Maintien des lignées génétiquement modifiées

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Effet de l’inactivation du GPR18 sur le vieillissement cardiovasculaire et métabolique au cours du diabète et de l’obésité

(NTS-FR-803609v1 – 13/07/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien

Souris : 114

Souffrances

▲ 50

▲ -

▲ 64

▲ -

Devenir

114

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles tuées sans réveil. Génotypées par prélèvement du bout de la queue à sept jours, elles reçoivent un régime gras et sucré induisant obésité et diabète, des mesures de glycémie répétées et, en fin d'étude, une chirurgie de la carotide sous anesthésie. Le porteur indique que la pose d'un cathéter dans la carotide empêche tout réveil, l'animal ne pouvant en être privé sans se vider de son sang, d'où une mise à mort sous anesthésie. Il affirme que l'étude d'un régime mimant le syndrome métabolique impose le passage par un modèle in vivo.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès en Europe et dans le monde. Elles sont associées au vieillissement, à l’obésité, au diabète, et à l’inflammation chronique, accélérant ainsi le vieillissement cardiovasculaire et contribuant à la mortalité et à la morbidité chez les patients âgés. Les résolvines, dérivés des acides gras polyinsaturés oméga-3 considérés comme bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, sont des substances lipidiques induisant une résolution de l’inflammation. Les résolvines agissent via des récepteurs spécialisés. La résolvine D2 et son récepteur GPR18 sont encore très peu étudiés dans le domaine de la résolution de l’inflammation et des conséquences sur les maladies cardiovasculaires. Notre hypothèse est que la résolvine D2 et son récepteur GPR18 pourraient contribuer à limiter l’inflammation et le vieillissement cardiovasculaire. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si l’absence du récepteur GPR18 produit l’effet inverse à savoir prolonge et/ou accentue ces phénomènes. Nous souhaitons identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle de vieillissement cardiovasculaire et métabolique induit par un régime riche en graisse et en fructose (sucre) qui provoquera une inflammation, une obésité, un diabète et altèrera les fonctions cardiovasculaires. Ce régime sera administré à des souris sauvages ayant GPR18 ou des souris dépourvues de ce récepteur. Une exploration des fonctions cardiovasculaires sera faite dans les deux groupes.

Bénéfices attendus

La réussite de cette étude permettra de montrer qu'un échec dans la résolution de l'inflammation induit par des changements métaboliques provoque une accélération des maladies cardiovasculaires. A plus long terme, nos travaux pourront soutenir l'emploi de supplémentation en résolvine pour prévenir ou améliorer l'état vasculaire des patients en situation de syndrome métabolique et réduire le vieillissement artériel lié à l'âge.

Procédures

A 7 jours de vie, 1 mm de l'extrémité de la queue (non ossifiée) est prélevé pour le génotypage et les souriceaux sont tatoués. Ceci dure environ 5 min. Les souris vigiles subiront une très légère piqûre au bout de la queue pour prélever une goutte de sang (5 µl) (comme chez les diabétiques) 1 fois par mois pendant 3 mois (en tout moin de 1 min), puis à la 30 ème semaine et 31 ème semaine 7 fois (à T0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min) donc en cumulé, 1min sur 2h). Dans tout le protocole, le temps de piqure pour prélever 5 µl de sang représentera 3 min. A l'age de 8 semaine, une contention de 7 min de la souris sera réalisée. En point finale, l'anesthésie pour la chirurgie et l'examen durera 1h en tout. A la fin de l'expérience, 1 ml de sang sera prélevé sur animal anesthésié qui sera mis à mort sans réveil préalable. L'animal subira la totalité de la procédure sur 16 semaines.

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisse et en fructose induit un syndrome métabolique avec une prise de poids important pouvant générer un inconfort de la souris. Les mesures de glycémie via une goutte de sang à la queue seront répétées toutes les 4 semaines, une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré peut apparaitre.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort après les 2 procédures car les animaux auront un cathéter dans la carotide à la fin des 2 procédures. Il n’est pas possible d’enlever ce cathéter sans que l’animal ne se vide de son sang. Donc la mise à mort de l'animale se fera sur animal inconscient par injection sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Le profil des cellules impliquées dans l’inflammation et des cellules de la paroi artérielle, l'étude des mécanismes d'action de la résolvines D2 et de son récepteur GPR18 se font déjà in vitro au laboratoire. Nous avons également mis au point l'étude de la contraction et dilatation des artères isolées par une methode ex-vivo. Cependant, pour étudier l'effet d'un régime qui induit un changement de métabolisme et qui mime le syndrome métabolique, sur le système cardiovasculaire et les paramètres métaboliques comme la glycémie, de la tolérance au glucose et de la résistance à l’insuline, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.

Réduction

Nous faisons toutes les mesures sur un même animal. Des calculs statistiques permettent de prédire le nombre minimal d'animaux à utiliser pour avoir des résultats significatifs et limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Une anesthésie sera pratiquée pendant la chirurgie et l’examen cardiovasculaire. Du gel ophtalmique est déposés sur les yeux pour éviter le dessèchement. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étapes de la procédure : perte de poids maximale de 20% par rapport à la dernière pesée, l’animal sera sorti de l’étude et remis sous régime normal. Si des signes de stress trop importants sont observés pendant la contension de la souris (pression trop élevée), elle sera remise dans sa cage d’origine. Pour la zone une piqûre à la queue : la zone sera surveillée activement tous les jours pendant les 4 jours suivants. Si une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré apparait, la plaie sera désinfectée avec de la bétadine. Un spray peut être appliqué pour aider à la cicatrisation et à la diminution de la démangeaison. Un anti-douleur local en badigeon sera également administré pour diminuer la douleur. Si une fausse route survient cela peut percer l’œsophage, l’animal sera mis à mort. Pour l'examen cardiovasculaire final, les points limités déterminés sont : -les signes de réveil (changements rapides de pression artérielle ou de fréquence cardiaque donnée par échographie suite au pincement des pattes et souffle dans les vibrisses), le % de l'anesthésiant sera modifié pendant le temps nécessaire. - la diminution de la température corporelle en dessous de 36°C, la température de la platine sera remontée. - Fréquence cardiaque anormale sous anesthesiant (différente de 350-400 battements par minute), le % d’anesthesiant sera adapté. Si aucun des ajustements ci-dessus n’améliore ni l’état hémodynamique ni le bien-être de l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris sauvages sous régime riche en graisses et en fructose développent une obésité, une insulino résistance et une rigidité artérielle proche de celle de l’homme. Il est plus facile de réaliser une invalidation génique chez les souris. Des souris adultes mâles et femelles de 18 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.

