Maintien des lignées génétiquement modifiées

250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).

Raffinement

Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).

9 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles servent à un service d'archivage de lignées génétiquement modifiées, avec stimulation ovarienne par injections et chirurgie de réimplantation d'embryons. Le porteur indique que les femelles sont tuées pour récupérer les embryons et que d'autres animaux le sont pour prélever sperme et embryons destinés à la fécondation in vitro. Il affirme que l'utilisation de ces animaux est "indispensable" pour sécuriser les lignées de recherche.

Objectifs

Le service a pour principale mission de cryopréserver les lignées de souris génétiquement modifiées des différents plateaux dans le but de sécuriser et rationaliser leur utilisation. Le service propose un ensemble de prestations: - la cryoconservation des lignées murines transgéniques à partir de sperme ou d'embryons - L’archivage et le stockage de ces paillettes - La possibilité d'échanger des lignées via des paillettes entre chercheurs - La reviscience de lignées. Le service réalise les mises au point et le développement de nouveaux protocoles permettant d'améliorer les prestations proposées.

Bénéfices attendus

L'archivage et par de là la sécurisation des lignées murines génétiquement modifiées en cas de soucis sanitaire. La possibilité d'arrêter sous forme repirante une lignée égéntiquement modifiée non utilisée et de permettre la revitalisation de cette dernière si besoin par la suite. L'envoi de paillettes et non d'animaux vers des collaborateurs. Respect des 3R

Procédures

Injection sur femelles vigiles : lors de la stimulation ovarienne des femelles (deux injections : le geste est réalisé en moins d'une minute) et lors de l'anesthésie des femelles pseudogestantes avant réimplantation : une injection (durée moins d'une minute) . Acte chirurgical lors de la réimplantation des embryons issus des fécondations in vitro. La chirurgie dure environ 5 à 8 minutes.

Impact sur les animaux

La réimplantation nécessite une procédure invasive soit un acte chirurgical. Des effets indésirables pourraient être observés sur des animaux pendant et après l'acte chirurgical.

Devenir

Procédure 1: euthanasie des femelles pour récupérer les embryons Procédure 2: euthanasie des animaux pour récupérer le sperme et les embryons pour effectuer la FIV Procédure 3: euthanasie des femelles pseudogestantes car elle ne pourront plus resubir de chirurgie après naissance des souriceaux (lignée redérivée)

Remplacement

Les méthodes d'archivage et de revitalisation nécessitent l'utilisation d'animaux. L'utilisation de ces animaux est indispensable. Ne sont utilisées et congelées que des lignées nécessaires aux projets de recherche.

Réduction

Réduire en diminuant le nombre d’animaux utilisés: uniquement 2 mâles sont nécessaires pour une cryo de sperme et sécuriser une lignée. Ces méthodes permettent de sécuriser et de rationaliser les élevages. On limite la réimplantation des embryons à 3 femelles, même si le nombre d’embryons est supérieur (et dans ce cas les embryons seront congelés). Seuls 2 mâles sont utilisés pour la cryo de sperme, ils sont isolés 72h à 1 semaine d’où une demande d’autorisation de projet.

Raffinement

Raffiner en utilisant au mieux les animaux. Renforcement de l'enrichissement des cages contenant les mâles vasectomisés isolés. La durée d'isolement des mâles est réduite au maximum. Eviter tout stress des animaux pendant les manips (gestation...) Les points limites sont dans le 4.2. Les animaux opérés lors du transfert d’embryon seront soumis à une attention particulière pour la gestion de la douleur avec réadministration d’antalgique si nécessaire après la chirurgie Les cages hébergeant les femelles réimplantées sont enrichies avec une cabane, du sopalin. Deux femelles maximum sont mises par cage. Une surveillance quotidienne est réalisée.

