Procédures légères
Utilisation de faibles doses d’interleukine 2 dans un modèle murin d’autisme médié par une activation immunitaire maternelle pendant la grossesse
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue pour prélèvements et 60 femelles réutilisées dans d'autres accouplements ou d'autres projets. Trente femelles gestantes reçoivent une injection destinée à activer leur système immunitaire, pour que leur descendance développe un phénotype autistique. Une partie des 180 petits reçoit ensuite de la vitamine D dans son alimentation pendant six semaines et passe un test comportemental de quatorze heures, l'autre partie est opérée sous anesthésie et tuée sans réveil. Le porteur écrit que le projet répond aussi à la "nécessité" d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, ce qui rend selon lui l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet,nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Dans le cadre de ce projet, des femelles gestantes recevront une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) afin d’induire le modèle de troubles du spectre autistique dans la descendance qui sera étudié. Une partie de la descendance recevra une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) ou une supplémentation en vitamine par l'alimentation à visée thérapeuthique (animal vigile, 6 semaines en continu) et suivra un test comportemental non stressant (animal vigile, 1 fois, 14h avec enrichissement, accès à l'eau et la nourriture et en groupe). L'autre partie sera soumise à une chirurgie sans réveil (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 5 minutes) a des fins de meilleurs compréhension des mécanismes pathologiques.
Impact sur les animaux
L'injection d'une molécule pourra induire une douleur légère de courte durée aux femelles gestantes et va induire un phénotype de comportement autistique dans la descendance. Le changement de régime pourra induire une baisse de la consommation alimentaire de manière transitoire en raison de la néophobie du modèle animal. Une partie des animaux aura une chirurgie sans réveil. L'anesthésie lors de cette chirurgie pourra entrainer une hypothermie ou encore une détresse respiratoire. L'autre partie des animaux recevra une injection et suivra un test comportemental. L'injection peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. Le test comportemental peut générer un stress transitoire.
Devenir
Une partie des femelles impliquées et produites dans le projet pourra être réutilisée. Les autres animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements nécessaires pour des analyses.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement du cerveau et la mise en place des processus comportementaux de socialisation. Ils sont donc nécessaire dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les processus d'interactions sociales. Ce projet répond également à la nécessité d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, rendant l'utilisation d'animaux indispensable.
Réduction
Au total 30 femelles et 180 petits de la descendance seront utilisés pour ce projet. Le nombre total d’animaux impliqués sera réduit au minimum. Les 15 mères n'ayant pas reçu d'injection induisant de l'inflammation, seront réutilisées pour d'autres accouplements programmés. De plus les 45 femelles issues de mère contrôle pourront être réutilisées dans d'autre projets. Concernant les tests comportementaux nous avons utilisés le nombre minimum d'animaux afin d'assurer la fiabilité des résultats avec une puissance suffisante. Par ailleurs, dans la suite, seuls les males seront utilisé pour la biologie et le comportement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé afin de limiter le stress des animaux. Les croquettes supplémentées en vitamine D sont de consistance normale et ne nécessite donc pas d'enrichissement particulier. Le système du test comportemental permet de maintenir les animaux en groupe ce qui réduit aussi le stress des animaux en procédure. La procédure chirurgicale sera effectuée sous anesthésie et analgésie et elle sera sans réveil. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé en immunologie et particulièrement pour les études de développement de nouvelles immunothérapies. De plus, les comportements pro-sociaux de la souris commencent à être de mieux en mieux connus, même si les aspects liés à la communication chez ce modèle demandent à être approfondis, elle représente un modèle de choix pour l'analyse des comportements autistiques Les femelles seront utilisées entre 10 et 12 semaines pour la reproduction, à cet âge les femelles sont robustes et fertiles. Afin de compléter nos précédents résultats les mâles seront ensuite utilisés entre 8 semaines pour compléter nos précédents résultats et assurer la reproductibilité et 24 semaines afin de completer nos résultats pour évaluer le maintien de l'éfficacité clinique à long terme
Évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) de l’innocuité et de l’efficacité de molécules innovantes pour le traitement des AVC chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 5000
Venus des autres autorisations du même laboratoire, où des accidents vasculaires cérébraux leur sont provoqués, 9 600 souris et 5 000 rats sont transportés vers un appareil d'IRM installé dans un laboratoire partenaire. Cette autorisation ne couvre que les examens d'imagerie, déclarés en niveau de souffrance léger, et tous ces animaux seront tués pour prélever le cerveau. Chaque examen se fait sous anesthésie générale de dix à quarante-cinq minutes, répétée à cinq dates après l'accident vasculaire, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue pour injecter un agent de contraste. Le porteur qualifie l'IRM de méthode non invasive garantissant une approche respectueuse du bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'aucune méthode alternative n'atteint le niveau d'information de l'expérimentation animale.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC), qu'ils soient hémorragiques ou ischémiques, constituent des pathologies neurologiques majeures, causées respectivement par la rupture ou l'occlusion d'un vaisseau cérébral. À ce jour, il n'existe aucune stratégie pharmacologique efficace pour atténuer les conséquences d'un AVC hémorragique, et les traitements de l'AVC ischémique sont limités par des effets secondaires et une efficacité variable. Notre laboratoire a développé et validé plusieurs modèles murins (souris et rats) qui reproduisent fidèlement les différentes formes d'AVC. Ces différents modèles sont essentiels pour refléter la diversité étiologique et épidémiologique observée chez l'Homme, permettant ainsi d'évaluer l’innocuité et l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques proposées par les industriels. Chaque modèle d’AVC a fait l’objet d'une DAP spécifique, regroupant des projets de recherche distincts avec des paramètres d'évaluation communs. Toutes les procédures expérimentales décrites dans ces DAP sont réalisées au sein de l’établissement principal, à l'exception de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) faisant l’objet de la présente DAP. L'IRM, réalisé dans un laboratoire partenaire, est un outil central dans toutes nos études et pour l’intégralité de nos modèles d’AVC. Elle permet de mesurer la taille et la localisation des volumes lésionnels et hémorragiques, d'évaluer l'intégrité de la barrière hématoencéphalique, le niveau d’inflammation parenchymateux ainsi que la diffusion sanguine et tissulaire dans des zones cérébrales précises. Ces informations sont essentielles pour comprendre les mécanismes de réponse aux traitements et leur efficacité. Cette DAP concerne l'ensemble des animaux des DAP précédemment déposées et acceptées, décrivant l’utilisation de l’IRM.
