Procédures légères

500 souris, 500 rats et 125 lapins vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, tous tués pour récupérer organes et fluides et y doser un composé. Les prélèvements sanguins se font au sinus rétro-orbitaire chez la souris, à la veine caudale chez le rat, à la veine marginale de l'oreille chez le lapin, avec des isolements d'une heure par jour en cage individuelle pour récolter urines et fèces. Le projet suit le devenir de molécules dans le corps pour le compte de clients, l'espèce étant choisie selon la demande de ces derniers. Le porteur retient le lapin parce que sa taille permet des prélèvements de plus grand volume, argument de réduction qui repose sur la quantité de matière tirée de chaque individu.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la pharmacocinétique de composés (médicament ou ingrédient). Lors de l’élaboration d’un nouveau médicament, il est indispensable de s’assurer qu’il atteindra correctement sa cible (cellule, tissu), qu’il pourra être correctement utilisé puis éliminé. C’est précisément l’objectif des études de pharmacocinétique : suivre le devenir d’un composé dans l’organisme. Les résultats de ces études permettent d’identifier les éventuelles étapes au cours desquelles le composé rencontre un obstacle l’empêchant de remplir sa mission (absorption, distribution, métabolisme, élimination). C’est sur la base de ces résultats que la formulation, la dose ou le mode d’administration peuvent être ajustés pour optimiser l’efficacité d’un composé donné. En première intention, des évaluations in silico et/ou in vitro permettent de faire une première étape de caractérisation d’un composé (formulation, structure, concentration, etc.). En deuxième intention, l’évaluation chez l’animal vivant apporte des informations supplémentaires cruciales pour améliorer l’efficacité du composé : biodisponibilité sanguine et tissulaire, concentration des métabolites, clairance, demi-vie, etc. C’est l’objet du présent projet.

Bénéfices attendus

De nombreuses pathologies sont aujourd’hui incurables à cause d’un manque d’efficacité des traitements existants. Nos études de pharmacocinétique contribueront à rendre les traitements du futur plus ciblés et plus efficaces en ayant une meilleure connaissance de leur utilisation par l’organisme.

Procédures

1) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie ou non (selon l’espèce, et le site du prélèvement). Ces prélèvements seront très rapides (1 minute). Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude, mais respectera les limites décrites dans la procédure. 2) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements de fèces ou de mictions. Ces prélèvements s’effectueront sur une durée maximale d’une heure par 24h, en cage isolée. Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude. 3) Les animaux recevront une ou plusieurs injections de composés. Les administrations sont très rapides (2-3 minutes). Le nombre d’administrations sera dépendant de chaque étude mais respectera les limites décrites dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les nuisances pouvant être causées dans ce protocole proviennent : - De l’introduction d’une aiguille lors de l’injection d’un composé. - D’un prélèvement sanguin (pouvant être réalisé à la veine mandibulaire ou au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat), veine marginale de l’oreille (lapin) du vivant de l’animal. Dans le cas d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat) ou à la veine marginale de l’oreille (lapins), les animaux seront anesthésiés. - D’un isolement de courte durée (1h maximum par 24h) pour la récolte de mictions et de fèces ou bien lors de l’administration d’un composé par voie aérienne en cage à nébuliser. Toutes les manipulations seront effectuées par un personnel qualifié. Une attention particulière sera portée au stress de l’animal en favorisant une acclimatation des animaux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans cette procédure seront mis à mort afin de récupérer leurs organes et fluides dans le but de pouvoir doser le composé injecté, ses métabolites et ses précurseurs, ou toute molécule nous permettant de retracer le devenir du composé dans l’organisme.

Remplacement

Chaque fois que cela sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement des tests animaux. L’utilisation unique d’études in vitro n'est pas suffisante pour évaluer la pharmacocinétique d’un composé. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, tissulaires d'un animal entier. De plus, c’est une exigence réglementaire de démontrer des effets bénéfiques chez l’animal (puis chez l’Homme), pour qu’un médicament potentiel puisse prétendre à une autorisation de mise sur le marché.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, chaque fois que cela sera possible, les candidats médicaments seront initialement évalués en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre minimum d’animaux est défini en tenant compte de la variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes d’animaux. Le nombre de rats, de souris et de lapins nécessaires a été défini afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cela nous conduit à former des groupes de 10 animaux chez la souris et le rat, et des groupes de 5 animaux pour les lapins.

