Maintien des lignées génétiquement modifiées

Nées de croisements de lignées génétiquement modifiées destinées à l'étude du cancer, 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À 21 jours, sous brève anesthésie générale, chacune subit l'ablation de moins d'un millimètre de l'extrémité de la queue et la pose d'une bague numérotée à l'oreille. Le porteur décrit la queue de la souris comme un organe sensible, contenant os, cartilage, vaisseaux et nerfs, dont l'absence entretient un handicap, et retient l'âge de 21 jours parce que l'ossification n'y est pas achevée. Les souris dont l'ADN ne correspond pas à ce qui est attendu sont tuées, les autres restant en vie pour l'élevage des lignées ou des expériences ultérieures.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement de queue pour obtenir un échantillon de tissu de souris transgénique afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère gravement l’état général de l’animal. Le prélèvement de tissu sera effectué en même temps que l’identification des animaux par la pose d’une bague numérotée à l’oreille, lorsque les animaux pourront être sevrés à l’âge de 21 jours. La procédure sera réalisée sous une brève anesthésie générale. Ces derniers représentent des modèles d’expérimentation OGM, générés pour l’étude du développement tumoral au laboratoire. Ces modèles sont à la base des projets de l’équipe, basés sur l’étude de la reprogrammation des cellules dans le développement du cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’étude de l’ADN des animaux d’intérêt élevés dans l’établissement grâce au morceau de tissu prélevé à la queue, couplée à leur identification à l’oreille par une bague numérotée. L’intérêt de ce projet est de générer des modèles d’étude OGM, qui seront utilisés dans la majorité des projets futures. En effet, ils seront à la base des projets de l’équipe, qui étudie principalement l’effet de la reprogrammation des cellules dans le développement du cancer.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 21 jours, réalisé en même temps que leur identification par bague à l’oreille. La durée du prélèvement caudale sera de quelques secondes et l’identification des animaux par pose d’une bague à l’oreille nécessite moins d’une minute. Pour cela, les animaux seront placés sous anesthésie générale puis maintenus à la main pour être immobilisés le temps de la réalisation du geste par l’expérimentateur. L’anesthésie durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue, sera inférieur à 1mm et réalisé sous anesthésie générale afin de limiter les effets indésirables. La queue de la souris a de nombreuses fonctions (régulateur de température, balancier, organe sensitif du toucher…) et son absence entretient un handicap pour les souris. C’est un élément de l’anatomie de la souris sensible, qui contient des os, du cartilage, des vaisseaux sanguins et des nerfs. La coupe de la queue après 28 jours d’âge occasionne un inconfort prolongé dû à son développement osseux et nerveux. Ainsi, à l’âge de 21 jours, un prélèvement de moins de 1mm peut être envisagé sans induire d’effets indésirables pour l’animal. Cet âge est choisi car il est compatible avec une identification par bague à l’oreille ainsi qu’avec le sevrage des souriceaux.

Devenir

Les animaux dont l’ADN ne correspond pas aux besoins seront mis à mort. Les autres animaux d’intérêt seront conservés pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques, ou seront utilisés pour des expérimentations futures.

Remplacement

L’utilisation de souris génétiquement modifiées permet l’étude d’un gène ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des outils et techniques permettent de modifier l’ADN de façon très précise. De plus, la modification de cet ADN peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.

Réduction

Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter les pertes des modifications d’ADN apportées au fur et à mesure des croisements successifs (environ 15 à 20 souris maximum par lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). Le nombre d’animaux inclus dans ce projet à été calculé afin d’obtenir suffisamment de souris pour entretenir un élevage, tout en ayant été réduit à son minimum. L’élevage de lignées génétiquement modifiées est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. Il est important de noter que le croisement de lignées génétiquement modifiées entraine la production d’animaux de mauvais génotype, c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles attendues.

Raffinement

Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé tôt, à l’âge de 21 jours. A cet âge, l’ossification de la queue n’est pas complète. Ainsi, cela permet de limiter la nuisance du geste. La taille du prélèvement est réduite à son minimum et représente au maximum 1mm. Pour réduire le nombre de manipulations faites sur l’animal, le prélèvement est réalisé en même temps que la pose d’une bague numérotée à l’oreille de la souris maintenue sous anesthésie générale et immobilisée avec la main. Un léger saignement peut apparaître après le prélèvement, et peut être stoppé immédiatement avec une pression à l’extrémité de la queue. Pour suivre l’état de santé des animaux après l’intervention, une fiche de suivi (grille de score) est utilisée. Elle regroupe plusieurs aspects cliniques comme le comportement, l’état de stress ou le niveau d’hydratation par exemple.

Choix des espèces

La modification génétique est généralement réalisée chez la souris. Elle représente un modèle entier très adapté pour des études liées à la modification de gènes, la génération d’individus étant rapide et maîtrisable. Le prélèvement de tissus sera réalisé avant ossification de la queue à l’âge de 21 jours, afin de limiter les nuisances sur l’animal. Ce geste sera réalisé en même temps que le sevrage et l’identification définitive des animaux par la pose d’une bague à l’oreille afin de limiter le nombre de manipulations sur les animaux. Enfin, la procédure sera réalisée sous anesthésie générale pour limiter les nuisances pour l’animal.