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de l'AVC ischémique repose sur l'administration de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à une thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la complexité de la procédure de thrombectomie, seule une minorité de patients (
Procédures
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux se limitent principalement à l’anesthésie générale nécessaire pour les examens d'IRM. Cette procédure, bien que potentiellement répétée dans le temps, reste relativement courte : entre 10 et 45 minutes environ. La randomisation et l’équilibrage des groupes expérimentaux permettra de réduire la fréquence d’examen et donc la durée de l'anesthésie pour chaque animal. En dehors de cet aspect, l'IRM offre un avantage majeur : c'est une méthode non invasive, qui permet de déterminer l'efficacité des traitements sur de nombreux paramètres sans intervention chirurgicale ou prélèvement. Ainsi, les contraintes pour les animaux restent limitées, garantissant une approche respectueuse du bien-être animal. Les acquisitions IRM, programmées aux moments clefs de chaque projet (J0, J1, J2, J5 et J14), se dérouleront sous anesthésie générale. Après une, l’animal sera installé sur le berceau de l’IRM, où l’anesthésie sera maintenue. Pour éviter la sécheresse ophtalmique, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de l'animal. Durant l’examen, une surveillance continue sera assurée grâce à un module de contrôle respiratoire, et le berceau sera chauffé pour maintenir le confort thermique. L’administration d’un agent de contraste intraveineux sera nécessaire pour certaines séquences spécifiques, impliquant la mise en place d’un cathéter dans une veine de la queue de l’animal sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale est légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux se limitent principalement à l’anesthésie générale nécessaire pour les examens d'IRM. Cette procédure, bien que potentiellement répétée dans le temps , reste relativement courte : entre 10 et 45 minutes environ. La randomisation et l’équilibrage des groupes expérimentaux permettra de réduire la fréquence d’examen et donc la durée de l'anesthésie pour chaque animal. Il convient de noter qu’au cours du transport des animaux entre nos locaux et l’appareil d’IRM situé à Cyceron, le trajet inclut un passage extérieur d’une dizaine de mètres. Pour minimiser le stress, nous utilisons un chariot de transport adapté, totalement fermé, maintenant les animaux dans l’obscurité complète. En dehors de cet aspect, l'IRM offre un avantage majeur : c'est une méthode non invasive, qui permet de déterminer l'efficacité des traitements sur de nombreux paramètres sans induire de douleur à l’animal. Ainsi, les contraintes pour les animaux restent limitées, garantissant une approche respectueuse du bien-être animal.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort selon la DAP correspondante permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ces projets représentent des étapes cruciales des tests d'innocuité et d'efficacité de nouvelles thérapies in vivo, faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations menées in vitro par nos partenaires industriels financeurs. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d'atteindre le niveau d'information fourni par l'expérimentation animale. Les connaissances actuelles, issues de la littérature et de l'expérience de notre laboratoire, positionnent la souris et le rat comme modèles de choix pour nos projets. Les rongeurs sont en effet parmi les espèces les plus étudiées dans le domaine de l'AVC, permettant ainsi une analyse comparative et critique fiable des résultats. L’utilisation de l’IRM constitue en lui-même une réduction et raffinement dans la mesure où il permet d’avoir un diagnostic de façon non invasive, répété longitudinalement sur le même animal. Obtenir les mêmes informations que celles produites par l’IRM utiliseraient un nombre d’animal beaucoup plus important puisque l’équivalent des données fournies par chaque séquence IRM équivaut à une analyse immunohistochimique du cerveau de l’animal. De plus, les données fournies sont translationnelles avec la clinique.
Réduction
Les données issues de la littérature préclinique, combinées à une analyse de puissance régulièrement actualisée avec nos propres résultats, permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux par groupe, en fonction du modèle d’AVC et des procédures expérimentales. Cette estimation repose sur une analyse de puissance et une répartition équilibrée entre les groupes. Cette approche garantit la détection de différences significatives tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Pour limiter le nombre d’acquisition IRM par animal, nous avons réparti les animaux en sous-groupes, chacun passant les examens à des jours spécifiques selon les besoins de l'étude. Cela permet de réduire la fréquence des anesthésies pour chaque animal tout en garantissant des données complètes et pertinentes pour chaque projet. Cette approche nous permet d'obtenir des données robustes tout en respectant les principes éthiques de réduction du nombre d'animaux utilisés, garantissant ainsi la validité scientifique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards conformes aux normes européennes et isolés des bruits extérieurs. Chaque cage sera équipée d’enrichissements variés dépendamment des souches animales et donc des projets. Ils auront également un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de leur séjour dans nos locaux. Leur bien-être sera suivi par du personnel qualifié, avec des contrôles biquotidiens cinq jours par semaine et quotidiens les week-ends et jours fériés. De plus, les animaux seront régulièrement pesés, au moins deux fois par semaine. Les animaux seront transportés de nos locaux à l’IRM situé dans le laboratoire partenaire dans un chariot adapté et fermé, garantissant un environnement sombre pour limiter leur stress. Ce transport, qui s’effectue en environ 5 minutes, inclut un passage extérieur d’une dizaine de mètres. Pendant les examens IRM, les animaux seront anesthésiés et un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle sera contrôlée grâce à une couverture chauffante. La fréquence et l’amplitude respiratoire seront surveillées en continu, permettant à l’expérimentateur d’ajuster l’anesthésie si nécessaire. Bien que la surveillance soit continue durant l'examen IRM, elle sera intensifiée pendant les premières heures suivant le réveil. En cas de signes de stress ou de souffrance non anticipés, la procédure sera immédiatement interrompue. Si les points limites définis dans cette DAP sont atteints, l’animal sera euthanasié conformément aux protocoles établis.
Choix des espèces
La souris et le rat occupent une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rongeur, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de ces espèces des modèles animaux privilégiés pour la recherche préclinique. Les souris utilisées seront âgées d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 35g pour les SWISS et OF1 et de 25g pour les C57BL/N. Les rats seront quant à eux âgés de 6 à 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 350g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
« Le rôle d’IKAROS dans une forme pédiatrique de leucémie : facteur de la maladie ou cible pour la soigner ? »
- Recherche appliquée
- Cancers
Immunodéprimées et maintenues en cages individuelles ventilées pour éviter les infections, 200 souris vont être utilisées dans une étude sur une leucémie de l'enfant, 188 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de cellules leucémiques puis jusqu'à huit prises de sang hebdomadaires, et 160 souris reçoivent en plus vingt injections de chimiothérapie sur quatre semaines. Le porteur annonce que toute perte de poids sera traitée comme un signe de souffrance et un effet sévère, entraînant la mise à mort de l'animal concerné. Toutes sont tuées à la fin, sang, moelle osseuse et rate étant analysés pour y compter les cellules leucémiques.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d'une protéine dans un type de leucémie qui touche principalement les enfants. Nos études suggèrent que, contrairement aux autres formes de leucémie, cette protéine d'intérêt pourrait ici aider les cellules cancéreuses à survivre. Nous allons donc examiner si la disparition de la protéine d'intérêt dans ces cellules pourrait freiner la progression de la maladie. Pour ce faire, nous testerons un médicament déjà utilisé chez d’autres patients cancéreux afin de voir s’il pourrait devenir une nouvelle option de traitement pour ce type de leucémie. Auparavant, nous allons comparer deux modèles de souris afin de choisir celui qui se prête le mieux à notre étude. Ce travail pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques afin de mieux traiter certains enfants atteints de leucémie.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans un type spécifique de leucémie chez l’enfant. À court terme, il pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible pour le traitement de cette maladie. Cela ouvrirait la possibilité d’utiliser un médicament déjà disponible en clinique, ce qui faciliterait une mise en application rapide pour les patients. Avantages à long terme : À plus long terme, cette recherche pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre la leucémie, avec moins d’effets secondaires. Cela améliorerait la qualité de vie et les chances de guérison des patients. En réduisant l’utilisation de traitements lourds et généralisés, elle pourrait également limiter l’impact environnemental lié à certains médicaments de chimiothérapie.
Procédures
Dans cette étude, plusieurs procédures sont réalisées sur des souris pour évaluer l’efficacité de traitements contre la leucémie. Jusqu’à 188 souris peuvent être concernées par des prises de sang, effectuées une fois par semaine pendant un maximum de huit semaines. Chaque prélèvement dure environ deux minutes et est réalisé par du personnel expérimenté. Une injection unique est également prévue au début de l’étude, pour chacune des souris. Cette intervention, qui dure environ vingt minutes par animal (temps de préparation compris), est suivie d’une observation quotidienne pour vérifier l’état de santé des animaux. Un autre traitement, sous forme de chimiothérapie, nécessite jusqu’à 160 souris. Il consiste en vingt injections réparties sur quatre semaines. Chaque injection dure environ deux minutes, et les souris sont observées juste après pour s’assurer qu’elles vont bien. Toutes les manipulations sont réalisées par groupes de cinq souris. L’expérimentation peut être arrêtée plus tôt que prévu si des résultats suffisamment clairs sont obtenus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Impact sur les animaux
Douleur : Certaines procédures, comme les prélèvements sanguins ou les injections, peuvent provoquer une douleur légère à modérée. Cette douleur est généralement brève et disparaît quelques minutes après l’intervention. L’apparition de la leucémie peut également entraîner des douleurs quelques jours ou semaines après l’induction, une fois la maladie installée. En cas de signes de douleur après l'établissement de la leucémie, les animaux seront immédiatement euthanasiés et examinés. Perte de poids : Les animaux seront pesés chaque semaine. Perte de poids sera considérée comme un signe de souffrance et un effet sévère, et l’animal concerné sera euthanasié. Réduction de l’activité ou de la mobilité : Certains animaux peuvent devenir moins actifs à cause de la maladie ou si le système nerveux est affecté. Une surveillance quotidienne sera mise en place. Si une forte réduction de la mobilité ou une incapacité à se déplacer persiste plus de deux jours, cela sera considéré comme un signe de détresse. Stress : Des manipulations comme les injections ou les prélèvements peuvent provoquer un stress léger et temporaire. Celui-ci dure en général moins d’une heure après la procédure. Un stress prolongé pourra être suspecté en cas de changements persistants dans le comportement. Changements comportementaux : Des modifications telles que léthargie, agitation ou agressivité peuvent apparaître après certaines interventions. Elles sont en principe transitoires, durant quelques jours. Si ces troubles persistent ou s’aggravent, une évaluation sera faite pour décider d’une éventuelle euthanasie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et analysés à la fin des procédures. Plus précisément, le sang, la moelle osseuse et la rate seront analysés pour détecter la présence de cellules leucémiques par cytométrie de flux.
