Procédures légères

Un bout de queue coupé à cinq ou six jours pour lire leur génotype, puis un gavage quotidien pendant un mois, douze heures en cage métabolique, deux anesthésies gazeuses pour poser et retirer un capteur de fluorescence sur le dos, 1 400 souris atteintes de polykystose rénale enchaînent ces étapes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le gavage peut irriter la gorge et provoquer des fausses routes, et que l'anesthésie peut entraîner une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. Si le saignement de la queue dure plus d'une heure, la souris est tuée. Toutes le sont à la fin, y compris celles qui n'ont pas le génotype recherché, tuées sans qu'on leur prélève quoi que ce soit.

Objectifs

L'impact de l'insuffisance rénale chronique en Santé Publique est majeur puisque cette maladie touche des millions d'individus dans le monde. Malgré les efforts de recherche considérables, il existe toujours très peu d'options thérapeutiques. Nous nous intéressons dans ce projet à une insuffisance rénale particulière d’origine génétique : la polykystose rénale humaine. Cette maladie génétique correspond à dix pour cent des patients en insuffisance terminale en France. Il n'existe pas jusqu'à présent de traitement préventif ou curatif efficace en dehors d’un médicament dont l'efficacité est limitée et la tolérance, médiocre. Ce projet vise à étudier l’effet bénéfique potentiel dublocage de deux gènes impliqués dans le développement de cette maladie. Nous allons tester l'efficacité de deux nouvelles molécules sur le développement de cette maladie en les testant sur une lignée de souris qui développent spontanément la maladie kystique rénale.

Bénéfices attendus

Les traitements proposés aujourd'hui pour la prise en charge de la maladie rénale kystique ne sont pas efficaces et ne parviennet pas à freiner l'évolution de la maladie. Les stratégies thérapeutiques envisagées dans ce projet permettront de tester si nos deux inhibiteurs sont de bonnes options thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie, en combiné ou séparément. Ces traitements pourraient avoir un impact de manière plus générale sur l'insuffisance rénale chronique et aboutir à un essai clinique chez l'homme.

Procédures

1) Dans le cadre du génotypage de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. (2) Une partie des animaux recevront un traitement ou un placebo par administration orale quotidienne pendant un mois. Cette étape est très rapide, environ dix secondes par animal et elle est effectuée sur animal vigile. (3) Les animaux seront placés pendant douze heures dans une cage métabolique pour le recueil urinaire, elles seront hydratées et nourries normalement dans une pièce dédiée de l’animalerie sous la surveillance du personnel. (4) Les souris seront soumises à la mesure de leur fonction rénale par une nouvelle technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure ne sera effectuée qu’une fois en fin de protocole. Pendant la mesure non invasive de la fonction rénale, les animaux sont placés dans des cages individuelles pour ne pas risquer d’abimer le matériel de mesure. Les animaux retournent dans leurs cages initiales deux heures après. (5) En fin de protocole, le sang est prélevé sous anesthésie et analgésie (trente secondes environ), sur un plateau thermostaté ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris mutées. L’accumulation de kystes entraîne le développement d’une insuffisance rénale à 6 mois. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 4 ou 8 semaines. Les protocoles durant 4 semaines, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d’urine en cage métabolique et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. La douleur liée à l'administration de traceur pendant la mesure de la fonction rénale sera de courte durée. Ces administrations peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. Les complications liées à l'anesthésie au moment de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt pour le projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire sans réalisation de prélèvement. Les animaux disposant du génotype d’intérêt seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements nécessaires postmortem pour les analyses.

