Maintien des lignées génétiquement modifiées

600 souris génétiquement modifiées vont subir la section de deux millimètres de l'extrémité de leur queue, sur animal vigile sous contention et sans anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur signale un saignement possible et, dans de rares cas, un rejet du petit par sa mère. Les animaux restent vivants à l'issue de ce geste unique, leur sort dépendant ensuite du résultat du génotypage et de leur sexe, entre affectation à un projet, maintien de la lignée et mise à mort. Aucune connaissance ne sort de ce protocole, qui sert à trier un élevage destiné à des projets sur les désordres du métabolisme, le porteur écrivant que les méthodes de prélèvement non invasives testées n'ont pas donné de résultats exploitables.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les projets et pour le maintien des lignées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasive. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée pour le génotypage des lignées utilisées. Les animaux issus de cet élevage seront utilisés pour des projets liés à l’étude des désordres du métabolisme, de la modification du comportement alimentaire et de l'inflammation qui peut être trouvée au niveau du cerveau dans un contexte d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permets de selectionner les animaux ayant un gène d'intéret afin d'optimiser la gestion de l'élevage.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement du bout de queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de ces uniques procédures. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage et/ou de leur sexe : a/ Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé; b/ Utilisé pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’enjeux et l’objectif majeur de la réduction consiste ici à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en oeuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, si phénotype non dommageable) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir.

Raffinement

La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (tels que l'obésité, le diabète, les maladies neurodégénératives…). Les prélèvements seront réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.

Porteuses d'une modification génétique qui les fait développer une paralysie en vieillissant, 1 954 souris de la lignée M83 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le protocole tient à leur reproduction et à une biopsie d'oreille de deux secondes à quinze jours, faite au poinçon sous anesthésie gazeuse avec analgésique local. Les souris sont tuées au plus tard à huit mois dans le cadre de la gestion de l'élevage, ou conservées pour des projets expérimentaux à venir. Le porteur qualifie de prise en charge du phénotype dommageable le fait de tuer les animaux à l'âge où la paralysie commence à apparaître.

Objectifs

La lignée murine génétiquement modifiée M83 présente des caractéristiques similaires aux maladies neurodégénératives humaines, comme la maladie de Parkinson. C'est un modèle pertinent pour étudier les facteurs environnementaux tels que les pesticides, susceptibles d'accélérer la pathologie. Ce modèle permet de comprendre comment ces lésions se propagent dans le système nerveux central et périphérique, ce qui pourrait aider au diagnostic précoce et à la différenciation de la maladie de Parkinson et des maladie apparentées. Des études récentes montrent qu’il existe un lien entre la survenue de la maladie de Parkinson, le diabète de type 2, et l’exposition à des pesticides. Le premier objectif de ce projet est de maintenir cette lignée murine avec des caractéristiques génétiques propres au modèle parkinson, et d’éviter une variation génétique du modèle dans le temps. Le second objectif est d’introduire dans la lignée murine M83 des caractéristiques génétiques propres au modèle diabète, afin de s’assurer de la robustesse des données et éviter la variabilité, notamment lors de projets d’exposition à des pesticides dans un nouveau modèle de souris, issu du croisement entre le modèle murin M83 « Parkinson » et un modèle murin « diabète ».

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de bénéficier d'un modèle murin de la maladie de Parkinson, bien suivi et adapté, par les modifications génétiques apportées, à l'étude de l'impact des facteurs environnements comme les pesticides sur la maladie de Parkinson et le diabète.

Procédures

Le phénotype dommageable apparaissant tardivement lors du vieillissement des souris n’apparaît pas dans les procédures d’élevage décrites. Pour le génotypage des souris, une biopsie d’oreille (d'une durée de 2 secondes) sera prélevée de façon unique à l'âge de 15 jours sous anesthésie, en appliquant un analgésique local à l’aide d’un poinçon d’oreille adapté.

Impact sur les animaux

Les souris de la lignée M83 développent des problèmes moteurs tardifs apparaissant à partir de 8-10 mois. Ce phénotype dommageable n'est pas présent durant la phase d'élevage des souris car les souris sont mises à mort à l'âge de 8 mois au plus tard. Les prélèvements à l'oreille sur les animaux M83 induisent une douleur légère de courte durée.

Devenir

Pour chacune des 2 procédures, les animaux seront mis à mort au plus tard à l'âge de 8 mois dans le cadre de la gestion de l'élevage, ou conservés dans le cadre de projets expérimentaux à venir.

