Toxicologie et autres tests de sécurité

Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie sous anesthésie gazeuse pouvant durer une heure, avant onze prélèvements de sang étalés sur huit heures, un toutes les trente minutes. 48 rats Wistar mâles vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils sont hébergés seuls jusqu'à cinq jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. Il annonce qu'entre l'administration de la dose unique et la mise à mort aucun effet indésirable n'est attendu, tout en indiquant qu'un des deux pesticides testés est classé cancérogène, tératogène et susceptible de nuire à la fertilité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet plus large qui consistera à étudier les effets de l’exposition périnatale à un cocktail de 2 pesticides administrés par voie alimentaire. En effet, les études de toxicologie sur les pesticides sont le plus souvent réalisées sur chaque substance séparément. Or combinées, même à faible dose, certaines molécules peuvent conduire à l’apparition ou à l’amplification d’effets toxiques. De plus, ces études sont très largement menées en utilisant la voie orale en gavant l’animal. Le gavage pouvant être traumatique pour l’animal mais aussi pour l’expérimentateur, de plus en plus, les études de toxicologie sont réalisées en utilisant un vecteur alimentaire pour exposer les animaux (eau, croquette, pâte, gelée, etc). Nous souhaitons ainsi étudier la toxicité lors d’une administration par voie alimentaire d’un cocktail de 2 pesticides. Pour pouvoir valider notre méthode d’administration et déterminer les quantités de pesticides distribués dans différents organes, il est nécessaire de pouvoir comparer les concentrations sanguines à différents temps de chacune des 2 substances après leur entrée dans l'organisme, seules ou en association via l’alimentation avec les profils obtenus par gavage. Pour cela, 9 groupes de 5 rats mâles adultes Wistar seront répartis ainsi: un groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte, un groupe contrôle gavage (gavé seulement à l'huile), un groupe contrôle alimentation (seulement la pâte), un groupe exposé au cocktail de pesticides par alimentation, un groupe exposé au cocktail par gavage, un groupe exposé au pesticide 1 par alimentation, un groupe exposé au pesticide 1 par gavage, un groupe exposé au pesticide 2 par alimentation et un groupe exposé au pesticide 2 par gavage. Une procédure préliminaire sera réalisée pour mettre au point la technique de prélèvement de sang sur deux rats qui pourront selon les résultats être intégrés au groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques sur le comportement des substances étudiées dans l'organisme afin d’améliorer les modèles de modélisation basés sur la physiologie liée à une exposition aux mélanges de pesticides et l’évaluation des risques sanitaires associés. Il permettra aussi d’avoir des informations essentielles pour la mise en place de méthodes d’exposition plus représentatives de l’exposition humaine et tout aussi efficace que le gavage. Les résultats de ce projet pourront ainsi, être une base intéressante pour d’autres expérimentations réalisées sur des animaux plus sensibles au gavage comme les rates gestantes.

Procédures

Chaque animal sera tondu une fois au niveau de la nuque et une fois au niveau de la gorge (durée inférieure à 5 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés en utilisant un cathéter. Celui-ci sera installé dans la veine jugulaire dans le cadre d’une chirurgie (une fois par animal) effectuée sur les animaux anesthésiés par un gaz. Cette chirurgie durera au maximum 1h. Au maximum, 11 prélèvements de sang seront réalisés sur 8h (toutes les 30 minutes). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. Les animaux exposés par gavage, recevront une seule fois de l'huile de colza avec ou sans pesticides directement dans l'oesophage. Le gavage durera moins d'une minute. Les animaux exposés par voie alimentaire, mangeront volontairement une seule pâte avec ou sans pesticides. L'ingestion durera au maximum 30 minutes (si l'animal mange une partie puis pose la pâte avant de la reprendre). Les animaux seront isolés à partir de l'installation du cathéter jusqu'à la fin de chaque procédure soit au maximum 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à une dose unique de pesticides inférieure à la dose induisant la mort. De plus, un pesticide est de catégorie 2 pour la reproduction et le système nerveux et c'est un cancérogène/tératogène dû à la susceptibilité de nuire à la fertilité. Le deuxième pesticides de catégorie 3 est toxique en cas d'ingestion à de forte dose (supérieur à la dose induisant la mort). Les autres mentions de toxicité concerne les organismes aquatiques exposés chroniquement. Ainsi, entre le moment où les animaux recevront cette dose unique et leur mise à mort, aucun effet indésirable n'est attendu. Toutefois, les manipulations, comme la contention, et les manipulations lors des prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress chez le rat. L’hébergement individuel des rats pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à la fin des prélèvements sanguins dans le but de prélever post mortem différents organes cibles pour effectuer des dosages afin de déterminer la pharmacocinétique.

