Maintien des lignées génétiquement modifiées

Tués dès la fin de la procédure pour les uns, gardés jusqu'à douze mois puis mis à mort pour les géniteurs et génitrices, 16 950 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet consiste à créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées pour étudier les protéines qui structurent les neurones. Chaque poisson subit à quatre mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale destiné au génotypage, geste que le porteur décrit comme sans dommage tout en reconnaissant qu'il peut induire du stress et de la douleur. L'effectif reste sans justification statistique, le porteur indiquant qu'aucune méthode n'a pu servir à le déterminer puisque aucune expérience n'est menée sur les poissons adultes.

Objectifs

Notre programme de recherche porte sur l’étude de neuropathies héréditaires humaines caractérisées par des atteintes neurologiques sensitives et motrices. La prise en charge clinique des patients est actuellement symptomatique et aucun traitement curatif n’existe à ce jour, ce qui pose l’urgence de développer des modèles animaux précliniques pour la mise au point des thérapies. Nous nous intéressons aux protéines qui forment l’architecture du neurone et qui sont mutées dans nombre de maladies neurologiques. Notre programme de recherche vise à comprendre le rôle physiologique de ces protéines structurelles et leur régulation. Afin de mener ce projet à bien, nous avons choisi le modèle du poisson zèbre, qui constitue un modèle/outil de choix pour l’étude du système neuromusculaire, similaire à celui de l'Homme et déjà fonctionnel dès le stade larvaire précoce. En outre, la transparence de l'animal durant le développement nous permet de capturer les processus dynamiques qui nous intéressent par imagerie dans un modèle in vivo. Pour réaliser ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées poisson zèbre transgéniques. Ces lignées nous permettront de générer des embryons dans le but d’étudier les protéines structurelles des neurones par des techniques de microscopie ou de biochimie à des stades larvaires (

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre les fonctions des protéines contrôlant l'architecture des neuroneset leur implication dans des mécanismes pathologiques. L’objectif à long terme (>5ans) est de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit la du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zebres une fois dans leur vie.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seule les formes mutées, avec des mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer un phénotype dommageable (défauts sensorimoteurs). Ces défauts pourraient induire un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité ou de conditions d’hébergement particulières. Nous porterons une attention particulière aux déficits moteurs en évaluant la qualité de la nage des poissons générés (notamment observable lors du nourrissage) et à l’apparition de signes de souffrance. Pour les autres lignées transgéniques, un suivi des poissons zebres sera réalisé afin de s’assurer qu’aucun d’entre eux ne développe de phénotype dommageable dans le temps. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zebres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 12 mois puis mis à mort. Les autres seront mis à mort dès la fin de chaque procédure afin de ne pas garder d’animaux génétiquement modifiés , non nécessaires à la conduite de ce projet et ne pouvant pas être replacés (adoption ou autre projet).

Remplacement

Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines controlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonction de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des oeufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Étant donné qu'aucune expérience ne sera réalisée sur les poissons adultes, aucune méthode statistique n'a pu être utilisée pour déterminer le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a donc été déterminé sur la base du nombre de couples reproducteurs requis.

Raffinement

Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous analgésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Une sédation adéquate sera confirmée en vérifiant l'absence de réaction de fuite provoquée par le toucher. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (24h à 48h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectués par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptés aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.

Choix des espèces

Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives.

1 244 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, presque toutes tuées à l'issue, quinze restant en accouplement continu pour entretenir les lignées. 148 reçoivent sur les oreilles un analogue de la vitamine D pendant trois jours pour déclencher un mélanome, 540 une injection intradermique de cellules dendritiques dans les deux oreilles, 556 des injections intrapéritonéales d'immunothérapie deux fois par semaine pendant deux semaines. Le porteur annonce inflammation, démangeaisons et rougeur des oreilles, et une mise à mort dès que la tumeur atteint un centimètre cube. Il justifie le recours aux souris par le fait que le microenvironnement tumoral engage plusieurs organes, ce qui rend selon lui l'expérience in vivo "nécessaire", onze lignées génétiquement modifiées étant mobilisées.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer se développant à partir de mélanocytes cancéreux, les cellules pigmentées de la peau. Le système immunitaire est généralement en mesure d’éliminer les cellules tumorales. Toutefois, les cellules tumorales peuvent perturber la réponse immunitaire de manière à favoriser leur propre croissance, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome cutané. Ce cancer de la peau est hautement agressif, premièrement à cause de son potentiel à métastaser, et deuxièmement par sa fréquente résistance à la plupart des immunothérapies et thérapies ciblées utilisées aujourd’hui. Notre laboratoire s'intéresse à une molécule qui possède un rôle pro-tumoral dans le microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané. Cependant, les cellules et molécules impliquées dans la réponse immunitaire pro-tumorale sont encore mal connues. Le projet vise donc (1) à étudier dans un modèle murin de mélanome cutané, l’impact de cette molécule sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires ; (2) à identifier et étudier la fonction des sous-populations cellulaires immunitaire induite par cette molécule ; et enfin (3) à évaluer et améliorer l’effet du blocage de cette molécule associée à une thérapie déjà utilisée pour soigner les mélanomes cutanés chez l'humain. Afin de répondre à ces questionnements, nous étudierons la réponse immunitaire au niveau du microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur et dans le sang.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la réponse immunitaire impliquée dans le développement du mélanome cutané. Par ailleurs, ces nouvelles connaissances sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires dans le microenvironnement tumoral pourraient nous permettre éventuellement de la moduler en agissant sur ces types cellulaires spécifiques. De plus, cette étude permettra également d'évaluer le potentiel d’une nouvelle cible thérapeutique afin d’améliorer la survie des patients atteints de mélanome cutané.