Remplacement
Cette analyse in vivo est essentielle pour déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt dans les leucémie aiguë lymphoblastique, car elle permet d’étudier le comportement des cellules leucémiques dans un environnement biologique complexe, ce qui ne peut être réalisé par des techniques in vitro à ce stade du projet. En effet, les modèles in vitro ne reproduisent pas fidèlement les interactions biologiques et les mécanismes physiopathologiques présents dans un organisme vivant, limitant leur pertinence pour cette étude spécifique. Dans ce cadre, la souris constitue un modèle privilégié pour l’analyse des traitements en onco-hématologie, permettant de modéliser les interactions complexes entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement — interactions impossibles à étudier de manière aussi complète avec des cultures cellulaires seules. De plus, les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend particulièrement adaptées pour tester et valider de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux sera ajusté en fonction des besoins expérimentaux, en s’appuyant sur des calculs préalables permettant d’optimiser la taille des groupes. Les expériences d’induction de la leucémie seront réalisées avec des groupes de 5 animaux, répétées 2, 3 ou 4 fois selon les résultats obtenus. Si la première série montre des résultats significatifs, les autres ne seront pas effectuées. Sinon, nous poursuivrons avec la deuxième série, et ainsi de suite, jusqu’à l’obtention de résultats significatifs, avec un maximum de quatre séries. Cette approche séquentielle permet d’interrompre l’étude dès que des données robustes sont disponibles, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires non nécessaires. Ainsi, la conception expérimentale suit rigoureusement le principe de Réduction des 3R : le nombre d’animaux est limité à ce qui est strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables, les données sont exploitées au maximum, et toute expérimentation redondante est évitée. Cette stratégie permet de concilier la validité scientifique avec un impact réduit sur les animaux.
Raffinement
Afin de minimiser les perturbations liées aux prélèvements sanguins, aux injections, au phénotype délétère induit et à l'induction de la leucémie, des mesures spécifiques seront mises en œuvre. Les animaux seront étroitement surveillés afin de détecter tout signe de souffrance ou effet secondaire du traitement avant d'atteindre le seuil de mortalité. Les méthodes suivantes seront utilisées : Suivi du phénotype délétère : Les souris sont immunodéprimées et donc gardées dans des cages individuelles ventilées pour éviter les infections. Induction de la leucémie : Les animaux seront surveillés quotidiennement et toute détérioration de leur état sera immédiatement évaluée. Si des signes de douleur ou de détérioration physique apparaissent (critères de douleur : perte de poids, modifications du pelage, comportement, etc.), les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance et analysés directement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’analyse des traitements en onco-hématologie. Modélisation d'interactions complexes : Les souris permettent d'étudier les interactions entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement de manière bien plus fidèle que les cultures cellulaires seules. Évaluation de la réponse thérapeutique : Les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend précieuses pour tester de nouveaux traitements. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines, ce qui correspond à une phase de maturité du système hématopoïétique comparable à celle de l’adolescence, en accord avec le fait que nous étudions un cancer pédiatrique. Comme les deux sexes sont affectés par le sous-type de leucémie étudié, nous utiliserons des souris mâles et femelles
Etudes de maladies cérébrovasculaires héréditaires humaines chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
Une biopsie de queue de dix secondes et moins de trois injections par animal : ce sont les seuls actes déclarés pour 1 098 souris, dont 366 en niveau de souffrance léger et 732 en niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever leur cerveau à différents âges. Ce qu'elles subissent vient d'abord de leur génome, modifié pour reproduire deux formes héréditaires de maladie des petits vaisseaux cérébraux, la mort subite par accident vasculaire cérébral figurant parmi les effets annoncés. Le porteur remplace le tatouage par un poinçon à l'oreille pour limiter ce risque d'accident vasculaire, tout en rangeant la mort subite du côté des caractéristiques du modèle plutôt que des nuisances du projet.
Objectifs
Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont une cause majeure d’accidents vasculaires cérébraux récurrents chez l’homme, et aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Ce projet vise à étudier les lésions cérébrovasculaires dans des modèles souris reproduisant les anomalies génétiques de deux formes héréditaires fréquentes de ces maladies. Des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques seront effectuées sur des cerveaux prélevés à différents âges après la mise à mort des animaux, afin d’examiner l’évolution des lésions aux divers stades de la maladie. Ces études sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour concevoir et évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Santé humaine : Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension et le traitement des maladies des petits vaisseaux cérébraux. À court terme : Valider la pertinence d’un modèle chez la souris pour évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant la protéine humaine mutée responsable de l’une de ces deux maladies. À moyen terme : Mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la seconde maladie afin de développer des approches thérapeutiques adaptées.
Procédures
Biopsie de queue, une fois, 10 seconde. Injections intrapéritonéales ou sous cutanées, moins de 3/animal, 10 secondes.
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors de la biopsie de queue. Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors des injections intrapéritonéales ou sous cutanées. Mort subite de l’animal en lien avec la survenue possible d’accidents vasculaires cérébraux dans le modèle chez la souris de l’une des deux maladies.
Devenir
Les animaux des lots expérimentaux et de génotype d'intérêt sont mis à mort afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, un modèle in vitro ou computationnel ne peut pas être substitué au modèle animal
Réduction
Les âges auxquels les animaux seront analysés ainsi que la taille des échantillons ont été déterminés en se basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes. Ainsi il ressort que 15 animaux/ groupe seront nécessaires pour les études histologiques ou biochimiques ; 12 à 24 animaux/ groupe seront nécessaires pour les analyses moléculaires sur cellules uniques selon l’âge étudié. Des tests statistiques adaptés aux types de comparaison intergroupes seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Pour minimiser le risque d’accident vasculaire cérébral chez les souris mutées mimant une des 2 maladies, les souris sont identifiées par poinçon à l’oreille et non par tatouage/biopsie de queue. Une grille de score et une liste de points limites ont été établis. Les différents actes réalisés chez la souris sont réalisés par des expérimentateurs chevronnés. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nouveaux nés de 1 et 7 jours, prépubères, jeunes adultes et adultes de 2 mois à 9 mois pour étudier les différents stades de la maladie
Évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique de composés anti-infectieux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 210
Chercher la dose la plus forte qu'un animal peut recevoir avant que la toxicité devienne sévère : 760 souris et 210 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever organes et fluides. 45 études sont prévues sur cinq ans. Les animaux subissent des injections, un cathétérisme urétral qui peut enflammer la vessie, des administrations intranasales et des prélèvements sanguins répétés, avec pour effets annoncés une posture voûtée, un poil hérissé, des diarrhées, une gêne respiratoire et des hématomes. Le porteur présente le projet comme un moyen d'accélérer le développement de traitements contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et les délais des programmes de recherche et développement.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer la concentration maximale tolérée et à caractériser les profils pharmacocinétiques de nouvelles molécules anti-infectieuses chez la souris et le rat. L’objectif principal de l’étude est de déterminer la dose la plus élevée d’un composé pouvant être administré sans provoquer d’effets toxiques sévères chez les animaux, et ce, selon une voie d’administration donnée. Cette étape est essentielle pour évaluer la tolérance aiguë ou subaiguë d’un composé chez l’animal. Les traitements évalués incluent des antibiotiques, des antifongiques, des antiviraux, ainsi que des biothérapies innovantes comme les anticorps. Des observations cliniques et des analyses biologiques permettront d’évaluer les éventuels signes de toxicité ou d’effets secondaires. Les études de pharmacocinétique visent à déterminer comment un composé anti-infectieux est absorbé, distribué, métabolisé et éliminé dans l’organisme. Elle permet de mesurer l’exposition systémique après administration, notamment dans les tissus ciblés. Ces données servent à optimiser la posologie et à établir la relation entre la concentration et l’efficacité. Elle est essentielle pour prédire les conditions dans lesquelles le traitement sera le plus efficace. 45 études sont prévues pour la totalité du projet de 5 ans
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de sélectionner les doses maximales tolérées et les schémas d’administration optimaux des candidats thérapeutiques, afin de sécuriser leur usage dans les modèles infectieux. La concentration maximale tolérée constitue une étape fondatrice de la caractérisation préclinique ; elle assure à la fois la sécurité des animaux, la pertinence des doses testées, et la robustesse des données biologiques qui en découleront. Ce projet génèrera également des données de pharmacocinétiques robustes permettant de modéliser précisément la relation dose-exposition-efficacité. Ces informations orienteront le choix des molécules à prioriser et réduiront le recours inutile à des expérimentations ultérieures inefficaces. À moyen terme, les résultats obtenus renforceront la prédictibilité des études précliniques et amélioreront la transposabilité des données vers l’Homme ou l’animal. Cela contribuera à accélérer le développement de traitements innovants contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et délais des programmes de recherche et développement.