Remplacement

Pour évaluer les temps de rétention de certaines substances chimiques dans l’organisme, des modèles mathématiques ont été mis en place à partir d'exposition chez l'animal (principalement chez le rat). Cependant, ces modèles n'existent pas pour les molécules étudiés dans ce projet, ni pour des mélanges de substances avec pour méthode d’exposition, le gavage et l'ingestion d'une alimentation contenant des pesticides. Une approche par des modèles physiologiques ne permettra pas de prendre en compte tous les organes impliqués dans la métabolisation y compris les compartiments éventuels de stockage tels que les tissus adipeux. L'espèce choisi sera le rat car les organes seront suffisamment gros pour effectuer tous les dosages nécessaires (il faudrait le double d'animaux si l'étude était réalisée chez la souris). La souche Wistar est une espèce docile et facile à apprivoiser ce qui facilitera les manipulations notamment lors du gavage et des prélèvements sanguins. Cette étude nécessite donc une approche in vivo.

Réduction

Pour ce type de test, au minimum 4 animaux sont nécessaires pour évaluer les différents temps de présence et l’imprégnation des organes à des substances chimiques (cf essai n° 417 de l'Organisation de coopération et de développement économiques). Dans ce projet, nous étudierons 4 animaux par groupe plus un animal supplémentaire afin de pallier au risque qu’un animal présenterait des effets pouvant impacter les résultats et devant alors être exclu de l’étude, soit 5 animaux par groupe pour l'étude la cinétique. Ainsi, le projet sera composé de 4 groupes exposés par gavage, un groupe contrôle non gavé et 4 groupes exposés par voie alimentaire. Trois animaux maximum permettront de mettre au point la méthode de prélèvement et pourront être inclus dans le groupe contrôle non gavé.

Raffinement

Les animaux seront quotidiennement observés selon différents critères établis dans une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques permettant de déterminer un score. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager au mieux l’animal. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage et leur environnement sera enrichi (cylindres en carton, lanières de papier krafts, bâtons de bois à ronger) pour limiter le stress de l’animal tout le long de chaque procédure. Puis après la pose du cathéter, les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter toute blessure liée au cathéter entre congénères qui pourrait induire une infection et compromettre les résultats. Lors de la pose du cathéter, du sérum physiologique contenant de l’héparine sera injecté pour s'assurer du bon fonctionnement du cathéter et éviter la formation d'un caillot sanguin puis un bouchon sera placé pour éviter des possibles "fuites" de liquide biologique. L'extrémité du cathéter sera extériorisé pour réaliser des prélèvements de sang 3 jours plus tard. Pendant la période de récupération post-chirurgicale (3 jours), les animaux seront étroitement surveillés afin d'écarter toute douleur liée à l'installation du cathéter. Pour cela, en début et fin de journée, un examen clinique sera réalisé (selon les critères de la grille). En parallèle, afin de s'assurer du bon fonctionnement du cathéter, du sérum physiologique hépariné sera injecté dans le cathéter par un expérimentateur pendant que l'animal sera maintenu par un autre expérimentateur (contention classique). Une partie des animaux sera gavé avec une canule spécifique pour cette technique afin d'éviter tout dommage sur l'animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés par le cathéter préalablement installé. Si l'animal est docile et apprivoisé, il sera seulement maintenu par un expérimentateur pendant d'un autre expérimentateur réalise le prélèvement.

Choix des espèces

Le modèle rat est une espèce de référence en toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques et le temps de présence dans le sang afin de définir des valeurs de référence pour éviter d’éventuels effets chez l’Homme. Les animaux étudiés seront des adultes (environ 2 mois pour un poids compris entre 300 et 400g) pour garantir un poids suffisant des organes d’intérêt et pouvoir comparer les résultats de l’étude avec les données disponibles dans la littérature qui sont majoritairement obtenues sur des adultes.

40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.