Choix des espèces

Ce sont des lignées murines transgéniques utilisées par les équipes de recherche pour de nombreux projets scientifiques. Le but du service est de sécuriser ces lignées afin de pallier à d'éventuelles contaminations, éviter les phénomènes de dérive génétique et favoriser la rationalisation . Congélation de sperme : souris matures Congélation d'embryons préimplantatoires: des souris s âgées de 8 semaines minimum à 12 semaines, c’est à dire à maturité sexuelle, sont nécessaire pour réaliser la congélation sous forme d’embryons d’une lignée. Fécondation in vitro: jeunes femelles

60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, celles au génotype jugé fiable et d'intérêt gardées comme reproductrices, les autres tuées. Très jeunes, elles subissent une épilation, une biopsie de la pulpe d'un doigt et une amputation de phalange, gestes que le porteur reconnaît "stressants et potentiellement douloureux". Le projet vise à comparer ces méthodes de génotypage pour retenir la moins invasive. Il relève du raffinement des pratiques d'identification des souris génétiquement modifiées, que le porteur emploie dans "la quasi totalité" de ses projets.

Objectifs

Une condition essentielle à l'utilisation de souris transgéniques est la possibilité de les génotyper, c'est-à-dire de distinguer les souris porteuses de la mutation génétique à étudier. La plupart des souris issues de l'élevage d'animaux mutants doivent donc être génotypées avant d'être utilisées pour toute expérience de recherche. Bien que nous suivions les recommandations sur la technique d'amputation des phalanges comme méthode d'identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs éditées par le CNREEA (Comité national de réflexion éthique sur l'expérimentation animale) en 2021, nous cherchons encore à affiner les méthodes que nous utilisons en allant vers des méthodes non invasives et moins douloureuses.

Bénéfices attendus

A l'issue de ce projet, nous souhaitons pouvoir valider une méthode de génotypage et d'identification la moins invasive possible et la plus fiable également. Ceci passera notamment par un classement de douleur des méthodes testées pour pouvoir choisir la méthode la moins impactante pour nos souris. Nous envisageons de partager les résultats de ce projet par une communication interne à notre réseau professional mais aussi à l'ensemble de la communauté française avec une présentation en congrès national, voire une publication dans une revue dédiée.

Procédures

Les animaux de la 1re partie de l'étude feront l'objet de 3 prélèvements :épilation d'une touffe de poils, biopsie de la pulpe d'un doigt, biopsie d'une phalange distale. Il y aura un prélèvement par jour uniquement, 3 jours d'affilée. Chaque prélèvement dure moins de 10 secondes. Les animaux de la 2e partie de l'étude feront l'objet d'un seul des 3 prélèvements ci-dessus (1 type de prélèvement par groupe).

Impact sur les animaux

Les animaux feront l'objets de prélèvements stressants et potentiellement douloureux: épilation d'une touffe de poils, biopsie de la pulpe d'un doigt, biopsie d'une phalange distale. mentionnés ci-dessus. Nous surveillerons justement l'apparition de signes de douleur (léchage du lieu de prélèvement ou perte de prise alimentaire par exemple) afin de traiter ces douleurs si elles apparaissent et de sélectionner les méthodes les moins impactantes pour l'animal dans le futur.

Devenir

A l'issue de ce projet, les animaux seront gardés en vie en tant que reproducteurs dans notre animalerie d'élevage s'ils ont un génotype fiable et d'intérêt. Les autres seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet vise à raffiner les méthodes d'identification et de génotypage des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons ainsi pas réaliser ce projet autrement qu'en utilisant des souris. Cependant, des tests préliminaires ont été faits sur des animaux préalablement euthanasiés (d'autres projets) pour valider la quantité de poils nécessaire pour le génotypage en utilisant ces derniers, permettant ainsi de n'utiliser des animaux vivants pour ce projet que lorsque nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été calculé par une bio statisticienne qui se chargera également de l'évaluation statistique de chaque étape. De plus, selon les résultats de la 1re partie de l'étude, des groupes de la 2e procédure pourraient ne pas être réalisés (notamment si le génotype n'est pas fiable).