Procédures
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections et les douleurs liés au traitement. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). L'administration par voie urétrale nécessite l'installation d’un cathéter et peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cadre des études de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, les composés anti-infectieux testés peuvent induire certains effets indésirables transitoires chez la souris et le rat. Des réactions légères sont attendues, telles qu'une diminution temporaire de l’activité, une perte de poids modérée ou une légère réaction inflammatoire au point d’injection. En fonction des doses et de la voie d’administration, des signes de toxicité plus marqués peuvent apparaître, comme un poil hérissé, une posture voûtée, une réduction de la mobilité, ou une altération de la respiration. Des troubles digestifs (comme une diarrhée), une irritation locale ou des complications liées aux prélèvements sanguins (hématome, saignement) peuvent également survenir. Tous les animaux seront suivis au moins quotidiennement, et en cas de signes cliniques sévères, des soins adaptés seront appliqués par le responsable du projet (sur avis du vétérinaire).
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers.
Remplacement
Plusieurs approches alternatives sont utilisées en amont pour limiter le recours à l’expérimentation animale pour l'évaluation des effets secondaires ou de la biodistribution. Les tests ex vivo, comme les coupes de poumon ou les explants intestinaux, permettent de tester localement des anticorps monoclonaux ou des peptides antimicrobiens, mais ne reflètent pas les effets systémiques, ni la diffusion du traitement. Les organoïdes intestinaux ou pulmonaires humains, ou les organes sur puce permettent d’étudier les effets localisés d’un traitement, mais ne modélisent pas la pharmacocinétique, la biodistribution ou l’immunité adaptative. Les modélisations informatiques, comme les simulations de liaison médicament-récepteur, ou les réseaux d’interactions immunitaires, sont utilisées pour affiner les posologies ou prédire des toxicités, mais nécessitent toujours une validation expérimentale. Seule l’expérimentation animale permet d’intégrer la complexité de la réponse immunitaire, de la clairance, de la toxicité systémique et de l’efficacité dans un organisme complet. Ces approches non animales sont néanmoins systématiquement mobilisées en phase précoce pour sélectionner les meilleurs candidats et optimiser les doses.
Réduction
Nous utilisons systématiquement des tests alternatifs comme le test de viabilité cellulaire, l’essai de cytotoxicité, l’analyse de paramètres inflammatoires, ou encore des modèles d’organoïdes humains pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant toute phase expérimentale chez l'animal. Des modèles d'explant de poumon et de peau humaine reconstituée sont également utilisés pour évaluer la diffusion et l’irritation locale des produits candidats. Grâce à cette combinaison d’approches, nous réduisons significativement le nombre d’animaux utilisés tout en sécurisant la progression des thérapies testées.
Raffinement
Dans les études pharmacocinétiques, le raffinement repose sur des prélèvements sanguins peu invasifs (comme le micro-échantillonnage) et la réduction du stress par contention douce et habituation des animaux. L'utilisation de plans expérimentaux optimisés et de modèles bio-informatique permettent de raffiner nos protocoles. Le choix judicieux des temps de prélèvement et l'exploration de matrices alternatives (urine, salive) réduisent les interventions tout en assurant la qualité des données. Pour la détermination de la dose maximale tolérée, des protocoles adaptatifs avec escalade progressive des doses permettent de mieux contrôler l’apparition de toxicités. Des grilles d’évaluation clinique précises assurent l’arrêt rapide du traitement en cas de signes de souffrance. L’inclusion de biomarqueurs précoces permet d’anticiper les effets délétères avant qu’ils ne deviennent irréversibles. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. Par exemple, l’apparition de signes cliniques graves tels qu'une respiration difficile, ou une perte de réponse à un stimulus conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqûre...).
Choix des espèces
L’utilisation de la souris et du rat pour les procédures de détermination de la dose maximale tolérée et d’études pharmacocinétiques repose sur des considérations scientifiques, réglementaires et techniques. D’une part, la souris est l’espèce de référence en infectiologie préclinique, en raison de sa petite taille, de sa sensibilité bien documentée à de nombreux agents infectieux, et de la disponibilité de lignées standardisées. Elle permet une évaluation rapide de la tolérance aiguë d’un composé et de ses premiers paramètres pharmacocinétiques dans un modèle robuste, avec un nombre limité d’animaux et un faible volume de substance requis. D’autre part, le rat est utilisé en complément ou en seconde intention, car il permet des prélèvements sanguins en série plus volumineux, offrant une meilleure résolution temporelle dans l’analyse pharmacocinétique, et il est plus adapté à certaines voies d’administration. La complémentarité entre ces deux espèces permet donc d’obtenir des données fiables et conformes aux exigences des agences réglementaires. Dans le cadre des procédures de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, seuls des animaux adultes sexuellement matures ou jeunes adultes seront utilisés. Il s’agit d’un choix visant à garantir une réponse pharmacologique homogène, une tolérance physiologique suffisante, et une réduction des variables liées au développement ou au vieillissement. Chez la souris, les animaux seront âgés de 6 à 10 semaines, un stade où la croissance est stabilisée, la physiologie métabolique est mature, et le volume des fluides corporels est adapté aux manipulations et aux prélèvements sans risque excessif. Chez le rat, les animaux seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel les volumes sanguins autorisent des prélèvements sériels et où les capacités d’absorption, de métabolisme et d’élimination sont représentatives de l’âge adulte.
Evaluation de la neurovirulence de candidats vaccins virus vivants atténués issus de souches virales neurotropiques
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour vérifier qu'un procédé de fabrication n'a pas rendu un vaccin contre la fièvre jaune plus virulent, 4 000 souris de quatre semaines reçoivent une injection directement dans le cerveau, sous anesthésie gazeuse de cinq minutes, puis sont observées trois semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour un examen histologique de leurs organes. Le porteur attend comme effets des signes de neurovirulence, paralysie et incapacité à se déplacer et à se nourrir, et écarte l'analgésie au motif qu'elle ajouterait une piqûre ou fausserait l'inflammation observée. Il cite une méthode in vitro publiée, "BBB-Minibrain", qu'il juge trop variable, et conclut que le test sur des animaux non-humains reste exigé par les lignes directrices de l'OMS pour libérer les lots.
