Maintien des lignées génétiquement modifiées

Les souris qui ne servent pas à la reproduction et celles qui n'ont pas le bon génotype sont tuées au sevrage. 29 400 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 15 264 d'entre elles et modéré pour 14 136, les autres étant tuées pour analyse. Chaque animal subit trois injections dans l'abdomen, six coupures de l'extrémité de la queue, six prises de sang par microcoupure de la queue, un gavage, et jusqu'à seize semaines de régime gras. Le projet cherche à comprendre l'évolution de la maladie du foie gras d'origine nutritionnelle et génétique, sans que cet effectif de 29 400 souris reçoive de justification chiffrée au-delà d'un renvoi à des études précédentes.

Objectifs

La maladie du foie gras non alcoolique est définie par une accumulation de graisse dans le foie et généralement associée à des maladies comme le diabète et l’obésité. L’accumulation progressive de graisse est responsable de la dégradation du foie et de sa capacité à fonctionner normalement. Il n’existe aujourd’hui aucun marqueur biologique non invasif validé pour la détection de cette maladie ni aucun traitement médical approuvé. Notre objectif est donc d'utiliser des modèles murins pour comprendre comment le foie s'adapte aux perturbations portées par différents régimes afin de favoriser la progression de la maladie du foie ou d'influencer la guérison.

Bénéfices attendus

Ce projet explorera un biomarqueur non invasif de la gravité de l’état du foie et changements longitudinaux dans la maladie du foie suite à une intervention thérapeutique (modifications du mode de vie, des médicaments antidiabétiques, immunothérapies). Grâce à ce projet, nous pourrons identifier et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies du foie.

Procédures

1. Injection abdominale, 30s, 3 fois par animal 2. Coupure de l'extrémité de la queue, 30s, 6 fois par animal 3. Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 1 minute, 6 fois par animal 4. Gavage, 30s, une fois par animal 5. Régime gras, 16 semaines maximum.

Impact sur les animaux

1. Injection abdominale : douleur légère de courte durée. 2. Coupure de l'extrémité de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. 3. Régime riche en graisses : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actifs. 4. Régime alimentaire induisant une perte de poids : les animaux vont perdre du poids au fur et à mesure des semaines. 5. Mise à jeun : Les animaux pourront subir une gêne due à la sensation de faim. 6. Stress dû à la contention et à la sonde de gavage.

Devenir

Les souris non utilisées pour l’accouplement et les souris n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort au moment du sevrage. Tous les autres animaux en expérimentations seront mis à mort pour analyses.

Remplacement

Avant de recourir à des animaux, nous avons mené des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ainsi que des analyses de données déjà disponibles. Ces approches ont permis d’identifier les cibles à étudier. Toutefois, les effets systémiques et certaines interactions entre les cellules immunitaires et le foie, notamment celles influencées par l’alimentation, ne peuvent être reproduites qu’au sein d’un organisme vivant. À ce jour, aucun modèle alternatif (comme la modélisation informatique, ou les cultures de tissus) ne permet de reproduire toute cette complexité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé pour atteindre les objectifs scientifiques tout en limitant au maximum leur utilisation. Chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses, afin d’optimiser leur contribution à la recherche. Ces calculs sont basés sur les résultats d’études précédentes, ce qui permet de garantir que le nombre d’animaux est justifié et proportionné. Par ailleurs, le projet exclut l’utilisation de femelles dans les groupes expérimentaux, afin de réduire la variabilité due à la protection hormonale. Cela permet également de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé, avec du matériel adapté, afin de limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Par exemple, les injections et les prélèvements seront effectués avec des outils spécifiques et dans le respect des bonnes pratiques. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel animalier qualifié, et une grille d’évaluation du bien-être des animaux sera utilisée tout au long de l’étude pour ajuster les soins si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des maladies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et maladie du foie. Les animaux seront inclus à partir de l’âge de 8 à 10 semaines, ce qui correspond à l’âge jeune adulte chez la souris.