Elevage et maintien de souris transgéniques modèles pour l’étude du rôle pathogénique du stroma médullaire dans la leucémie myélomonocytaire chronique ou dans le contexte d’une hématopoïèse clonale.

(NTS-FR-530231v1 – 13/07/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 10000

Souffrances

▲ -

▲ 10000

▲ -

Devenir

280

9720

10 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et 280 transférées vers d'autres projets. Ce projet consiste à élever et maintenir des lignées transgéniques pour l'étude d'une leucémie, avec biopsie de l'oreille et pose d'un transpondeur RFID sous anesthésie locale. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées au maximum et que les animaux au mauvais génotype non utilisables sont tués, les autres étant gardés vivants pour des projets de recherche autorisés. Il affirme que la plupart des expériences se font à partir de sang ou de moelle de patients et réserve le recours aux souris aux questions liées au vieillissement de la moelle "non réalisables chez l'homme".

Objectifs

Notre équipe explore les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’une leucémie chronique appelée leucémie myélomonocytaire chronique. C’est une affection maligne associée au vieillissement de la moelle osseuse hématopoïétique, le tissu qui fabrique les cellules sanguines. C’est une affection sévère puisque l’espérance de vie est en moyenne de 2 à 3 ans après le diagnostic. Le seul traitement susceptible de guérir de cette leucémie est la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques mais ce traitement est souvent irréalisable compte tenu de l’âge des patients – en moyenne 70 ans et ne fonctionne pas très bien avec des rechutes fréquentes. Il n’y a pas de solution médicamenteuse efficace. L'objectif de ce projet est de développer et de maintenir des lignées transgéniques importantes pour répondre aux questions (gènes impliqués, pistes thérapeutiques nouvelles) que posent cette maladie, au nombre de 10 dans ce contexte, utilisées dans 3 projets autorisés différents.

Bénéfices attendus

Identification de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les leucémies aiguës mégacaryoblastiques pédiatriques.

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

La biopsie d'environ 1 mm de diamètre au niveau de l'oreille entraîne une douleur de courte durée. L'injection d'un transpondeur RFID de la taille d'un grain de riz sous anesthésie locale entraîne également une douleur de faible intensité. Ces interventions n'ont pas de conséquence à moyen ou long-terme.

Devenir

Réutilisés: animaux n'ayant pas le bon génotype transférés vers un autre projet- Euthanasie des reproducteurs après 6 portées au maximum et des animaux génétiquement modifiés non utilisables pour d'autres buts - Autres animaux gardés en vie pour utilisation continue dans des projets autorisés de recherche de l'équipe.

Remplacement

Aussi souvent que possible, les expériences réalisées dans ce programme le sont à partir de cellules de patients collectées lors de bilans de surveillance. Cependant, la réponse à certaines questions ne peut pas être obtenue chez l’homme ni dans des systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D in vitro. Il s’agit de connaître 1)le rôle du vieillissement sur l’évolution de la composition de la niche médullaire (l’analyse de souris de génotype identique et d’âge variable permet de maîtriser ce paramètre considéré comme important puisque la maladie étudiée est une maladie directement liée au vieillissement, ce que révèle l’analyse génomique des cellules leucémiques des patients) 2)la dynamique de l’impact d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire qui, elle aussi, nécessite des analyses répétées au cours du vieillissement, non réalisables chez l’homme. 3)l’impact d’un taux accru d'une protéine impliquée sur la croissance d’un clone leucémique et sa compétitivité vis-à-vis d’un clone sauvage est une troisième question à laquelle il n’est pas possible de répondre à partir d’échantillons issus de patients. Ces données doivent nous permettre d’évaluer l’utilité d’une approche thérapeutique visant à maîtriser la production de la protéine impliquée chez les patients lorsqu’un clone leucémique a été détecté. Dans ce programme de recherche, les animaux ne sont utilisés que lorsque la réponse aux questions générées par l’exploration de la leucémie étudiée ne peut être obtenue chez l’homme et par des expériences à partir de modèles in vitro : la plupart des expériences du programme de recherche sont réalisées à partir de prélèvement de sang ou de moelle obtenus de patients avec leur accord.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé au plus juste en utilisant le calculateur d'élevage du laboratoire Jackson et en se basant sur l'expérience acquise avec ces lignées dans le passé. Les individus n'ayant pas le bon génotype seront , quand c'est possible, transférés à d'autres projets et utilisés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique quotidienne et d'un environnement enrichi en tout temps. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront hébergés en groupes de 5 avec un enrichissement de la cage (swizzlenest, barre à ronger, tunnel ou maison en carton). L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire (Dietgel) leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Le choix de la souris est dicté : 1) par la bonne connaissance que nous avons de l’hématopoïèse murine qui reproduit de nombreux aspects de l’hématopoïèse humaine ; 2) la disponibilité de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre aux questions que nous nous posons ; 3) son vieillissement relativement rapide, compatible avec les analyses envisagées Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Utilisation d’une lignée de souris transgénique AARE-LUC pour identifier les inducteurs et les tissus cibles de la voie eIF2α-ATF4