Remplacement

Les méthodes alternatives à l’expérimentation animale se développent de plus en plus. Cependant, pour certaines problématiques telles que l’étude de phénomènes physiopathologiques, elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu’elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d’un organisme vivant. En particulier, la lignée murine M83 est un modèle largement utilisé pour l'étude des mécanismes d'accumulation de protéines pathologiques comme élément clé dans la maladie de Parkinson et les maladies apparentées.

Réduction

Pour introduire dans la lignée murine M83 de nouvelles caractéristiques génétiques, les plans de production ont été prévus au plus précis afin de ne pas produire plus d’animaux que nécessaire. Le croisement accéléré de la lignée M83 avec une lignée de souris conventionnelle est aussi une méthode de réduction puisque ne sont reproduits que les individus avec le profil génétique requis. Les souris M83 des 2 sexes mâles et femelles seront utilisés à la fois pour la gestion du noyau d’élevage, ainsi que pour les lots d’expérimentation, selon une proportion qui dépendra des portées obtenues. Cette stratégie permet d’utiliser tous les animaux produits en élevage.

Raffinement

La prise en charge du phénotype dommageable est assurée par la mise à mort des animaux à l’âge de 8 mois, âge à partir duquel le phénotype moteur progressivement sévère peut apparaitre, comme cela est décrit dans la littérature. Lors des biopsies d’oreille, le prélèvement sera réalisé à 15 jours d'âge, sous anesthésie gazeuse, en appliquant un analgésique local en condition aseptique à l’aide d’un poinçon d’oreille adapté. L'arrêt du saignement limité lors de la biopsie sera suivi et géré par les zootechniciens.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris résulte de la possibilité de générer des animaux génétiquement modifiés porteurs de gènes d’intérêt impliqués dans des maladies humaines. Ce travail vise le maintien de la lignée M83 qui est un modèle pertinent dans les travaux scientifiques sur la maladie de Parkinson et les maladies apparentées. Ces souris développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement.

La grande majorité de ces souris quitte le projet pour d'autres protocoles déjà autorisés, les autres, celles dont le génotype ne convient pas et les anciens reproducteurs, sont tuées. 4 428 souris porteuses d'une mutation provoquant une myopathie progressive vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit, jeune et éveillée, une biopsie de la queue pour identifier son génotype, geste répété au pavillon de l'oreille aux ciseaux fins quand l'analyse échoue. Le projet n'a d'autre objet que d'entretenir la lignée et de produire les lots d'animaux des projets de recherche, et le porteur ne justifie le chiffre de 4 428 que par le contrôle du nombre d'accouplements.

Objectifs

Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes d’une maladie génétique du muscle conduisant à une atteinte musculaire (myopathie) et nous développons également des approches thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de la mutation la plus fréquente chez l’homme qui récapitule en grande partie la pathologie humaine. Ces souris développent une faiblesse musculaire lentement progressive mesurable sur certains muscles par un perte de force. Il n y’a pas d’atteinte cardiaque ou respiratoire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du génotype d'intérêt pour nos études, indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie et pour pouvoir évaluer nos stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques d'une myopathie rare et invalidante (moins de 1 cas pour 100 000 naissances) et permettront le développement et la validation de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour d’autres maladies neuromusculaires.

Procédures

Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes. Exceptionnellement, s’il y a un problème de génotypage une nouvelle biopsie pour vérification sera réalisée, dans ce cas une petite biopsie tissulaire au niveau du pavillon de l’oreille sera réalisée en quelques secondes avec des ciseaux fins aiguisés

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage permettant l’identification génétique pourront induire une douleur légère et un léger stress de courte durée chez l'animal. Il peut également y avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Le phénotype des animaux induit une myopathie progressive qui peut entrainer une fatigue musculaire ainsi que des douleurs musculaires pouvant réduire la mobilité des animaux dans de rares cas.

Devenir

La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres projets préalablement autorisés utilisant des animaux à des fins scientifiques (utilisation continue). Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasié.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant au développement de la pathologie musculaire. De la même manière, pour le développement de stratégies thérapeutiques seul une administration dans organisme entier permet de vérifier l’efficacité e la potentielle toxicité d’un traitement ainsi que sa bonne dispersion aux organes cibles (ici les muscles) en fonction de son mode d’administration. Un modèle animal est donc nécessaire pour une bonne compréhension de la physiopathologie et comme modèle préclinique pour tester des approches thérapeutiques.

Réduction

4428 animaux seront entretenus dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre d'accouplement afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. Nous avons aussi optimisé notre stratégie de croisement afin d'obtenir des portées avec le bon génotype. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopreservation sera envisagée.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Des animaux sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris pour laquelle de nombreux outils analytiques sont disponibles. Le modèle utilisé est reconnu et validé par la communauté scientifique, permettant des comparaisons directes avec les données. Enfin, une nos stratégies thérapeutiques pour laquelle nous avons fait la preuve de concept est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Les souris utilisées pour les accouplements auront entre 2 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopréservation sera envisagée. Les animaux pour l’élevage sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 8 mois de vie pour les reproducteurs. Les animaux seront utilisés dans le cadre de projets autorisés, entre 3 semaines et 8 mois. Cela permet d’étudier le développement de la maladie en physiopathologie et aussi de pouvoir intervenir avant l’apparition des symptômes (avant 3 semaines) ou bien sur un phénotype plus installé (après 3 mois) lors d’évaluation de l’efficacité des traitements à prévenir ou reverter la maladie.

Un prélèvement de poils sous anesthésie sur chaque souris des deux premières générations : c'est la seule procédure décrite pour un élevage de 1 200 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet du projet est de fabriquer une lignée transgénique portant deux modifications indissociables, destinée à d'autres travaux sur les enzymes qui font communiquer cellules cérébrales et vaisseaux sanguins. Le porteur écrit qu'aucune souris ne sera élevée en excès ou sans raison, tout en prévoyant la mise à mort de celles dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Celles qui portent le génotype recherché restent en vie, pour la reproduction ou pour être versées à des expériences ultérieures.

Objectifs

L’objectif est d’obtenir une lignée de souris modifiées, avec deux caractéristiques non différenciables, destinée à être utilisée dans des projets de recherche scientifique. Ces souris sont des outils précieux en recherche médicale, particulièrement utiles pour comprendre comment certains gènes agissent dans différentes parties du corps et à différents moments. Elles nous aideront à mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de certaines enzymes impliquées dans la communication entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins, que ce soit en situation normale ou en cas de maladie. L’objectif final est de proposer des traitements mieux adaptés. Le bien-être des animaux sera suivi attentivement pour vérifier si ces modifications entraînent ou non des effets indésirables. Toutefois, d’après la manière dont ces souris ont été conçues, aucun effet négatif n’est attendu.

Bénéfices attendus

Etablir une lignée de souris modifiées possédant deux caractéristiques particulières qui ne peuvent pas être différenciées. Élever cette lignée a pour but de disposer d’un modèle fiable et spécifique pour étudier le rôle d’un gène ou d’un type de cellule dans un tissu ou un organe précis. Cela aidera à mieux comprendre certains mécanismes biologiques ou liés à des maladies, en lien avec les projets de recherche. Dans un premier temps, les chercheurs vérifieront que la modification apportée fonctionne comme prévu. Ensuite, les souris seront utilisées dans des expériences ciblées pour répondre aux questions posées par ces projets. Ce type de modèle permet d’obtenir des résultats plus précis, de limiter les erreurs et, à long terme, de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. Il pourra aussi être utilisé dans d’autres projets ou collaborations, ce qui renforce son intérêt scientifique.

Procédures

Prélèvement de poils sous anesthésie. Tous les animaux de première et deuxième génération seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex: génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n’est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype inattendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d’arrêt définis.

Devenir

Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêt seront mise à mort ou utilisé pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris serviront à la reproduction ou à l'expériementation.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris modifiées pour atteindre les objectifs des projets de recherche. Les expériences réalisées en laboratoire sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. L’utilisation de ces souris reste donc nécessaire pour comprendre certains mécanismes biologiques, notamment les effets de certaines modifications dans un corps vivant. Dans ce cadre, ce modèle reste indispensable.

Réduction

Le nombre de souris élevées est strictement limité aux besoins réels des projets de recherche et au maintien de la lignée. Aucun animal ne sera produit en excès ou sans raison. La reproduction est planifiée de façon centralisée et régulièrement ajustée en fonction des demandes des chercheurs et du responsable de l’élevage. Des outils de suivi permettent d’éviter les excédents. Quand c’est possible, les animaux sont partagés entre différents projets ayant des besoins similaires, pour éviter de faire plusieurs élevages séparés. Si certains animaux produits ne sont pas utilisés, la nécessité de poursuivre les prochaines portées est systématiquement réévaluée.

Raffinement

L’environnement des souris sera adapté aux besoins spécifiques de cette nouvelle lignée. Pour l’identification génétique, un simple prélèvement de poil sera préféré à une méthode plus invasive. Le bien-être des animaux sera contrôlé deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel qualifié. Si un effet indésirable devait apparaître chez certains descendants, une surveillance renforcée sera mise en place pour les premières générations. L’état de santé des souris sera évalué chaque jour selon une méthode standard, incluant l’observation de leur comportement, de leur poids, de leur aspect général et d’autres signes spécifiques liés au modèle utilisé. En cas de problème ou de souffrance, une intervention rapide sera déclenchée, selon des critères établis avec le vétérinaire. Lors des prélèvements et de l’identification, les animaux seront endormis avec un gaz anesthésiant pour éviter toute douleur. Le personnel est formé pour manipuler les souris avec douceur et effectuer les gestes rapidement. Après chaque prélèvement, une surveillance sera assurée pour vérifier qu’il n’y a pas de complications.

Choix des espèces

La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Son utilisation est essentielle pour étudier finement le rôle de certaines enzymes dans les interactions entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins. Elle permet de contrôler précisément leur activité, d’observer leurs effets dans un organisme vivant, et de tester des traitements potentiels. Cette approche, qui combine plusieurs domaines de recherche, est indispensable pour avancer vers des thérapies mieux adaptées aux maladies du cerveau. Les animaux seront génotypés à 4 semaines de vie.

17 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un seul geste, prélever un bout de queue ou d'oreille afin de connaître leur génotype. Sur les souriceaux de cinq à douze jours, la queue est coupée aux ciseaux chirurgicaux sur animal vigile, après séparation de la mère pendant dix minutes au maximum, le tatouage des doigts se faisant dans le même temps. Celles qui portent le génotype recherché partiront vers d'autres projets de l'établissement ou vers des collaborateurs, celles qui ne l'ont pas iront à la formation du personnel ou à des prélèvements post-mortem, ou seront tuées "pour permettre la bonne gestion de nos élevages". Le porteur renvoie la question du remplacement aux projets qui utiliseront ces souris, et affirme qu'il est "indispensable" de connaître leur génotype, donc que ces animaux "ne peuvent donc pas être remplacés ici".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir prélever les tissus (bout de queue ou d’oreille) nécessaires pour caractériser génétiquement les animaux. Les animaux génétiquement altérés produits et génotypés lors de ce projet seront utilisés pour répondre aux objectifs des différents projets autorisés dans notre établissement, portant entre autres sur des études des origines et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires. Les souris génétiquement altérées doivent être identifiées individuellement pour qu'elles puissent se voir attribuer le génotype qui leur est spécifique. Cette identification est réalisée par tatouage à l’encre des doigts des souris et le génotypage se fait directement après le tatouage par biopsie de queue ou d’oreille.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour les projets scientifiques autorisés dans notre établissement (en utilisation continue), mais également de caractériser génétiquement les animaux utilisés pour le maintien et l’optimisation de la gestion des élevages ainsi que ceux utilisés pour des prélèvements de tissus post-mortem.

Procédures

Un prélèvement de tissu (queue) sera effectué sur des souriceaux âgés entre 5 et 12 jours. Le prélèvement se fera sur animal vigile et durera moins d’une minute. Pour les animaux âgés de 12 jours ou plus, le prélèvement de tissu concernera un bout d’oreille (bord externe) et sera réalisé sous anesthésie pour une durée d’environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La procédure nécessite une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. De plus, une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrêmité de la queue ou d’un bord d’oreille à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. La procédure dure moins d’une minute par animal. Pour les animaux plus âgés qui seront anesthésiés avant le prélèvement, l’anesthésie en elle-même (d’une durée inférieure à 5 minutes) peut entraîner un léger stress d’une courte durée.

Devenir

Les animaux génotypés présentant un génotype d’intérêt seront utilisés de façon continue dans les projets de recherche autorisés dans notre établissement, pourront être envoyés à des collaborateurs, ou serviront pour le maintien de nos élevages. Certains de ces animaux pourront également servir pour des prélèvements de tissus et/ou d’organes post-mortem. Les animaux qui ne présenteraient pas de génotype d’intérêt pourront être utilisés pour la formation des personnels, pour des prélèvements de tissus et/ou d’organes post-mortem, ou seront sinon mis à mort pour permettre la bonne gestion de nos élevages.