Raffinement

Les expérimentateurs sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences des expérimentateurs est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Par ailleurs, les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton) de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Les lapins seront eux hébergés par 2, selon les conditions de la réglementation 2010/63. L'enrichissement sera composé de buchettes et d'un jouet. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante. Pour les gestes qui le nécessite, conformément à la règle des 3R, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront vus quotidiennement par un expérimentateur et/ou un zootechnicien. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Cependant, le lapin est phylogénétiquement plus proche de l'Homme que les rongeurs et compte tenu de sa taille, il permet des prélèvements de fluides ou de tissus importants réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Par conséquent, selon la demande du client l’espèce la plus adaptée sera choisie pour l’étude. Par défaut, les animaux seront utilisés à l'âge adulte car l’essentiel de notre activité se concentre sur des composés visant une population adulte. Nous n’excluons pas la possibilité qu’une étude nécessite de se dérouler chez des animaux plus jeunes (système immunitaire immature). Le cas échéant, l’âge minimum des animaux correspondra à l’âge du sevrage (3 semaines pour les souris et les rats et 7 semaines pour les lapins).

Vingt prélèvements sanguins, un par semaine pendant vingt semaines, et jusqu'à quatre séries d'injections dans les deux muscles des pattes pour chaque souris. 1 840 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes et y doser les vecteurs. Ces vecteurs synthétiques doivent transporter des ARN messagers codant des anticorps, avec l'idée de faire produire le traitement par l'organisme lui-même. Le porteur annonce un "tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies", alors que le projet en est à comparer l'efficacité de formulations chez la souris.

Objectifs

La prévention et le traitement des maladies infectieuses ainsi que le développement d’alternatives au antiviraux chimiques limités pourraient voir le jour sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme ouvrant ainsi un nouveau paradigme en biothérapie. Le développement d'une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps permettrai de concevoir rapidement des traitements antiviraux, et ainsi d'offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine correspondante. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit

Procédures

Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 4 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 3 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 20 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie…. Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Inflammation transitoire au niveau du site d’injection; 2) Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang; 3)- Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (injection et prélèvement).

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

De manière systématique, les vecteurs évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique, et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection de buprénorphine sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. De plus, cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté à aux vecteurs étudiés mais concernera quasi exclusivement des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.

Des femelles gestantes reçoivent une dose unique de tamoxifène par pipette, sous contention de vingt à trente secondes, pour désactiver trois gènes chez leurs embryons. 214 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à comprendre comment ces gènes commandent la formation du rein fœtal, sans perspective thérapeutique annoncée au-delà de la connaissance elle-même. Le porteur écrit que le tamoxifène "ne cause aucun effet secondaire" et fonde ses calculs sur 20 embryons, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 214 souris déclarées.