Remplacement

Nos travaux préliminaires sur lignées cellulaires prouvent un rôle fonctionnel des deux gènes étudiés dans ce projet au cours du développement de la maladie, pré-requis indispensable à un test thérapeutique in vivo. En raison de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pouranalyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique des deux inhibiteurs est l'amélioration de la fonction rénale, qui est mesurée soit par dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire, par mesure transcutanée.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1400 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En cas de saignemment lors de la biopsie un point de compréssion sera effectué sur le bout de la queue .Si le saignement persiste au delà d'une heure (problème de coagulation) l'animal sera euthanasié .Le rejet de la mère sera vérifié en regardant le lendemain s' il y a bien une poche de lait visible sur le nouveau né et éventuellement une adoption sera sera envisagée si possibilité . En dehors d'une courte période en cage individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée hebdomadaire pendant tous les différents protocoles (et tous les deux jours pendant les périodes de gavage). Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, la prostration, l'hérissement du pelage. Il existe aussi un risque de saignement causé par les injections avant la mesure de la fonction rénale. Il peut survenir aussi des complications liées à l'anesthésie gazeuse (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique)

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifié utilisé dans ce projet est un modèle reconnu dans la littérature comme modèle pertinent de la maladie kystique rénale chez l’homme. C'est donc le meilleur modèle pour une expérimentation à visée mécanistique et thérapeutique. Les animaux (mâles et femelles) seront utilisés entre 1 et 6 mois. Ils ne seront pas gardés au-delà du stade terminal de la maladie (6 mois). Les interventions thérapeutiques seront effectuées dans un groupe précoce de souris âgées d'1mois (Groupe préventif) et un sous-groupe plus tardif de souris âgées de 2 mois considéré comme âge adulte (Groupe curatif) : elles visent à diminuer la gravité de la maladie et à améliorer la survie des animaux. Le stade de 2 mois est choisi car les souris présentent déjà des kystes rénaux à cet âge. L'identification génétique est réalisée très précocement (5-6 jours) pour limiter la douleur.

3 561 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines subissant deux ouvertures du crâne de trente minutes chacune. La première injecte dans le cerveau un produit qui y déclenche la pathologie d'Alzheimer, la seconde y administre le médicament testé. Le porteur signale que cette induction peut provoquer des crises d'épilepsie fugaces et une perte de mémoire, et que les reproductrices sont tuées en fin de période de fertilité. La modification ajoute 120 souris pour examiner l'influence de l'environnement de l'établissement sur la maladie, quand le bénéfice attendu tient en une phrase, le projet "pourra mettre en évidence de nouveaux traitements".

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie. L’examen de l’influence de l’environnement de l’établissement utilisateur sur le développement de la pathologie nécessite la modification du projet initial avec ajout de 120 animaux transgéniques devant être génotypés.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux (sauf les souris homozygotes) seront soumis à des prélèvements de queue pour génotypage (1 fois par souris, durée de l'acte : 1 seconde), certains animaux vieilliront sans recevoir de procédure supplémentaire. Certains animaux recevront une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter un produit qui induit la maladie d'Alzheimer (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Certains animaux recevront une deuxième chirurgie au niveau du crâne pour administrer un médicament (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Une partie des animaux recevra un médicament injecté dans les veines pour traiter la maladie d'Alzheimer (à 3 mois, duré de lacte : moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire légère et certaines souris peuvent développer des crises d’épilepsie fugaces. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h).

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin des procédures expérimentales, afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques. Les animaux reproducteurs utilisés pour générer les souris d'expérimentation seront euthanasiés en fin de période de fertilité.

Remplacement

La maladie d'Alzheimer est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe de 2 à 5 individus, nourris ad-libitum, et ayant accès à l'eau à volonté, dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être et de mettre en œuvre des traitements appropriés si besoin. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles de chirurgies ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des points limites précoces précis et stricts ont été définis. Des échelles cliniques, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts basés sur les points limites permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. La maladie se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits discrets apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les souris à un temps précoce et à un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin de maladie, soit entre 4 et 11 mois.