Pour savoir si le microbiote intestinal déclenche l'arthrite juvénile, 5 464 souris colonisées par une flore humaine développent une arthrite chronique et sont examinées chaque semaine à mesure que leurs articulations gonflent, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des gavages, des injections, des prélèvements d'urine et de selles toutes les deux semaines, une ligature de l'iléon sous anesthésie pour certaines, et une exsanguination cardiaque à la fin. Le porteur indique que l'arthrite limite leur mobilité au point de gêner l'accès à la nourriture et à l'eau, et prévoit de la litière douce et du gel alimentaire posé dans la cage. Aucune n'est gardée vivante, le RNT précisant qu'elles ne peuvent être "ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées".

Objectifs

L’arthrite juvénile idiopathique (AJI) est une maladie caractérisée par la présence d’une ou plusieurs arthrites d’origine inconnue chez l’enfant de moins de 16 ans, sur une durée supérieure à 6 semaines. Les causes de l’AJI restent inconnues. Nous formulons l’hypothèse que la composition du microbiote, le dysfonctionnement de la barrière intestinale et la translocation de composants bactériens seraient des éléments déclencheurs du développement d’arthrite. Nos objectifs sont les suivants : 1. Comprendre si le microbiote intestinal des patients atteints d'AJI peut moduler la sévérité de l'arthrite. 2. Étudier l'impact spécifique de composants bactériens intestinales sur l'apparition et la gravité de l'arthrite chronique 3. Comprendre quelles molécules ont cet effet, et si des changements de leur absorption dans l'intestin de l'hôte pourraient avoir un impact sur l'arthrite. L'exploration de cette hypothèse doit tenir compte des interactions complexes entre le contenu du tube digestif et de nombreuses structures mécaniques, chimiques et immunologiques qui forment la barrière intestinale. Ainsi, l'exploration de notre hypothèse nécessite l'expérimentation dans le contexte d'un être vivant. Dans la mesure du possible, les mécanismes pathologiques mis en évidence par ces études sur les animaux seront explorés plus avant à l'aide de modèles in vitro ou ex vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet étudiera un lien de causalité entre la composition du microbiote intestinal et le développement de l'arthrite. Nous aurons une meilleure compréhension d'un mécanisme important de la maladie, la modulation de l'inflammation chronique de l'arthrite par la présence systémique de fragments de paroi provenant des bactéries intestinales. Ainsi notre projet ouvrirait la voie vers de nouvelles approches thérapeutiques de l'arthrite inflammatoire, basées sur la modulation de l’immunité intestinale, ou des thérapies ciblant spécifiquement les fragments de paroi bactérienne systémique afin de les inactiver ou de les éliminer des hôtes sensibles à l'arthrite. Globalement, nous comprendrons mieux un groupe spécifique de molécules communes à presque toutes les bactéries et dont l'effet sur l'hôte est mal compris.

Procédures

Interventions non-invasifs effectués sur des animaux vigiles : Prélèvement de l'urine/selles, toutes les 2 semaines, Quelque secondes Évaluation de la sévérité de l'arthrite , Hebdomadaire, moins d’une minute Gavage, 1 à 4 fois par souris , quelque secondes Injection, 3 à 4 fois par souris, quelque secondes Chirurgie de ligature de l'iléon sous anesthésie, 30 minutes Exsanguination cardiaque et perfusion cardiaque sou anesthésie, moins de 5 minutes

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues sur les animaux tout au long du projet sont : 1) Le stress et inconfort léger de courte durée, lié à la préhension, contention et au gavage ou injection. 2) Inconfort et douleur physique liés à la présence d'inflammation modérée dans les articulations, due à l'arthrite. 3) L’arthrite limitant la mobilité des souris, et peut avoir un impact sur l'accès à la nourriture et à l'eau. 4) L'intervention chirurgicale : de douleur et inconfort modérée contrôlés par l'analgésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux doivent être mis à mort pour prélèvements ou lorsqu’un point limite est observé.