Objectifs

Certaines malformations du rein et de l’appareil urinaire font partie des anomalies les plus graves que l’on peut détecter à la naissance. Dans les cas les plus sévères, elles peuvent entraîner la mort du nouveau-né. Dans d’autres cas, ces malformations peuvent causer des maladies rénales chroniques qui apparaissent plus tard, à l’adolescence ou à l’âge adulte. Ces maladies sont souvent liées à d’autres problèmes de santé, comme le diabète ou l’hypertension (pression artérielle trop élevée), qui sont les principales causes de mortalité chez les personnes atteintes. Depuis 1990, le nombre de cas de maladies rénales chroniques a augmenté de 29 %. Malgré l’ampleur du problème, il n’existe aujourd’hui aucun traitement permettant de guérir ces maladies. Dans notre laboratoire, nous cherchons à mieux comprendre comment se forment les reins. Pour cela, nous étudions un groupe de gènes qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Nous étudions les embryons parce que les reins se forment pendant la grossesse. Pour comprendre l’origine des malformations, il faut observer le développement dès le début, pas une fois que l’organe est déjà formé. Le tamoxifène est un médicament que l’on utilise comme un “interrupteur” pour activer un changement dans les gènes, de manière très ciblée, chez les souris de laboratoire. Dans notre modèle, certaines souris ont été génétiquement modifiées pour posséder un gène qui peut être désactivé (ou "supprimé") à un moment précis de leur vie. Mais ce gène ne se désactive pas tout seul : il faut un signal pour déclencher cette suppression. Ce signal, c’est le tamoxifène. Quand on administre le tamoxifène à ces souris, il agit comme une clé qui active une enzyme spéciale déjà présente dans leur organisme (appelée Cre recombinase, une sorte de petit outil moléculaire). Cette enzyme est inactive tant que le tamoxifène n’est pas là. Une fois activée, cette enzyme va repérer des "balises" spéciales placées autour du gène ciblé et va alors le couper ou le désactiver, comme si on retirait une pièce d’un circuit électrique. Ce mécanisme permet aux chercheurs d’étudier l’effet de la disparition de ce gène, à un moment précis et dans un tissu particulier, sans affecter tout l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement d'un groupe de 3 gènes altère la formation du rein fœtal. Ces malformations peuvent aboutir à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours. Les éléments de réponse à cette question permettront d’approfondir notre connaissance dans ce domaine.

Procédures

Chaque animal sera nourri par une dose unique de tamoxifène. Temps de contention de l’animal : 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation, nous envisageons une seule procédure qui consiste à administrer à des femelles gestantes du tamoxifène par voie orale, il ne s’agit pas de gavage mais par la méthode pipet feeding (alimentation par pipette) qui est moins invasive. Le tamoxifène ne cause aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon la réglementation, car il n’est pas possible de les maintenir en vie après l’expérimentation en raisons de contraintes éthiques et sanitaires.

Remplacement

Une des étapes de ce projet nécessite une quantité très importante des cellules progénitrices du rein. Afin de remplacer l’animal nous avons mis au point, dans notre laboratoire, un protocole qui nous nous permet d’obtenir des cellules progénitrices du rein en quantité suffisante sans avoir recours à l’animal. Afin d’étudier d'autres aspects du fonctionnement de ces gènes, nous aurons besoin d'invalider les trois gènes à la fois, ce qui n'est possible que sur le rein des embryons mutants.

Réduction

Selon nos calculs basés sur des tests statistiques, nous nous basons sur 20 embryons mais si nous constatons des variations moins grandes que prévues, nous reverrons le nombre d’embryons à la baisse.

Raffinement

Des points limites seront appliqués : perte de poids >15 %, signes de suffocation, altération persistante de l’état général (prostration, perte de mobilité, difficulté d’alimentation/hydratation), ou douleur manifeste non contrôlée. Tout animal présentant un de ces critères sera immédiatement retiré de l’étude et mis à mort (décrit selon 3.3.3) Une surveillance régulière, adaptée aux périodes critiques, sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle de recherche, car elle partage de nombreuses ressemblances génétiques et biologiques avec l’être humain. De plus, son patrimoine génétique peut être facilement modifié et étudié en laboratoire. Cela nous permet de créer des souris porteuses de maladies rénales semblables à celles que l’on observe chez l’humain. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines, car c’est à cet âge qu’elles sont le plus fertiles.

Une injection sous-cutanée par jour, du jour précédant l'accouplement jusqu'à la mise bas ou la mise à mort. 924 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, la seule nuisance retenue par le porteur étant une inflammation locale au point d'injection. Les mères sont anesthésiées puis disloquées, les embryons refroidis sur glace puis décapités entre les stades E14,5 et E20,5, pour prélever cœur, placenta, aorte, reins, poumons, foie et sang. L'hypothèse testée, un lien entre une modification des protéines et l'hypertrophie cardiaque des nouveau-nés de mères diabétiques, reste au conditionnel dans le texte, quand la mise à mort de 924 rats et de leurs portées est, elle, programmée.