Une contention, une injection dans l'abdomen ou sous la peau, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis une mise à mort réglementaire, 1 200 souris subissent cet enchaînement pour que de nouveaux arrivants s'exercent aux gestes de base, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Quatre animaux au maximum par personne formée, avec des anesthésies pouvant durer une heure pour les gestes les plus complexes. Ce qui est produit ici, c'est l'habileté manuelle de gens déjà titulaires d'une habilitation en expérimentation animale, que le porteur juge trop théorique. Il décrit une souris en silicone permettant d'apprendre la contention, l'administration orale et l'injection, avant de conclure que la formation sur animal vivant reste "indispensable".

Objectifs

Chaque année, de nouveaux étudiants, techniciens, ingénieurs et chercheurs arrivent dans les établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est d’apprendre à ces nouveaux entrants, titulaires d’une habilitation en expérimentation animale à maitriser les gestes techniques dont ils auront besoin pour leurs projets scientifiques. L’apprentissage technique dispensé lors de l’habilitation en expérimentation animale n’est pas suffisant d’un point de vue technique pour maitriser les gestes en autonomie. Cet apprentissage technique est essentiel pour manipuler les animaux sans stress et réaliser dans de bonnes conditions les protocoles auxquels ils sont associés. Pour les nouveaux entrants non formés aux gestes techniques, il est important de proposer une formation leur permettant de pouvoir acquérir les gestes techniques de base sur la souris (contentions des animaux sans stress, injections, prélèvements sanguins, anesthésies…), notamment dans les zones à risque infectieux. En effet, ces nouveaux entrants sont destinés à la manipulation d’animaux en zone à risque infectieux, le risque biologique pour le personnel doit donc être pris en compte. Une maitrise des gestes techniques sur les animaux est primordiale et doit être enseignée et évaluée pour s'assurer de travailler dans des conditions optimales, autant pour le manipulateur que pour l'animal.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir former les nouveaux entrants aux bonnes pratiques, notamment ceux qui entrent dans les zones à risques infectieux. À court terme, la formation des nouveaux entrants permet le respect des bonnes pratiques et la prise en compte du bien-être animal au laboratoire. À long terme, un geste réalisé de manière sûre et maitrisée sera reproductible et donc bénéfique pour les protocoles scientifiques menés.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d’injections et de prélèvements sanguins, selon les besoins d’apprentissage des nouveaux entrants dans leurs protocoles scientifiques. Pour la majorité des cas, la formation technique se limitera à l’apprentissage de la contention, d’une injection et d’une méthode de mise à mort réglementaire. Les autres gestes seront enseignés selon les besoins, au cas par cas. Deux types d’injections simples peuvent être réalisées sur des animaux vigiles : dans l’abdomen et sous la peau (une fois, 15 secondes). Pour des protocoles nécessitant l’administration de substances par la voie orale, les nouveaux entrants pourront être formés à l’administration volontaire, sur des animaux vigiles (une fois, 30 secondes). Quatre autres types d’injections, plus complexes à mettre en œuvre seront enseignées. Ces injections seront réalisées sur des animaux sous anesthésie locale ou générale (une fois, 15 secondes, avec durée d’anesthésie variable, de 2 minutes à 1h,selon le geste enseigné). Trois types de prélèvements sanguins pourront être réalisés, sous anesthésie (une fois, 30 secondes). Chaque animal ne subira pas plus d’une injection et un prélèvement sanguin par session de formation (en excluant les injections nécessaires pour l’anesthésie et/ou l’analgésie).

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur transitoire de faible intensité au point d’injection. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer chez les animaux une douleur transitoire et un inconfort de faible intensité. La réalisation de ces gestes par des personnes peu expérimentées peut provoquer un stress et un inconfort passager pour les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Les animaux utilisés pour cet apprentissage sont des animaux initialement destinés à la mise à mort, car leur patrimoine génétique ne correspond pas aux besoins des projets scientifiques. Ces animaux ne peuvent pas être replacés en raison de leur caractère OGM (organisme génétiquement modifié).