Raffinement

L'objectif de ce projet est justement de raffiner les méthodes actuelles en cherchant à aller vers des techniques moins voire non-invasives et ainsi pouvoir abandonner la biopsie de phalange distale pour le génotypage et l'identification. En pratique, les animaux feront l'objet d'un suivi très précis de la douleur et des anti-douleurs seront utilisés lorsque nécessaire. Les animaux manipulés étant très jeunes, nous veillerons en particulier à éviter tout rejet maternal après les procédures ainsi qu'à un bon allaitement des souriceaux par leur mère.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont utilisées à l'ICS dans la quasi totalité de nos projets (ayant chacun leur justification scientifique). L’utilisation de ces souris nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique, raison pour laquelle nous utilisons la souris dans ce projet de raffinement des méthodes de génotypage et d'identification. Conformément aux recommandations émises par la CNR2EA de février 2021, l’identification sera réalisée entre les 7ème et 10ème jours de vie.

6 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'activité relève d'une "prestation de services" de production de lignées transgéniques, de redérivation et de cryopréservation, avec injections d'hormones et microchirurgies sous anesthésie (vasectomie, transfert d'embryons). Le porteur indique que toutes les femelles donneuses sont tuées pour récupérer un maximum d'ovocytes et les mâles fertiles pour récupérer leur sperme, les mâles vasectomisés étant renouvelés deux fois par an. Il présente la congélation des lignées comme une application des 3R alors qu'elle sert d'abord à maintenir un stock de modèles pour les équipes clientes.

Objectifs

Le but de la redérivation sera de maintenir les lignées de souris sous un statut sanitaire acceptable. Dans notre établissement, beaucoup de souris (60% environ) sont immunodéprimées. Par conséquent, la présence de certains microorganismes mettrait en péril leurs bien être. La congélation des lignées des souris permet de répondre à la règle des 3R (réduction du nombre de souris) tout en protégeant ces lignées d’une dérive génétique, d’une contamination génétique ou d’une catastrophe naturelle. La modification du patrimoine génétique des souris permet de répondre à des problématiques diverses et variées (recherche fondamentale ou appliquée).

Bénéfices attendus

La redérivation de nos souris permet de garder des souris immunodéprimées au sein de notre service. La congélation de nos souris répond à la règle des 3R , c'est à dire réduire au maximum le nombre de souris. La transgénèse permet aux équipes de recherche d'obtenir des modèles de recherche.

Procédures

Certaines souris subiront 2 Injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, en sous cutané, réalisées en 5 secondes. Chaque chirurgie serat réalisée une fois, sous anesthésie générale. La souris reste sous anesthésie durant 40 minutes. La chirurgie dure 15 minutes.

Impact sur les animaux

Au cours de nos procédures, nous réalisons des microchirurgies sous anesthésie générale. Les effets indésirables pourraient être des infections. Nous devons également conserver des mâles stériles individualisés. Ce type d'hébergement est une source de stress.

Devenir

Toutes les femelles donneuses d'ovocytes sont mises à mort afin de récupérer un maximum d'ovocytes. Les mâles fertiles sont mis à mort afin de récupérer un maximum de sperme lors de la congélation de sperme.

Remplacement

Notre structure propose la redérivation, la congélation et la modification du patrimoine génétique de la souris. Chaque chercheur justifie l'utilisation de la souris comme modèle de recherche.