Bénéfices attendus

Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Tués à l'issue, pour les prélèvements ou en raison d'une difficulté supposée à les remettre en groupe après 24 heures d'isolement, 1 900 rongeurs, 750 souris et 1 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris passent jusqu'à 24 heures seules en cage à métabolisme après administration du produit, tandis que des rats sont opérés pour recevoir un cathéter dans le canal biliaire, parfois deux autres dans le duodénum et la veine fémorale, une chirurgie qui peut durer jusqu'à deux heures. Les rats porteurs de deux ou trois cathéters peuvent repasser en cage à métabolisme une semaine plus tard, la mesure de la diurèse sur 24 heures peut être répétée jusqu'à trois fois, et les deux espèces peuvent être privées d'eau ou de nourriture. Le porteur range parmi les bénéfices destinés aux rats et aux souris eux-mêmes "une amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané ou en intraveineux d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être répétée jusqu’à 3 fois en faisant 1 session par semaine après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h ou 2ou3X 24h séparée d’environ 1 semaine) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

48 truies gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour reprendre leur cycle de production dans l'élevage. Elles reçoivent une ou deux prises de sang et une injection de vaccin ou de placebo, avec des effets indésirables possibles au point d'injection et de la fièvre. Le porteur teste l'innocuité chez la truie gestante d'un vaccin déjà autorisé chez le porc en engraissement, en préalable à une étude d'efficacité. Il justifie le recours à l'espèce porcine par le fait que le vaccin lui est destiné.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester l’innocuité de l’administration d'un vaccin inactivé par voie intramusculaire contre Actinobacillus pleuropneumoniae, chez la truie gestante. C'est un vaccin à destination des porcins visant une immunisation active des porcs à partir de 6 semaines d'âge, afin de réduire les lésions pulmonaires et la colonisation des voies respiratoires par Actinobacillus pleuropneumoniae (App) exprimant des toxines. Ce vaccin est administré chez le porcelet en croissance pour protéger les animaux en engraissement contre la toux, la pleurésie et la mortalité liées à cette bactérie. L'innocuité a donc été évaluée pour ce stade physiologique. En effet, ce vaccin dispose d'une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour les porcins et est indiqué pour les porcs en engraissement. La truie infecte les porcelets à partir de l'âge de 2 semaines et ces porcelets infectés propagent l'infection dans le groupe lors de la disparition de l'immunité maternelle, après le sevrage. La transmission se fait par l'intermédiaire des gouttelettes de salive projetées par les animaux porteurs. La sensibilité immunitaire de l'élevage dépend du niveau d'anticorps d'origine maternelle (AOM) pouvant perdurer de 5 à 12 semaines, et de la présence de souches d'App non virulentes à l'origine d'une protection immunitaire croisée. La vaccination des truies, en réduisant la colonisation des voies respiratoires, permettrait de diminuer l'exposition et la contamination des porcelets sous la mère durant la phase d'allaitement. Elle permettrait également de fournir une immunité passive aux porcelets, via des anticorps dans le colostrum, afin de les protéger dans leurs premières semaines de vie, avant l'immunisation active par la vaccination. L'innocuité chez la truie en cas de gestation n'a pas été établie pour ce vaccin. Cette étude sur l'innocuité est préliminaire à une étude d'efficacité, et va permettre de réaliser des tests sérologiques : en effet il n'existe aucune donnée chez la truie concernant la réponse immunitaire en anticorps vis à vis de ce vaccin, et donc le possible transfert d'immunité aux porcelets, via le colostrum.

Bénéfices attendus

Dans le dossier d'AMM, l’innocuité du médicament vétérinaire n’a pas été établie en cas de gestation. En vue d'une utilisation du vaccin sur les truies en cours de gestation, il est nécessaire, avant d'en étudier l'efficacité, d'établir des connaissances sur l'innocuité. C'est l'objet de cette étude.

Procédures

Les prises de sang se feront sur animal vigile. Cette opération sera réalisée une fois, 6 semaines avant mise bas pour le groupe placébo, et deux fois, 6 et 1 semaines avant la mise bas pour le groupe vacciné. La durée maximale d'une prise de sang est d'une vingtaine de seconde. Les injections de vaccin ou de placébo seront faites selon les bonnes pratiques d'injection et durent en moyenne 3 secondes. 48 animaux seront concernés.

Impact sur les animaux

Les prises de sang et la contention sont une source de stress ponctuel pour la truie. Les cas de saignement par le point de ponction sont rares mais pas inexistants. La vaccination qui peut également avoir des effets indésirables sur les truies : rongeur et gonflement au point d'injection, élévation de la température corporelle. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux conformément à la réglementation en vigueur. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie en fin de procédure. Ils continueront leurs cycles de production classiques d'un élevage de porcs.

Remplacement

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine.

Réduction

L'unité épidémiologique est l'animal. Les écarts attendus entre le groupe témoin et le groupe vacciné nécessitent de mener l'étude sur 48 animaux, soient 24 truies par groupe. Des données qualitatives (état de santé des animaux, évaluation du site d'injection) et quantitatives (température rectale, taux d'anticorps) seront comparées entre groupes par des tests statistiques. Le nombre d'animaux pour lequel une prise de sang sera réalisée a été fixé pour représenter l'unité épidémiologique, soient 48 truies.

Raffinement

Les prises de sang seront réalisées par une personne aguerie à ce geste afin que les périodes de contention soient réduites autant que faire se peut. Pour les vaccinations, il est recommandé d'utiliser une contention afin que les injections soient réalisées correctement. Cette contention consistera loger les truies temporairement dans des stalles individuelles, les unes à côté des autres, pour la durée des injections. Les truies seront ensuite libérées. C'est une procédure réalisée classiquement à chaque séance de vaccination dans l'élevage expérimental de Romillé. Parmi les effets indésirables du vaccin chez le porc en croissance sont rapportés une induration, une rougeur ou un gonflement au site d'injection qui se résorbent spontanément, ainsi qu'une augmentation de la température pendant 1 à 2 jours après l'injection. Ce sont des effets indésirables qui arrivent fréquemment lors de la vaccination des animaux et qui feront l'objet d'investigations lors de cette étude. Tout autre symptôme sera également noté. Des soins seront apportés aux animaux dès que nécessaire (antipyrétiques, anti inflammatoires, isolement en infirmerie). En cas d'effets indésirables cumulés ou impactant l'état général de l'animal, la/les truie(s) concernée(s) sera/ont isolée(s) en infirmerie, soignée(s) et sortie(s) de l'étude. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux d'enrichissement, conformément à la réglementation. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Choix des espèces

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine. Les truies seront suivies de 6 semaines avant la mise bas jusqu'à la mise bas. Les vaccinations seront réalisées sur cette période (6 et 3 semaines avant mise bas). La comparaison des effets indésirables et de la réaction immunitaire liés à la vaccination se feront sur cette période. Leurs porcelets à la naissance seront également inclus dans l'étude.

Pour suivre dans le sang le devenir d'un candidat médicament, 3 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les études, ils peuvent être opérés pour recevoir un cathéter dans une veine ou une artère, une minipompe ou une administration dans l'intestin, isolés jusqu'à cinq jours après la chirurgie, mis à jeun, puis soumis à des prises de sang répétées, l'expérience pouvant s'achever par un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien. 875 d'entre eux peuvent être réutilisés dans d'autres projets, par exemple de formation, et les autres sont tués, notamment après ce prélèvement, en cas d'effets marqués du produit ou s'ils portent un dispositif implanté. Le porteur présente le recours au rat comme "un passage obligatoire" avant toute administration à l'humain, sans nommer ni le produit testé ni la maladie visée.

Objectifs

Le projet consiste à étudier le devenir dans l'organisme d'un candidat médicament chez le rat (éveillé ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons de sang après administration du produit à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de liquide cephalo-rachidien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la maladie humaine qui est visée par le/les produit(s) testé(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques de l’espèce utilisée (le rat) et le développement de méthodes pour améliorer le bien-être des animaux. Ces méthodes sont de plus en plus adaptées à l’espèce animale la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour introduire un tube très fin dans les veines et/ou les artères ou bien introduire une minipompe qui libère progressivement le produit (20 à 45 minutes) ou une chirugie pour l'administration du candidat médicament dans l'intestin (20-30 min). Les rats seront administrés (moins de 2 minutes) avec les produits à tester par différentes voies: orale, intrapéritonéale (au niveau de l'abdomen), sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, dans la trachée, ou intraveineuse (avec une dose unique ou par injection lente). Les animaux pourront être mis à jeun la veille de l'administration pour une durée qui est dépendante du produit à tester. Des prélèvements de sang (moins de 2 minutes) pourront être réalisés: - Au niveau de la veine sous la langue de l’animal transitoirement anesthésié - Au niveau de la veine de la queue, du cou ou des pattes sur l’animal actif au moyen d'un maintien adapté de l'animal - Au niveau de l'artère qui distribue le sang du coeur vers la tête (carotide) ou de l'artère de la cuisse (fémorale) sur animal préalablement implanté d'un tube très fin.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie, les animaux pourront être hébergé individuellement: 5 jours maximum post chirurgie. Cet hébergement individuel engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'hébergement individuel permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'hébergement individuel en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (en milieu artificiel ou par informatique) pour évaluer la pharmacocinétique d’un nouveau produit. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 5 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.