Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses de mutations qui leur font développer une maladie neurodégénérative avec l'âge, les souris de ce projet reçoivent en plus un sepsis provoqué par chirurgie, à six mois ou à douze mois. 200 d'entre elles vont être utilisées, 96 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 64 modéré et 40 léger, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles présentent pendant 24 à 48 heures une baisse d'activité, le poil hérissé et parfois des diarrhées liquides, avant d'être transportées vers un second établissement pour une imagerie cérébrale sous anesthésie profonde. Les souris qui servent à produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leurs modifications génétiques.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Reproduction assistée dans l’espèce féline : prélèvement d’ovocytes guidé par échographie, de maturation ovocytaire ex vivo, de fécondation in vitro et de congélation d’embryon.
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Hébergés dans un établissement utilisateur et porteurs sains d'une maladie génétique de la jonction entre le nerf et le muscle, quatre chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis stérilisés et proposés à l'adoption. Les trois chattes subissent une induction des chaleurs, une ponction d'ovocytes guidée par échographie sous anesthésie générale, puis une ablation des ovaires. Le mâle est soumis jusqu'à six fois à un cathétérisme urétral sous anesthésie pour prélever sa semence, avant d'être castré. Le porteur mentionne des complications possibles, infection utérine, hémorragie, douleur après l'opération, pathologie urinaire liée aux sondages répétés, et présente la ponction échoguidée comme un raffinement par rapport au prélèvement par ouverture de l'abdomen.
Objectifs
La reproduction assistée a fait d’importantes avancées chez certains grands félins sauvages, constituant un outil précieux dans la préservation de ces espèces. Cependant elle reste très peu explorée chez nos chats domestiques, et chez les petits félins sauvages. Chez ces derniers, elle pourrait représenter un apport à la préservation des espèces. Chez les chats domestiques, elle permettrait aux éleveurs de faciliter les croisements entre individus distants géographiquement ou dans le temps, et de préserver des gamètes ou embryons provenant d’individus d’intérêt. En effet actuellement, contrairement à ce qui a pu être développé dans l’espèce canine, la reproduction chez le chat domestique est très majoritairement réalisée sans assistance. Ce projet a pour objectif premier d’évaluer la transposition de méthodes mises au point chez les grands félins, avec une expérience récemment publiée chez un chat domestique, à consolider. L’approche nouvelle inclut le prélèvement échoguidé d’ovocytes (« ovum pick-up ») chez la chatte, la maturation de ces ovocytes en culture (ex vivo), la fécondation in vitro et la congélation des embryons obtenus. Ce projet permettra également de préserver des embryons issus de chattes porteuses saines d’une maladie de la jonction entre le nerf et le muscle (myasthénie congénitale), liée au gène le plus impliqué dans ces pathologies chez l’Homme (ColQ) et de cryopréserver ce modèle d’intérêt biomédical, qui pourra ainsi être utilisé dans l’éventualité d’un besoin pour un projet sur cette maladie. Les 3 chattes porteuses seront stérilisées à la fin du projet et mises à l’adoption, ainsi que le mâle donneur de sperme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'optimiser un protocole de prélèvement d’ovocytes, maturation ex vivo et fécondation in vitro chez la chatte domestique, et ainsi d’élargir les outils de reproduction assistée disponibles dans cette espèce. Les adaptations qui auront été nécessaires par rapport aux protocoles existants chez les grands félins sauvages pourront constituer une base de travail pour appliquer ces méthodes à des espèces de petits félins sauvages, et ainsi contribuer à la sauvegarde de ces espèces. Enfin, ce projet sera mené sur des chats porteurs d’une anomalie génétique de potentiel intérêt en recherche biomédicale, et les cryopréservations effectuées dans le cadre de ce projet permettront de préserver un possible modèle animal d’intérêt pour la pathologie humaine.
Procédures
- Prélèvements d'ovocytes guidés par échographie, sous anesthésie générale, 1 fois pour chacune des trois chattes. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 1 heure - Ovariectomie (stérilisation par retrait chirurgical des ovaires) sous anesthésie générale, 1 fois pour chacune des trois chattes. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 1 heure - Prélèvements de sperme sous anesthésie générale par cathétérisme urétral (équivalent à un sondage urinaire), 6 fois maximum sur le chat mâle. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 30 minutes - Orchidectomie (castration) sous anesthésie générale 1 fois sur le chat mâle. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 30 minutes
Impact sur les animaux
Sur les chattes, les effets indésirables possibles incluent : - La survenue d'infections utérines induites par le protocole d’induction de chaleurs (complication rare). - D'éventuelles complications chirurgicales de la procédure de ponction d’ovocyte incluant hémorragie, douleur post-opératoire. - Le stress lié aux anesthésies. Sur le chat : - Le stress lié aux anesthésies. - L'éventuelle survenue d’une pathologie du bas appareil urinaire suite aux cathétérismes urétraux répétés.
Devenir
Nous n'attendons pas de séquelles suite à la mise en oeuvre des différentes procédures prévues sur les 4 chats inclus dans le projet. S'agissant par ailleurs de chats en bonne santé et très sociables, qui seront stérilisés en fin de projet, ils seront mis à l'adoption.
Remplacement
La problématique du projet portant sur la reproduction assistée chez le chat domestique, et le projet nécessitant de travailler sur des gamètes provenant d’individus de cette espèce, il n’est pas techniquement possible d’obtenir ce type de cellules sans avoir recours à un prélèvement sur l’animal (chat domestique). Néanmoins, des phases de mise au point de la technique de prélèvement d’ovocytes ont été réalisées ex vivo au préalable, permettant d’optimiser certaines conditions de prélèvement, notamment la dépression à appliquer pour prélever les ovocytes.