Réduction

Nous utilisant des hormones non néfastes (PMSG, hyperOva et hCG) pour la souris, permettant d'obtenir un nombre maximal d'ovocytes et d'embryons, et par conséquent de réduire le nombre de femelles utilisées. La congélation des lignées murines est une méthode permettant de réduire au maximum le nombre de souris et limiter au maximum le maintient d’animaux respirant aux phénotypes dommageables non utiles immédiatement à une recherche expérimentale. Le maximum de mâles vasectomisés sera de 280 animaux (28*2*5). Nous avons en permanence 28 males vasectomisés qui nous permet de détecter 10 femelles en œstrus (chiffre empirique), c'est à dire les mères porteuses. A l'âge de 4 mois, ils sont mis en accouplement avec les futures mères porteuses. On les garde jusqu'à l'âge de 9 mois car, passé cette date, ils sont peu actifs et le nombre de femelle pluggée chute dramatiquement. Par conséquent, on les renouvelle, 2 fois par an. Un maximum de 2100 mères porteuses seront utilisées au cours des 5 ans à venir. Pour les redérivations, on prévoit 30 projets par an, incluant un lot de 4 mères porteuses soit 30 * 4 *5 souris. Pour les projets "transgénèse", on prévoit 15 projets par an, nécessitant un maximum de 5 expérimentations incluant à chaque fois un lot de 4 mères porteuses soit : 15*5*4*5 mères porteuses soit (30*4*5) +(15*5*4*5) = 2100 mères porteuses.

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale. Les yeux des animaux sont protégés du dessèchement par du collyre "OcryGel". Au cours de la chirurgie, réalisée sous loupe binoculaire, les animaux sont placés sur une table chauffante thermostatée à 28°C. Tous les animaux sont ensuite accueillis dans une cage, elle-même chauffée par un tapis. Le tapis chauffant est retiré après le réveil de tous les animaux. De plus, des analgésiques adaptées (métacam ou doliprane) sont introduit dans l'eau de boisson durant 3 jours après l'intervention. Les mâles individualisés reçoivent un enrichissement supplémentaire, un igloo en carton.

Choix des espèces

Notre structure met à disposition une prestation de redérivation des souris afin de maintenir un statut sanitaire à l'élevage des souris immunodéprimées. La congélation des souris transgéniques permettra de garder ces modèle sous la forme congelée et non respirante. La création de modèles murins transgéniques permettra d'obtenir des modèle pertinents pour des études en recherche fondamentale, ainsi qu'en recherche clinique. Les mâles subiront une vasectomie seront âgés entre 8 et 10 semaines. On les gardera au maximum 10 mois. Les femelles donneuses d'ovocytes seront âgées entre 4 et 6 semaines. On utilise des femelles prés pubères afin d'induit facilement un cycle hormonal en injectant les hormones appropriées. Les souris mises en accouplement auront au minimum 5 semaines. Les mères porteuses seront matures, âgées entre 2 et 9 mois.

4150 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3300 d'entre elles et modéré pour 850, une partie étant livrée pour la reproduction et le reste tué. Les femelles reçoivent des injections pour la superovulation ou subissent une chirurgie de réimplantation d'embryons, dans le cadre d'un service payant d'importation, d'archivage par congélation et de fécondation in vitro de lignées génétiquement modifiées. Le porteur indique que les femelles porteuses partent en contrôle sanitaire et que les portées sont livrées aux clients. Il présente le service comme un moyen de réduire le nombre de souris en élevage et de sécuriser les lignées.

Objectifs

Notre service propose des prestations dites de « décontamination » permettant d’importer des souris en respectant un statut sanitaire strict mais nécessaire pour l’étude du système immunitaire : cela permet de faire rentrer des animaux dits "propres" dans nos animaleries. Notre service propose également d'archiver ces lignées de souris par cryopréservation. Cette prestation permet de conserver les lignées murines, sous forme congelée, lorsqu’il n’est plus nécessaire d’avoir des animaux pour expérimentation. Cela permet également de pouvoir sécuriser le modèle créé et le réutiliser plusieurs années après si de nouvelles expérimentations sont nécessaires. Enfin cela permet de faciliter les échanges de ces modèles avec d'autres chercheurs qui pourraient utiliser le modèle créé pour d’autres projets à travers le monde.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra donc de sécuriser pour les chercheurs les lignées génétiquement modifiées créées contre tout problème de dérive génétique notamment, de faciliter les importations de lignées en respectant un statut sanitaire strict nécessaire au travail sur le système immunitaire et les échanges avec les chercheurs d’autres centres. Donc, il permettra de réduire le nombre d’animaux en élevage, tout en évitant de réutiliser des animaux pour créer des modèles qui existent déjà dans d’autres centres de recherche.