(NTS-FR-843188v1 – 06/07/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal

Souris : 1035

Souffrances

▲ 255

▲ -

▲ 780

Devenir

780

255

1 035 souris transgéniques vont être utilisées, dans des procédures déclarées sévères pour 780 d'entre elles et sans réveil pour 255, alors que la partie sur les effets attendus ne décrit que des interventions légères, piqûre d'aiguille, jeûne de 16 h et isolement de courte durée. Les animaux reçoivent de la luciférine puis sont anesthésiés pour une imagerie de bioluminescence, avec des prélèvements sanguins submandibulaires, afin de visualiser l'activation d'une voie de signalisation selon le régime nutritionnel ou un traitement. Une partie est tuée pour prélever les organes et une autre réutilisée dans d'autres expériences, le porteur gardant vivantes les souris dont le transgène est fonctionnel. Il indique tester d'abord l'effet des inducteurs sur cellules en culture, mais justifie le recours à la souris par l'étude au niveau de "l'animal entier".

Objectifs

Afin de pouvoir étudier le rôle joué par la voie de signalisation eIF2α/ATF4 au niveau de l’animal entier, nous avons généré une lignée de souris transgénique qui exprime le gène rapporteur luciférase sous le contrôle de séquences de fixation du facteur de transcription ATF4. Cette lignée de souris a été breveté et constitue un outil de choix pour visualiser le stress nutritionnel ou pharmacologique au niveau de l'animal entier. Notre objectif avec cet outil murin transgénique est de mieux caractériser les conditions d’activation de cette voie de signalisation dans l’espace et dans le temps en fonction du régime nutritionnel ou du traitement pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre chez les mammifères les effets de la consommation d’un régime déséquilibré en acides aminés ou d’un traitement avec un inducteur pharmacologique. Dans ce but, les souris transgéniques bioluminescentes sont un outil de choix pour situer dans l’espace (identification des tissus et cellules cibles) et dans le temps (chronologie d’activation en fonction des sites) l’activation de la voie eIF2α-ATF4 dans des conditions de carences nutritionnelles en acides aminés ou lors d’un traitement pharmacologique par la mesure de la bioluminescence au niveau du corps entier de l’animal vigile, de l’expression (immuno-histochimie) et/ou de l’activité de l’enzyme codée par le gène rapporteur luciférase dans les tissus cibles.

Procédures

Des prises de sang pourront aussi être réalisées sur animal vigile au niveau de la veine submandibulaire (1 min par souris) à l'aide de microlancettes spécifiques. Elles seront réalisées avant et après le protocole nutritionnel en alternant le côté du prélèvement. Pour visualiser l’activité luciférase en utilisant un appareil d’imagerie bioluminescente (10 min par souris), les animaux seront injectés avec de la luciférine (10 sec par souris), anesthésiés sans effets indésirables (15 min par souris). Pendant toute la durée d'adaptation au régime contrôle (7 jours) et d'expérimentation (96h maximum), les souris seront hébergées individuellement avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.

Impact sur les animaux

Les 2 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les expériences réalisées ne vont pas engendrer d’effets indésirables sévères : piqûre d’aiguille, transport des souris, anesthésie gazeuse, jeûne de 16h maximum et isolement de courte durée.

Devenir

Les animaux dont le transgène n’est pas fonctionnel seront mis à mort (105 souris). Les autres animaux dont le transgène est fonctionnel sont gardés en vie (930 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs nutritionnels déséquilibrés en acides aminés, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (100 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (680 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs pharmacologiques, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (50 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (100 souris).

Remplacement

De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur des lignées de cellules en culture permettent d'abord de tester l'efficacité de carence en un acide aminé ou d’inducteurs pharmacologiques sur l’activation de la voie eIF2α-ATF4. Ces expériences permettent dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal de l’induction de la bioluminescence, il s'avère indispensable de répéter les expériences. Etant donné que les procédures sont légères, une même souris pourra être réutilisée pour tester l’effet de plusieurs régimes après une période de récupération d’une semaine.

Raffinement

Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Par ailleurs, l'utilisation d’un transgène exprimant la luciférase nous permettra de suivre l’activation de la voie eIF2α-ATF4 à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).

Choix des espèces

Les deux lignées homozygotes de souris transgéniques bioluminescentes (fond génétique C57 Bl/6), ont été générées par notre équipe. Les croisements pour amplifier ces deux lignées seront réalisés avec des souris âgées de 4 à 6 mois, âge où le taux de fécondité est optimum. Pour toutes les procédures, les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 2 à 24 mois. L'âge pourra dépendre de l'objectif de l'expérience réalisée.

Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur

(NTS-FR-854369v1 – 20/06/2023)

Formation professionnelle
Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche appliquée
- Troubles nerveux

Souris : 1678
Rats : 365

Souffrances

▲ -

▲ 791

▲ 1132

▲ 120

Devenir

2043

2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".

Objectifs

Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.

Procédures

- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.

Remplacement

La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.

Réduction

Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).

Raffinement

- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.

Choix des espèces

Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.

Elevage et maintien de souris transgéniques pour l’étude de la diversité des cellules résidantes CD8+CD103+ au niveau tumoral

(NTS-FR-833808v1 – 01/06/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 3650

Souffrances

▲ -

▲ 3650

▲ -

Devenir

3570

3 650 souris vont être utilisées, la plupart tuées et quelques-unes transférées vers d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Il s'agit d'élever et d'entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec une biopsie d'un fragment d'oreille et la pose d'un transpondeur RFID sous anesthésie locale. Les reproducteurs sont tués après six portées et les animaux au mauvais génotype réorientés ou tués, ce qui montre le rendement de l'élevage transgénique. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours à des souris vivantes, les bénéfices annoncés contre le cancer du poumon restant lointains.