Objectifs

Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle protéique qui est augmentée lors de stress métabolique chronique, type diabète (hyperglycémie). Elle a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiaque. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication d’une modification des protéines dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse, en lien avec l’altération de la vascularisation placentaire. (2) Identifier les mécanismes impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par une augmentation de la modification des protéines.

Bénéfices attendus

Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.

Procédures

1 jour avant l’accouplement et jusqu’au euthanasie ou la mise bas les animaux recevront une fois par jour, une injection sous cutanée afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation. A la fin de cette période, les embryons sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, placenta, aorte, rein, poumons, foie, sang).

Impact sur les animaux

L’injection sous cutanée peut être à l’origine d’une inflammation localisée, qualifiée de nuisance légère.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie des embryons, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Les développements cardiaque et placentaire sont des processus complexes et intégrés faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque et placentaire par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 924 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés après avoir fait une analyse d’égalité des variances.

Raffinement

Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements (y compris après l’accouplement) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Une semaine d’acclimatation sera alors réalisée. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement, pour les males et par deux pour les femelles dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Pour les mâles servant à la reproduction, ils seront hébergés par 2 à la réception jusqu’à la reproduction. Post accouplement, les rats seront hébergés individuellement. Lors du sacrifice des animaux (sacrifice des mères), une couverture anesthésique sera mise en place, puis l’animal sera disloqué. Les embryons de E14.5 à E20,5 seront anesthésiés sur glace puis euthanasiés par décapitation et prélevés. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recours et qui les maîtrise.

Choix des espèces

Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque et placentaire, différents stades de développement embryonnaires sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire de E5,5 à E20,5, permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et placentaire.

La grande majorité de ces souris quitte le projet pour d'autres protocoles déjà autorisés, les autres, celles dont le génotype ne convient pas et les anciens reproducteurs, sont tuées. 4 428 souris porteuses d'une mutation provoquant une myopathie progressive vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit, jeune et éveillée, une biopsie de la queue pour identifier son génotype, geste répété au pavillon de l'oreille aux ciseaux fins quand l'analyse échoue. Le projet n'a d'autre objet que d'entretenir la lignée et de produire les lots d'animaux des projets de recherche, et le porteur ne justifie le chiffre de 4 428 que par le contrôle du nombre d'accouplements.

Objectifs

Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes d’une maladie génétique du muscle conduisant à une atteinte musculaire (myopathie) et nous développons également des approches thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de la mutation la plus fréquente chez l’homme qui récapitule en grande partie la pathologie humaine. Ces souris développent une faiblesse musculaire lentement progressive mesurable sur certains muscles par un perte de force. Il n y’a pas d’atteinte cardiaque ou respiratoire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du génotype d'intérêt pour nos études, indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie et pour pouvoir évaluer nos stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques d'une myopathie rare et invalidante (moins de 1 cas pour 100 000 naissances) et permettront le développement et la validation de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour d’autres maladies neuromusculaires.

Procédures

Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes. Exceptionnellement, s’il y a un problème de génotypage une nouvelle biopsie pour vérification sera réalisée, dans ce cas une petite biopsie tissulaire au niveau du pavillon de l’oreille sera réalisée en quelques secondes avec des ciseaux fins aiguisés

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage permettant l’identification génétique pourront induire une douleur légère et un léger stress de courte durée chez l'animal. Il peut également y avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Le phénotype des animaux induit une myopathie progressive qui peut entrainer une fatigue musculaire ainsi que des douleurs musculaires pouvant réduire la mobilité des animaux dans de rares cas.

Devenir

La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres projets préalablement autorisés utilisant des animaux à des fins scientifiques (utilisation continue). Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasié.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant au développement de la pathologie musculaire. De la même manière, pour le développement de stratégies thérapeutiques seul une administration dans organisme entier permet de vérifier l’efficacité e la potentielle toxicité d’un traitement ainsi que sa bonne dispersion aux organes cibles (ici les muscles) en fonction de son mode d’administration. Un modèle animal est donc nécessaire pour une bonne compréhension de la physiopathologie et comme modèle préclinique pour tester des approches thérapeutiques.