Procédures

Lors de la 1ère partie, 148 souris au maximum seront anesthésiée par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 3 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire un mélanome cutané. Pour la 2ème partie du projet, 540 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles, et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes). Enfin, la 3ème partie concernera 556 souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 2 semaines (durée de 20 secondes) avec une immunothérapie combinée.

Impact sur les animaux

Une minorité des animaux de 2 lignées de souris utilisées (moins de 30% des effectifs) est susceptible de développer un phénotype dommageable se traduisant par l'apparition de tumeurs spontanées non pigmentées et à croissance rapide, un suivi particulièrement attentif sera mis en place. L'application d'analogue de ka vitamine D sur les oreilles des animaux sous anesthésie gazeuse légère engendrera un léger stress d'une courte durée. (Lors des transferts des cellules dendritiques, les animaux donneurs seront de la même espèce, du même sexe et du même fond génétique que les animaux receveurs (qui recevront l'injection de ces cellules) éliminant les risques de rejet. Néanmoins, cette procédure engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux receveurs et une inflammation au niveau des oreilles, accompagnées de démangeaisons et d'une rougeur. Les injections intrapéritonéales d'anticorps sur d'autres modèles ont déjà été réalisées par le passé dans notre équipe, et nous n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection et un stress du à la contention sera ressenti pendant un temps court ( quelques secondes). Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur mais une rougeur pourrait apparaitre sur la peau recouvrant la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire dans le mélanome cutané. permettent de maintenir les lignées utilisées dans ce projet de recherche. Au maximum 15 animaux seront utilisés pour les expérimentations en utilisation continue, pour avoir 5 accouplements en continu.

Remplacement

Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet vont nous permettre d'étudier des gènes ou des cellules dont l'implication dans le mélanome a été suggéré in vitro par notre laboratoire ainsi que d'autres. Les phénomènes impliqués dans le mélanome cutané mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires qui composent l'ensemble du microenvironnement tumoral. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes cellules et molécules pouvant être impliquées dans le développement du mélanome, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 11 lignées de souris différentes et d'un maximum de 1204 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.

Raffinement

Tous les animaux feront l'objet d'une observation quotidienne basée sur leur apparence générale, leur posture et leur comportement. Tous les animaux intégrés dans une procédure expérimentale seront soumis à l'application de points limites définis, stricts et spécifiques de ce projet. En cas de signes cliniques tels qu'un dos courbé, un pelage ébouriffé, une absence de réaction aux stimuli ou encore une inflammation ou une infection au niveau des sites d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et pourra recevoir des soins selon l'avis du vétérinaire. Si l'état de l'animal est jugé critique (blessure importante par exemple), une euthanasie immédiate sera pratiquée. Pour les souris développant des tumeurs cutanées, un suivi renforcé sera assuré quotidiennement. Le volume tumoral sera mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et l'euthanasie sera réalisée si la taille de la tumeur atteint 1 cm3. Toutes procédures pouvant induire douleur ou stress chez l'animal sera effectuée sous anesthésie légère gazeuse, n'engendrant qu'un stress léger de courte durée dû à la contention. Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.

Choix des espèces

Les mécanismes cellulaires dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané impliquent plusieurs organes différents (peau, ganglions lymphatiques, etc.) et ces interactions inter-organes nécessitent plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la croissance tumorale, l'implication du système immunitaire et à terme, identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