Atteintes d'un syndrome lymphoprolifératif qui les tue vers dix-sept semaines sans signe clinique annonciateur, les souris homozygotes de cet élevage sont tuées au plus tard à quinze semaines pour anticiper les points limites. 37 300 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures déclarées à un niveau de souffrance léger, avec pour seul geste une biopsie sur animal vigile destinée au génotypage. Une partie est expédiée vivante vers le laboratoire demandeur en "utilisation continue", le reste est tué pour la gestion de l'élevage ou le prélèvement de gamètes. L'élevage alimente des essais de composés contre les maladies liées aux immunoglobulines G4, et le porteur écrit que le nombre d'animaux est calculé au minimum tout en précisant qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée".

Objectifs

Les maladies immunitaires sont parfois difficiles à diagnostiquer du fait des signes cliniques variés qui leurs sont associés. Cela rend également leur traitement difficile et le taux de rechutes est important. L’objectif de ce projet est d’améliorer la prise en charge et le traitement des maladies associées aux immunoglobulines G4 (protéines du sang produite par le système immunitaire). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (immunoglobulines G4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’Homme. Des souris reproduisant ces maladies grâce à des modifications génétiques spécifiques seront utilisées afin d’étudier l’apparition et le développement de ces maladies mais également de tester de nouveaux traitements. Nous mettrons en place un élevage de ces souris afin de générer les animaux nécessaires aux expérimentations.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles de souris, au plus proche de la maladie humaine, sont très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de leur diagnostic difficile à établir et à dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechute. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de déterminer le génotype de l’ensemble des animaux de ce projet. Les souris homozygotes pour les modifications génétiques présentent un phénotype dommageable qui commence 3 semaines après la naissance.

Impact sur les animaux

Les animaux développent un syndrome lymphoprolifératif 3 semaines après la naissance conduisant à leur mort après 17 semaines. Aucun signe clinique laissant présager de l’issue fatal de ce syndrome lymphoprolifératif n’est décrit chez ces animaux. Par ailleurs, une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés pour une utilisation continue vers le laboratoire demandeur, soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (avant l'atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permet une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permet de valider certaines hypothèses et d’obtenir de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire, nos données historiques et les techniques de reproduction assistées (fécondation in vitro, stimulations hormonales…) permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Dans la mesure du possible, la lignée sera maintenue via des croisements générant des individus n’exprimant pas le phénotype dommageable lymphoprolifératif. Lorsqu’il sera nécessaire de générer des individus avec le phénotype dommageable, notamment pour développer la lignée ou pour la production des lots d’intérêt, si cela est possible, nous privilégierons les fécondations in vitro (embryons portés par des femelles pseudogestantes non mutées) car les femelles altérées génétiquement avec le phénotype dommageable ont des difficultés à mener à terme leur gestation. Les animaux avec phénotype dommageable développent un syndrome lymphoprolifératif 3 semaines après la naissance conduisant à leur mort après 17 semaines. Aucun signe clinique laissant présager de l’issue fatale de ce syndrome lymphoprolifératif n’est décrit chez ces animaux. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, ces animaux seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 15 semaines. Une observation quotidienne sera réalisée pour identifier tout animal qui présenterait des signes cliniques.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les souris sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elles constituent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Les animaux homozygotes avec le phénotype dommageable seront expédiés ou euthanasiés au plus tard à l’âge de 15 semaines.

Issues des lignées génétiquement modifiées déjà engagées dans les autres projets de l'équipe, 1 000 souris vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger, qui tient en un seul acte : la section de 2 mm de l'extrémité de la queue au sevrage, pour génotypage. La nuisance annoncée se limite à un saignement éventuel, sans anesthésie ni analgésie, le porteur jugeant l'anesthésie elle-même plus gênante que le geste. Cette autorisation existe parce que la réglementation encadre désormais ces prélèvements invasifs, plusieurs essais de génotypage sur poils ayant échoué. Les souris ne sont pas tuées à l'issue, elles restent en vie et poursuivent leur utilisation dans les projets en cours sur le rôle de CD146 dans les maladies cardiovasculaires.

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer des biopses de queues sur les souris génétiquement modifiées qui ont intégrées dans tous nos projets scientifiques en cours et à venir (ayant déjà des autorisations de projet ou en cours) dans le but de génotyper nos lignées. La nouvelle réglementation exige désormais une autorisation pour ces prélèvement sinvasifs en vue de génotypage. Plusieurs essais de génotypage non invasifs sur poils ont été réalisés, sans succès par notre équipe. Nos projets en cours concernant la compréhension du rôle de CD146 dans les maladies cardiovasculaires ainsi que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant cette molécule, notamment les vésicules extracellulaires. Nous utilisersons des modèles expérimentaux d'athérosclérose ainsi que des souris n'exprimant plus la molécule.

Bénéfices attendus

Les animaux utilisés dans ce projet permettront d'apporter de nouvelles données dans la compréhension du rôle de CD146 dans les maladies cardiovasculaires. Génotypage et contrôle qualité de nos lignées murines.

Procédures

Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Cette intervention durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue au moment du sevrage à 4 semaines, éventuellement saignement.

Devenir

Animaux maintenus en vie, utilisation continue dans des DAP d'expérimentation.

Remplacement

Ces stratégies ont été décrites dans chacune des DAP précédentes, il s'agit de biopsier les animaux de ces DAP en vue de les génotyper. Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro mimant les plaques d'athérosclérose et suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur le rôle de CD146 dans la progression des maladies cardiovasculaires. Il est dons nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.