Réduction
Il n’est pas prévu de réaliser de test statistique, s’agissant d’un protocole de validation méthodologique. Le nombre de 3 femelles nous permettra de garantir l’obtention d’un nombre suffisant d’ovocytes pour tester différentes conditions de culture. Sur la technique d’ovum pick-up, celle-ci a été testée jusqu’à aujourd’hui sur une seule chatte, avec succès. Ces trois nouvelles chattes permettront de cumuler davantage de données sur cette nouvelle technique. Un seul chat mâle sera suffisant pour produire la semence nécessaire aux essais de fécondation in vitro. Enfin, ce projet, de par son objectif secondaire qui est de cryopréserver une lignée de chats actuellement hébergés au sein d’un établissement utilisateur pour stopper cet hébergement et placer les chats présents, s’inscrit également dans une démarche de réduction.
Raffinement
Les chats seront hébergés dans un espace de surface supérieure aux exigences réglementaires, aménagé avec des enrichissements permettant aux animaux d’exploiter la verticalité (tablettes en hauteur, arbres à chats), plusieurs zones de confort disponibles (coussins, paniers), des jouets variés à disposition. La nourriture (croquettes) est distribuée dans des « pipolinos », permettant aux chats d’augmenter leur budget-temps alimentation. Les bacs de litière sont changés quotidiennement 7j/7 et des visites tri-quotidiennes 7j/7 sont réalisées par l’équipe de zootechniciens. Dans le cadre du projet, toutes les procédures chirurgicales ou celles impliquant un stress ou nécessitant l’immobilité des chats seront réalisées sous anesthésie générale, et une analgésie adaptée à l’intervention mise en œuvre sera implémentée. Sur le projet lui-même, la mise au point de la technique d’« ovum pick-up » s’inscrit également dans une démarche de raffinement, puisqu’elle a vocation à remplacer le prélèvement plus invasif par laparotomie, y compris sur des espèces de félins sauvage dans le cadre de leur préservation. Enfin, des points limites précoces et adaptés ont été définis, permettant une intervention rapide en réponse à tout signe précurseur de douleur ou de stress.
Choix des espèces
S’agissant de mettre au point une méthodologie de cryopréservation d’embryons dans l’espèce féline, le choix de l’espèce s’est porté sur le chat domestique. Animaux adultes en âge de reproduire, en lien avec la problématique du projet.
Elevage de souris génétiquement modifiées qui développent spontanément des cancers mammaires
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Produire des souris qui développent d'elles-mêmes des tumeurs mammaires, puis les tuer pour en prélever les tissus : le projet ne prévoit pas d'autre activité que l'élevage d'une lignée transgénique. 134 souris femelles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'avoir jamais observé les stades les plus avancés, tout en admettant qu'ils pourraient s'accompagner d'une perte de poids, d'une apathie et d'une difficulté à se mouvoir. La conduite tient à un seuil de taille : quand un zootechnicien palpe une tumeur qui approche du maximum autorisé, il le signale et l'animal est sorti ou tué dans les plus brefs délais.
Objectifs
Le but du projet est de produire des souris présentant spontanément des tumeurs mammaires afin de prélever des tissus sur ces animaux après euthanasie.
Bénéfices attendus
En permettant l'élevage de cette lignée transgénique qui développe des tumeurs, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers mammaires.
Procédures
C’est l’élevage d’une lignée de souris présentant spontanément des tumeurs mammaires.
Impact sur les animaux
Seules les souris femelles (et pas les mâles) transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Il n'y a donc pas d'intervention pour favoriser ce processus de cancérisation. Cependant, même si nous ne l'avons jamais observé, aux stades les plus avancés de la maladie, des souris pourraient présenter des signes d'affaiblissement, avec une perte de poids et une apathie, voire une difficulté à se mouvoir si les tumeurs mammaires étaient maintenues au-delà du point limite.
Devenir
Les souris présentant des tumeurs sont euthanasiées à la fin des procédures, soit pour des prélèvements post-mortem, soit parce qu'elles atteignent le point limite.
Remplacement
Nos souris transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Elles serviront à générer des prélèvements après euthanasie qui seront utilisés en recherche. Même s’il est maintenant possible d'utiliser des cellules en culture, il n'est pas possible de reproduire la diversité de cellules présents dans une tumeur, ni l'évolution de la nature de ces cellules au cours du temps. L’étude de ces prélèvements permettra de comprendre les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein.
Réduction
Le nombre de souris est limité au minimum pour maintenir la colonie et produire les animaux nécessaires pour notre étude. Ce nombre doit permettre d'obtenir un nombre suffisant d'animaux à prélever. Nous prévoyons que 134 souris développant des tumeurs seront produites au cours des 5 ans du projet.
Raffinement
Les souris sont élevées avec un enrichissement du milieu au niveau de la litière avec du coton et une cabane en carton. Les souris sont suivies quotidiennement et lorsque des tumeurs mammaires apparaissent, un suivi visuel et par palpation est réalisé. Si le zootechnicien constate l’apparition d’une tumeur qui pourrait s'approcher de la taille maximale autorisée, il doit le signaler immédiatement et l’équipe de recherche demande la sortie de l’animal ou l’euthanasie dans les plus brefs délais.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les reproductions des animaux de 6 semaines en capacité optimale de reproduction sont utilisés. Les animaux utilisés à des fins scientifiques ont 4, 8 ou 12 semaines.