Objectifs

Le cancer du poumon, dont on distingue deux formes: à petites cellules et non à petites cellules (le plus fréquent), est le cancer le plus meurtrier dans le monde. Son incidence est en constante augmentation. Son pronostic est toujours largement conditionné par la possibilité d'en effectuer une exérèse chirurgicale, mais celle-ci n'est possible que lorsqu’il est encore peu étendu. Toutefois, même dans ces cas, en association ou non avec une chimiothérapie et/ou une radiothérapie, le pourcentage de guérison reste très faible, sans parler des formes étendues non opérables, en particulier avec extension métastatique, sur lesquelles la chimiothérapie a peu d’effet. Le pronostic global est donc très mauvais, la survie à 5 ans ne dépassant pas 15%. L'objectif de ce projet est de développer et de mainteir des lignées de souris transgéniques pour des gènes importants dans les cellules T résidentes dans les tumeurs. Ces lignées (3) souris seront utilisées dans plus de 4 projets différents.

Bénéfices attendus

Identification de nouvelles stratégies thérapeutiques (immunothérapie) dans le cancer du poumon.

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Devenir

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est indispensable car la mécanistique est trop complexe pour reconstruire un microenvironnement adéquat pour le développement des tumeurs et étudier l’interaction du système immunitaire avec la tumeur. Cependant d'autres études seront réalisées sur des échantillons tumoraux humains afin de renforcer les résultats obtenus dans le modèle murin. Les lignées murines produites permettront de faire ces expériences dans d'autres projets autorisés.

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Les modèles tumoraux murins sont les plus appropriées pour notre étude et nous pourrons ainsi les comparer aux cancers du poumon humains. Un des modèles transgéniques nous permet d’étudier le rôle de l’intégrine dans le système immunitaire et dans le contexte tumoral. Les autres modèles transgéniques permettent d'humaniser le système immunitaire des souris pour poser les questions requises. Ainsi, l'epèce murine est la plus pertinente. Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Elevage et maintien de souris transgéniques dans l’étude des leucémies aiguës mégacaryoblastiques

(NTS-FR-786759v1 – 01/06/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 7625

Souffrances

▲ -

▲ 7625

▲ -

Devenir

180

7445

7 625 souris transgéniques vont être utilisées dans un projet d'élevage classé en souffrance légère, la plupart tuées à l'issue et environ 180 transférées vers d'autres projets. Chaque animal subit une biopsie de l'oreille et l'implantation d'une puce RFID sous anesthésie locale pour le génotypage. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées et que les souris au mauvais génotype sont réutilisées ailleurs. Il présente une dizaine de lignées comme incontournables pour étudier les leucémies aiguës mégacaryoblastiques de l'enfant.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers pédiatriques rares, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de CSH est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L'objectif de ce projet est de développer et de maintenir des lignées transgéniques (au nombre de 10) dans ce contexte.

Bénéfices attendus

Identification de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les leucémies aiguës mégacaryoblastiques pédiatriques.

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Devenir

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : -La génération et la maturation terminale de toutes les lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro. -Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients. -Les approches précliniques in vivo dans des modèles transgéniques sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires toxiques.

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Les souris possèdent un système physiologique proche de celui de l’homme. De plus, l’isolement de tous les composants du système hématopoïétique murin est possible par des approches de cytométrie en flux. Nous étudions aussi les spécificités du développement de leucémies chez les enfants par comparaison aux leucémies adultes. Le temps court de gestation chez la souris et le nombre relativement important d’embryons dans cette espèce permet d’avoir accès aux étapes précoces du développement hématopoïétique embryonnaire. Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Elevage et maintien de souris transgéniques modèles dans le cadre de recherches sur les néoplasmes myéloprolifératifs

(NTS-FR-776640v1 – 01/06/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 30000

Souffrances

▲ -

▲ 30000

▲ -

Devenir

3000

27000

30 000 souris transgéniques vont être utilisées dans un projet d'élevage classé en souffrance légère, la plupart tuées à l'issue et environ 3 000 transférées vers d'autres projets. Chaque animal subit une biopsie de l'oreille et l'implantation d'une puce RFID sous anesthésie locale pour le génotypage. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées et que les souris au mauvais génotype sont réutilisées ailleurs. Il revendique une trentaine de lignées comme incontournables pour la recherche sur les néoplasmes myéloprolifératifs, l'effectif de 30 000 servant à produire et entretenir ces lignées.

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies hématologiques caractérisées par une production exagérée et incontrôlée de globules rouges, plaquettes ou globules blancs. Ils ont une évolution fatale à plus ou moins long terme et restent sans traitement spécifique curatif. Notre équipe développe différentes souris génétiquement modifiées pour comprendre les mécanismes d’aggravation des NMP et par la suite, dans d'autres projets, de tester des médicaments dans ces formes sévères réfractaires aux thérapies actuelles qui posent un problème de santé publique. Grâce à ce projet, au moins 30 lignées seront maintenus pour utilisation dans plus de 3 projets de recherche.

Bénéfices attendus

La découverte de cibles d'inhibiteurs de certaines protéines mutantes par thérapie ciblée, ou par d'autres stratégies thérapeutiques, conduit à des essais cliniques, pouvant potentiellement améliorer la prise en charge des patients concernés.