Remplacement

Avant la mise en œuvre de gestes effectués sur l’animal vivant, les nouveaux entrants seront formés sur des souris de simulation ou sur des animaux morts. La souris de simulation est une souris en silicone permettant l’apprentissage de quelques gestes techniques (contention, administration orale volontaire et injection). La limite de ces méthodes de remplacement est que les gestes réalisés dans les protocoles scientifiques sont réalisés sur des animaux vivants, qui sont mobiles. Les animaux vivants ne seront utilisés qu’en cas de besoin, pour des gestes techniques que les nouveaux entrants doivent maitriser en autonomie pour leurs protocoles expérimentaux. Les habilitations à l’expérimentation animale sont essentiellement théoriques. Cette formation pratique est donc indispendable pour améliorer les conditions de manipulation des animaux et la fiabilité des résultats obtenus.

Réduction

Les animaux utilisés ne seront pas produits pour ces entrainements mais sont des animaux destinés à la mise à mort. En effet, les animaux utilisés seront des animaux anciens reproducteurs ou qui ne possèdent pas les caractéristiques génétiques leur permettant d’être inclus dans des projets scientifiques. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est limité à 4 par nouvel entrant. Si le nouvel entrant est déjà à l’aise avec les gestes qu’il doit effectuer, les animaux ne seront pas utilisés. Le nombre d’animaux utilisé sera adapté à la demande d’acquisition de gestes techniques. Ce nombre est réduit au maximum tout en permettant l’acquisition des actes techiques.

Raffinement

Les gestes de base en expérimentation qui seront réalisés lors de cette formation ne seront réalisés qu’après une bonne maitrise de la contention des animaux, sans stress. La supervision de cet apprentissage sera réalisée par un formateur expérimenté. La majorité des gestes techniques est réalisée sous anesthésie locale ou générale. Pour les gestes qui le nécessitent, des analgésiques adaptés seront utilisés. Des points limites prédictifs d’un échec de la maitrise du geste ont été définis afin d’éviter toute souffrance pour les animaux utilisés.

Choix des espèces

Les expérimentations réalisées au sein de notre établissement utilisateur sont essentiellement réalisées sur des souris. Former les nouveaux entrants sur la même espèce est essentiel pour mener à bien leurs expérimentations selon les bonnes pratiques. Les animaux utilisés seront des animaux de réforme adultes dont l’âge est compris entre 8 semaines et 9 mois. Pour les projets nécessitant l’entrainement sur un âge non prévu dans ce projet, le protocole d’entrainement sera décrit dans le projet scientifique affilié.

8 564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 816 d'entre elles boivent pendant six semaines une eau additionnée de doxycycline, 160 subissent jusqu'à cinq prélèvements de moelle osseuse au cours de leur vie, et les autres sont irradiées puis greffées de moelle avant de recevoir des injections dans le péritoine et des prélèvements mensuels. Certaines sont suivies jusqu'à 24 mois, soit une vie entière. Le porteur veut comprendre ce que devient, des années après une greffe, un environnement de moelle resté porteur d'une mutation, et affirme avoir "besoin" de travailler sur un "organisme entier" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas ces échanges.

Objectifs

La moelle osseuse joue un rôle essentiel en produisant toutes les cellules du sang à partir de cellules immatures appelées cellules souches. Ce processus, très précisément contrôlé, dépend de signaux envoyés par l’environnement de la moelle, qui influencent le comportement de ces cellules. Quand des anomalies génétiques héritées viennent perturber ce mécanisme, cela peut mener à des maladies graves comme les leucémies. Le projet se concentre sur un gène particulier, impliqué dans la régulation de ces cellules souches. Des mutations héritées dans ce gène augmentent le risque de développer une leucémie. Ce gène est actif à la fois dans les cellules du sang et dans celles de l’environnement de la moelle osseuse. Ainsi, même après une greffe de cellules souches — qui permet de remplacer les cellules du sang — les cellules de l’environnement de la moelle osseuse restent porteuses de la mutation. L’objectif de cette recherche est de mieux comprendre comment ces mutations influencent les échanges entre les cellules du sang et leur environnement, surtout chez des patients greffés depuis plusieurs années. Pour cela, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire ces mutations, afin d’observer leur impact au fil du temps (en particulier en mimant les évènements de la vie comme des infections).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un facteur de transcription dans l'hématopoïèse normale et leucémique. Une mutation de ce facteur entraîne une leucémie, qui ne peut être soignée que par une greffe de cellules souches. Cependant, lors de cette greffe, seules les cellules sanguines sont remplacées, tandis que les cellules de la moelle osseuse, qui produisent ces cellules sanguines, ne le sont pas. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l'impact à long terme de cet environnement muté de la moelle osseuse sur les cellules greffées, afin d'évaluer comment cet environnement pourrait affecter l’efficacité et la durabilité de la greffe.