Etude de pathologies immunitaires chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 200 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir six à dix prélèvements sanguins mensuels et trente injections en deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés sont maintenus en contention pour une biopsie de queue d'un à deux millimètres, puis séparés de leur mère cinq minutes au plus. Les souris développent la pathologie immunitaire recherchée, dont le porteur attend un stress ou une douleur légère à modérée. Aucune n'est déclarée gardée vivante à l'issue, le porteur indiquant que "l'ensemble des animaux devront être utilisés pour arriver à une conclusion statistiquement valide", et le bénéfice attendu tient à un "savoir crucial au développement de traitements thérapeutiques adaptés".
Objectifs
Ce projet vise à étudier le rôle d'un gène dans le contrôle de la réponse immunitaire à l'état physiologique ainsi qu'à déterminer les mécanismes par lesquelles des mutations de ce dernier entraînent la maladie chez la souris. Pour ce faire, nous étudierons la réponse immunitaire au sein de modèles de souris dans lesquels ce gène d'intérêt est soit non-fonctionnel, soit muté. Les connaissances apportées par cette étude permettront d'approfondir la compréhension de ces maladies ainsi que leur traitement.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d'approfondir les connaissances sur les mécanismes de la réponse immunitaire à l'état physiologique et comment leur altération peut conduire au développement de maladies immunitaires. Un savoir crucial au développement de traitements thérapeutiques adaptés.
Procédures
- des prélèvements sanguins d’une minute seront effectués sur des animaux tous les mois jusqu'à leur 6-10 mois pour un total de 6-10 prélèvements par animal . - des traitements par injection de quelques secondes seront administrés à des animaux vigiles tous les 2 jours sur une durée de 2 mois = 30 injections. - les nouveau-nés subiront une contention courte d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé.
Impact sur les animaux
- La piqûre de l'aiguille peut provoquer un léger stress/douleur chez l'animal. - La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress/douleur léger chez l'animal. - Le développement de pathologie immunitaire peut provoquer un stress/douleur léger à modéré chez l'animal. – La piqûre et la contention liée à l’injection de traitements peut provoquer un stress léger à modéré chez l’animal.
Devenir
L'étude a été optimisée de telle sorte que l'ensemble des animaux devront être utilisés pour arriver à une conclusion statistiquement valide.
Remplacement
La mise en place de pathologies immunitaires décrit un mécanisme complexe d'interaction entre le système immunitaire et les autres systèmes de l'organisme qui nécessite des expériences in vivo. Toutefois, des expériences préliminaires nous ont permis d’axer et planifier judicieusement cette étude.
Réduction
Les stratégies d'accouplement et le nombre d'animaux utilisés ont été calculés à partir de nos expériences antérieures afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des tests statistiques fiables et valides.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après génotypage pour vérifier qu’ils soient bien acceptés par leur mère. - Des points limites ont été prédéterminés minutieusement en tenant compte des différents phénotypes des souris. Un système de score associé permettra une prise en charge adaptée des souris notamment via un plus grand enrichissement de l'environnement et l'utilisation d'antalgiques/analgésiques. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par un personnel formé et compétent. Les prélèvements sanguins seront espacés dans le temps et avec des volumes faibles et des aiguilles fines. Les injections de traitements avec des aiguilles fines, des volumes faibles.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour étudier le développement du système immunitaire et ses pathologies associées, en particulier parce que son système immunitaire est proche de celui de l'Homme. En effet, le système immunitaire murin et humains partagent les mêmes sous-populations cellulaires. De plus, il est à noter qu'un grand nombre de mutations identifiées chez l'Homme comme causant la maladie immunitaire, lorsqu'introduites chez la souris entrainent la mise en place de pathologies similaires, confirmant leur proximité biologique dans des contextes aussi bien physiologiques que pathologiques. Les animaux seront utilisés à un stade de développement adulte permettant d’atteindre un stade de maturité immunitaire suffisant.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Opérées sous anesthésie pour déclencher un sepsis, transportées vers un second établissement, anesthésiées de nouveau une demi-heure pour recevoir un radiotraceur et passer à l'imagerie cérébrale, 200 souris au maximum vont être utilisées, dont 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris portent des modifications génétiques qui leur font développer une maladie neurodégénérative et des déficits cognitifs, le sepsis étant déclenché à six ou à douze mois d'âge. Le porteur décrit un poil hérissé, une posture voûtée, une baisse d'activité et des diarrhées dans les vingt-quatre à quarante-huit heures qui suivent, et une anesthésie profonde qui expose à un arrêt cardiorespiratoire. Les souris utilisées pour produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, les autres après l'imagerie, pour récupérer leurs tissus.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Rôle de l’inflammation dans un modèle de maladie cardiovasculaire chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.
Procédures
Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.
Remplacement
L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.
Prélèvement de tissus de souris transgéniques pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'extrémité de la queue, moins de trois millimètres, est coupée aux ciseaux sur des souriceaux âgés de cinq à dix jours, maintenus une trentaine de secondes. 37 750 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le geste sert à repérer celles qui portent la mutation cardiovasculaire recherchée, lesquelles partiront en reproduction ou vers d'autres protocoles, les autres étant tuées ou utilisées comme contrôles. Le porteur affirme que la douleur est moindre avant ossification "car le système nerveux n'est pas totalement développé", sans mentionner d'anesthésie ni indiquer combien de souriceaux seront tués faute de porter la bonne mutation.