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Devenir

Remplacement

L’utilisation d’animaux est incontournable car nous essayons de savoir si les mutations survenant dans des cellules souches hématopoïétiques miment les symptômes hématologiques observés chez les patients atteints de NMP et si ces symptômes chez l’animal peuvent être traités par des médicaments, auquel cas où on peut espérer qu’il seront traités chez les patients souffrant des même symptômes. Il s’agit donc d’analyser l’organisme dans sa globalité incluant ses paramètres hématologiques complexes et sa survie. Les analyses in vitro ne peuvent pas reproduire l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, base de la résistance et dominance clonale des cancers, et reproduise seulement la différenciation et prolifération partielles de ces cellules. Les analyses in vitro sur l’efficacité des médicaments ne peuvent donc qu’être partielles sur des effets limités ne prenant pas en compte la guérison des cancer

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Nos modèles ont été développé chez la souris. Plusieurs publications ont montré que ces modèles, en particulier le modèle principal, miment la maladie humaine NMP et permettent de reproduire les résultats des thérapies chez l’homme, en particulier pour l’interféron et les inhibiteurs de JAK2. Ce sont donc les meilleures modèles sur l'espèce murine. Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Elevage et maintien de souris transgéniques modèles pour l’étude de l’hétérogénéité des macrophages associés aux tumeurs sur le développement tumoral et l’évolution du cancer

(NTS-FR-094158v1 – 01/06/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 8000

Souffrances

▲ -

▲ 8000

▲ -

Devenir

250

7750

8 000 souris transgéniques vont être utilisées dans un projet d'élevage classé en souffrance légère, la plupart tuées à l'issue et environ 250 transférées vers d'autres projets. Chaque animal subit une biopsie de l'oreille et l'implantation d'une puce RFID sous anesthésie locale pour le génotypage. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées et que les souris au mauvais génotype sont réutilisées ailleurs. Il revendique plus de soixante lignées comme indispensables pour étudier les macrophages des tumeurs, l'effectif de 8 000 servant surtout à produire et entretenir ces lignées.

Objectifs

Les tumeurs solides ne sont pas seulement composées de cellules tumorales, mais également de fibroblastes, de cellules immunitaires telles que les lymphocytes ou les cellules myeloïdes et de matrice extracellulaire, un ensemble de molécules extracellulaires sécrétées par les cellules qui fournissent un support structurel et fonctionnel ; le tout formant ce que l'on appelle communément le microenvironnement tumoral. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages appelés dans ce contexte « macrophages associés aux tumeurs » sont notamment retrouvés dans une proportion élevée et les observations cliniques ont établi une corrélation claire entre l'abondance de ces macrophages et la sévérité du pronostic. Des études récentes notamment basées sur des approches bio-informatiques ont révélé une grande plasticité des macrophages dans les tissus sains et les tumeurs. Pour étudier l'impact de ces cellules sur le micro-environnement tumoral et l'évolution des tumeurs, un grand nombre de lignées de souris transgéniques sont indispensables (plus de 60).

Bénéfices attendus

Identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants pour de nombreux cancers.

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Devenir

Remplacement

Pour étudier la plasticité des macrophages associés aux tumeurs, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour récapituler le microenvironnement tumoral et ses intreactions avec le reste de l'organisme (cellules immunitaires) et corroborer ou non les résultats précédant établis par des approches in vitro, in silico (bioinformatique) et ex vivo.

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation chez la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Elevage et maintien de souris transgéniques modèles dans le cadre de recherches sur les hémopathies malignes

(NTS-FR-351209v1 – 26/05/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 3500

Souffrances

▲ -

▲ 3500

▲ -

Devenir

500

3000

3 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 3 000 tuées et 500 transférées vers d'autres projets. Élevées et maintenues comme lignées génétiquement modifiées, elles subissent une biopsie de l'oreille et la pose d'un transpondeur sous anesthésie locale, pour alimenter des recherches sur les cancers du sang. Le porteur précise que les reproducteurs sont tués après six portées et que les individus au mauvais génotype partent vers d'autres projets. Il affirme que ces lignées sont "indispensables" et que le recours aux animaux est "incontournable" pour étudier ces maladies.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire et maintenir des lignées indispensables (plus de 10) pour étudier des mécanismes à l’origine de l’apparition des hémopathies malignes chez l’homme. Ce sont des affections de la moelle osseuse, tissu qui est responsable de la fabrication de l’ensemble des cellules du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes). Les hémopathies malignes regroupent un ensemble hétérogène de cancers des cellules sanguines ; on distingue les leucémies, les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les lymphomes. Les lignées élevées pourront servir dans des recherches sur ces maladies dans 3 projets autorisés.

Bénéfices attendus

Procédures

Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Devenir

Réutilisés: animaux n'ayant pas le bon génotype transférés vers un autre projet- Mise à mort des reproducteurs après 6 portées au maximum et des animaux génétiquement modifiés non utilisables pour d'autres buts - Autres animaux gardés en vie pour utilisation continue dans des projets autorisés de recherche de l'équipe.

Remplacement

Les conséquences fonctionnelles des évènements « fondateurs » du cancer ne peuvent être pleinement appréhendées qu’au sein d’un organisme vivant ; en effet ces anomalies génétiques fondatrices influent sur l’expression de nombreux gènes qui eux-mêmes conditionnent le devenir des cellules en réponse aux multiples signaux extracellulaires présents chez un individu et au sein d’un tissu (hormones, facteurs de croissance etc…). L’utilisation d’animaux est incontournable pour évaluer l’importance des processus biologiques affectés par ces anomalies fondatrices. Pour ces raisons, nous établissons des lignées de souris génétiquement modifiées indispensables pour l'étude de ces maladies.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé au plus juste en utilisant le calculateur d'élevage du laboratoire Jackson et en se basant sur l'expérience acquise avec ces lignées dans le passé. Les individus n'ayant pas le bon génotype seront préférentiellement transférés à d'autres projets et utilisés.

Raffinement

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et techniques détaillées essentielles à nos études. C'est donc l'espèce animale la plus pertinente pour ces études. Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.