Réduction

Nous appliquerons la stratégie de réduction, à savoir 1/ l'utilisation dès que possible de schémas d'accouplements ne ne nécessitant pas ou peu de génotypage (-/- x -/-), 2/ l'arrêt des élevages de lignées non utilisées et cryoconservation de celles-ci, 3/ des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques), 4/ le développement en parallèle des méthodes de génotypage sous le seuil . Au total, dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux nécessaires aux expérimentations, à savoir un nombre de 1000 souris qui résulte du nombre de souris nécessaire en lien avec nos besoins expérimentaux pour atteindre la puisance statistique nécessaire minimale.

Raffinement

Ces stratégies ont été décrites dans chacune des DAP précédentes, il s'agit de biopsier les animaux de ces DAP en vue de les génotyper. Concernant le prélèvement invasif, il s'agit d'une méthode éprouvée, précise, rapide et standarisée, ce qui limite les effets indésirables liés au stress et à la douleur. L'anesthésie, subie comme une nuisnace, n'est pas nécessaire dans ce cas. Egalement, l'analgésie n'est pas pertinente. La cicatrisation sera suivie dans le temps et de manière quotidienne après le prélèvement.

Choix des espèces

Il s'agit de génotyper les souris utilisées dans tous nos protocoles pour lesquels les autorisations ont été obtenues. Les modèles animaux d'athérosclérose sont des outils importants pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients des maladies cardiovasculaires. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le plus utilisé pour générer des souris transgéniques qui sont largement utilisées pour étudier le rôle précis de molécules. Ils sont déja disponibles à l'animalerie du CEFOS. Les biopsies de queues se font au moment du sevrage.

Reproducteurs d'au moins 90 jours, mis en croisement pour fournir les embryons et les larves d'autres projets, 5 280 poissons zèbres vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun perd 20 % de sa nageoire caudale, coupée sous anesthésie à la tricaïne, avec de la lidocaïne ajoutée à l'eau contre la douleur. Le porteur indique que la nageoire repousse en sept à dix jours et que le poisson nage correctement entre-temps. Le prélèvement sert à trier les individus, 2 400 porteurs de la mutation recherchée partant vers des projets ultérieurs, les 2 880 autres étant tués.

Objectifs

Permettre de déterminer le statut génétique des poissons adultes âgés d'au moins 90 jours de vie.

Bénéfices attendus

Le projet nous permet de conserver uniquement les individus de génotypes désirés et s'intègre dans la Réduction du nombre d'animaux dans les projets de recherche.

Procédures

Prélèvement de 20% de la nageoire caudale sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

La procédure est de classe légère. L'eau des poissons sera supplémentée de lidocaine, antalgique, pour diminuer la douleur et le stress de la procédure. Pendant 7-10 jours, le poisson nagera avec une nageoire caudale plus petite le temps que celle-ci régénère mais cela ne l'empêche pas de nager correctement ou de chercher sa nourriture.

Devenir

Les animaux porteurs de la mutation seront utilisés ultérieurement dans des projets scientifiques (n=2400), les animaux non porteurs de la mutation d'intérêt seront euthanasiés (n=2880).

Remplacement

Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l'analyse du développement précoce du système nerveux central et entérique car il permet une visualisation de ces organes au cours du développement embryonnaire et larvaire grâce à la transparence des embryons et larves et à la rapidité de son développement précoce. Le développement des organes et leurs fonctions sont assez similaires avec les organes humains, ce qui fait du poisson zèbre un organisme de choix. Nous travaillons sur la meilleure compréhension du développement d'organes qui communiquent entre eux (cerveau et intestin), il n'est donc pas possible de réaliser nos projets de recherche en utilisant des lignées cellulaires in vitro.

Réduction

Les animaux utilisés dans ce projet sont les reproducteurs qui seront mis en croisement pour obtenir les embryons et larves pour les études scientifiques. Le nombre d'animaux est maintenu le plus bas possible tout en maintenant un nombre d'individus suffisants (40 couples d'adultes par lignée) pour éviter une dérive génétique. Les larves et embryons issus des croisements peuvent être analysés au niveau de plusieurs organes (cerveau, intestin, nageoires, cartilage de la face) en même temps ce qui limite le nombre de reproducteurs nécessaires et donc le nombre de poissons à génotyper.

Raffinement

La dose de tricaine, anesthésique, a été validée par notre vétérinaire. La gestion de la douleur est également pris en charge par l'ajout de lidocaine, antalgique, dans la solution d'anesthésique avant la procédure, pendant la procédure de biopsie et ensuite pendant la phase de convalescence du poisson. Des publications récentes nous ont permis de choisir le meilleur antalgique et la dose à utiliser pour notre procédure. Au cours du projet, une veille bibliographique nous permettra de connaitre d'autres signes possibles de douleur ou d'angoisse chez le poisson et nous pourrons prendre des mesures de raffinement appropriées.

Choix des espèces

Pour réaliser des études de gènes impliqués dans les maladies développementales de l'enfant, il faut pouvoir suivre l'effet des mutations d'un gène donné sur le développement de l'organe atteint (dans notre cas le cerveau et l'intestin) et ce, dans sa globalité et dans son contexte d'interaction moléculaire avec les autres organes environnants. Ce type d'études ne peut donc se réaliser sur des lignées cellulaires in vitro. Le poisson zèbre est un modèle approprié pour nos études sur la fonction des gènes responsables de troubles du neurodéveloppement. Le poisson zèbre est un vertébré et possède des régions cérébrales identiques à celles de l'être humain. Il a un développement ex-utero, ce qui nous permet de réaliser l'ensemble de nos études sur des embryons et des larves âgées de moins de 5 jours de développement. Pour obtenir ces embryons et larves, nous avons besoin de reproducteurs, mâles et femelles, pour produire des oeufs fécondés. Ces reproducteurs sont des poissons adultes âgés de 90 jours. A ce stade, les nageoires caudales sont assez grandes pour procéder à une biopsie de 20% sans altérer le comportement du poisson adulte. Les 20% de cette nageoire caudale repousse en 7-10 jours.