Objectifs
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de pathologies cardiovasculaires. L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. L’objectif de ce projet est l'élevage de plusieurs modèles de souris présentant des modifications génétiques permettant de reproduire des pathologies humaines. Cet élevage implique d'identifier les animaux et d'identifier ceux qui expriment les mutations génétiques d'intérêt. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans d’autres projets de recherche.
Bénéfices attendus
L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. Les animaux seront ensuite utilisés dans divers protocoles autorisés qui s'inscrivent dans le domaine de la recherche cardiovasculaire.
Procédures
Afin d’identifier et de caractériser les souris exprimant les gènes modifiés. Celle-ci nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de seconde. Au moment d’être replacé dans sa cage d’hébergement, l’extrémité de la queue (moins de 3 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Cette manipulation très rapide ne dure pas plus de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 3mm) peut conduire à une légère perte de sang ainsi que du stress et une douleur limitée.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus postmortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt seront euthanasiés ou utilisés comme contrôles dans les projets de destinations ou en prélèvement post mortem. Les souris présentant des signes de souffrances seront euthanasiées. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Les pathologies cardiovasculaires sont complexes et font intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, les modèles murins nous permettent de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler des gènes particuliers.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des équipes de recherche. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. De plus nous réalisons les prélèvements de manière raisonnée. S'il s'agit d'une lignée établie, le prélèvement est réalisé uniquement sur la première portée afin de contrôler qu'il n'y ai pas de dérive génétique.
Raffinement
La manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des agents pathogènes. Le prélèvement est réalisé entre 5 et 10 jours afin de limiter la douleur. En effet le système nerveux n'étant pas totalement développer la douleur est moindre que sur un animal adulte. Les instruments utilisés sont désinfectés avant chaque utilisation et leur aiguisage est contrôlé avant utilisation. Après le prélèvement une compression du bout de la queue est effectuée afin de favoriser l'arrêt du saignement. Les souris seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance liés à une éventuelle infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Nous avons comme enrichissement dans les cages, des battons de coton, du kraft, des igloos, des tunnels et des bâtonnets de bois. En cas de signes cliniques pouvant entrainer un mal-être comme une modification du comportement, d’apparence, de poids, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
De nombreux modèles murins ont déjà été décrits, développés et validés pour les pathologies cardiovasculaires. Le modèle murin permet d'invalider des gènes particuliers donc d'étudier les mécanismes physiopathologiques sous jacent à ces gènes. Le bout de queue est sectionné avant ossification entre 5 et 10 jour, stade auquel la perception de la douleur est moindre. Les animaux utilisés pour les projets de recherche ultérieurs sont adultes (7-10 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis de pathologies qui affectent majoritairement des individus adultes.
Elevage de lignées murines présentant une inflammation chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.
Procédures
Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.
Remplacement
L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.
Réduction
Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).
Cryoconservation et redérivation de lignées transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Congeler du sperme et des embryons pour disposer d'un stock de secours des lignées de l'établissement : 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une vasectomie, les femelles un transfert embryonnaire par ouverture de l'abdomen, avec un risque d'hémorragie et d'arrêt cardiaque sous anesthésie que le porteur classe parmi les effets pouvant aller jusqu'au grave. Les mâles vasectomisés sont ensuite accouplés à des femelles pour déclencher leur ovulation et sont tués après plusieurs échecs successifs, les femelles porteuses étant gardées jusqu'au sevrage des petits. Le porteur présente cette gestion de stock comme une "alternative plus éthique" au maintien de lignées non utilisées, la finalité réelle restant l'intendance des lignées de l'animalerie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de cryoconserver des lignées murines de l'établissement utilisateur afin de disposer d’un stock dit de « backup » en cas de perte de la lignée ou pour toute autre nécessité, telle que la non-utilisation prolongée des lignées. Ces lignées pourront ainsi être redérivées ultérieurement dès que nécessaire (nouveaux projets, rafraîchissement ou perte de la lignée, etc.).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de proposer une alternative plus éthique au maintien ou au stockage de lignées non utilisées, autre que par la génération d’individus, afin de limiter fortement le nombre d’animaux mis à mort. Il en est de même pour le rafraîchissement de lignée, où plusieurs croisements (backcross) et donc plusieurs générations d’individus sont nécessaires avant l’utilisation des nouveaux animaux dits « rafraîchis » ou « backcrossés ».
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule de ces interventions (Procédures chirurgicales): vasectomisation ou transfert embryonnaire soit une seule chirurgie par animal et une fois seulement.
Impact sur les animaux
Pour la partie cryoconservation, des nuissances ou effets indésirables possibles de type légères à modérées sont attendues tels que: des douleurs ou du stress lié à l'injection, des effets liés aux hormones utilisées, ou des gênes dues à la stimulation de l’ovulation. Pour la partie redérivation (procédure chirurgicale), les effets secondaires peuvent aller de légers à graves, comme : un refroidissement important du corps pendant l’opération, pouvant provoquer un arrêt cardiaque à cause de l’anesthésie, des douleurs à cause de l’ouverture du ventre (gérées par des médicaments contre la douleur), un risque de saignement important si les vaisseaux sanguins ou les organes sont mal manipulés. Si cela arrive, l’animal est euthanasié. Après l’opération, les effets attendus sont en général légers à modérés : perte de poids importante (plus de 15 % en 3 jours), souvent causée par un manque d’activité ou d’appétit, signes de douleur ou d’inconfort (comme du stress ou un comportement apathique). Un outil spécial (le "Mouse Grimace Scale") est utilisé pour évaluer la douleur. Si l’animal souffre trop, il est euthanasié.
Devenir
Les animaux vasectomisés serviront tous à l'accouplement de stimulation des femelles ou seront mis au repos en vue du prochain accouplement. Les mâles ne donnant plus de résultats ( plusieurs échec successif aux accouplements) seront mis à mort. Les femelles ayant subit un transfert embryonnaire seront gardées jusqu'au sevrage des petits. Les femelles n'ayant pas subit de FIV seront réaccouplées jusqu'à l'obtention d'un bouchon vaginal.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à conserver et restaurer des lignées de souris génétiquement modifiées en congelant du sperme, des embryons ou des ovocytes, puis en les réimplantant pour faire naître de nouveaux animaux. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (en laboratoire, sur ordinateur ou sur tissus isolés) permettant de créer un animal vivant et fertile uniquement à partir de matériel génétique. Des techniques comme la culture cellulaire, la modélisation informatique ou les analyses moléculaires sont utilisées en amont pour vérifier la qualité du matériel et éviter de recourir inutilement à l’animal. Toutefois, pour obtenir des souris vivantes, le transfert d’embryons dans des femelles reste indispensable. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire à cette étape. Tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et leur souffrance : des méthodes alternatives (PCR, analyses informatiques, bases de données) sont privilégiées dès que possible pour réduire les procédures. La souche CBA/C57 a été choisie car elle s’occupe bien de ses petits, même en cas de petite portée, ce qui n’est pas toujours le cas chez d’autres souches.
Réduction
Ce projet vise à conserver des lignées de souris génétiquement modifiées ou présentant un intérêt particulier, en congelant leur sperme ou leurs embryons. À chaque étape, tout est fait pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant une conservation fiable du matériel génétique. a) Détermination du nombre d’animaux : Le nombre d’animaux nécessaires est basé sur les recommandations de réseaux spécialisés (EMMA, INFRAFRONTIER), les données historiques et les besoins techniques pour assurer une conservation réussie. Pour congeler du sperme : 2 à 3 mâles fertiles par lignée sont utilisés. Pour les embryons : les accouplements sont planifiés pour obtenir 40 à 50 embryons, en accord avec les standards (avec un taux de survie après décongélation supérieur à 90 %). b) Approche statistique : Aucune analyse statistique formelle n’est requise, car le projet ne teste pas d’hypothèses scientifiques. Le nombre d’animaux est défini de manière raisonnée, en s’appuyant sur l’expérience, des protocoles optimisés et les bonnes pratiques partagées dans la communauté scientifique. c) Réduction du nombre d’animaux : Plusieurs mesures concrètes permettent de réduire le recours aux animaux : Études pilotes pour vérifier à l’avance la qualité des échantillons, selection du génotype le plus adapté (homozygote ou hétérozygote) pour éviter de produire des animaux inutilisables, mutualisation des procédures entre équipes travaillant sur les mêmes lignées, réutilisation d’animaux quand c’est possible, production limitée aux seuls animaux nécessaires ; par exemple, les femelles ne sont produites que si elles sont requises pour une procédure.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera vérifié deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel formé. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et des traitements contre la douleur seront systématiquement appliqués et adaptés au cas par cas après l’intervention. Une attention particulière sera portée à la phase de réveil : les animaux seront placés dans un environnement chaud, sécurisé et confortable. Un suivi post-opératoire régulier sera effectué à l’aide d’outils validés pour évaluer leur état de santé et ajuster les soins si nécessaire. Des mesures de confort seront systématiquement mises en place : cage chauffée, enrichissement du milieu de vie, réduction du stress et des manipulations. En cas de douleur persistante ou de souffrance malgré les soins, des actions complémentaires seront envisagées, y compris une euthanasie si nécessaire, dans le respect des règles en vigueur.
Choix des espèces
Les lignées transéniques à conserver étant murines, cette espèce n'est donc pas rempaçable. Les mâles pour la vasectomie seront utilisés à 8 semaines de vie et les femelles entre 8-10 semaines, la maturité sexuelle devant être atteinte pour pouvoir réaliser la procédure.
Étude du développement des neurones inhibiteurs dans le cerveau visuel de la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour observer comment se forment les circuits inhibiteurs du cortex visuel, 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie des souriceaux reçoit une injection dans le cerveau, puis une plaque métallique est fixée sur leur crâne par chirurgie. Les animaux vivent ensuite en cage avec cet implant et sont immobilisés par la tête, éveillés, jusqu'à trente-deux séances d'une heure trente réparties sur trois mois. Une partie est tuée pour des analyses post-mortem, les autres sont proposées en don à d'autres équipes ou tuées faute de pouvoir être réutilisées en raison de leur modification génétique.
Objectifs
Notre projet de recherche cherche à comprendre comment se développent les réseaux inhibiteurs, ces circuits neuronaux qui régulent l'activité du cerveau, dans les régions responsables du traitement de la vision. Ces circuits sont composés de neurones particuliers, appelés interneurones, qui ont pour rôle de moduler l'activité cérébrale en empêchant une excitation excessive. Ils sont essentiels pour assurer un traitement équilibré et précis des informations visuelles. Nous étudierons chez des souris génétiquement modifiées comment ces réseaux inhibiteurs se forment et se connectent pendant le développement, en particulier dans le cortex visuel primaire, une région clé pour interpréter ce que nous voyons. Notre hypothèse est que le bon développement de ces réseaux est crucial pour que le cerveau puisse analyser les images de manière stable et cohérente. En comprenant mieux la manière dont ces circuits se construisent, nous espérons aussi mieux cerner certains troubles du développement cérébral, comme ceux liés à l'autisme ou à la schizophrénie, où l'équilibre entre excitation et inhibition est souvent perturbé.
Bénéfices attendus
Les maladies cérébrales ont un impact profond sur la santé des individus, affectant leur autonomie, leur éducation, leur capacité à travailler, leur mobilité ainsi que leurs relations sociales. Elles représentent ainsi un lourd fardeau à la fois humain, social et économique. Il est donc essentiel de mieux comprendre les propriétés fondamentales qui régissent la force, la dynamique, l’organisation spatiale, la localisation anatomique et la composition moléculaire des connexions synaptiques entre types neuronaux spécifiques, tant dans des conditions normales que pathologiques. Nous faisons l’hypothèse que de nombreux troubles cognitifs et psychiatriques, tels que la schizophrénie, l’autisme, la dépression, ou encore certaines formes de douleur chronique, trouveraient leur origine dans un dysfonctionnement des circuits du néocortex. Toutefois, les mécanismes précis du fonctionnement normal de ces circuits, ainsi que les altérations qui surviennent dans ces pathologies, restent encore largement inconnus. Par le biais de nos recherches, nous visons à combler ces lacunes fondamentales. En utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types cellulaires et des réseaux neuronaux spécifiques. Cela nous permettra d’élaborer un cadre physiopathologique robuste pour mieux comprendre les maladies du cerveau, avec pour objectif à long terme de développer de nouvelles approches thérapeutiques et d'améliorer la prise en charge des patients. En comprenant mieux la manière dont ces circuits se construisent, nous espérons aussi mieux cerner certains troubles du développement cérébral, comme ceux liés à l'autisme ou à la schizophrénie, où l'équilibre entre excitation et inhibition est souvent perturbé.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min) afin de connaitre leur patrimoine génétique. Une partie des souriceaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 5minutes environ) sous anesthésie générale. Ces animaux auront au minimum 9 jours après une implantation d’un dispositif sur leur tête lors d’une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum. L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués ensuite, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur. Pour la biopsie caudale, il y a un risque de saignement. L’injection intracérébrale chez les souriceaux est associée à un risque d’hémorragie et un risque de rejet de la portée par la mère. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui est associée à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Cette chirurgie implique une anesthésie générale qui entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de dépression cardiorespiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel, il existe également un risque rare de perte de l’implant. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux.
Devenir
À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront proposés en dons à d’autres équipes ou euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale : l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (960) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales puis participeront à l’imagerie afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur un même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme https:ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, bâtonnet de bois à ronger et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire qui apportent conseils et recommandations pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous nous assurerons de la bonne reprise en charge des petits par leur mère immédiatement après le geste et environ 30 minutes après. La chirurgie stéréotaxique sera effectuée sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention pour limiter la douleur. Nous maintiendrons la température des animaux au cours de toute la durée de l’anesthésie pour éviter toute hypothermie. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Pour les séances d’imagerie tête fixée, afin de réduire le stress, nous prévoyons d'effectuer entre 1 et 2 semaines d'habituation des animaux au dispositif de fixation de la tête. Nous ajusterons également la surface du disque rotatif pour faciliter une bonne prise pour les animaux et réduire l'inconfort. Et enfin nous prévoirons des périodes de repos entre les sessions d’imagerie, par exemple 3 jours de repos par semaine et 1 semaine de repos toutes les 2 semaines. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux dès leur naissance et jusqu'à plusieurs mois.
Thérapeutique de la cystinurie à partir d’un modèle murin
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Les souris qui n'ont pas le génotype recherché et les couples en fin de reproduction sont tués, comme les animaux entrés en procédure, dont les reins et le cœur sont prélevés après la mort. 2 043 souris vont être utilisées, 1 443 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 600 dans des procédures modérées. Ces souris forment spontanément des calculs de cystine, et 600 mâles subissent des recueils d'urine répétés jusqu'à treize fois, seize heures en cage métabolique sans nourriture, un gavage quotidien pendant deux semaines, pour certaines l'ablation d'un rein sous anesthésie. Le porteur précise que les animaux seront utilisés entre six et dix semaines, avant l'apparition vers six mois des calculs qui rendent leur état douloureux.