Objectifs
Afin de répondre aux exigences de la réglementation, la neurovirulence de nouveaux vaccins en développement qui ont un tropisme pour le système nerveux central doit être comparée avec un vaccin de référence pour assurer et documenter le maintien de l’atténuation au cours de la multiplication virale lors du processus de fabrication. Le vaccin contre la fièvre jaune est un vaccin vivant atténué ayant un tropisme pour le système nerveux. Le caractère vivant atténué de ce vaccin implique un risque potentiel, lors du processus de fabrication, de réversion vers un phénotype plus virulent. Administré chez l’homme, un vaccin avec une virulence excessive pourrait entrainer des signes adverses graves tels qu’une encéphalite et une paralysie des nerfs crâniens. La réglementation demande donc que la stabilité du vaccin au cours du processus de fabrication soit évaluée en amont afin de garantir la sécurité des personnes qui recevront une injection vaccinale. Le projet vise donc à administrer des dilutions de vaccin contre la fièvre jaune à des souris, hébergées pendant une durée adaptée pour observer l’apparition éventuelle de symptômes cliniques neurologiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : Valider le processus de fabrication de vaccins contre la fièvre jaune Contribuer in fine au développement de vaccins sûrs pour l’Homme et conformes aux spécifications et aux textes de référence en vigueur
Procédures
Administration unique de moins d’une minute sous anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes, pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Signes cliniques caractéristiques de la neurovirulence du virus étudié (paralysie, incapacité à se déplacer et à se nourrir…). Effets secondaires transitoires liés à l’anesthésie (étourdissement et perte d'équilibre brefs suite à l’anesthésie).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes et faire une évaluation histologique.
Remplacement
A ce jour, Il existe une méthode in vitro « BBB-Minibrain », décrite mais cette approche repose sur l’utilisation de cellules primaires nécessitant plusieurs jours de différenciation. À l’issue de ce processus, il a été observé une forte variabilité, ce qui limite considérablement la fiabilité de la méthode. Ainsi, même si un développement a été réalisé et publié, cette méthode ne permet pas une comparaison robuste et reproductible des vaccins à tester selon les exigences règlementaires des lignes directrices. Dans ce projet, l’évaluation de la neurovirulence se fait en évaluant les signes cliniques et les points limites, dans l’engagement à respecter les exigences réglementaires et à garantir la qualité et la sécurité du vaccin requis par les lignes directrices en vigueur (WHO TRS872 annexe 2, Appendix 3). Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par la ligne directrice. Il n'existe pas des méthodes in vitro validés et acceptés par les autorités pour évaluer la sécurité de lots de vaccin de la fièvre jaune obtenus par culture sur œuf.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés au total est calculé au plus juste de façon à répondre aux exigences réglementaires afin d’obtenir des résultats robustes et exploitables.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, bâtonnet et matériel de nidification) et dans des conditions environnementales appropriées pour cette espèce. L’injection intracérébrale par voie transcutanée consiste en une simple injection avec une aiguille de 27G très rapide (30 secondes), sans résistance, sans chirurgie (pas d’incision) ni utilisation de cadre stéréotaxique, sur un animal sous anesthésie (moins de 5 minutes) à des concentrations d'Isoflurane assurant l’inconscience de l’animal et donc l’absence de douleur ressentie pendant l’injection. La voie d’injection utilisée n’induit pas plus de douleur qu’une injection intrapéritonéale et moins qu’une injection intraveineuse ou intramusculaire et l’administration d’un analgésique (par exemple la lidocaïne pour éviter tout biais sur l’inflammation attendue) n’est pas pertinente car cela nécessiterait la réalisation d’une deuxième injection avant l’anesthésie donc une douleur et un stress pour l’animal (analgésique systémique) ou alors allongerait la durée de la procédure (analgésique local). L’administration d’un anti-inflammatoire n’est pas nécessaire et interfèrerait avec l’objectif de l’étude (évaluation de la neurovirulence). L’observation clinique des animaux témoins immédiatement après l’injection et lors du retour dans la cage après le réveil dans des études réalisées précédemment n’a pas montré de signes de douleur visible (absence de piloérection, prostration, abattement, posture voutée...). De plus le protocole d’étude doit être 100% comparable aux études antérieures pour ne pas apporter de biais dans les comparaisons de résultats. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués : En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire y compris l'euthanasie. En cas de de signes cliniques entrainant des difficultés pour accéder à la nourriture, des gels hydratants avec ou sans aliments pourront être rajoutés dans les cages des animaux afin qu'ils puissent se nourrir plus facilement, ainsi que des croquettes à même la litière.
Choix des espèces
L'espèce murine est largement décrite dans la littérature pour l'évaluation de la neurovirulence de virus neurotropiques. Les souris seront âgées de 4 semaines au moment de l’injection et seront observées pendant 3 semaines, tel que préconisé dans les lignes directrices.
Effet d’un médicament anti-épileptique sur un modèle de crise épileptique chez la souris – pharmacodynamique et effets en association avec un autre médicament anti-épileptique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un son intense déclenche chez ces souris une crise d'épilepsie réflexe souvent suivie de la mort, et c'est cette mort que le projet mesure. 676 souris issues d'une sélection génétique pour leur sensibilité aux crises audiogènes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 638 recevant une injection d'antiépileptique avant une stimulation sonore de soixante secondes au plus, 38 la stimulation seule, celles qui survivent étant mises à mort ensuite. Un laboratoire pharmaceutique cherche à savoir si son médicament, déjà autorisé, protège de la mort subite qui suit une crise, seul ou associé à un autre. Le porteur annonce comme nuisances un stress sonore et la douleur d'une piqûre, et écrit que la convulsion "n'engendre pas de souffrance intrinsèquement", tout en retenant la létalité comme critère de mesure.
Objectifs
Le risque de mort subite chez un patient épileptique (SUDEP) est en moyenne trois fois plus élevé que dans la population saine. Aujourd'hui, on n'en connait pas la raison et beaucoup d'énergie est déployée pour mieux comprendre ce phénomène, chez l'Homme comme chez l'animal. Il existe un modèle de SUDEP chez la souris qui correspond à la présentation d'un son intense qui va déclencher une crise réflexe souvent suivie de la mort. Le bénéfice de ce modèle repose sur le fait qu'il n'est pas invasif et qu'il ne repose pas sur une stimulation électrique ou chimique. Un laboratoire pharmaceutique a développé un médicament ayant reçu une AMM (autorisation de mise sur le marché) dans le cas des formes d'épilepsie à haut risque de décès. Ce laboratoire cherche à savoir si ce médicament, au-delà de ses effets pour empêcher les crises d'épilepsie, pourrait s'avérer être aussi capable d'éviter un décès en cas de crise d'épilepsie. Le laboratoire cherche aussi à savoir si ce médicament, associé à un autre médicament ayant aussi une AMM, pourrait apporter un gain d'efficacité supplémentaire pour éviter les décès. Ce projet vise à répondre à ces questions sur un modèle souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'envisager l'emploi de médicaments anti-crises pour les patients épileptiques pour réduire le risque de mort subite qui peut succéder une crise d'épilepsie.
Procédures
638 souris aurons une injection (3 sec) et une stimulation auditive de 60 sec maximum. 38 souris aurons une stimulation auditive de 60 sec maximum.
Impact sur les animaux
Nous attendons deux types de nuisances : 1/ un stress induit par l'application d'un stimulus sonore intense et 2/ une douleur légère liée à la l'acte de la piqûre.
Devenir
Les animaux ne présentant pas de létalité après le test seront mis à mort. Ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude du fait qu'ils auront été sujets à une injection d'un médicament anti-crise.
Remplacement
Les crises d’épilepsie impliquent un grand nombre de modifications biologiques intégrées. L’animal ne peut pas être remplacé pour la compréhension de ces mécanismes biologiques intégrés.
Réduction
Notre modèle souris que nous emploierons dans ce projet, est issu d'une sélection génétique. Sa réponse optimale au test à la crise audiogène permet de réduire en moyenne par 3 le nombre de souris nécessaires si nous avions établi un protocole avec des lignées de souris classiques.