40 000 souris vont être utilisées, à raison de vingt secondes chacune, le temps de percer un disque de 1,5 mm dans l'oreille d'un animal vigile. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger et aucune souris n'est tuée dans ce cadre, toutes étant gardées vivantes pour des études, des expéditions, une cryoconservation ou les prestations de services de l'établissement. Le prélèvement sert à revérifier le génotype d'animaux déjà génotypés une première fois, le porteur indiquant un taux d'erreur pouvant atteindre 15 %. Il présente ce contrôle qualité comme une façon de limiter la duplication des études et la production d'animaux, sans indiquer comment il arrive à 40 000 individus.

Objectifs

La recherche biomédicale utilise des lignées de souris génétiquement modifiées (GM). Ces souches de souris portent une ou plusieurs modifications génétiques dans leur génome, apportées par des technologies bien établies. Ces animaux GM visent soit à comprendre le(s) rôle(s) d'un gène, soit à reproduire une pathologie humaine pour en comprendre le développement et/ou tester des thérapies potentielles. Ces lignées sont donc des modèles d'étude pour la recherche biomédicale. Ces souches sont créées sur demande par les équipes de recherche, puis mises à disposition de la communauté scientifique via des banques qui archivent ces modèles sous forme de sperme ou d'embryons congelés. Pour mener à bien les études scientifiques, il faut que nous sachions si les souris GM produites par élevage sont porteuses de la bonne mutation ou non. Une procédure de biologie moléculaire, le génotypage, permet de détecter la présence ou l'absence de la modification génétique dans la souris (génotype). Ce génotype est déterminé chez l'animal à partir d'un prélèvement de tissu. Selon les études bibliographiques à ce sujet, l’application de cette procédure de génotypage n’est pas infaillible, avec un taux d’erreur pouvant aller jusqu’à 15% .Avant d'intégrer des souris dans une étude scientifique, de les archiver ou de les mettre à disposition des équipes de recherche, il est nécessaire de confirmer leur génotype. Ceci permet d'éviter toute incohérence dans les études et les résultats futurs, en tenant compte de ce taux d'erreur possible.

Bénéfices attendus

Les techniques de génotypage ne sont pas infaillibles. Par ailleurs, en effectuant plusieurs centaines de biopsies par semaine, cela peut entraîner une contamination génétique d'une lignée, avec la détection d'une mutation différente de celle attendue. Les erreurs de génotypage peuvent avoir de multiples conséquences. Dans un groupe de souris dédié à une étude scientifique, la présence d'un mauvais génotype peut influencer les résultats de l'étude, rendant les conclusions plus ou moins convaincantes. Pour les lignées archivées, un génotypage erroné peut menacer la pérennité et la qualité des modèles congelés disponibles pour la recherche. En conséquence, la confirmation du génotype des animaux dédiés à une étude renforce la qualité, la robustesse et la reproductibilité de la recherche biomédicale. Elle améliore également la qualité des stocks de lignées archivées, bénéficiant ainsi aux chercheurs. Ce contrôle qualité, représenté par la confirmation du génotypage, permet de minimiser la duplication des études, la production d'animaux et la création d'une lignée génétiquement modifiée.

Procédures

Nous prélevons une biopsie de 1.5mm de diamètre sur animaux vigiles à l'aide d'une pince spécialement dédiée et désinfectée. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal et dure au maximum 20 secondes. L'animal est ensuite replacé dans sa cage d'origine.

Impact sur les animaux

Le poinçon à l'oreille peut entrainer une douleur légère et de courte durée au site de prélèvement.

Devenir

A l'issue de la procédure déclarée, les animaux sont gardés en vie pour être impliqués dans le cadre de nos prestations de services, dans une étude scientifique, une expédition ou une cryopréservation

Remplacement

Pas d’autre possibilité que le recours à l'animal vivant pour le projet de prélèvement de tissu.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble de nos activités. Ceci permet de réduire de manière la quantité d'animaux générés et donc prélevés pour le génotypage.

Raffinement

La méthode de poinçon à l'oreille est éprouvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs sur les animaux. De plus, les animaux sont surveillés quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation dans le temps.

Choix des espèces

La majorité des projets menés dans notre institut utilise la souris comme espèce pour trois raisons principales: ses capacités de reproduction, ses caractéristiques génétiques proches de l'homme, et les techniques d'ingénierie génétique bien maitrisées. Il existe à ce jour, plusieurs dizaines de milliers de lignées génétiquement modifiées dans cette espèce. Les biopsies pour le re-génotypage se font après le sevrage des souris, soit à partir de 5 semaines d’âge. Les souris à regénotyper peuvent être plus âgées, en fonction du timing de la réalisation du projet.

Les chiens de cette colonie portent la mucopolysaccharidose de type IIIA, maladie génétique qui détruit progressivement les cellules du cerveau, et 100 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger dont le seul objet est de produire des animaux malades pour une future étude de thérapie génique. Les femelles subissent jusqu'à huit prises de sang et huit frottis vaginaux par cycle, deux inséminations artificielles, parfois des injections pour aider à la mise bas. Parmi les effets attendus, le porteur liste les complications de gestation, les morsures entre reproducteurs et le cannibalisme des chiots. Vingt chiens sont annoncés adoptés et quatre-vingts comptés comme morts, alors que le texte évoque aussi des porteurs sains devenus reproducteurs à leur tour et des chiens malades versés à des études d'évaluation de produits thérapeutiques.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de maintenir une lignée de chiens atteints de Mucopolysaccharidose de type IIIA afin de générer des animaux nécessaires à l'évaluation d'un projet thérapeutique par thérapie génique.