Objectifs
La cystinurie est une maladie génétique responsable de lithiase récidivante. La lithiase désigne la formation de calcul/concrétion solide dans les cavités rénales (dans les voies urinaires). Cette maladie touche près d'une personne sur 7000 mais représente la principale cause de lithiase génétique chez le sujet jeune et l'enfant. Cette maladie est causée par la mutation de transporteurs rénaux d'acides aminés (tel que la cystine) qui les empêche d'être réabsorbé de l'urine. La cystine se retrouve alors en quantité excessive dans l'urine et finit par précipiter sous forme de calculs urinaires (lithiase). L'obstruction causée par ce calcul est responsable de la crise de colique néphrétique. La répétition de ces crises de colique néphrétique peut conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères. La thérapeutique actuelle est insuffisante et repose essentiellement sur l'alcalinisation des urines, l'augmentation de la diurèse et sur l'utilisation de médicaments liant la cystine (D penicillamine, tiopronine) mais exposant les patients à des effets indésirables parfois sévères. Suite à l'apparition d'une mutation spontanée sur les transporteurs d'acide aminé urinaire dans un élevage, il existe un modèle murin présentant des lithiases de cystine comparables aux lithiases décrites chez l'homme. Cependant, elles ne font pas de colique néphrétique car les calculs se trouvent dans la vessie uniquement. Notre objectif est de prouver dans ce modèle murin, que l'alcalinisation urinaire est efficace dans la prévention des récidives de calculs cystinuriques et de déterminer quel traitement alcalinisant est le plus efficace.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce travail est de montrer que l'utilisation des nouveaux traitements peut permettre de réduire l'activité lithiasique chez les patients cystinuriques. Ces traitements pourraient permettre d'améliorer significativement la qualité de vie des patients cystinuriques et réduire le risque d'insuffisance rénale voire de mise en dialyse. Les procédures permettront de déterminer quel traitement est le plus efficace pour alcaliniser les urines, pour prévenir la précipitation de la cystine chez des souris sans dégradation de la fonction rénale et chez des souris rendues insuffisantes rénales.
Procédures
Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris cystinuriques. C’est-à-dire qu’elles forment spontanément des cristaux de cystines. L'accumulation de ces cristaux peut entraîner la venue de calculs urinaires conduisant au phénotype dommageable de ces souris. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 6-10 semaines, et les protocoles durant 4-6 semaines ou jusqu'à 3 mois, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Dans le cadre du génotypage d'une partie de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. Les animaux seront soumis à des recueils urinaires soit par émission spontanée d'urine (technique du spot urinaire qui ne dure que quelques secondes), soit par recueil en cage métabolique de 16h (1 seule fois pendant la procédure). Les spots urinaires seront répétés de façon hebdomadaire : une ou deux fois par semaine durant 4 ou 6 semaines ou 3 mois, soit respectivement 4, 6, 8 ou 13 fois. Ces recueils sont effectués sur animal vigile. Certains animaux seront soumis à une chirurgie rénale réalisée sous anesthésie générale associé à une analgésie pré et post-opératoire (néphrectomie, chirurgie durant 25min). Certains animaux seront soumis à un gavage (procédure réalisée sur animal vigile, ne durant que 10 secondes) de façon quotidienne pendant 2 semaines soit 14 fois. A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin sous anesthésie générale puis d’une euthanasie, suivie des prélèvements nécessaires aux différentes analyses (rein, cœur, ...).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux n'est pas dommageable avant un âge de plus de 6 mois, lorsque les calculs sont en nombre importants. Les expérimentations seront donc réalisées avant que ce phénotype apparaisse. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d'urine en cage métabolique, et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. Concernant la chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. De plus, la chirurgie peut induire des douleurs à l'animal provoquées par la procédure (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures), des complications liées à l'anesthésie chimique (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique), une altération de l'état général de l'animal tel que la perte de poids ou la déshydratation, un stress de l'animal lié à l'hébergement individuel et privation d'aliment pendant 16 heures.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire. Les animaux qui n'auront pas le génotype requis pour les procédures ainsi que les couples en fin de reproduction seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Remplacement
Une partie des données seront obtenues par des analyses in vitro. Nous étudierons ainsi la cinétique de dissolution des cristaux de cystine in vitro en alcalinisant des urines de patients jusqu'à la disparition des cristaux. Toutefois ces données seront insuffisantes pour mener à bien le projet. En effet, chez les patients et chez les souris, la quantité d'espèce alcaline excrétée dans l'urine n'est pas le reflet direct de la quantité apportée par voie orale. Autrement dit, même si nous montrons que l'alcalinisation directe des urines permet de réduire la précipitation de la cystine, il restera à prouver que l'apport d'alcalin par voie digestive peut effectivement faire varier favorablement le pH urinaire. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable
Réduction
Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle et grâce à un calcul de puissance permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux prévu est de 600 souris mâles de 6 à 10 semaines pour les procédure expérimentales. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d'animaux prévu est de 2043 pour l'élevage, incluant les 600 souris mâles utilisés pour l'expérimentation. La production et donc l’élevage des souris sera adapté aux besoins des différents protocoles. Les souris pourront être cryo-préserver s’il n’y a plus de procédure en cours.
Raffinement
Concernant l'hébergement, le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de différentes tailles permettant aux animaux de les décompacter, et grâce à des morceaux de bois à ronger. Les animaux sont observés quotidiennement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage, notamment au décours des cages métaboliques. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les animaux seront pesés chaque semaine. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de poids. Les gestes invasifs, à l'exception du gavage qui nécessite que l'animal soit vigile pour ne pas induire de fausse route, seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Tous les autres gestes comprenant le recueil d'urine ne sont pas invasifs. Les animaux seront habitués aux cages métaboliques et aux contentions pour le gavage.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est un modèle murin de cystinurie déjà existant suite à la survenue spontanée d'une mutation dans un transporteur rénal d'acide aminé. Ces souris sont viables, n'ont pas de phénotype dommageable dans les premières semaines de vie. Un élevage de ce modèle sera mis en place et constitué exclusivement d'animaux homozygotes pour la mutation et ne présentant pas de phénotype dommageable avant l’âge de 6 mois. Nous utiliserons des souris de 6-10 semaines, âge à partir duquel des cristaux sont analysables chez les souris mutantes, mais bien avant l'apparition d'un phénotype dommageable (lithiase urinaire) qui occure après 6 mois. Nous utilisons régulièrement le modèle in vivo murin et possèdons donc tous les outils nécessaires à l'élevage et l'utilisation de ce modèle.