Raffinement
Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser toute souffrance des animaux. Ceci se traduit par une durée limitée du stress auditif (max 60 sec), une utilisation d'une cuve circulaire pour éviter les angles dans lesquels la souris pourrait se cogner. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle- même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas et qu'elle n'engendre pas de souffrance intrinsèquement. Néanmoins, si une souris présentait une convulsion qui ne s'arrêtait pas (status epilepticus), considérable comme un point limite, nous euthanasierons instantanément la souris par une dislocation cervicale et elle serait exclue du protocole. Cet événement ne nous est cependant jamais arrivé.
Choix des espèces
Seule la souris présente des crises audiogènes létales. Les animaux ne seront testés qu'une seule fois à l'âge de 33±3 jours ; ce qui correspond à un âge jeune de la souris (elle devient adulte à 8-10 semaines) et au pic de la sensibilité à la crise audiogène.
Caractérisation de souris exprimant un facteur de la coagulation muté
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une biopsie de l'oreille d'une à deux secondes pour le génotypage, une piqûre pour endormir, puis une procédure de trente à quarante-cinq minutes dont elles ne se réveilleront pas : 460 souris vont être utilisées dans des procédures classées sans réveil ou légères. Le projet porte sur l'interaction entre les plaquettes sanguines et un facteur de la coagulation muté, dans la perspective de mieux caractériser des patients atteints d'une maladie hémorragique. Le porteur affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test adapté n'éviterait aujourd'hui le recours aux animaux non-humains. Il justifie la mise à mort sans réveil par le volume de sang à prélever, trop important pour que l'animal survive, et par des tests in vivo trop invasifs ou trop hémorragiques.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Il est important de bien comprendre comment ces facteurs de la coagulation interagissent avec d'autres protéines pour remplir leur fonction. Dans ce projet, nous allons étudier l'interaction d'un facteur de la coagulation avec les plaquettes sanguines qui sont des cellules vitales dans l'arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
A court-terme, cette étude va nous aider à comprendre le rôle de l'interaction entre les plaquettes sanguines et le facteur de la coagulation étudié dans l'arrêt du saignement et dans les processus de thrombose. A plus long terme, ce projet permettra de mieux caractériser certains patients souffrant d'une maladie hémorragique due à un dysfonctionnement du facteur de la coagulation étudié.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises aux gestes suivants: 1) 1 biopsie au niveau de l'oreille. Ce geste prend 1-2 secondes 2) 1 piqûre pour induire une anesthésie générale. Cette piqûre se fait en une seconde. Tous les autres gestes se feront sous anesthésie générale et à la fin de chaque procédure d'une durée allant de 30 à 45 minutes, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience.
Impact sur les animaux
Lors du génotypage, un stress peut être généré lors de la contention des animaux afin de réaliser génotypage. Lors de la biopsie pour le génotypage une douleur transitoire peut intervenir.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés. En effet, pour les tests ex vivo, les prélèvements sanguins nécessaires sont d'un volume trop important pour que l'animal puisse rester en vie. En ce qui concerne les tests in vivo, ceux-ci sont soit trop invasifs soit accompagnés d'une perte sanguine trop importante, justifiant leur classification "sans réveil".
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Une partie des tests sera fait sur du sang prélevé chez les souris d'intérêt. Ces tests in vitro nécessitent moins d'animaux car ils sont plus reproductibles que les tests in vivo. D'autre part, nous avons au fil des années acquis une expérience importante sur le type de tests qui seront mis en oeuvre dans ce projet. Nous pouvons donc anticiper avec une certaine confiance le nombre minimum d'animaux qui sera nécessaire à l'obtention de résultats interprétables et robustes d'un point de vue statistique. Si les résultats des premières expériences s'avèrent encore plus discriminants que nous avions anticipé, alors nous n'utiliserons pas toutes les souris prévues et nous arrêterons les expériences plus prématurément qu'anticipé.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés régulièrement afin de s'assurer de leur bien-être. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure expérimentale. Les souris sont anesthésiées pendant l'intégralité des procédures expérimentales et analgésiées pour certaines procédures.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Des souris âgées entre 8 semaines et 1 an seront utilisées pour le projet
Evaluation sur rongeurs de l’immunogénicité d’un vaccin anti-clostridien
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Tués à quarante-deux jours pour un unique prélèvement de sang, 420 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit deux injections vaccinales de 5 mL réparties sur deux sites, à trois semaines d'intervalle, puis une anesthésie profonde suivie du prélèvement terminal. L'objet est réglementaire : vérifier tous les trois mois puis tous les six mois l'activité d'un vaccin antibotulinique déjà commercialisé, sur ses deux formats de flacon, pour renouveler son autorisation de mise sur le marché au Brésil. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu, que la réglementation impose un pool de sérum de dix animaux par lot et par temps de stabilité, et que le cobaye est "imposé par les autorités nationales brésiliennes".
Objectifs
Cette demande concerne le renouvellement quinquennal de l'Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) au Brésil pour un vaccin antibotulinique (types C et D). L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la performance du vaccin tout au long de sa durée de vie afin d’assurer ce renouvellement d’AMM. Le projet prévoit une vérification trimestrielle de l'activité du vaccin sur cobayes pendant la première année, puis une vérification semestrielle au cours de la deuxième année, et ce, sur toute la durée de stabilité du produit. Étant donné que le vaccin est disponible en deux volumes de flacons différents (formes commerciales), chaque série de tests sera effectuée sur les deux tailles pour assurer une évaluation complète.
Bénéfices attendus
Garantir l’efficacité du vaccin anti-clostridien et permettre ainsi sa commercialisation selon les exigences réglementaires en application au Brésil. Au Brésil, le même produit est commercialisé sous deux formats différents. La vaccination des vaches mères est essentielle pour protéger les veaux contre les diarrhées néonatales, surtout face à l'antibiorésistance et à la demande de pratiques d'élevage plus respectueuses. La vaccination permettrait de contribuer aux actions de prévention.
Procédures
Les animaux seront vaccinés deux fois à 21 jours d’intervalle (J0 et J21). La durée de chaque vaccination est estimée à 30 secondes au maximum par animal. Un protocole anesthésique profond (une ou deux injections selon le protocole, d’une durée de 1 à 3 secondes) avec analgésie est mis en place à J42, ensuite le même jour, un unique prélèvement sanguin d’une durée maximale de 2 min est effectué en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux. A J0, Vaccination, les animaux pourraient ressentir un léger stress lors de la contention nécessaire à l’injection. Une légère douleur sera ressentie par les animaux lors de l’introduction de l’aiguille. Afin de pallier cela, l’ensemble de cette intervention est réalisée par du personnel qualifié et formé, elle dure généralement moins de 2 minutes par animal. Il n’est pas attendu de réaction locale, ni de réaction systémique de la part des cobayes suite à l’administration du vaccin. A l’injection du vaccin, un volume total de 5 ml est requis par les autorités, il sera alors réparti en deux sites d’injection, soit 2x 2,5ml à chaque vaccination. Ceci pourrait causer une gêne pour l’animal. Cette gêne est passagère et durera quelques minutes. A J21 : Vaccination de rappel, les nuisances sont identiques à ceux de J0 A J42 : Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie, les nuisances engendrées seront donc une gêne à la contention, un stress (30 secondes) au moment de l’injection d'un anesthésiant. L’ensemble de cette intervention sera réalisée par du personnel qualifié et durera environ 2 à 3 minutes par animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure afin d’assurer un prélèvement sanguin suffisant pour les analyses
Remplacement
La procédure est celle requise par les autorités nationales brésiliennes et les données sont requises afin de statuer sur la libération des vaccins. Il n’existe pas de référence règlementaire, à présenter comme alternative.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser est déterminé conformément aux exigences réglementaires. La réglementation exige un pool de sérum correspondant à 10 animaux. Il doit répondre aux exigences suivantes: - chaque lot de vaccin doit être testé - Pour chaque lot , 7 temps de stabilité sont contrôlés, à savoir: 0, 3, 6, 9, 12, 18, et 24 mois de stabilité du vaccin - Pour chaque vaccin, chaque format commercialisé du produit doit être testé.