Remplacement

Il existe des systèmes que nous pouvons utiliser pour nos études, notamment des organoides et les systèmes de micro-support 3D tels que les intestins-sur-puce, qui nous permettent de reproduire la barrière épithéliale intestinale et de réaliser des études précises sur les mécanismes de transport, en comparant les cellules provenant de plusieurs types de souris. Cela nous permet de réduire le nombre de souris nécessaires, puisque les cellules récupérées à partir d'un petit nombre de souris (après la mise à mort) peuvent être utilisées pour lancer les cultures ex vivo. Nous ferons des tests dans ces systèmes ex vivo qui nous permettront d'évaluer, par exemple, le transport de fragments spécifiques de la paroi bactérienne. D'autre part, nous devrons éventuellement réaliser les expériences sur des animaux vivants pour valider nos études. Autant que possible, les expériences sur les animaux auront été affinées par nos données obtenues en ex vivo. D'autre part, les méthodes ex vivo ne suffisent pas à démontrer le rôle causal entre le microbiote intestinal et le développement d'arthrite chez l'hôte. La relation de causalité entre le microbiote intestinal et l'arthrite chez les hôtes implique de multiples paramètres en interaction complexes qui sont répartis dans l'organisme (par exemple, l'intestin, la circulation, les articulations, les cellules épithéliales, les cellules immunitaires, etc), que nous ne pouvons pas reproduire in vitro ou ex vivo. Par conséquent, les procédures expérimentales décrites ici nous permettent soit de collecter du matériel pour des études ex vivo, soit d'étudier des paramètres physiologiques, immunitaires et pathologiques complexes qui ne peuvent être étudiés en dehors d'un hôte vivant.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris à un minimum garantissant une puissance statistique suffisante, le nombre optimal d’animaux pour chaque procédure a été décidé en tenant compte des connaissances sur la variation naturelle de l'arthrite entre les souris, et du nombre de souris nécessaire pour produire des résultats statistiquement significatifs, déterminée à l'aide d’un logiciel. Nous avons estimé qu’un maximum de 5464 souris au total sera nécessaires pour réaliser ces 5 procédures. Pour chaque procédure, nous avons prévu tous les groupes expérimentaux possibles qui pourraient être nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Pour maintenir l'élevage, nous utilisons l'accouplement des souris à microbiote humanisé. Nous obtiendrons uniquement les génotypes nécessaires aux expériences, sans produire inutilement des souris de type sauvage. En ce qui concerne l'élevage, nous ne pouvons pas prévoir avec précision le nombre de souris générées et leur génotype. Nous proposons un nombre qui nous permettrait raisonnablement d'obtenir les groupes requis, mais nous nous efforcerons également d'élever et d'utiliser les souris aussi efficacement que possible, afin de minimiser le nombre de souris qui ne peuvent être incluses dans une expérience ou pour la collecte de biomatériaux. En outre, au fur et à mesure que nous recueillons des données, nos résultats peuvent montrer que tous les groupes de souris proposés dans un protocole ne sont pas nécessaires pour réaliser une expérience robuste. Par exemple, en fonction des résultats obtenus, un groupe de contrôle particulier peut ne pas être nécessaire. Dans ce cas, nous supprimerons ces groupes de l'étude, ce qui réduira le nombre de souris nécessaires. Par conséquent, le nombre total d’animaux pourrait être inférieur à notre estimation de départ.

