Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-302587)
30 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous maintenus en vie. Ils font l’objet de prélèvements de sang et d’urine quatre fois par an, sous contention légère, pour caractériser les séquences d’anticorps équins et affiner le contrôle antidopage. Le porteur décrit des nuisances limitées à un stress de contention et une douleur brève au point de piqûre. Il répète qu’il est « indispensable » de disposer de prélèvements de chevaux sains et qu’il n’existe « pas d’alternative » non animale.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Grâce notamment aux progrès de l’immunopathologie, des substances thérapeutiques ciblées (biothérapeuthiques) ont été développées pour le traitement de différentes pathologies (cancers et maladies inflammatoires résistantes aux traitements conventionnels). Il s’agit principalement d’anticorps monoclonaux (Monoclonal AntiBody (MAB)) produits dans des conditions particulières et caractérisés par leur spécificité d’action. Ces biothérapeuthiques sont susceptibles d’être employés dans l’objectif d’augmenter les performances des chevaux, les classant dans la catégorie des substances interdites et les rendant ainsi sujet de recherche prioritaire. Des méthodes de dépistage et de confirmation des macromolécules bio-thérapeutiques dans les matrices équines (méthodes par LC/HRMS) sont en cours de développement au sein du laboratoire. La stratégie utilisée pour ces méthodes d’analyse est de cibler les séquences peptidiques humaines qui sont différentes des séquences peptidiques équines afin d’identifier dans les échantillons biologiques la présence de macromolécules bio-thérapeutiques éventuellement administrées. En effet, les mAbs thérapeutiques, séquencés par génie génétique, sont issus de séquences murines ou humaines. Par conséquent, il est possible de différencier de manière formelle dans des matrices équines, les anticorps naturellement produits par le cheval, des mAbs thérapeutiques éventuellement administrés. Ces séquences sont majoritairement référencées dans des banques de données numériques communiquant une information sur la structure de ces molécules. Bien que les bases de données numériques telles que Uniprot ou encore RefSeq contiennent des séquences protéiques bien annotées pour les chevaux, elles résultent bien souvent de l’annotation du génome ou du transcriptome d’un unique ou d’un faible nombre d’individus. Des peptides caractéristiques des IGg humaines ont été identifiés comme tels dans nos conditions analytiques dans 10% environ des échantillons de plasma équin testés pour le moment. À la suite des travaux déjà réalisés au laboratoire, Il est donc indispensable d’analyser les deux matrices biologiques sanguines et urinaires, prélevées à partir de différents chevaux connus, n’ayant jamais été exposés à aucun produit dopant ni aucun traitement autres que vermifuges et vaccinations obligatoires en dehors des médications d’urgence éventuelles, afin de déterminer les séquences peptidiques équines endogènes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les anticorps monoclonaux (mAbs) thérapeutiques, séquencés par génie génétique, sont issus de séquences murines ou humaines. Par conséquent, il est possible de différencier de manière formelle dans des matrices équines, les anticorps naturellement produits (endogènes) par le cheval, des mAbs thérapeutiques éventuellement administrés. Ces séquences sont majoritairement référencées dans des banques de données numériques communiquant une information sur la structure de ces molécules. Bien que les bases de données numériques contiennent des séquences protéiques bien annotées pour les chevaux, elles résultent bien souvent de l’annotation du génome ou du transcriptome d’un unique ou d’un faible nombre d’individus. Il est donc indispensable d’analyser les matrices biologiques sanguines et urinaires prélevées à partir de différents chevaux connus, n’ayant jamais été exposés à aucun produit dopant ni aucun traitement autres que vermifuges et vaccinations obligatoires en dehors des médications d’urgence éventuelles, afin de déterminer les séquences peptidiques équines endogènes. Le bénéfice attendu est donc l’identification de ces séquences peptidiques endogènes ce qui permettra de sélectionner avec la sécurité requise (en accord avec les critères d’identification) les fragements pour l’identification des mAbs exogènes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des prélèvements de sang (2 tubes de 10 mL, 10 secondes) et d’urine seront prélevés à chaque fois (une fois par saison, soit 4 fois par an, un an étant la durée du projet). Chaque cheval est prélevé par du personnel expérimenté. Les urines sont prélevées par mixtion spontanée. Les volumes nécessaires sont petits (centaine de mL, 15 secondes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances sont légères : un stress peut être induit par la contention ainsi qu’une douleur légère et brève au point de piqûre. Le nombre total de prélèvements par cheval est de 4 en tout pour le projet sur 1 an (un prélèvement chaque saison). Ces prélèvements sont réalisés par du personnel expérimenté.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont maintenus en vie à l’issue de la procédure.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Pour mener à bien ce projet comme expliqué dans les objectifs du projet, le cheval étant l’animal cible, il est indispensable de disposer de prélèvements équins collectés chez des chevaux sains non traités. Il n’existe pas d’alternative non animale.
2. Réduction
Afin d’éviter toutes procédures expérimentales injustifiées, des échanges réguliers sont entretenus avec les collègues des différents laboratoires en Europe et dans le monde. Il a donc été vérifié que cette étude n’est pas conduite par une autre équipe. Comme mentionné dans la saisine, la fréquence déjà observée de la présence potentielle de peptides « humains » est de 0,1 (10%). Sur un effectif de 50 chevaux environ tous genres confondus, cela fait donc en théorie 5 prélèvements pour lesquels un signal pourrait être détecté. Lorsqu’on réalise un calcul de puissance statistique sur la base de la fréquence de 0,1 (loi binomiale car 2 évènements, soit absence soit présence). Pour une puissance de 95%, à un risque alpha de 0,05 afin de mettre en évidence une différence de plus ou moins 0,1 (soit mettre en évidence qu’il y a en fait 0 détection), la taille de l’effectif devrait être n=165. Le nombre d’échantillons demandé est très petit mais peut être suffisant pour cette première étape de validation.
3. Raffinement
Les chevaux évoluent dans un environnement adapté : ils sont hébergés en boxes individuels avec possibilité de contact avec leurs voisins via des grilles. Ils sont sortis quotidiennement à la demi-journée au paddock en herbe ou en sable (en fonction de la période de l’année et de la portance des sols). Les hongres de l’étude sont également au pré en groupe pendant les deux mois d’été. Du fourrage ad libitum leur est donné ainsi qu’une ration de concentrés adaptée aux besoins de chaque individu. Des pesées et notes d’état corporel étant effectuées mensuellement sur ces chevaux pour adapter leur ration. Les prélèvements sont réalisés par du personnels familier et qualifié avec une contention légère (tenue au licol).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le projet concerne le développement d’une méthode de détection dans des prélèvements équins. Il est donc indispensable de disposer de prélèvements équins. Des animaux adultes seront utilisés (mâles et hongres, les femelles étant prélevées dans un autre établissement utilisateur)