Procédures

Les animaux pourront subir : deux injections intra-péritonéales ou une chirurgie réimplantation d'embryon. Le personnel étant formé, la chirurgie en elle-même ne dure que 15 minutes. En comptant les soins pré opératoires et post opératoires, c'est-à-dire de l'accueil des animaux jusqu'au réveil, la procédure dure 1h. Enfin, certains des animaux seront transportés en voiture et train agréés vers notre prestataire.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent des injections intrapéritonéales, une anesthésie pour la chirurgie ainsi que la chirurgie elle-même. Certaines souris seront envoyées chez notre prestataire pour analyse sanitaire, pour éviter au maximum le stress induit par le transport : les souris sont préparées, et sont stabulées dans une zone spécifique climatisée et au calme dans l’attente du transporteur agréé.

Devenir

Les femelles porteuses sont envoyées en contrôle sanitaire, les portées obtenues sont livrées à nos clients pour accouplement

Remplacement

La dernière mise en place de la prestation de cryopréservation de lignée murine sous forme de sperme avec contrôle qualité sur Blastocyste, nous a permis de remplacer les femelles pseudo gestantes ainsi que les portées qui en sont issues (utilisées normalement dans le contrôle qualité du sperme cryopréservé) par des blastocystes in Vitro.

Réduction

Le nombre de souris femelles utilisées a baissé en raison de la mise en place de la prestation de cryopréservation de lignées murines sous forme de sperme avec contrôle qualité sur Blastocyste. Le nombre de souris utilisés pour les prestations d’archivage et cryopréservation a diminué. Dans le souci de répondre encore plus à la règle des 3 R et notamment au Réduire, nous avons en effet fait évoluer notre grille de prestation afin de proposer une prestation de cryopréservation de sperme avec contrôle qualité sur ADN de blastocyste. Nous avons développé la PCR sur blastocystes afin d’éviter d’utiliser des souris pseudogestantes pour la vérification du génotype des embryons obtenus. Nous avons ainsi réduit le nombre de femelles annuel.

Raffinement

Nous sommes actuellement un ingénieure d'étude et une assistante ingénieure dans le service. Suite à une formation optimale, nous ne réimplantons que 2 à 3 femelles pour toutes décontaminations. Cela nous permet de livrer nos prestations en utilisant un minimum d'animaux en les impactant le moins possible en chirurgie. La formation permet en effet d'avoir des animaux patients qui restent en chirurgie une quinzaine de minutes maximum. Grâce à cette rapidité d'exécution, les animaux sont beaucoup moins impactés par la chirurgie. Les animaux sont observés en cage individuelle pendant toute la phase de réveil après la chirurgie. Nous ajoutons des enrichissements du milieu dans la cage d'hébergement et nous surveillons les animaux tous les jours avec nos personnels animaliers dédiés. Tout animal souffrant est immédiatement identifié et une décision sur la poursuite des soins ou la mise à mort est rapidement prise par l'équipe. D’un point de vue pratique, le bien-être des animaux sera respecté tout au long du projet. Toute procédure stressante ou douloureuse sera réalisée sous anesthésie générale et sous prescription d’anti douleur.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Ce sont des animaux de petite taille et à la reproduction rapide. Nous avons une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Nous utilisons des males âgés de 10-12 semaines pour la cryopreservation. C'est à cet âge que la réserve en spermatozoïdes est la plus élevée. Nous utilisons des femelles de 3-4 semaines pour la super ovulation. A cet âge les femelles réagissent à la super ovulation de façon optimale. Prendre des femelles plus âgées diminuerait la quantité d'ovocytes obtenue. Concernant les souris porteuses nous utilisons des femelles du fond génétique mixte de 6-8 semaines car ce sont bonnes mères.