Bénéfices attendus

Le syndrome de San Filippo A, est la conséquence d'une accumulation d’une molécule, partiellement dégradées, dans les tissus de l'organisme. Ceci est le fait d'une mutation génétique qui affecte l'activité d'une enzyme nécessaire pour la dégradation de cette molécule. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l'Homme, ils apparaissent habituellement avant l'âge de 3 ans. Par la suite, l'atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d'autonomie vers l'âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 15 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l'efficacité des produits thérapeutiques, études de dose...). Le présent projet vise à obtenir des animaux atteint de la maladie puis d'évaluer l'efficacité d'un traitement de thérapie génique. C'est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques ainsi que la tolérance globale de l'approche avec le suivi IRM (Imagerie à Résonnance Magnétique), les données hématologiques, etc. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.

Procédures

Pour la mise en place de la colonie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Prise de sang pour dosage hormonal des femelles afin de déterminer avec précision le moment de la saillie ou de l’insémination artificielle : 8 prises de sang maximum par cycle avec une durée de 5 minutes maximum. - Frottis vaginaux pour la détermination du stade du cycle sexuel : 8 frottis maximum par cycle avec une durée maximale de 5 minutes. - Insémination artificielle (IA) : 2 IA intra-vaginales ou intra-utérines par cycle, la procédure prend 10 minutes - Prélèvements pour conservation de semences congelées pour les futurs mâles et la procédure prend environ 30 minutes. - Injections possibles pour aider à la mise-bas : 1 à 3 injections qui prennent quelques secondes - Prélèvements buccaux et de poils pour le génotypage des chiots : 1 seule fois à la naissance avec une durée d’une minute.

Impact sur les animaux

Les actes nécessaires au développement et maintien de lignée sont peu ou non invasifs. Les effets indésirables possibles sont ceux liés à la reproduction : • Un risque de complication lors des gestations, mises bas et lactation • Hématome lors de prise de sang nécessaire pour un suivi vétérinaire • Risque de morsures entre reproducteurs • Cannibalisme des chiots par la mère . Les animaux hétérozygotes MPSIIIA, c’est-à-dire porteurs sains de la maladie, ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux reproducteurs seront adoptés lorsqu'ils prendront leur retraite, généralement vers l'âge de 7-8 ans. Les animaux réutilisés incluent les hétérozygotes MPSIIIA (porteurs sains de la maladie) générés, qui deviendront eux-mêmes reproducteurs pour assurer la continuité de la lignée, et les homozygotes MPSIIIA malades, qui participeront à des études d'évaluation de produits thérapeutiques. Les animaux sains seront soit inclus en tant que « témoin sain » dans les projets de recherche préclinique, soit intégrés dans des programmes d’adoption, soit mis à mort après le génotypage, en fonction des besoins.

Remplacement

Cette demande d’autorisation de projet a pour but le maintien d’une lignée de chien MPSIIIA dont les animaux de génotypes -/- (malades) et certains +/+ (témoins) issus de la reproduction seront intégrés dans une étude préclinique de thérapie génique. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV qui seront utilisés dans l’étude préclinique à venir (qui fera l’objet d’une demande d’autorisation spécifique). Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaire pour une demande d'essai clinique de phase I/II pour lesquelles l'utilisation d'un modèle gros animal, permettant la mise en place d'approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l'essai clinique est indispensable et nécessite donc l'utilisation de cette lignée de chiens MPSIIIA. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour tester l'effet d'un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l'efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n'est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L'animal est le seul organisme vivant permettant d'étudier l'impact d'un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d'administration utilisé et la dose administrée.

Réduction

100 animaux seront utilisés au total dans ce projet. Ce nombre représente une estimation maximale prenant en compte la globalité du projet. Pour le maintien de la lignée, on se reposera sur les croisements entre les différents chiens de la colonie récupérée ainsi que des paillettes de semences congelées pour des inséminations artificielles, afin de réduire le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l’animal et sont réalisées par un personnel formé et expérimenté. Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Ils seront suivis quotidiennement par les techniciens animaliers, à minima 2 fois par jour les jours ouvrables et 1 fois par jour les weekends et jours fériés. Les chiens mâles seront soumis à des prélèvements de sperme pour réaliser des spermogrammes et/ou conservation de paillettes de sperme pour des futures inséminations artificielles. Ces prélèvements seront réalisés entre 1 et 2 fois par an par un vétérinaire spécialisé en reproduction canine. Une fois la gestation avérée par échographie, la date de mise-bas approximative est calculée et un planning de garde de nuit est instauré au moins une semaine avant cette date. En effet, un animalier passe voir la chienne reproductrice pendant sa garde pour s’assurer que tout se passe bien. Si la chienne est sur le point de mettre bas ou si la mise-bas a commencé, l'animalier reste sur place pour s'occuper d'elle et des chiots si nécessaires. En cas de problèmes éventuels lors de la mise-bas, l’animalier contacte le vétérinaire de garde. Une fois la mise bas terminée, un planning de garde de nuit est établi pour la gestion des chiots éventuellement plus faibles (biberonnage, gavage, soins, etc.). A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Pour suivre efficacement l'état de santé des animaux et intervenir rapidement, une liste de points limites a été établie. Cette liste permet de définir une conduite à tenir afin d'arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l'aide de mesures telles que l'euthanasie ou par un traitement adapté

Choix des espèces

Le choix du chien MPSIIIA comme modèle d'étude est basé sur la prédisposition raciale à la même maladie génétique que chez l'homme. De plus la transmission génétique est la même que chez l'homme. Le choix de l'espèce est également basé sur son homologie avec l'homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Les animaux pourront rentrer en reproduction entre 18 et 24 mois, et plus exactement lors des secondes chaleurs de chiennes. Les mâles seront également matures sexuellement à cet âge-là et pourront intégrer les cycles de reproduction pour inséminer les femelles à partir de ce moment.