Procédures

2816 animaux seront soumis a l'ingestion d'eau supplémentée de doxycycline ,pendant 6 semaines (non toxique à la dose utilisée). 160 animaux subiront un prélèvement de moelle osseuse maximum 5 fois au cours de leur vie sous anesthesie et analgésie. Lles autres animaux subiront une transplantation de moelle osseuse necessitant une irradiation de 2 minutes maximum et une injection de cellules (en anesthesie et analgésie, maximum 20 secondes). Au bout d’un mois pour permettre la prise de greffe, ces animaux subiront une injection de certaines drogues dans le péritoine (moins de 20 secondes en contention) à des doses non mortelles pour une souris sauvage. Ces souris seront ensuite étudiées par prélèvement régulier (maximim une fois/mois) de moelle osseuse et de sang.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de moelle osseuse, réalisés sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et ne sont effectués qu’une fois par mois maximum au cours de la vie de l’animal. Cette procédure est considérée de sévérité modérée. Les expérimentations impliquant une transplantation nécessitent une irradiation préalable, également de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de l’animal pour une durée inférieure à deux minutes. Une greffe de moelle osseuse est ensuite effectuée quelques heures après l’irradiation afin de garantir la survie de l’animal et de greffer les cellules d’intérêt, cette procedure dure moins de 2 minutes anesthesie comprise. Une surveillance étroite est assurée dans les heures qui suivent, et du gel hydratant est ajouté dans les cages durant la première semaine post-procédure.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre l'analyse des tissus de ces animaux

Remplacement

Nous avons validé au laboratoire, in vitro et in vivo , que les mutations hétérozygotes du gène d'interet impactent la différenciation des cellules hématopoïétiques et induisent un état qui pourrait précéder une leucémie. Les mutations que nous étudions sont des mutations germinales et donc exprimées à la fois dans les cellules sanguines et dans les cellules du microenvironnement médullaire. Afin de déterminer la part intrinsèque (aux cellules sanguines) et extrinsèque (stroma) dans ce dysfonctionnement des cellules hématopoïétiques nous avons besoin de le faire sur un organisme entier et en particulier en créant des chimères ayant des cellules du microenvironnement muté et des cellules hématopoïétiques normales (comme après une greffe chez les patients mutés) et inversement. Pour remplacer l’utilisation des animaux, nous allons également utiliser les cellules de ces souris pour réaliser des tests de différenciation ex vivo (coculture des différentes combinaisons de cellules). Les modèles murins sont utilisés majoritairement par la communauté scientifique internationale pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans des pathologies hématologiques. De nombreux outils d’analyse moléculaire sont mis en place dans ces modèles : Le modèle murin est un modèle d'étude en cancérologie et particulièrement dans les cancers du sang. En effet, la production des cellules du sang se fait grâce à des protéines très conservées entre l'espèce humaine et murine.