24 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour 2 160 d'entre elles. L'acte consiste à couper l'extrémité de la queue de chaque souriceau, animal jeune et vigile, pour lire son génotype, avec parfois un second prélèvement à l'oreille sur l'adulte. Une partie des souriceaux porte une mutation qui arrête leur croissance et 561 seront tuées pour cette raison. Le porteur prévoit d'en garder 16 175 vivantes pour ses propres projets sur la maladie de Parkinson et la dystonie, et de tuer les 8 104 restantes s'il ne trouve pas d'équipe pour les reprendre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’élevage et le maintien de plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées avec la nécessité de réaliser un prélèvement invasif pour connaitre le patrimoine génétique des souriceaux. Ces animaux sont produits pour être utilisées comme modèle animal pour l’étude des mécanismes moléculaires en lien avec des maladies du mouvement comme la maladie de Parkinson et la dystonie. Ils seront également utilisés pour étudier les causes des effets indésirables graves des traitements observés chez les patients traités pour ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de produire et maintenir les souris nécessaires pour permettre des recherches sur la maladie de Parkinson et la dystonie. Actuellement en France, on estime que près de 200 000 personnes sont touchées par la maladie de Parkinson, avec plus de 25 000 personnes nouvellement diagnostiquées tous les ans. La maladie de Parkinson est la 2ème maladie neurodégénérative la plus fréquente en France après la maladie d’Alzheimer et une cause majeure de handicap chez les personnes âgées. Les autres maladies du mouvement sont également un enjeu sociétal car multiples et atteignant diversement les patients avec parfois une forme génétique. Ces maladies plus rares nécessitent également une exploration qui permettra d’améliorer la vie de patients à terme. Les animaux produits dans ce projet contribueront entre autres à tester des nouvelles technologies thérapeutiques pour la maladie de Parkinson. Cela pourrait permettre à long terme de développer de nouveaux traitements ciblés afin de prévenir ces troubles invalidants, ayant un bénéfice direct pour chaque patient et son entourage. Ces animaux permettront également de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition d'effets indésirables graves lors du traitement des patients parkinsoniens et potentiellement, à plus long terme, améliorer la prévention et la prise en charge de ces effets.

Procédures

Pour tous les animaux produits au cours de ce projet, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animal jeune et vigile pour connaitre le patrimoine génétique des animaux (une seule fois, moins d’une minute par animal). Rarement un re-prélèvement à l’oreille (1 seule fois, moins d’une minute, animal vigile) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’ensemble des manipulations (nécessitant notamment des contentions) génèreront un stress pour les animaux. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue (ou de l’oreille) pour connaitre leur patrimoine génétique. La mutation génétique de certains des souriceaux se traduira par un arrêt précoce de la croissance nécessitant leur euthanasie.

Devenir

Les animaux qui ne seront pas utilisés pour nos projets de recherche, seront euthanasiés s’il n’est pas possible de les donner à d’autres équipes (8104). Une partie des souriceaux sera euthanasiée pour éviter toute souffrance car ils présenteront un arrêt précoce de leur croissance (561). Nous estimons que 16175 animaux seront gardés en vie et transférés, en utilisation continue, dans nos projets de recherche.

Remplacement

Les projets pour lesquels ces animaux sont élevés porteront sur l’étude des comportements moteurs et impulsif, il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire afin de pouvoir réaliser des tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences.

Réduction

Dans ce projet nous estimons que nous produirons 24840 animaux maximum afin de fournir les animaux nécessaires à nos projets de recherche en cours, les projets en cours de validation ou de révision ou futurs. . Ce nombre tient compte d’un pourcentage de perte lié aux aléas de l’élevage et aux effets indésirables induits par certaines mutations génétiques ainsi que du pourcentage d’animaux porteurs du patrimoine génétique d’intérêt. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaires pour nos lots expérimentaux. Ces lots ont été définis en utilisant des tests statistiques afin de limiter au strict minimum les effectifs par groupe tout en obtenant des résultats statistiquement exploitables. En fonction des besoins expérimentaux pour les projets de recherche il est possible que nous produisions moins d’animaux que prévu. Si certaines des lignées de maintiennent ne seront plus utilisées, nous pourront envisager de faire de la cryopréservation afin de réduire la production des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (carré de coton et bâtonnet de bois à ronger). Un suivi spécifique sera mis en place pour les petits porteurs de la mutation génétique impliquant un arrêt précoce de la croissance : il sera vérifié la présence de lait dans l’estomac et l’évolution du poids afin de détecter l’atteinte potentielle de points limites nécessitant l’euthanasie des animaux. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous amènerons la mère avec la portée dans leur cage d’origine dans une pièce dédiée, au calme. La taille de la biopsie sera limitée au strict minimum afin d’être le moins invasif possible pour les animaux. Le geste, parfaitement maitrisé, sera réalisé de manière rapide en utilisant du matériel propre et désinfecté entre chaque animal pour prévenir tout risque de contamination ou d’infection. Une surveillance des petits sera assurée à leur retour en cage et 20 minutes après la biopsie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet s’intéresse à la production et au maintien de lignée de souris qui seront utilisées pour l’étude de la pathogenèse et thérapeutique des troubles moteurs et comportementaux de la maladie de Parkinson, une pathologie neurodégénérative fréquente ; et de la dystonie, une maladie génétique rare. Les animaux élevés dans ce projet seront prélevés pour connaitre leur génotype à l’âge de 7-10 jours et si correspondant au génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche à l’âge adulte de 6-10 semaines. Ces animaux aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et de réponse au traitement dans ces différentes maladies et le déclenchement des troubles comportementaux et cognitifs induits par les traitements dopaminergiques. Ces comportements ne peuvent être reproduits ni modélisés par des modèles in vitro ou computationnels. Les approches expérimentales dans lesquelles ces animaux seront utilisés nécessite des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Une fois les acteurs pharmacologiques et moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles cellulaires lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés

Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".

Objectifs

Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.

Procédures

Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).