633 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, un prélèvement de tissu au bout de la queue sous anesthésie générale au moment du sevrage, sept d'entre elles au maximum subissant un second prélèvement dans le pavillon de l'oreille quand le premier échoue. Ce génotypage sert à fournir des lots de souris transgéniques et sauvages à des projets sur la maladie d'Alzheimer, publics comme privés. Le champ de devenir est vide alors que la justification annonce que toutes les souris sont gardées vivantes, celles au bon génotype pour les études demandeuses et les surnuméraires pour des projets sans exigence de génotype. Le porteur écrit que cette lignée est "nécessaire" pour répondre aux "besoins" de ces études et qu'il n'existe pas d'autre méthode pour étudier in vivo le vieillissement pathologique.

Objectifs

L’objectif du projet est d’assurer la reproduction des souris, de les élever et définir leur génotype dans le cadre de la gestion de projets scientifiques sur la maladie d’Alzheimer pour constituer des groupes de souris transgéniques et sauvages issues des croisements programmés. La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Aujourd’hui, aucun traitement n’est capable de prévenir efficacement la maladie qui est initiée plus de 20 ans avant les premiers symptômes. Ces projets collaboratifs peuvent porter sur l’étude de mécanismes physiopathologiques de la maladie, la recherche de biomarqueurs à visée diagnostique ou thérapeutique mais aussi pour étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques tout en intégrant le concept « one health ». Même si la recherche reste très active, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme non familiale la plus représentée dans la population. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour évaluer ou prévenir le vieillissement pathologique Alzheimer versus le vieillissement physiologique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu dans ce projet est de pouvoir gérer le nombre d’animaux transgéniques versus sauvages en fixant le nombre d’accouplements le plus juste pour l’obtention du nombre de souris souhaitées avec un génotype clairement identifié dans les études scientifiques collaboratives publiques et/ou privées sur la maladie d'Alzheimer. Le contrôle sur la lignée transgénique permet de mieux prévenir le risque de dérive génétique et de s’assurer au sein de la plateforme expérimentale animale de la qualité de l’élevage et de l’hébergement.

Procédures

Pour 630 souris : 1 prélèvement tissulaire à l'extrémité de la queue sous anesthésie générale en moins de 5 secondes. En cas de perte de la boucle ou de résultats inexploitables suite à la biopsie de la queue (estimation 1% des effectifs, soit 7 souris maximum) : un deuxième prélèvement sous anesthésie générale sera effectué dans le pavillon de l'oreille. Pour 3 reproducteurs mâles : 1 prélèvement tissulaire dans le pavillon de l'oreille sous anesthésie générale. Le prélèvement se réalise en moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.

Devenir

Les individus avec le génotype requis seront gardés en vie pour une utilisation dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées ou pour la reproduction. Les individus surnuméraires seront gardés en vie pour une utilisation dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.

Remplacement

Cette lignée de souris transgéniques élevée dans l’animalerie est nécessaire pour répondre aux besoins des études collaboratives évaluées scientifiquement par des experts externes pour le public et internes pour le privé. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour étudier in vivo des mécanismes physiopathologiques, monitorer de nouveaux biomarqueurs à visée diagnostique ou thérapeutique ou juger l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

La stratégie d'accouplement envisagée repose sur les études collaboratives privées ou publiques, donc cela évite des accouplements en continu (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) et limite la production d'animaux surnuméraires. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Pour cette lignée, les deux transgènes sont transmis ensemble sans dissociation possible limitant ainsi les croisements multiples pour obtenir le bon phénotype. Les descendants sont dans 50 % des cas des souris hétérozygotes Alzheimer et l’autre moitié des souris de type sauvage. Toutes les souris sont utilisées dans les projets pour comparer les deux phénotypes. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet prend en compte qu’un mâle TG hétérozygote sera accouplé avec deux femelles de type sauvage. Le nombre moyen de petits est de sept par portée pour cette lignée. Sur une année, on peut compter dix-huit femelles accouplées sachant que trois mâles et six femelles seront achetés au début du projet. Les accouplements seront programmés tous les 4 mois pour avoir des souris des deux phénotypes dans les projets expérimentaux et renouveler les couples reproducteurs.

Raffinement

Sans autre alternative de prélèvements biologiques non invasifs pour le génotypage, le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum de l’ordre d'un millimètre cube. Des points limites ont été définis pour réaliser ou pas la biopsie et sont détaillés dans les annexes. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Les souris incluses dans cette procédure (âge max 6 mois) n’expriment pas de phénotype dommageable.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins transgéniques. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les individus qui vont subir une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage sont âgés de 21 à 30 jours. Cet âge correspond à l'âge du sevrage (séparation avec la mère) afin de ne pas compromettre le développement postnatal. Le développement de l'ossification de la queue n'est pas encore achevé à cet âge et limite ainsi la nuisance liée à ce geste. Le prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié pour les animaux de plus de 6 semaines et adultes. Ce cas de figure est rare (moins de 1% des animaux biopsiés dans l'animalerie) mais peut être réalisé à l’arrivée des premiers couples parents provenant du fournisseur agréé (pour vérification du génotype), en cas d’échec de la procédure de génotypage à partir de la biopsie de queue ou si au moins deux souris de la même cage perdent leur boucle d’oreille.