Réduction

Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux de la littérature et des test statistiques adaptés au petits echantillons nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études longitudinales nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de coton pour réduire le stress potentiel et la présence d'igloos rigides rouges dans toutes les cages pour offrir un abri sécurisé. En cas de comportement inhabituel tel que la prostration, un pelage terne et hirsute, ou des signes de blessures infligées par d'autres animaux, l'individu concerné est isolé et reçoit une attention renforcée. Une perte de poids soudaine dépassant 20% du poids initial de l’animal est également surveillée (selon une grille de scoring en annexe). Des soins appropriés sont alors prodigués, incluant la désinfection des plaies ou un accès facilité à la nourriture si nécessaire. Si aucune amélioration n'est constatée malgré ces mesures, des décisions seront prises pour mettre fin à la vie de l'animal de la manière la plus humaine possible afin de prévenir toute souffrance inutile, en accord avec les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les souris immunodéficientes NSG sont hébergées dans un environnement répondant aux normes « Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) » pour prévenir l'apparition de phénotypes dommageables). Les prélèvements médullaires (de degré de sévérité modérée) sont réalisés sous anesthésie et analgésie, avec l'animal placé sur une plaque chauffante et surveillé attentivement jusqu'à son réveil. Les personnes effectuant ces prélèvements sont formées à cette technique et possèdent les compétences nécessaires pour manipuler les souris et effectuer les gestes techniques dans le respect du bien-être animal. L'animal est surveillé et une grille de «scoring » est appliquée: ses critères principaux sont: le poids corporel et la taille; l’apparence physique, la posture et démarche, les signes cliniques, l’environnement (état de propreté de la cage par exemple), le comportement non provoqué et le comportement après stimulation. Ces critères sont notés de 0 à 3, 0 étant normal, 1 à surveiller attentivement, 2 soins si nécessaires et 3 mise à mort .

Choix des espèces

La communauté scientifique internationale privilégie l'utilisation de modèles murins pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans les pathologies hématologiques, en raison de la conservation des gènes et des voies de signalisation entre l'Homme et la souris. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris en hématopoïèse sont souvent extrapolables à l'humain. De nombreux outils d'analyse moléculaire et cellulaire sont déployés dans ces modèles, permettant une analyse fine à l'échelle de la cellule unique Nous réaliserons des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, en incluant des périodes à différents âges (1, 3, 6 et 12 mois) ainsi que durant le vieillissement (souris âgées de 24 mois minimum). Ces différentes étapes permettront d’observer l’évolution de l’hématopoïèse, chez la souris pouvant être extrapolée chez l’Homme (hématopoïèse jeune, adulte et clonale) dans des conditions basales. Les patients ayant notre gène d'interet muté sont soumis tout au long de leur vie à des stimulations répétées de l’hématopoïèse par des virus, des bactéries, etc. Nous allons les mimer par injection de certains produits stimulant la formation des cellules sanguines.

Des souris femelles de cinq semaines, choisies parce que le projet porte sur le lymphœdème qui suit la chirurgie du cancer du sein, elles sont 370, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une opération d'une vingtaine de minutes sous anesthésie leur provoque un lymphœdème, puis trois injections dans le derme leur administrent des vecteurs à ARN circulaires censés faire repousser les vaisseaux lymphatiques. Le porteur reconnaît que la chirurgie et le lymphœdème provoquent des douleurs modérées. Les souris sont ensuite transportées vers un second établissement où on les tue pour prélever les tissus, une modification que le porteur présente comme se faisant sans ajout d'animaux.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. La réalisation de la dernière étape des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Génétiquement modifiées pour accumuler dans leur cerveau les protéines de la maladie d'Alzheimer, les souris de ce projet développent vers six à huit mois des lésions entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement. 1 284 souris vont être utilisées, 924 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de queue au génotypage, puis jusqu'à dix-neuf administrations intranasales sous anesthésie, une à trois séances d'imagerie de trois heures et des tests de mémoire dont une épreuve de nage. Toutes sont tuées à six ou sept mois pour prélever le cerveau, le porteur ajoutant qu'elles ne pourraient de toute façon pas être placées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre et se dépose sous forme de plaques ou s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière sang-cerveau qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau, cependant, elle rend aussi difficile le passage de molécules thérapeutiques. Ces dernières années, une technologie de petites molécules thérapeutiques, appelée nano-anticorps a été développée, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Une approche complémentaire pour contourner cette barrière, consiste à administrer les médicaments par voie nasale. En effet, certaines zones situées à l’avant du cerveau, près du bulbe olfactif (zone du cerveau impliqué dans l’odorat), au-dessus des fosses nasales, offrent un passage plus accessible grâce à de petites ouvertures dans l’os du crâne et permettent ainsi la pénétration accélérée de molécules thérapeutiques. Par ailleurs, il existe des types de matériaux particuliers appelés thermogel qui à température ambiante sont liquides, ce qui les rend faciles à appliquer et qui au contact de la chaleur du corps, se transforment en gel. Cette transformation permet au médicament de rester en place et d’être libéré progressivement sur plusieurs heures. Cela en fait une excellente option pour ce projet, car ils aident les petites molécules thérapeutiques, comme les nano-anticorps, à adhérer à la muqueuse nasale et à atteindre le cerveau plus efficacement. En résumé, ce projet vise à évaluer la combinaison de ces différentes technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Des nano-anticorps visant les agrégats de protéines seront diffusés à partir de thermogels appliqués dans les fosses nasales. Nous déterminerons si cette stratégie, testée chez l’animal modèle de maladie d’Alzheimer (souris génétiquement modifiées pour reproduire des accumulations de protéines), permet de freiner la propagation des lésions et d’améliorer les capacités de mémoire des animaux traités.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante pour le diagnostic et le traitement de la maladie d’Alzheimer. Si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait contribuer à évaluer cette nouvelle méthode de diagnostic de la maladie et cette nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme. Ainsi, à plus long terme, ces recherches pourraient donc permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes pour les patients et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Tous les jeunes souriceaux produits auront un prélèvement, à l’état vigile, d'un fragment de l’extrémité de la queue pour définir leur patrimoine génétique (moins d’une minute par animal, une fois). Une partie des animaux recevra une seule administration de notre thérapie ou son contrôle. Cette administration sera réalisée (durée de l’administration : 45 secondes environ) sous anesthésie générale pour une durée de maximum 5 minutes Pour une partie de ces animaux des séances d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectuées avant et, ou, après l’administration : 1 à 3 séances d’IRM (3 heures maximum par séance, à 44h d’intervalle minimum), le tout sous anesthésie générale. Si la mise en place du thermogel est validée sur les procédures précédentes, une autre partie des animaux recevra plusieurs administrations de notre thérapie ou son contrôle (19 administration au total, durée de chaque administration : 45 secondes environ), le tout sous anesthésie générale (durée de maximum 5 minutes).Ces animaux réaliseront ensuite des tests comportementaux visant à évaluer leur mémoire (des objets et des lieux) : 2 tests répartis sur une durée de 9 jours. Le premier test sera composé de 3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours, et le deuxième test consistera en 4 essais par jour pendant 5 jours (essais de 90 secondes maximum) puis 1 essai de 90 secondes maximum le sixième jour. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 6 à 8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur patrimoine génétique. Un léger saignement est à prévoir. Les administrations et examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale et donc sont associés aux risques anesthésiques suivants : risque d’hypothermie, risque de déshydratation et risque d’anomalies cardiaques et respiratoires. Le risque sera très faible pour les administrations puisque la durée d’anesthésie sera inférieure à 5 minutes. Les administrations pourront générer une légère douleur et un inconfort et possiblement des saignements locaux limités. Les tests comportementaux impliqueront un stress lié au placement dans un nouvel environnement et un risque d’hypothermie lorsque l’animal sera mouillé.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux post-mortem à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études in vitro, dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Dans le cadre de ce projet les études vitro ont permis de sélectionner les meilleurs agents thérapeutiques à tester sur l’animal. Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permis ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet (1284 souris) est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature. Les résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Les animaux surnuméraires produits seront cédés, dans la mesure du possible, pour être utilisés dans d’autres projets.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement agréé, dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (coton ou kraft pour faire un nid, bâtonnets de bois à ronger, maisonnettes). Un programme de suivi rapproché des lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer est mis en place afin de détecter l’apparition de symptômes cliniques liés à la modification génétique. Ce suivi sera réalisé à partir de 5 à 6 mois en fonction de la lignée et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées. Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir le plus précocement possible pour minimiser toute souffrance animale. La biopsie de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible, elle sera réalisée dans un endroit calme et le petit sera replacé immédiatement après le geste avec sa mère et le reste de la portée. Il sera surveillé immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il ne saigne pas et qu’il soit bien pris en charge par sa mère. Pour prendre en charge les différents risques liés à l’anesthésie générale des animaux plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-anesthésie sera également mise en place. Pour vérifier l’innocuité et la tolérance de nos administrations intranasales, nous ferons un suivi rapproché des animaux traités afin d’assurer une prise en charge rapide des éventuelles gênes ou douleurs qui pourraient être visibles avec l’avis du vétérinaire. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel environnement avant les tests pour minimiser le stress induit. Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés d’une heure minimum pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles particulièrement pertinents et largement utilisés dans la recherche, notamment pour l’étude du système nerveux. Leur génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Dans le cadre de notre projet 2 lignées transgéniques d’intérêt nous permettront de mener à bien nos recherches. Nous utiliserons ces souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux produits seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours après leur naissance. Cet âge est choisi car il permet de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre très tôt leur génotype. Toutes les expérimentations visant à évaluer notre thérapie seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les administrations seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 2 à 7 mois). Dans le cadre diagnostique, les administrations intranasales et examens d’imagerie associés seront initiés à 6 ou 7 mois (lésions denses). Les traitements thérapeutiques seront eux initiés à 2 ou 3 mois (début des lésions) sur une durée de 4 mois avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 6,2 ou 7,2 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.