Raffinement
Toute anomalie sur les installations est directement remontée à un poste de garde permettant une intervention rapide y compris les weekends. Les animaux sont observés quotidiennement et des passages supplémentaires sont organisés si des signes préoccupants sont observés sur les animaux. Des points limites précis et spécifiques sont mis en place pour cette procédure. Préalablement au prélèvement sanguin terminal les animaux sont soumis à une anesthésie générale profonde associée à une analgésie. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance continue de leur environnement (température, humidité) et de leur santé (observation quotidienne). Une intervention 24h/24 est prévue en cas de problème technique. Pour éviter toute souffrance aux animaux, le prélèvement sanguin en fin d’étude est réalisé sous anesthésie générale profonde avec analgésie et des points limites précis et spécifiques sont mis en place.
Choix des espèces
Le cobaye est imposé par les autorités nationales brésiliennes. Des animaux adultes sont nécessaires car leur système immunitaire doit être mature.
[MODIFICATION] Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Les rats utilisés appartiennent à une lignée dont le système immunitaire est altéré et dont la rétine dégénère, choisie pour que la greffe de cellules humaines ne soit pas rejetée sans recourir à des traitements antirejet. 325 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit une chirurgie de quinze à vingt minutes pour recevoir dans l'espace sous-rétinien des photorécepteurs dérivés de cellules souches humaines, puis jusqu'à six séances mensuelles d'imagerie et d'électrorétinogramme sous anesthésie générale, un électrorétinogramme durant environ trente minutes. Tous sont tués en fin de procédure pour examiner la rétine et vérifier la survie des cellules greffées, le porteur affirmant par ailleurs qu'une injection dans le second œil reste sans impact parce que la rétine ne possède pas de récepteurs de la douleur.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendues artificiellement sensibles à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle. L’ajout d’une injection intraoculaire chez les animaux nécessite une modification du projet initial sans ajout d’animaux.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire développées ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’obtenir un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d'édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection de cellules (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et est réalisée une seule fois. l'anesthésie s'accompagne d'un traitement analgésique délivré avant le début de l'acte et en post-opératoire. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). [MODIFICATION] Une injection d’un indicateur d’activité cellulaire est réalisé sous anesthésie/analgésie. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure par des méthodes règlementaires pour des explorations post-mortem.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire et un risque accru d’infection en raison de l’immunité réduite. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. L’animal étant déjà anesthésié pour la procédure chirurgicale, par conséquent il n’y aura pas d’impact significativement négatif sur le fait de pratiquer une injection intra-oculaire dans chaque œil. La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur et, par conséquent, une injection dans l’œil contralatéral n'aura pas d'impact significatif sur la santé globale de l'animal. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal. La capacité des cellules transplantées à répondre de manière intrinsèque à la lumière est entièrement évaluée et validée en amont par des approches in vitro permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans les deux yeux. Par ailleurs, la majorité des actes peut être réalisée sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 325 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importante des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à environ un quart des expérimentations (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux d’évaluation de la fonction visuelle, qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Les deux gestes chirurgicaux, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires. En raison du caractère immunodéficient des animaux, ces derniers sont hébergés dans des cages stérilisées et dans un portoir ventilé distinct avec étiquetage spécifique. Les manipulateurs changent de gants entre chaque animal lors du change ou des différents examens/gestes.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Production de réactifs et de tissus issus d’animaux de ferme, dans le cadre de la production et du contrôle qualité des vaccins commercialisés ou en développement.
- Production de routine
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Moutons : 60
Poules : 1500
Dindes : 50
Autres oiseaux : 30
Saignés pour produire les géloses et les réactifs qu'un laboratoire pharmaceutique utilise pour fabriquer et contrôler ses vaccins, 60 moutons, 4 chevaux, 50 dindes, 30 oies et 1 500 poules vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil ou légères. Un mouton donne une poche de 500 mL, un cheval une à deux poches de 200 mL cinq à six fois par an, une oie ou une dinde 40 mL toutes les quatre semaines. Chaque poule, elle, est ponctionnée au cœur sous anesthésie générale et tuée sans reprendre conscience. Le porteur indique que la demande en sang de cheval est tombée de 400 poches par an à une vingtaine grâce à un procédé de substitution, affirme que le choix des espèces est "historique", et annonce que les 144 animaux non tués seront proposés à l'adoption après évaluation vétérinaire.
Objectifs
La production de vaccins bactériens nécessite la culture de bactéries sur des géloses au sang. L’emploi de ce sang est décrit dans les dossiers d’AMM. Le contrôle de vaccins nécessite l’emploi de réactifs obtenus à partir de sang d’animaux. Les réactifs obtenus sont : - des globules rouges (servant pour des tests d’hémagglutination) - du sang total sur anticoagulant pour le coulage de géloses au sang. La direction de Sanofi Pasteur a décidé de la nécessité de poursuivre les investigations scientifiques et les essais de développement. Ces études de recherche et développement de vaccins nécessitent également l’obtention de sang ou de ses dérivés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices escomptés résident dans la mise sur le marché de vaccins destinés à prévenir un large éventail de pathologies chez l’homme.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins. Un mouton peut produire une poche de sang de 500 mL, le prélèvement dure 5 minutes environ. Il peut être prélevé au moins 4 semaines après ce prélèvement. Un cheval peut produire jusqu’à 10 poches de 200 mL selon les besoins, mais dans les faits, il n’est prélevé que pour une à 2 poches de 200 mL, 5 à 6 fois dans l’année. Le prélèvement dure 3 minutes environ. Une oie ou une dinde peut donner environ 40 mL de sang toutes les 4 semaines. Le prélèvement dure 1 mn. Enfin, une poule donne 40 mL de sang, sous anesthésie générale, par voie intracardiaque et est ensuite euthanasiée.
Impact sur les animaux
Pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Les gestes techniques sont simples et maitrisés par un personnel qualifié et expérimenté. Pour l’animal, la nuisance équivaut à la pénétration d’une aiguille. La contention adaptée des animaux réduit considérablement le temps et le stress de la manipulation. Elle permet un geste précis et réduit considérablement les risques d’échec des ponctions veineuses.
Devenir
A l’issu d’un test, les animaux seront proposés à l’adoption. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision. Ce n’est toutefois pas le cas des poules qui sont euthanasiées suite à la ponction cardiaque sous anesthésie générale
Remplacement
Lorsque la science le permet, la société utilise des réactifs « animal-free ». La société travaille activement sur des réactifs alternatifs sans produit d’origine animale. C’est le cas par exemple de la production d’Haemophilus qui jusque-là nécessitait l’emploi de sang défibriné de cheval lors de la confection des géloses au sang. La société a mis au point un nouveau procédé qui permet de substituer ce sang. La demande en sang de cheval a considérablement diminué (passant de 400 poches/an à une vingtaine aujourd’hui) couvrant uniquement des besoins spécifiques en développement. Pour autant, il existe encore des procédés ou des contrôles qui nécessitent le recours au sang animal.
Réduction
Le nombre d’animaux donneurs est calculé en fonction des besoins estimés. Les besoins des utilisateurs sont variables et dépendants de la production des vaccins, que ce soit pour la fourniture de gélose ou pour la fourniture de réactif pour les tests de contrôle qualité ou de R&D et amélioration continue. De ce fait, un effectif minimal est nécessaire pour assurer les besoins.
Raffinement
Les protocoles de prélèvement de sang sur animaux vigiles sont classés en léger. Le stress durant l’hébergement est limité par l’hébergement en groupe des animaux et l’enrichissement de leur environnement. Les protocoles de prélèvements terminaux sont classés « sans réveil ». La souffrance est réduite par le recours à l’anesthésie. Les animaux sont systématiquement prélevés dans des installations séparées des zones d’hébergement.