Une à deux prises de sang de deux millilitres, parfois au sinus occipital, à l'arrière du crâne : c'est la seule procédure déclarée pour 652 poules d'une lignée à croissance lente, classée d'un niveau de souffrance léger. Les animaux resteront vivants et le porteur prévoit de les réutiliser dans d'autres protocoles, faute d'intervention majeure subie. La liste des atteintes attendues déborde pourtant largement la prise de sang, avec du picage entre congénères pouvant creuser des plaies cutanées profondes, des atteintes de l'appareil locomoteur, une dégradation générale de l'état d'un individu sans cause identifiable avant autopsie, et des lésions cérébrales possibles si l'aiguille s'enfonce trop loin. Le maintien de cette lignée est présenté comme indépendant de tout intérêt industriel, alors que le caractère sélectionné est d'ordre agronomique et que les poussins produits couvriront les demandes des projets de recherche.

Objectifs

Le présent projet vise à maintenir la diversité génétique dans cette souche utilisée régulièrement comme modèle de poulet à croissance lente, indépendamment de tout intérêt industriel. Maintenue en petits effectifs depuis plus de 50 générations, il est crucial d’y optimiser les accouplements pour éviter la consanguinité.

Bénéfices attendus

Grâce au maintien de lignées de poulet uniques, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’adaptation des animaux à croissance lente dans le cadre de la transition agroécologique. Ces poulets, maintenus de façon à optimiser la diversité génétique durant des décennies, sont en effet un modèle de choix pour étudier notamment les comportements des animaux en plein air.

Procédures

Une à 2 prises de sang de 2 mL d'une durée de moins d'une minute

Impact sur les animaux

Le passage à la cage collective provoque intrinsèquement des risques de picage entre les animaux pouvant conduire à des plaies cutanées plus ou moins profondes et étendues. Il est aussi possible d’observer des atteintes à l’appareil locomoteur. Au cours des élevages de longue durée comme ici, il est aussi possible d’observer une dégradation de l’état général d’un individu aux causes parfois non définies avant une autopsie. Enfin, la réalisation d’une prise de sang est susceptible de conduire à la formation d’un hématome. Si elle est effectuée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent être observées.

Devenir

Nous utilisons ici nos individus pour permettre la production d'une descendance. Nos animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus de cette lignée.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de maintenir une population d’animaux vivant avec un caractère d’intérêt agronomique. Il n’est pas possible d’avoir cette démarche sans l’utilisation de ceux-ci.

Réduction

Au total, 652 animaux seront requis pour la réalisation de 1 à 2 prises de sang. Les effectifs de reproducteurs mis en place sont nécessaires gérer sur le long terme la consanguinité et les risques de dérive génétique (c'est-à-dire la fixation due au hasard de gènes n’ayant pas de lien direct avec le caractère d’intérêt). Nous nous sommes appuyés pour cela sur les équations de la théorie de la taille efficace de population nécessaire pour permettre le maintien de la variabilité génétique au sein d’une population. Cette théorie dit que la taille efficace d’une population doit contenir au moins 50 à 100 individus contribuant efficacement à la reproduction. Dans un cadre de sex-ratio différent de 1, ces équations disent qu’avec une population constituée de 16 mâles et 48 femelles, nous aurons une taille efficace de 50 individus, permettant le maintien de la variabilité génétique de notre caractère tout en limitant l’augmentation de la consanguinité.

Raffinement

Raffinement de l’hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au cours de l’élevage. Les animaux en cage collective auront à leur disposition divers combinaisons d’enrichissement : perchoir, bloc à piquer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu, un isoloir sera inclus dans une extrémité des cages pour permettre aux animaux une zone de cache. Pour limiter les phénomènes de picage, des répulsifs dit anti picage pourront être appliqués sur les animaux victimes de picage. Les animaux seront soumis à une observation soutenue, plusieurs fois par jour, afin de détecter le plus précocement possible toute dégradation du bien-être. Un arbre de décision visant à faciliter la gestion quotidienne des animaux (atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux zootechniciens chargés du suivi des animaux. Raffinement de la procédure: Cas de la prise de sang au sinus occipital: afin de réduire le risque de lésions cérébrales pouvant être associé à la réalisation d'un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille afin d'éviter tout possibilité d'enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d'injection évite l'arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter également la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Ceci permettra de limiter les mouvement erratiques des animaux susceptibles d'engendrer un échec de la prise de sang. Les personnes affectées à cette tâche seront des personnes habituées à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Cas de la prise de sang effectué à la veine alaire ou jugulaire: afin d'améliorer l'accès à ses veines, de l'alcool à 70° sera appliqué au niveau du site d'injection pour désinfecter la zone de prélèvement mais aussi pour profiter des capacités de vasodilatation de ce produit rendant la ponction plus simple. De même un point de compression sera effectué et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Le modèle poulet de chair a croissance lente est associée à l’espèce poule domestique. La sélection sur ce critère a été faite sur cette espèce. C’est pourquoi nous l’avons choisi ici. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge adulte d’environ 42 semaines pour suivre les performances de croissance et de reproduction, produire les poussins destinés au renouvellement des lignées, mais aussi couvrir les besoins en individus demandés par les projets de recherche s’appuyant sur ce phénotype.