Entretien d’une lignée de souris invalidées pour le gène codant les orexines et création et entretien d’une lignée dérivée, invalidée pour le gène codant les orexines et pour le gène du 26RFa

(NTS-FR-905410v1 – 22/05/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées

Souris : 720

Souffrances

▲ -

▲ 720

▲ -

Devenir

720

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir une lignée génétiquement modifiée invalidée pour les gènes de deux neuropeptides, avec une biopsie de la queue sous anesthésie pour le génotypage. Les animaux au génotype "inadéquat" sont mis à mort après le génotypage, les reproducteurs trop âgés une fois qu'ils ne produisent plus de portées. Le porteur affirme que l'étude de ces neuropeptides "n'est possible que dans un système intégré" et justifie ainsi le recours à la souris, l'entretien de la lignée servant de support à de futurs projets.

Objectifs

L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi impliqués dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique, c'est à dire dans la capacité du système à maintenir un équilibre de fonctionnement (ici la glycémie) quelles que soient les contraintes extérieures. C’est notamment le cas des Orexines : neuropeptides hypothalamiques, exprimés dans l’aire hypothalamique latérale (LHA) et connues pour stimuler la prise alimentaire. Nos observations montrent que les orexines sont co-exprimées avec le 26RFa, autre neuropeptide hypothalamique de la LHA. De plus, le 26RFa a récemment été décrit comme un nouvel acteur de la régulation centrale de la glycémie. La compréhension du rôle des orexines, de ses mécanismes d’action et des interactions existant entre les deux systèmes neuropeptidergiques (Orexines et 26RFa) pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Ce projet vise à entretenir la lignée de souris invalidées (Knock-Out) pour le gène codant les orexines et à obtenir une lignée de souris invalidées à la fois pour les orexines et le 26RFa (double mutant). Ces lignées permettront de caractériser le rôle et les mécanismes d’interaction de ces neuropeptides dans la régulation de l’homéostasie glucidique en contextes physiologique et physiopathologique. L’entretien de la lignée invalidée pour le 26RFa fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée. Les protocoles de recherche utilisant ces souris mutantes seront détaillés dans d’autres projets de recherche spécifiques, ce projet ne concerne que l’obtention et l’entretien des lignées transgéniques.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’approches d’hybridation in situ a permis une première évaluation de l’expression des orexines et du 26RFa dans le système nerveux central. Nous avons observé que ces deux neuropeptides sont conjointement exprimés dans une population de neurones de l’hypothalamus latéral. Si le rôle des neurones à 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique a récemment été mis en évidence, le rôle des orexines est, à l’heure actuelle, mal connu. La colocalisation de ces deux systèmes neuropeptidergiques dans les mêmes neurones suggèrent néanmoins qu’ils pourraient tous deux être impliqués et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. De fait, l’étude de ces modèles de souris invalidés soit pour les orexines seules, soit pour les orexines et le 26RFa, compléteront les études menées chez les animaux invalidés pour le 26RFa seul. Les données obtenues chez ces mutants permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides et les interactions mises en jeu entre ces deux systèmes dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes moléculaires sous-tendant leur action.

Procédures

Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm déstiné au génotypage des animaux) sous anesthésie à l'isoflurane : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie.

Impact sur les animaux

L’élevage et la reproduction d’animaux n’induisent aucun stress ni souffrance particuliers chez les animaux. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié, pour déceler tout signe de souffrance : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante. Si 'un de ces signes ou une combinaison de signes apparait, le suivi de l'animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés (désinfection à la bétadine, analgésie assurée par injection de 200µg de buprénorphine, répétée après 4 heures si nécessaire). Si l'état de l'animal s'aggrave dans les heures qui suivent ou ne s'améliore pas dans les 24 heures, il sera considéré qu'un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par décapitation après anesthésie générale à l'isoflurane (5%). Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Afin de réduire une éventuelle souffrance lors d’une mise bas difficile, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. Au cours de la mise bas, les femelles seront suivies afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise bas dure en moyenne 2 heures chez la souris). En cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera manipulée pour aider à la mise bas.

Devenir

L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien de la lignée 26RFa-/- ; Or-/-. Les animaux de génotype adéquats seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissances à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquats donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.

Remplacement

L’étude du rôle du système neuronal à Orexines et de ses interactions avec le système à 26RFa dans la régulation de l’homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation d’animaux modèles.

Réduction

La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos entre chaque test, afin d’évaluer les rôles des orexines et du 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas. En cas de difficultés (temps de mise bas allongé, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera isolée après avoir reçu 1ml de fluide tiède par voie SC pour la réhydrater. Elle sera gardée dans un endroit calme et chaud. L’abdomen de la mère sera manipulé afin de favoriser l’expulsion des petits. Si l’aide apportée n’est pas suffisante pour déclencher la mise-bas et afin d’éviter une souffrance de la mère, elle sera mise à mort par décapitation après anesthésie générale à l’isoflurane (5%). Les femelles démontrant des signes de dystocie seront mises à mort immédiatement.

Choix des espèces

La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existe pas chez d’autres modèles mammifères. La mutation ciblée a été créée en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) SM1 dérivées de 129S6/SvEvTac. Cette lignée a ensuite été rétrocroisée en fonds C57Bl/6J au moins 8 fois par le laboratoire donneur. Les animaux mutants pour le gène codant les orexines (lignée murine B6.129S6-Hcrttm1Ywa/J) provenant du Jackson Laboratory seront croisés avec des animaux C57Bl/6J afin d’entretenir une reproduction. La lignée 26RFa-/- (également connue sous le nom Qrfp-/-) utilisée dans ce projet fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée.

Comprendre et cibler l’épitranscriptome de l’îlot pancréatique pour restaurer la sécrétion d’insuline dans le diabète de type 2.