Choix des espèces
Le choix des espèces est historique. Le choix de l’animal est lié à l’acquisition de données par le passé. Par exemple : Certaines bactéries se développent mieux dans du sang de mouton que dans du sang de cheval, d’où le choix de l’espèce ovine. Certains tests de contrôle qualité (par hémagglutination) ne fonctionnent qu’avec des globules rouges d’oie, de dinde ou de poules adultes. Les volailles représentent des espèces de choix concernant les tests d’hemagglutination. Le choix de l’espèce des volailles dépend du type de tests réalisés. Les gros animaux ont été retenus en priorité pour les volumes importants de prélèvements qu’ils permettent. (Chevaux, moutons). Les procédés de production et de contrôle sont déposés dans les dossiers d’enregistrement. Les animaux sont adultes. Ils sont nécessaires afin de recueillir leurs globules rouges, utilisés dans un test d’hémagglutination très spécifique.
Analyse de la réponse immunitaire, de la protection contre l’infection et de la stabilité d’un candidat vaccin universel antigrippal dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent deux vaccinations intramusculaires dans les pattes sous anesthésie, à vingt et un jours d'intervalle, et 37,5 % d'entre elles sont infectées par le virus de la grippe par inhalation sous anesthésie profonde, puis pesées chaque jour pendant quatorze jours. Le porteur indique que la dose élevée de virus peut provoquer une perte de poids marquée et des signes cliniques, et que les animaux sont mis à mort soit à l'atteinte d'un point limite, soit en fin d'étude pour les prélèvements. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiologie d'un "organisme entier" et que le recours à la souris est "nécessaire" pour satisfaire les exigences réglementaires.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aigue, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux circulant dans le monde. Elle provoque chaque année environ 1 milliard de cas, 3 à 5 millions de cas graves (infections respiratoires entraînant des hospitalisations), et entre 300 000 et 650 000 décès particulièrement chez les individus vulnérables (personnes âgées, les enfants et immunodéprimés). Les souches responsables de la grippe, principalement de type A ou de type B, peuvent coexister sur une saison, ce qui rend le taux d’incidence annuel imprévisible. La vaccination reste à ce jour la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle agit en induisant des réponses immunitaires contre la souche virale circulante, ciblant les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins présentent une efficacité limitée : ~32 % pour les personnes âgées et ~43% pour les personnes adultes. Cette efficacité réduite s’explique en partie par les mutations très fréquentes, diminuant la correspondance entre le vaccin en cours et la souche circulante. D’autre part, le virus de la grippe renferme une protéine interne, hautement conservée entre les différentes souches virales. Cette caractéristique fait d’elle une cible pertinente pour de nouveaux vaccins universels capables d’induire des protections plus durables et plus efficace, notamment en cas de pandémies. L’objectif est de renforcer l’efficacité en testant de nouveaux candidats, ciblant la protéine interne, chez la souris. Cela se fait via deux axes principaux : élargir la couverture vaccinale en ciblant simultanément les souches A et B, et renforcer la réponse immunitaire grâce à l’ajout d’un adjuvant. Le second axe vise à étudier si une réponse immunitaire préexistante, induite par des expositions antérieures aux virus grippaux, peut améliorer ou modifier la réponse à une vaccination contre la grippe. Ce projet vise ainsi à contribuer à la mise au point d’un vaccin plus performant et mieux adapté aux défis épidémiologiques posés par la grippe.
Bénéfices attendus
Contrairement aux protéines de surface du virus de la grippe qui mutent souvent, la protéine interne, située à l'intérieur du virus, est beaucoup plus conservée entre les différentes souches de grippe. Cette faible variabilité fait d’elle une cible intéressante pour le développement de vaccins à large spectre, pouvant offrir une protection universelle contre diverses souches grippales contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre d'autres sous types de la maladie actuellement présents chez les espèces aviaires, ayant le potentiel de provoquer une nouvelle pandémie. Le bénéfice attendu du projet est donc d’accroître l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et de garantir une préparation optimale en cas de future pandémie grippale. À l’issue de ces recherches, le candidat-vaccin entrera en phase clinique chez l’humain, avec pour objectif de diminuer la mortalité et l’incidence des formes graves de la grippe, apportant un bénéfice majeur à la santé publique.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 vaccinations, réalisées par voie intra musculaire dans les pattes sous anesthésie générale légère. Ces injections sont espacées de 21 jours et chaque injection dure quelques secondes. Au moment de la mise à mort, un prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie générale légère dans 3 procédures sur 4 (81% des animaux). Les infections virales (représentant 37,5% des animaux) sont réalisées par inhalation et sous anesthésie profonde par injection. Cette injection est réalisée en quelques secondes, 1 seule fois par souris. L’infection est réalisée en quelques minutes pour chaque souris, afin de garantir la réussite du geste et la sécurité de l’animal. Les souris infectées seront pesées tous les jours sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Le geste de l'immunisation intramusculaire peut entrainer une douleur locale mais temporaire suite à l’injection. Les formulations utilisées sont à base de solution saline et les volumes injectés limitent fortement les risques de souffrance. L’infection virale par inhalation peut provoquer un stress léger et transitoire. 2 doses de virus seront utilisées en fonction des expériences : - une dose faible à laquelle une légère perte de poids peut être observée dans les quelques jours suivant l’infection, paramètre qui sera surveillé. - une dose élevée pouvant entrainer une perte de poids plus importante avec des signes cliniques (modification du comportement et altération de l’aspect physique. Une surveillance quotidienne rigoureuse sera mise en place pour minimiser la souffrance animale
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mis à mort soit après atteinte d'un point limite défini dans le protocole, soit en fin d'étude pour les prélèvements post mortem nécessaires. Cette approche garantit le respect du bien-être animal tout en se conformant aux exigences réglementaires post-exposition.
Remplacement
La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire dans différents organes de la souris. Aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique. Des études de remplacement sont en cours de développement, mais cela ne permet pas mimer la physiologie d’un organisme entier. L’utilisation de la souris s’avère donc pertinent et est même nécessaire afin de satisfaire les exigences réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est basé sur nos études antérieures et des approches statistiques, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et robustes, permettant de détecter des différences significatives entre les groupes. Au sein d’une même procédure, plusieurs candidats vaccins seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux du groupe contrôle. Le nombre d’animaux estimé correspond au nombre maximum d’animaux pouvant être utilisé dans ce projet. Cependant, durant tout le long du projet, en fonction des résultats obtenus à chaque procédure ou chaque temps points, les nombre d’animaux pourront être réduits et certains temps points supprimés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au minimum durant une semaine avant le début d’une procédure. Dans l’ensemble de nos groupes expérimentaux, un enrichissement de l’environnement est systématiquement mis en place dans les cages des souris afin d’améliorer leur bien-être. Cet enrichissement comprend, par exemple, l'ajout de maisonnettes en carton, de morceaux de bois, ainsi que d'autres éléments favorisant l'expression des comportements naturels des animaux. Ces mesures visent à diminuer le stress et à promouvoir un état émotionnel positif tout au long de l’étude. La vaccination est réalisée dans les pattes de la souris sous anesthésie légère, afin de limiter le stress lié à la préhension et la piqure. Les infections virales par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde. Des surveillances régulières sont assurées après les différentes études de pré-infection ou d’infection. Suivant l’infection, des croquettes et de l’eau pourront être mises à disposition dans la cage pour faciliter leur accessibilité. Une eau gélifié contenant l’équivalent nutritifs des croquettes pourra être utilisé comme substitut et déposé directement dans la cage. Enfin, au moment de l’euthanasie, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie locale (Collyre anesthésique local) et sous anesthésie gazeuse pour minimiser toute sensation de douleur.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques d’autant plus que notre équipe maîtrise les outils et méthodes associés. Le modèle murin est par ailleurs largement documenté dans la littérature, ce qui nous permet de situer et de comparer nos résultats aux données existantes. Cette espèce offre donc tous les critères requis pour atteindre nos objectifs et mettre au point de nouvelles formulations vaccinales contre les infections grippales. Les animaux âgés de 5 semaines seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Nous allons donc utiliser des animaux sevrés de 6 semaines (jusqu’à 12 semaines si besoin). Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non vieillissant.