Remplacement

Les animaux issus de ce projet seront utilisés (lorsque leur génotype le permet) dans les projets autorisés dans notre établissement. C’est dans ces projets qu’est à chaque fois justifié la nécessité d’utiliser les animaux produits et génotypés dans le présent projet et l’impossibilité de les remplacer. Ainsi, il est indispensable de connaître le génotype des animaux concernés afin de pouvoir les utiliser dans les projets autorisés et c’est pourquoi ces animaux ne peuvent donc pas être remplacés ici.

Réduction

Le nombre d’animaux génétiquement altérés pour lesquels un prélèvement de tissu sera fait est calculé en fonction des besoins expérimentaux. Les élevages sont optimisés pour produire un maximum d’animaux ayant le génotype d’intérêt pour les projets autorisés. Les animaux surnuméraires ou ne possédant pas le génotype d’intérêt peuvent être utilisés pour la formation des personnels ou pour des prélèvements de tissus post-mortem après mise à mort selon les méthodes réglementaires. Le nombre de ces animaux est d’ailleurs régulièrement suivi par la SBEA afin d’optimiser au mieux les schémas d’accouplement des lignées concernées. Les lignées qui ne seraient plus utilisées sont arrêtées dès que possible, ou sont cryoconservées si nécessaire. En parallèle de ces prélèvements, des méthodes de génotypage sous le seuil réglementaire seront testées pour être mises en place au sein de l’animalerie et ainsi réduire au fur et à mesure le nombre d’animaux génotypés par méthode « invasive ».

Raffinement

Pour réduire le nombre de manipulations, l’identification par tatouage et la biopsie de queue sont réalisés en même temps. Les souriceaux de la portée sont placés dans une boîte propre, elle-même placée sur plaque chauffante afin d’éviter une trop grande déperdition de chaleur aux souriceaux. La biopsie de queue est réalisée à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale désinfectée entre chaque animal. L’identification et la biopsie, réalisées par un personnel expérimenté, n’excèdent pas 1 minute par animal et ne provoquent pas ou très peu de saignement. La portée est rendue à la mère dès la fin des prélèvements (durée n’excédant pas 10 minutes au total), et la boîte est désinfectée avant d’y remettre une nouvelle portée. La présence de l’ensemble des souriceaux dans le nid après la biopsie est vérifiée dès le lendemain, lors du suivi journalier. Concernant les animaux âgés de plus de 2 semaines au moment de l’identification, l’identification ainsi que la biopsie auront lieu sous anesthésie, et la biopsie réalisée concernera non pas un bout de queue, mais un bout du bord externe de l’oreille. À partir de cet âge là, le prélèvement à l’oreille est moins impactant que le prélèvement à la queue.

Choix des espèces

Les modifications génétiques des lignées de souris élevées dans notre animalerie permettent de réaliser les différents projets autorisés dans notre établissement, et de répondre aux questions scientifiques soulevées dans des thématiques telles que l'étude des origines et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires. En effet, la souris est un des modèles les mieux connus du point de vue génétique, permettant ainsi d’y apporter différentes modifications génétiques, et ses mécanismes physiologiques sont semblables à ceux de l’Homme, ce qui en fait donc un très bon modèle d’étude pour les travaux réalisés dans les différents projets autorisés de notre établissement. Les animaux seront identifiés et prélevés à un âge compris entre 5 et 12 jours. Les animaux qui seraient plus âgés au moment du génotypage seront prélevés sous anesthésie. La procédure de génotypage doit être faite le plus tôt possible pour que les animaux puissent être utilisés jeunes dans les projets autorisés ou pour des prélèvements de tissus post-mortem sur des animaux juvéniles lorsque c’est nécessaire. Cela permet aussi de connaître le génotype des animaux suffisament tôt pour pouvoir effectuer la sélection des animaux à garder ou non pour le maintien des élevages.