(NTS-FR-509247v1 – 10/05/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien

Souris : 480

Souffrances

▲ -

▲ 300

▲ 180

▲ -

Devenir

480

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales de glucose et d'insuline, des gavages, un séjour en cage métabolique et des injections répétées de deux inhibiteurs, le brequinar et le bisantrène, pour étudier une enzyme liée à la sécrétion d'insuline dans le diabète de type 2. Le porteur indique que ces molécules sont cytotoxiques in vitro et qu'elles ont provoqué chez l'humain des effets toxiques sur le sang et le foie, les souris étant surveillées et euthanasiées si elles perdent 20 % de leur poids. Il conclut que les lignées cellulaires ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifierait le modèle in vivo.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer, in vivo, le rôle de la déméthylase FTO dans la fonction et l’identité des cellules bêta au sein des îlots pancréatiques mais égalment dans d'autres organes métaboliques. Pour cela nous injecterons dans différents modèles de souris des inhibiteurs pharmacologiques de cette enzyme, le bisantrene et le brequinar puis nous étudierons leurs différents effets au niveau transcriptionnel et métabolique. Des modèles génétiques d'invalidation du gène codant l'enzyme seront également utilisés pour les différents tissus (cellules bêta et alpha pancréatiques, foie, tissus adipeux)

Bénéfices attendus

Des données préliminaires réalisées au sein du laboratoire sur des lignées cellulaires bêta pancréatiques montrent que l’inhibition de la déméthylase FTO (par siRNA ou inhibiteurs pharmacologiques) améliore l’expression des gènes de l’identité et de la fonction de la cellule bêta pancréatique, associé à une augmentation de la sécrétion d’insuline. Ainsi les résultats obtenus au cours du projet pourraient nous permettre d’identifier in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de conserver la masse des cellules bêta pancréatiques et/ou d'améliorer la sécrétion d’insuline au cours du diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une prise de poids régulière 2 fois par semaines au maximum. - suivi en cage métabolique (durée 1 semaine) - des injections intrapéritonéales de glucose, pyruvate ou insuline (6 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, chaque expérimentations étant espacées d'une semaine minimum, durée 4 heures) - des gavages de glucose (3 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, durée 4 heures) - des injections intrapéritonéales de molécule pharmacologiques (1 fois par jour pour chaque individu, pendant 5 à 20 jours, durée 1 heures), avec changement de site d'injection entre chaque injection

Impact sur les animaux

Les différents protocole pourront engendrer un stress chez les animaux suite aux diverses manipulations ainsi que des douleurs légères. Seuls l'effet du brequinar et du bisantrene, encore peu connu chez la souris, est susceptible d'induire des douleurs modérée chez les animaux et/ou des variations de comportements. Toutefois des études in vitro montrent que ces inhibiteurs peuvent être cytotoxiques. Chez l’Homme des essais cliniques pour le traitement de la leucémie ont également montré des effets hématotoxiques et hépatoxiques temporaires. Pour pallier à toutes ces nuisances, les animaux seront manipulés dans des pièces dédiées et calmes, avec une surveillance quotidienne pour détecter le moindre signe de souffrance (blessure, posture ou comportements anormaux, perte de poids importante, etc).

Devenir

Les animaux utilisés étant génétiquement modifiés, aucun des animaux utilisés en fin de protocoles sera maintenu en vie. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude.

Remplacement

Des expérimentations in vitro, réalisées sur des lignées cellulaires de cellules bêta pancréatiques murines, montrent des résultats très encourageants quand au rôle de la déméthylase FTO et de ses inhibiteurs dans la régulation de l'homéostasie du glucose. Toutefois les modèles de lignées cellulaires sont limités et ne permettent pas d'étudier la communication inter-organe qui peut avoir lieu au cours de la régulation de l'homéostasie du glucose et du diabète de type 2. Ainsi l'utilisation de modèles in vivo, par l'utilisation de souris génétiquement modifiées, et/ou soumises à un régime riche en graisse, permet de reproduire les conditions physiologiques et physiopathologiques afin de mieux comprendre le rôle de la déméthylase FTO dans le développement du diabète de type 2 ou d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Pour définir statistiquement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de déterminer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés.

Raffinement

Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires. L’état général des animaux sera évalué par les utilisateurs ainsi le personnel animalier. Les points limites déterminés pour nos protocoles sont : le dos vouté, le poil hérissé, une perte de poids de 20% et la prostration ou l’absence de réaction des animaux. Dans ce cas l’animal sera enregistré au SBEA. Un traitement visant à soulager l’animal pourra être mis en place, le cas échant sans amélioration, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris reste le meilleur modèle permettant d’étudier l’importance d’un gène dans le développement de maladies et d’identifier de nouveaux traitements potentiels. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement déficientes pour le récepteur de la leptine (souris Db/Db), qui reproduisent la physiopathologie du diabète de type 2 ainsi que les souris contrôles correspondantes. Des souris C57Bl6J soumises à un régime standard ou riche en graisse seront également utilisées dans ce même but. Des souris invalidées dans les cellules alpha ou bêta pancréatiques et dans d'autres tissus pour le gène codant la déméthylase FTO pourront également être utilisées au cours du projet afin de mieux comprendre le rôle de Fto dans les différents organes métaboliques (MipCre Fto-Flox, RipCre Fto-Flox ; GcgCre Fto-Flox ; AdipoQCre Fto-Flox ; AlbCre Fto-Flox). Ces modèles de souris seront associés aux souris contrôles respectives. Les souris C57Bl6/J ou invalidées pour FTO seront utilisées à partir de 5 semaines de développement afin de mettre en place un régime alimentaire riche en graisse de 12 à 24 semaines et induire un phénotype diabétique. Des souris Db/Db de 8 et 16 semaines seront également utilisés pour les injections d'inhibiteurs de FTO (bisantrene ou brequinar). Les souris de 8 semaines permettront d'étudier les effets de l'inhibition de FTO dans des cellules bêta fonctionnelles. Les souris de 16 semaines permettront également d'étudier les effets de l'inhibition de FTO mais dans des cellules bêta ayant une fonction altérée.