Gavées à deux et trois jours de vie, amputées d'un fragment de queue entre le cinquième et le onzième jour, puis soumises adultes à une injection et à six prélèvements sanguins, 1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 1 728. Toutes sont tuées à la fin pour analyse. Le porteur précise que seule l'injection sous-cutanée se fait sous anesthésie, les autres gestes étant pratiqués sur animal vigile parce qu'ils sont courts et maîtrisés par l'opérateur. Il justifie l'effectif par la seule affirmation d'avoir retenu le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans donner ni calcul ni taille de groupe.

Objectifs

La production d’anticorps protège contre des pathogènes mais provoque aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique un type de cellule particulier, appelé cellules dendritique folliculaire, qui se retrouve dans les ganglions lymphatiques et la rate. L’origine de ces cellules et leur mécanisme de différenciation ne sont pas bien connus, ce qui empêche la découverte de nouveaux médicaments contre ces maladies autoimmunes. Ce projet vise à mieux comprendre l’origine de cette cellule et à étudier l’implication d’un récepteur, qui pourrait alors être ciblé par de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le développement du système immunitaire et la réponse immune. Etant donné que la protéine étudiée est actuellement ciblée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.

Procédures

Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Les juvéniles (entre jour 5 et jour 11 après naissance) sont soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) et à 6 prélèvements de sang (durée du prélèvement < 2 min). L’injection par voie sous-cutanée s’effectue sur animal anesthésié. Les autres interventions se feront sur animal vigile car il s'agit de gestes courtes et qui sont parfaitement maitrisés par l'opérateur.

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour connaitre l’origine des cellules dendritiques folliculaires et tester la fonction d’un récepteur dans leur formation. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes, les ganglions et la rate, où se trouvent ces cellules. Chez la souris, les structures des ganglions et de la rate sont bien connues et en plus sont identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement le du système immunitaire impliquant la formation des cellules folliculaires dendritiques.