Raffinement

Nous établirons des groupes reproducteurs de souris colonisées naturellement par le microbiote humain transmis par la mère. Il n'est donc plus nécessaire de gaver les souris avec du microbiote humain au début de chaque expérience, ce qui réduit le stress, la douleur et la souffrance. Pour les procédures expérimentales débutant sur des souris adultes, deux semaines d'acclimatation sont programmées pour le bien-être des souris, une fois qu'elles sont transférées dans leurs groupes expérimentaux. En outre, pour établir des groupes de reproduction colonisés par le microbiote humain, certaines souris sont utilisées car elles ne développeront pas d'arthrite, ce qui évite des souffrances inutiles. L’évaluation des animaux est effectuée rigoureusement à l’aide d’une grille d’évaluation avec les pointes limites précis. L'évaluation de l'arthrite n'est pas effectuée avant l'âge du sevrage, car l'arthrite n'apparaît jamais avant ce stade. Le renforcement d’enrichissement des cages, le nombre d’animaux par cage et les soins médicaux à fournir dépendront des signes cliniques observés. Lorsque les signes cliniques d’arthrite apparaissent, pour minimiser la douleur, nous mettons de la litière douce et la nourriture ou du gel alimentaire directement dans la cage. Pour l'évaluation de l'arthrite, nous avons mis au point un système de photographie des articulations des animaux pour éliminer la nécessité de mesurer physiquement les membres inflammés, ce qui peut provoquer des douleurs, et de réduire le temps de contention des animaux. Pour les animaux qui vont subir de la chirurgie, la douleur sera gérée de manière rigoureuse : les souris recevront une analgésie, une anesthésie générale, et une réhydratation injectable. Les souris seront maintenues sur un tapis chauffant tout au long de la procédure pour éviter l’hypothermie, et leur état sera rigoureusement suivi. Chaque procédure du projet sera réalisée dans un environnement calme, avec un nombre limité de personnel dans la pièce dédiée aux expérimentations afin de ne pas stresser les animaux.

Choix des espèces

La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme et pour laquelle il existe une lignée mutante, permettant des études mécanistiques approfondies. Elles nous permettent d'imiter l'aspect juvénile de l'arthrite, ce qui est le but de notre étude. Les souris peuvent également être maintenues dans des conditions stériles et être recolonisées avec des microbiotes humains, ce qui permet d'étudier les effets spécifiques des microbiotes associés aux maladies humaines. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transposables à l’homme. Pour établir les groupes des souris d'élevage colonisés avec la flore intestinale provenant de selles humaines, la recolonisation sera faite en utilisant les adultes (souris à maturité sexuelle) âgés de minimum 8 semaines. Pour toute autre procédure, étant donné que l'arthrite peut être due à des effets du développement immunitaire survenant au début de la vie et que notre modèle murin peut développer de l'arthrite dès l'âge de 5 semaines, nous étudierons le développement de l'arthrite chez les souris entre 4 semaines d'âge et l'âge adulte (15 semaines d'âge maximale).

Pour mesurer si une thérapie génique injectée dans le sang atteint le muscle, le cœur et la respiration, 1 120 souris issues d'une lignée reproduisant la maladie de Steinert vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement de queue pour génotypage, une injection du vecteur viral, des prises de sang répétées, puis une série de mesures qui totalisent plus de deux heures par animal, dont une épilation du thorax pour l'échographie cardiaque et la pose d'électrodes transcutanées. Le porteur signale un risque de blessures aux griffes lors du test d'agrippement et des irritations douloureuses après l'épilation. Une partie des souris nées de ces croisements n'a pas le génotype recherché, et le RNT indique qu'elles seront mises à mort sans jamais entrer dans l'expérience.

Objectifs

La Dystrophie Myotonique de type 1 ou maladie de Steinert est une maladie génétique rare sans traitement affectant tous les organes, mais caractérisée principalement par un problème de décontraction des muscles. Elle est causée par la perte d’activité d’une protéine, MBNL, dont le rôle est de régler les niveaux de dizaines de gènes. Son inactivation a donc des conséquences très importantes sur tous les organes (muscle, cœur, appareil respiratoire) et les patients les plus sévèrement atteints meurent prématurément des défaillances de ces organes. Des études réalisées sur des modèles cellulaires ou par injections locales dans des modèles de souris reproduisant la maladie ont permis de montrer que l’injection d’un traitement réactivant MBNL corrige les défauts de décontraction des cellules musculaires. Afin de vérifier l’efficacité du traitement au niveau du corps entier et de pouvoir traiter des patients humains, notre projet a pour objectif de tester l’efficacité du traitement donné par injection intraveineuse dans un modèle murin de la maladie. Cette approche devrait permettre au traitement d’atteindre tous les organes touchés et de corriger les défauts essentiels mortels (notamment les problèmes cardiaques et respiratoires). Dans un premier temps, le modèle murin de DM1 sera mis en reproduction et caractérisé au niveau des fonctions musculaire, cardiaque et respiratoire. Ensuite, deux études de recherche de la dose médicamenteuse seront réalisées : la première étude sera réalisée sur un temps court afin de déterminer la dose efficace, puis une seconde étude plus longue permettra de vérifier la persistance du traitement dans le temps.