Etude du rôle de RXRg durant la remyélinisation après consommation de Cuprizone.

(NTS-FR-664964v1 – 30/03/2023)

Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux

Souris : 360

Souffrances

▲ -

▲ 360

▲ -

Devenir

360

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire leur myéline pendant quatre à douze semaines, puis une injection létale afin de prélever leur cerveau, pour étudier le rôle du récepteur RXRg dans la remyélinisation. Le porteur affirme que la cuprizone n'entraîne ni douleur ni inconfort et laisse un comportement normal, tout en déclarant le projet en gravité modérée. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la remyélinisation, processus dynamique qui ne pourrait selon lui être observé que chez l'animal vivant.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une gaine qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, elle doit être reformée par des cellules spécialisées. Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche la myéline de se reformer conduisant aux symptômes cités précédemment. Il est important de comprendre pourquoi la myéline n’est pas reformée. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de la myéline. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons comment la myéline se forme et comment différents facteurs peuvent stimuler sa régénération dans la SEP.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique qui entoure les fibres nerveuses dans le système nerveux central. Cette gaine est nécessaire pour la transmission des informations entre les neurones. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel, toutefois chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP) la myéline est la cible du système immunitaire ce qui entraine différents troubles neurologiques tels que des troubles moteurs, et une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher la régénération de la myéline et donc de contribuer à la maintenance des troubles cités. Différents acteurs ont été identifiés comme facteurs stimulant la formation de myéline dans la SEP. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces facteurs dans la formation de myéline en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Ici, n=300 animaux recevront un régime alimentaire comprenant de la Cuprizone pour générer une perte de myéline pendant différents temps (4, 5, 6, 12 semaines et un groupe deux fois 4 semaines). A l’issue de ces différents temps de consommation, les animaux ayant consommé la Cuprizone ainsi que les contrôles (n=30) non nourris à la Cuprizone pendant 5 semaines recevront une injection létale d’anésthésique et seront mis à mort. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Impact sur les animaux

La cuprizone est un traitement introduit dans la nourriture qui induit une démyélinisation des neurones et une activation du système immunitaire. Ce traitement n’entraîne pas de douleur ou d’inconfort chez l’animal, et les symptômes moteurs liés à ce traitement, telle que la coordination motrice, sont faibles. De plus, le traitement à la Cuprizone n'engedrera aucune modification du comportement animal, les animaux auront un comportement tout à fait normal. Toutefois, au début de la consommation, une légère perte de poids peut être observée chez la souris bien qu'il y ait une absence de faim/soif chez l'animal. L’effet de la Cuprizone est également réversible, c’est-à-dire que l’arrêt de sa consommation entraîne la restauration de la myéline. Un dernier effet attendu est le léger stress généré chez l’animal par les injections intrapéritonéales d’anesthésique/analgésique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un modèle in vitro dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant, cependant la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’Homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs de vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié des programmes moléculaires contrôlés par ces récepteurs ainsi que des traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, ce projet émane des nombreuses analyses menées préalablement in vitro sur des cultures primaires des oligodendrocytes, microglie ou des neurones qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans ce projet, nous prévoyons d’utiliser 10 animaux par lot de chaque sexe. Ces effectifs tiennent compte de la variabilité inter-individus ainsi que de potentielles différencies liées au sexe. Les analyses seront réalisées avec des tests statistiques adaptés. Si des différences liées au sexe sont mises en évidence, des études plus poussées seront réalisées dans un second temps. Dans l’éventualité où des complications apparaissent durant l’expérience, 10 % d’animaux supplémentaires par lignée seront prévus (soit n=10 par lignée) afin de conserver un nombre suffisant de réplicat pour réaliser des analyses statistiques. Ceci représente un ajout de n=10 animaux/lignées, soit 30 animaux en plus. A des fins de réduction, les animaux générés en plus pourront servir aux différents temps de consommation de Cuprizone si besoin est. Il est possible que peu voire aucun animal ne meurt durant l’expérience. Dans ce cas, les 10% d'animaux supplémentaires prévus par lignée ne seront pas utilisés.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés en groupe dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur/souffrance aux animaux. En effet, la Cuprizone est faiblement concentrée, les dégradations de myéline seront mineures et principalement localisées dans le corps calleux, ce qui ne devrait pas générer de phénotype durant le suivi expérimental. Quelques troubles de coordination motrices peuvent cependant être observés en début de traitement. De plus, une légère perte de poids peut être observée au début de la consommation de Cuprizone. Le poids corporel des animaux sera alors contrôlé avant, pendant, et après consommation de Cuprizone. Si une perte de poids comprise entre 5 % et 10 % est observée, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de la souris pour faciliter sa prise alimentaire. Si une perte de poids supérieure à 10 % est observée, l’animal sera exclu de la procédure. A l’issue de la consommation de Cuprizone, la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie générale par injection d'un mélange d'anesthésique : analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections sont peu douloureuses également, et génèrent principalement un stress à l'animal. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel. Cependant, chez des patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est dégradée par le système immunitaire ce qui engendre différents troubles moteurs et cognitifs, et une réaction inflammatoire importante. Cette dernière va empêcher la régénération de myéline et donc maintenir les troubles cités précédemment. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de myéline. Pour comprendre comment la remyélinisation se met en place, nous utiliserons le modèle murin puisque ce modèle récapitule très bien la myélinisation chez l’Homme. De plus, les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet nous permettent d’étudier des programmes moléculaires importants dans la régénération de myéline, et différents traitements pharmacologiques ciblant ce programme ont déjà été validés chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 semaines) pour évaluer la régénération de la myéline dans des conditions pathologiques mimant la sclérose en plaques.