Etude du microbiote de l’intestin grêle dans un modèle murin de Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
9 377 souris vont être utilisées, certaines recevant jusqu'à 105 administrations orales, une chaque jour pendant quinze semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 2 782 d'entre elles et modéré pour 6 595, et toutes sont tuées pour prélever plusieurs organes par animal. Une partie développe spontanément une inflammation de l'iléon proche de la maladie de Crohn, avec diarrhée et perte de poids, à quoi s'ajoutent des transferts de microbiote, des changements de régime et des prises de sang sur animal vigile. Le porteur justifie l'effectif par quinze ans d'expérience du modèle et par la variabilité entre individus, et prévoit de refaire chaque expérience deux à trois fois lorsque les résultats vont dans le sens de son hypothèse.
Objectifs
Le rôle du microbiote intestinal a été exploré dans la santé et dans un large éventail de pathologies. Il a été clairement démontré que le microbiote intestinal joue un rôle dans la pathogenèse des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) et constitue une cible thérapeutique potentielle dans ces maladies. Cependant, la grande majorité des données disponibles concerne le microbiome fécal ou colique, alors que le microbiome de l'intestin grêle joue probablement un rôle au moins aussi important. La composition et les fonctions du microbiote intestinal sont façonnées par son environnement, et il n'est donc pas surprenant que la composition, la biogéographie et la distribution du microbiote de l'intestin grêle soient différentes de celles du côlon. Dans des expériences préliminaires, nous avons montré chez l'Homme et chez la souris que les microbiomes de l'iléon et du côlon sont différents à la fois en termes de composition et de fonctions. Les objectifs du projet actuel sont de caractériser le microbiote de l'intestin grêle, l'influence de l'alimentation sur ce microbiote, son altération dans les MICI et son rôle dans la pathogenèse et en tant que cible/outil thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) touchent plus de 300 000 patients en France et elles sont en partie liées à une altération du microbiote intestinal. Les traitements actuels des MICI ne sont pas toujours efficaces ; ils ne sont que suspensifs et ne ciblent pratiquement que le système immunitaire en ignorant la composante du microbiote. D’autre part, l’atteinte de l’intestin grêle qui est présente chez deux tiers des patients avec maladie de Crohn est particulièrement difficile à traiter et représente un besoin médical encore plus important que les autres localisations inflammatoires. Notre projet vise à mieux comprendre comment les microbes qui vivent dans notre intestin interagissent avec notre organisme, en particulier au niveau de l’intestin grêle. Ces recherches nous aideront à découvrir comment ces échanges fonctionnent dans un corps en bonne santé, mais aussi dans certaines maladies. L’objectif est de trouver de nouvelles façons de soigner en agissant à la fois sur le microbiote (les microbes) et sur le corps humain. Ce projet réunit plusieurs domaines scientifiques pour étudier comment notre système immunitaire et notre métabolisme travaillent avec les microbes de l’intestin. Il nous permettra de mieux comprendre les causes de maladies comme les MICI, notamment lorsqu’elles touchent l’intestin grêle, et d’identifier de nouvelles pistes de traitement pour les patients.
Procédures
Au cours de ce projet, les souris pourront suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) un transfert de microbiote intestinal par administration orale pendant 2 jours (animal vigile, moins de 10 secondes) ii) une mise sous régime alimentaire spécifique durant 2 à 12 semaines (animal vigile, prise alimentaire spontanée) iii) un traitement quotidien à visée thérapeutique tous les jours durant 5, 10 ou 15 semaines soit un maximum de 105 administrations pour les temps les plus longs (animal vigile, moins de 30 secondes). Tous les groupes impliqués seront suivis grâce à une grille de score effectuée de manière hebdomadaire (ou plus si nécessaire) et impliquant une manipulation d’environ une minute par animal. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraîches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvement de sang sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Le modèle murin utilisé développe spontanément et de manière très progressive une inflammation intestinale pouvant entraîner une diarrhée et une perte de poids. Certains animaux seront soumis à un changement de régime alimentaire ce qui pourrait induire une diminution transitoire de la prise alimentaire en raison de la néophobie de la souris. Le projet comprend différentes techniques d’administrations pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entraîner un risque de péritonite (très rare). De même, la répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraîches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également un prélèvement sanguin pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie (très rare).
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproduction sans prélèvement. Les souris impliquées dans les procédures seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés pour l’analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera un maximum de 9377 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée au développement d’une iléite spontanée (inflammation de l’iléon) dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie de Crohn chez l'homme. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associés à un scoring hebdomadaire de la sévérité de l’inflammation permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique permettant de réduire également les risques de poussées inflammatoires en conditions standard. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire au maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont effectués par un personnel formé et autorisé. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maîtrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris commerciales et une souche mutante qui développent spontanément une inflammation dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie de Crohn chez l'homme. Justification des stades : Les souris seront utilisées entre l’âge 3 et 15 semaines. En effet, il existe dans ce modèle une phase d’induction de l’inflammation entre 3 et 7 semaines, puis une phase de chronicité entre 7 et 30 semaines. Nous commencerons à le projet à 3 semaines (révolues) car cela correspond au sevrage des animaux et donc à une étape clé dans le développement de leur microbiote intestinal et de leur système immunitaire qui sont deux acteurs majeurs du processus d’inflammation intestinale.