Coupe de l'extrémité de la queue ou de l'oreille, sur animal vigile, cinq secondes : 600 souris subissent ce prélèvement dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Cinq cents d'entre elles passeront ensuite dans d'autres projets, les autres sont tuées après avoir servi à maintenir la lignée. Ces prélèvements servent à génotyper des souris modifiées pour quantifier l'élimination des mitochondries anormales, une lignée que l'établissement veut obtenir et conserver dans un fond génétique pur. Le porteur écarte les méthodes non invasives par follicules pileux, fèces ou écouvillonnage buccal, qu'il déclare "pas toujours adaptées" et "souvent sources de contaminations", sans dire lesquelles ont été essayées ni sur quelles données il conclut.

Objectifs

Ce projet a pour objectif l'obtention et le maintien d'une lignée murine dans un fond génétique pur. Cette lignée murine permet de quantifier le processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales. Les mitochondries sont de petites structures à l'intérieur d'une cellule qui jouent un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires. L'obtention et le maintien de cette lignée nécessitent obligatoirement le recours au génotypage (= méthode utilisée pour la caractérisation génétique de modèles murins génétiquement modifiés) et au marquage des souris, permettant ainsi une identification unique de chaque souris en évitant le risque de confusion quant à l'identité et au génotype de l'animal. Il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins expérimentaux. Pour ce faire, il est nécessaire d'identifer les animaux et de les génotyper. Cependant, dans certaines situations, il n'est pas possible de réaliser les actes d'identification et de prélèvement de tissus indispensable au génotypage en un seul geste. Le reccueil de tissus pour le génotypage par des méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fécès ou par un écouvillonnage buccal ne sont pas toujours adaptées aux conditions de diagnostics moléculaires utilisés et sont souvent sources de contaminations affectant les résultats. Cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter les prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L'objectif de ce projet est donc de permettre l'identification et le prélèvement de tissus pour réaliser le génotypage des animaux génétiquement modifiés lorsque celui-ci ne peut pas être couplé à une méthode de marquage.

Bénéfices attendus

Ce projet de prélèvement de tissus pour génotypage et identification des animaux à l'aide d'une bague mise à l'oreille (avec un numéro unique permettant d'identifier de manière individuelle tous les animaux) permet une sélection des animaux d'intérêt et permet également d'optimiser la gestion et l'élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront utilisés pour les expérimentations. De plus, le génotypage par prélèvement de l'extrêmité de la queue ou de l'oreille permet de minimiser les risques de contamination entre échantillons. Ces prélèvements sont des méthodes de génotypage de gravité légère. Lorsqu'ils sont scientifiquement justifiés, ils représentent le meilleur compromis en accord avec les principes de réduction et de raffinement.

Procédures

Le prélèvement de l'extrémité de la queue ou de l'oreille (durée 5 secondes) est réalisé sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de l'extrêmité de la queue ou de l'oreille entraine une douleur légère de courte durée. Dans de très rares cas, un saignement léger de la plaie peut survenir. La contention de l'animal lors du prélèvement peut engendrer un stress léger. De manière exceptionnelle, une infection au niveau du tissu prélevé peut survenir.

Devenir

- Une partie des animaux sera gardée en vie pour être utilisés dans d'autres procédures expérimentales (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - Une partie des animaux sera utilisée pour maintenir la lignée, puis mis à mort.

Remplacement

Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition pour des projets scientifiques de modèles génétiquement modifiés. Le remplacement ne se situe donc pas directement à ce niveau mais en amont lors du choix du modèle. Dans nos conditions de production et de maintien de lignées génétiquement modifiées, la biopsie à l'extrêmité de la queue ou de l'oreille pour le génotypage, associée à la pose d'une bague auriculaire pour l'identification, constitue la méthode la plus performante, fiable, unique et durable.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les plans d'élevage et de maintien de la lignée murine sont définis en amont dans le but de réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux génotypés.

Raffinement

Le raffinement pour ces techniques est de s'assurer d'avoir un process cadré et éprouvé qui sera appliqué par des techniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l'intensité et la durée de la douleur induite par la biopsie. Les outils de prélèvements sont soigneusement nettoyés et désinfectés. Les bagues d'identification sont à usage unique et désinfectées. Une fois le prélèvement réalisé, l'animal est remis dans sa cage et observé pour vérifier qu'il se déplace correctement et qu'aucun signe de souffrance ou de détresse n'est visible. Un suivi quotidien post-biopsie sera réalisé. Si une infection survient au niveau de la plaie, une solution antiseptique de type vétédine sera appliquée sur la plaie jusqu'à la guérison.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui permettra, dans la mesure du possible, d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux âgés d'au moins 21 jours.