50 000 souris transgéniques vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le dixième et le quinzième jour de vie, chacune se voit amputer l'extrémité de la queue sur un millimètre et tatouer par injection intradermique, ou, à l'âge adulte, découper un morceau du pavillon de l'oreille. Le porteur indique qu'environ 15 000 souris au génotype inutile seront tuées, qu'un millier servira à l'entraînement aux gestes techniques, et que 35 000 seront gardées pour l'élevage ou versées aux projets qui les ont commandées, la mutilation de l'oreille par un congénère et l'automutilation de la queue figurant parmi les incidents prévus. Il écrit que le projet s'arrêtera dès qu'une méthode moins invasive sera disponible, et que le génotypage par follicule pileux est déjà à l'essai dans l'établissement.

Objectifs

L’établissement est une animalerie d’élevage de souris génétiquement modifiées nécessitant la détermination de la constitution génétique de chaque individu par une amplification précise de séquences d’ADN (génotypage par PCR), qui est généralement réalisée en même temps que leur identification. L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement (biopsie) de queue ou du pavillon d’oreille pour obtenir un morceau de tissu de souris transgéniques afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère l’état général de l’animal (phénotype dommageable). La biopsie sera effectuée en même temps que l’identification des animaux par tatouage à l’aide d’encre appliquée en intradermique ou, très exceptionnellement, par la pose d’une bague numérotée à l’oreille (à l’âge adulte uniquement). Ce projet sera interrompu, sur décision de la SBEA de l’établissement ou une modification de la réglementation, si une méthode alternative moins invasive peut être proposée. Des essais sont actuellement réalisés dans l’établissement pour réaliser les génotypages à partir de prélèvements de follicules pileux mais cette technique nécessite une optimisation des conditions de purification et d’amplification de l’ADN.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la réalisation du génotypage, couplé à l’identification des souris transgéniques à phénotype non dommageable en élevage dans l’EU, dans l’attente de la mise au point d’une méthode non invasive. Il permet de gérer au mieux l’élevage de souris transgéniques pour sélectionner les souris avec le gène à sélectionner avant le sevrage. Ce projet pourra être réalisé sur 5 ans mais sera interrompu dès qu’une méthode alternative sera disponible, en particulier pour toutes les lignées qui pourraient être génotypées à partir d’un prélèvement de follicules pileux.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 10-15 jours. Si le prélèvement de tissu doit être réalisé à l’âge adulte, il sera réalisé sur le bord du pavillon de l’oreille dans une partie souple, non cartilagineuse de l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue ou sur le bord du pavillon de l’oreille, selon l’âge de la souris, et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. Dans les deux cas, le prélèvement peut entrainer un léger saignement local qui peut être stoppé immédiatement par une légère pression de la zone incisée. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort du au poids de la bague. En cas de bagarre entre congénères, la bague peut être arrachée ou l’oreille mutilée.

Devenir

Les animaux dont les séquences d’ADN ne sont pas celles attendues (génotype sans intérêt pour les porteurs de projet) seront mis à mort (environ 30% soit 15 000 souris); à l’exception de quelques souris qui pourront être utilisées pour réaliser du tutorat (environ 1000 souris). Les animaux d’intérêt (contenant le bon gène) seront conservés soit pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques, soit pour prélèvement de tissus, soit pour être utilisés dans les projets pour lesquels ils sont produits (35 000 souris).

Remplacement

L’utilisation de souris transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.

Réduction

Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 souris maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Il est important de noter que le croisement de lignées transgéniques entraine la production d’animaux de génotype non utilisable dans les projets c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles ciblées. Certains de ces animaux (mais ne représentant qu’un faible pourcentage) pourront être utilisés dans la cadre de la formation aux gestes techniques ou comme animaux « témoins » de projet.

Raffinement

Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille sera réalisée précocement, à l’âge de 7-12 jours, avant l’ossification de la queue ou du cartilage de l’oreille, ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, le prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille sera privilégié et sera effectué si possible sous anesthésie gazeuse afin de limiter les mouvements de l’animal et de réaliser le geste avec précision. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. La biopsie de l’oreille sera réalisée au niveau du pavillon dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille pour limiter les nuisances. Cette zone est fibro-cartilagineuse et tapissée d’une fine couche de peau. L’incision sera réalisée dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille. En cas d’apparition d’une inflammation au niveau de la zone de biopsie ou d’automutilation de la queue, la plaie sera traitée selon la procédure décrite par la vétérinaire désignée jusqu’à cicatrisation. Tout animal présentant une blessure ou un signe d’automutilation (ce qui est souvent le cas des souris mâles qui peuvent être agressives avec leurs congénères) sera soigné selon la procédure fournie par la vétérinaire désignée. En cas d’apparition d’un signe de mal-être ou de souffrance comme un manque de toilettage, une prostration même sous stimulation de l’expérimentateur, l’animal pourra être mis à mort si son état général le justifie. Le tatouage à l’encre par injection intradermique n’entraine pas de nuisance. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque la validation des séquences d’ADN à amplifier par PCR est confirmée.

Choix des espèces

La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et l’établissement est un plateau de conservation et d’élevage de différents modèles de souris transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. Le prélèvement caudal sera réalisé à l’âge de 7-12 jours afin de limiter les nuisances. Le prélèvement effectué sur le pavillon l’oreille sera réalisé à 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifiée à cet âge.