Bénéfices attendus

La caractérisation du modèle de souris reproduisant la maladie de Steinert permettra de connaitre les symptômes, notamment au niveau des fonctions musculaires et cardiorespiratoires. Cette étude est nécessaire pour faire les meilleurs choix de tests et optimiser les temps de traitements et d’arrêt de l’étude thérapeutique qui sera faite dans un second temps. L’étude d’efficacité thérapeutique du traitement réactivant MBNL permettra de déterminer la meilleure dose pour le traitement de thérapie génique, ce qui servira à transposer la dose aux futurs essais cliniques qui seront réalisés chez les patients.

Procédures

Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection unique sur souris éveillée (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur souris éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésiée (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les souris seront soumises à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire et de la myotonie (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité globale (durée moyenne 15min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses des produits thérapeutiques, ce qui pourrait entrainer un stress et une douleur légère et passagère due à l’injection. Une douleur légère et passagère locale pourrait être ressentie au moment du prélèvement du petit morceau de queue réalisé à des fins de génotypage, ainsi qu’au moment des prélèvement de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisés pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les échocardiographies, par la pose d’électrodes transcutanées au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle (ENMG) ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire sur animal éveillé (pinch test, test d’agrippement) notamment si l’animal présente une blessure au bas du dos (pinch test) ou au niveau des griffes ou des pattes (test d’agrippement). L’ensemble de ces nuisances constitue pour l’animal un niveau global de contrainte léger à modérée.

Devenir

Les animaux sans génotype d’intérêt issue de la procedure de la caractérisation genetique seront mises à mort. Les animaux, avec génotype d’intérêt, utilisés pour la caractérisation du modèle et les études de recherche de la dose du produit thérapeutique seront euthanasiés à la fin du protocole pour récolter les tissus et les organes pour les analyses moléculaires, hématologique et histologique.

Remplacement

La maladie de Steinert est causée par la perte de fonction d’une protéine, MBNL, qui entraine des défauts dans les fonctions de nombreux organes, donc le cœur et la fonction respiratoire. Notre projet consiste à mesurer l'efficacité d’un médicament permettant d’activer à nouveau la protéine MBNL et de corriger ces pertes de fonction. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées dans des modèles de cellules car il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques). Il est également impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de notre médicament peut entrainer une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre le traitement, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 8 souris) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) et 3) l’obtention des souris non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant les tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles de la respiration. Lors de certains tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante et quand nécessaire, une application de gel oculaire sera réalisée pour augmenter le confort des animaux anesthésiés. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Les sites d’insertion des aiguilles seront désinfectés et en cas de signes d’infections ou d’inflammation, un traitement anti-inflammatoire et/ou antibiotique sera administré dans l’eau des biberons. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les souris étant des animaux grégaires, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements médicamenteux administrés dans l’eau de biberon s’avéraient nécessaires : dans ce cas, la période d’isolement serait réduite au maximum.

Choix des espèces

La maladie de Steinert affecte le bon fonctionnement des muscles, du cœur et de la respiration. A ce jour, des modèles murins, drosophiles et poisson-zèbres portant cette maladie ont été décrits. De ces trois modèles, la souris est le modèle le plus utile, car il est le seul modèle de mammifère et il développe des symptômes similaires à ceux observés chez les patients (atteinte des muscles, du cœur et de la respiration). Il permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la maladie. La caractérisation préalable du modèle entre les âges de 2 à 12 mois permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de bien choisir le temps de démarrage du traitement, afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.

Produire et génotyper des rats porteurs d'une myopathie myotubulaire, pour alimenter d'autres projets du laboratoire : 3000 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2250 d'entre eux et modéré pour 750. L'acte infligé se limite à un prélèvement de tissu de la queue sur animal vigile, en même temps que l'identification, une seule fois dans leur vie et en moins de deux minutes. La part modérée vient de la maladie elle-même, une faiblesse musculaire et une atteinte locomotrice que la lignée reproduit, et le porteur indique tuer les animaux avant l'apparition des symptômes quand aucun projet ne les attend. Les autres sont gardés en vie pour la reproduction ou une utilisation continue. Les 600 rats par an annoncés reposent sur l'historique de production de l'établissement, et le porteur ajoute que ce chiffre pourra évoluer selon de nouvelles orientations scientifiques.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux afin de maintenir une souche de rats génétiquement altérée nécessaire à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie de la myopathie myotubulaire dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour une maladie génétique humaine grave, rare et orpheline de médicaments à partir d'un modèle murin mimant cette maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de myopathie myotubulaire.

Procédures

Les prélèvements de tissus de queue se font sur animaux vigiles. Cet acte se fait en même temps que l'identification individuelle des animaux et n’est pratiqué qu’une seule fois au cours de la vie des animaux. Au total, moins de 2 minutes sont nécessaires pour réaliser ce double geste. A considérer comme étant de gravité légère.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu (queue) sur jeunes animaux vigiles. La contention d’animaux jeunes peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs de la pathologie étudiée dans notre laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux ou gardé en vie pour la reproduction ou une utilisation continue.

Remplacement

Un effort de remplacement est réalisé en amont et en parallèle de ce projet. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions scientifiques dans des modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études scientifiques ne se fait que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions. Par exemple lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des maladies neuromusculaires, ou la distribution d’un traitement dans l’ensemble d’un organisme.

Réduction

Nous avons prévu d’utiliser un total de 3000 rats pour satisfaire les besoins de l'ensemble des études pour les 5 années à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 600 rats par année pour la lignée de rat objet de ce dossier, soit un total de 3000 rats sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.

Raffinement

Dans ce projet, les rats mimant la myopathie myotubulaire seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (igloo en cellulose, bâtonnets de bois pour ronger, éléments pour la confection des nids, copeaux, tunnel, etc. et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe (sexage). De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice, aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et apétant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour transférer les animaux d'une cage à l'autre lors du change des litières, les zootechniciens soulèvent délicatement les animaux par le corps et utilisent leurs des tubes-maisons pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l’identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie post-natale par prélèvement d’un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore différenciés.

Choix des espèces

Le rat a été choisi comme animal modèle car cet animal a pu être modifié génétiquement afin de présenter une altération génétique responsable de l’apparition de la myopathie myotubulaire qui est l'un des axes de recherche de notre Equipe de recherche. Ce modèle reproduit les signes cliniques et pathologiques de la maladie connue chez les patients, ce qui inclus une faiblesse musculaire et une insuffisance respiratoire. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce afin de réaliser l’identification et le prélèvement pour génotypage (biopsie), et aux stades sexuellement matures pour la reproduction.

2 583 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tissus, 1 291 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 1 292 un niveau modéré. Elles reçoivent un régime riche en lipides pendant neuf ou dix-huit semaines pour développer une athérosclérose, cinq administrations orales, une injection, deux échocardiographies sous anesthésie et deux séquences d'irradiation avant greffe de moelle osseuse. Le porteur qualifie de durée moyenne le stress de l'irradiation et de l'échocardiographie, et n'attribue aux autres gestes qu'une douleur légère et brève. Une grille de score doit déclencher la mise à mort anticipée des souris dont la souffrance ne peut être soulagée.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont une cause de morbidité et de mortalité importante dans le monde. En particulier, l’athérosclérose est connue pour ses conséquences : principalement l'infarctus du myocarde, mais aussi les accidents vasculaires cérébraux et l’anévrisme aortique. Ce projet vise à étudier de façon détaillée l'effet protecteur de certaines cellules du système immunitaire dans des modèles expérimentaux d'athérosclérose chez la souris, initiés via une alimentation lipidique. Cette étude permettra de consolider le potentiel impact bénéfique de ces cellules dans la prévention de la progression de l’athérosclérose chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre l’impact de certaines cellules du système immunitaire dans l’athérosclérose. Cette étude permettra d’évaluer le rôle de ces cellules durant la progression de la maladie afin de définir un potentiel future médicament ayant un effet protecteur.

Procédures

Le prélèvement pour identification de la modification génétique sera fait au moment du sevrage de l’animal, elle pourra occasionner une douleur légère et ne prendra que quelques secondes. Le prélèvement de sang (1 à 2 prélèvements/souris) sera fait sur animal anesthésié. Le prélèvement prend moins de 30 secondes par animal. Les administrations par voie orale (5/souris) seront faites sur animaux vigiles et prennent moins de 15 secondes par animal. Les injections seront faites sur animaux vigiles (1 injection/souris). Une injection prend moins de 10 secondes. L’échocardiographie (2/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra environ de 20 minutes par animal. L’irradiation préalable à une greffe de moelle osseuse (2 séquences d’irradiation/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra environ 7 minutes par animal. Les animaux seront mis sous régime riche en lipides afin d’induire l’athérosclérose. La durée des régimes sera de 9 ou 18 semaines. Les animaux prendront du poids, toutefois sans affecter leur état général.

Impact sur les animaux

Le prélèvement pour identification peut occasionner une douleur légère et un stress de courte durée. Les injections peuvent causer un stress et une douleur légère de courte durée. Les administrations orales peuvent causer une douleur légère et un stress de courte durée. L’échocardiographie et l’irradiation peuvent entraîner un stress de durée moyenne.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses des tissus.

Remplacement

Les modèles de souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'athérosclérose. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie adaptée. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles d’athérosclérose en culture cellulaire permettant de reproduire la physiopathologie de la maladie. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre la souris et l’humain, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation des résultats. Ces animaux permettront d’analyser finement le rôle spécifique de certaines cellules immunitaires que sont les macrophages. Seules des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées pour ces études pour rester cohérents avec les conditions cliniques, l’athérosclérose étant une maladie touchant les adultes chez l’humain.

Entre le cinquième et le onzième jour de vie, un fragment de queue est coupé aux ciseaux chirurgicaux sur des souriceaux séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, pour le génotypage. Les nouveau-nés subissent ensuite deux gavages, parfois des injections, et les souris adolescentes deux semaines d'injections quotidiennes, l'excipient pouvant irriter la peau. 784 souris vont être utilisées, 624 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 160 un niveau léger, pour comprendre comment le drainage lymphatique gouverne le développement du ganglion. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs organes.

Objectifs

Les cellules immunitaires circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés dans les ganglions par le réseau lymphatique qui draine le tissu. Ce projet vise à mieux comprendre comment le drainage affecte le développement du ganglion lymphatique en utilisant des modèles de souris.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages et dans certains cas à des injections pour une meilleure prise des traitements. Les souris adolescentes seront soumises selon les lots à des injections pendant 2 semaines pour une meilleure action du médicament. Un prélèvement de sang est effectué sur certains animaux. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique.

Impact sur les animaux

Pour le génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrémité de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. Le geste dure moins d’une minute par animal. Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’excipient peut provoquer une irritation cutanée. Les injections induisent une douleur légère de courte durée.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles assurent la bonne prise du médicament. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du ganglion lymphoïde. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du réseau et des ganglions.