Réduction

4428 animaux seront entretenus dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre d'accouplement afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. Nous avons aussi optimisé notre stratégie de croisement afin d'obtenir des portées avec le bon génotype. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopreservation sera envisagée.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Des animaux sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris pour laquelle de nombreux outils analytiques sont disponibles. Le modèle utilisé est reconnu et validé par la communauté scientifique, permettant des comparaisons directes avec les données. Enfin, une nos stratégies thérapeutiques pour laquelle nous avons fait la preuve de concept est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Les souris utilisées pour les accouplements auront entre 2 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopréservation sera envisagée. Les animaux pour l’élevage sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 8 mois de vie pour les reproducteurs. Les animaux seront utilisés dans le cadre de projets autorisés, entre 3 semaines et 8 mois. Cela permet d’étudier le développement de la maladie en physiopathologie et aussi de pouvoir intervenir avant l’apparition des symptômes (avant 3 semaines) ou bien sur un phénotype plus installé (après 3 mois) lors d’évaluation de l’efficacité des traitements à prévenir ou reverter la maladie.

Vérifier que des lots d'un vaccin contre la fièvre de Lassa gardent leur pouvoir immunisant malgré des écarts de fabrication, telle est la finalité de ce projet. 48 souris immunodéficientes de lignée S129 IFNAR vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Marquées par des encoches pratiquées dans les oreilles, réparties en quatre groupes de douze, elles reçoivent une ou deux injections à un mois d'intervalle et un prélèvement de sang. La moitié est tuée au quinzième jour, l'autre au quarante-cinquième, pour prélever les organes servant à mesurer la réponse vaccinale.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de confirmer qu’un vaccin contre la fièvre de Lassa conserve ses propriétés immunogéniques indépendamment de certaines caractéristiques variables du vaccin qui peuvent être mesurées lors de sa production. Ces résultats sont essentiels pour le développement clinique de ce candidat vaccin.

Bénéfices attendus

L’efficacité d’un vaccin contre la fièvre de Lassa a déjà été démontrée chez le primate non humain. Des lots cliniques de ce vaccin sont actuellement en production. Ce projet nous permettra de vérifier que certaines caractéristiques mesurées sur les lots produits n’impactent pas l’immunogénicité du vaccin, permettant ainsi le développement du vaccin vers des essais cliniques.

Procédures

Après répartition en 4 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 3 vaccins testés selon différens protocoles vaccinaux), les 48 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Une ou deux injections de vaccins à un mois d’intervalle sur animaux vigiles - Un prélèvement de sang sur animaux vigiles. - Une mise à mort. Chacun des gestes effectués sur les animaux ne durera pas plus de 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Ce type de vaccin a déjà été utilisé chez le rongeur et n’a pas causé d’effets secondaires chez les animaux. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les organes qui seront utilisés pour déterminer les réponses à la vaccination.

Remplacement

Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro l’induction de réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques que peut conférer une solution vaccinale. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité des candidats vaccins.

Réduction

Dans ce projet, 4 groupes de 12 animaux seront constitués. Chaque groupe de 12 souris est constitué de 6 animaux mâles et 6 animaux femelles. Dans chaque groupe, les animaux recevront une injection de milieu ou une injection de vaccin. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort à J15 pour des prélèvements qui permettront de déterminer les réponses à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection à J30 et sera mise à mort à J45 pour prélèvements qui permettront de déterminer les réponses après une seconde vaccination. La mise à mort de douze animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.

Raffinement

Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de désinfectant. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique, l’ajout de gel hydrique peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. Des points limites sont établis et les mesures adaptées mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée est un modèle largement utilisé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.

Un rat par binôme d'étudiants, 31 par an pendant cinq ans, soit 155 rats au total, tous tués à l'issue de la séance. Chacun reçoit deux injections pour l'analgésie et l'anesthésie, subit un cathétérisme de l'artère fémorale de trente minutes et de la veine pénienne de dix minutes, puis six injections de substances pharmacologiques, dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger. Le réveil est exclu d'emblée, les cathéters posés ne le permettant pas. