Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés, et grâce à l’entrainement préalable que les participants recevront en amont, un seul animal par participant permettra la réalisation d’une chirurgie complète (rat ou souris). En effet, le passage à la chirurgie pratique ne sera pas réalisé tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé, diminuant ainsi le risque d’échecs et l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement à part et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment afin de réduire au maximum le stress des animaux. Les gestes réalisés sur animaux vigiles (sous cutanée, intrapéritonéale) sont normalement maitrisés par les participants qui ont validé au préalable une formation initiale à l’expérimentation animale niveau applicateur ou concepteur, limitant ainsi le stress et la douleur liés à la réalisation de ces gestes techniques. Les encadrants ayant sensibilisé les participants aux différentes phases de l’anesthésie, s’assurent que chaque participant réalise l’intervention chirurgicale sous anesthésie générale conformément aux bonnes pratiques de narcose, myorelaxation et analgésie. Un analgésique est administré 30 min avant le début de la procédure chirurgicale en quantité suffisante pour limiter toute douleur per-opératoire, sa durée d’action couvrant la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie sans attendre le réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect des bonnes pratiques, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques chirurgicales. Cette procédure chirurgicale sera réalisée dans un ratio encadrant/ participant (1/4) permettant de détecter précocement tout signe de souffrance des animaux ou une couverture anesthésique insuffisante et de prendre les mesures correctives adéquates (prolongation de l’anesthésie ou mise à mort précoce).

Choix des espèces

Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche, ces travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Pour les travaux pratiques de chirurgie, la procédure chirurgicale enseignée étant une ovariectomie, des femelles sont utilisées.

Valider un geste chirurgical, pas produire des connaissances : 10 rongeurs diurnes vont subir une opération d'une heure et demie sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des électrodes sont implantées après incision du scalp, puis chaque animal reste seul en cage pendant une semaine. Le porteur indique que la plaie peut s'enflammer au point que l'animal se gratte et arrache ses points de suture, et qu'une infection reste possible. Les dix animaux sont tués pour autopsie, afin de vérifier ce que la chirurgie a fait à leurs tissus, et le RNT ne nomme pas leur espèce.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un projet de recherche plus large visant à étudier les effets de la lumière ambiante sur le cycle veille/sommeil au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne et chez un modèle animal diurne. Le projet de recherche scientifique se propose de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise le cycle veille/sommeil chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur les états de vigilances. Pour tester cette hypothèse il sera nécessaire d'enregistrer le cycle veille/sommeil sur les animaux au moyen d'électrodes d'enregistrement. L'objectif du présent projet est l'acquisition et la validation de la compétence nécessaire à la mise en oeuvre de ces enregistrements sur l'espèce diurne. Cette étape vient en amont de la mise en oeuvre de l'étude scientifique.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur le cycle veille/sommeil pourrait permettre de participer à la prévention des troubles du sommeil et de leurs conséquences comme les troubles de l'humeur, les troubles métaboliques comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter. Le transfert et la validation de l'approche sur l'espèce diurne permettra à la partie du projet scientifique relative à l'étude du sommeil de démarrer dans des conditions qui garantissent le bien-être des animaux, la qualité des données enregistrées et donc leur exploitation statistique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront placés en cage individuelle à l'issu de la chirurgie pendant une semaine.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induit une douleur modérée, de l'inflammation au niveau de la plaie cutanée (incision du scalp) ce qui peut conduire l'animal à se gratter et à arracher les points de suture. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir. La contention nécessaire à la mise en place de l'anesthésie pourrait induire un stress léger transitoire. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle enrichie pendant une semaine pendant laquelle le suivi de l'état de santé des animaux sera réalisé. Cette situation pourrait induire un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour autopsie afin de vérifier macroscopiquement les conséquences tissulaires de la procédure chirurgicale.

Remplacement

La régulation du cycle veille/sommeil et la mesure des effets de la lumière sur ce cycle implique plusieurs stuctures nerveuses et horloges cérébrales qui fonctionnent en réseau interconnectés et l'intégrité de la rétine qui leur relaie l'information lumineuse. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-structures.

Réduction

Il n'y aura pas d'analyse statistique des résultats car il s'agit d'acquisition de compétences. Le nombre d'animaux a été défini sur la base de la complexité de la chirurgie, des connaissances du modèle animal et de sa physiologie et du risque anesthésique du fait que ces animaux qui sont diurnes seront opérés de jour moment où ils sont normalement actifs et au pic de leur métabolisme contrairement au rat et à la souris. Dèss que l'approche chirurgicale aura été validée comme reproductible la procédure sera stoppée.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée à l'espèce. Tout au long de la chirurgie, les animaux seront maintenus sur tapis chauffant thermostaté (température de 38°C) muni d'une sonde rectale pour éviter de placer l'animal en hypothermie. Les yeux seront recouvert de gel oculaire hydratant pour éviter le déssèchement de la cornée. La chirurgie sera réalisée en conditions aseptiques. Après la chirurgie, les animaux seront réhydratés par injection d'une solution saline isotonique et stérile puis placés sous lampe chauffante jusqu'à leur complet réveil et sous surveillance. La douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie par la mise en place d'un traitement analgésique post-opératoire par prise de médicaments dans l'eau de boisson. La prise hydrique quotidienne sera alors mesurée. Dès le lendemain de la chirurgie, l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement à l'aide d'une grille de score pemettant d'objectiver des points limites pertinents suffisamment précoces pour interrompre dès que nécessaire la procédure et ainsi limiter la souffrance animale. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront hébergés pendant une semaine dans seuls des cages enrichies avec plus du matériel de nidification pour aider à la thermorégulation et un bâton à ronger. Nous validerons que l'ajoût d'un tunnel en verre dans la cage est compatible avec la pose d'électrodes et d'un connecteur à la surface du crâne, afin de garantir l'intégrité du dispositif implanté qui permettra de collecter les données scientifiques et donc d'obtenir un résultat exploitable (principe de réduction).

Choix des espèces

Il s'agit d'un projet de formation visant à transférer une compétence chirurgicale à un modèle de rongeur diurne afin de permettre l'enregistrement du sommeil sur cette espéce. Le sommeil sera étudié sur de jeunes adultes lorsque les structures nerveuses impliquées sont mâtures.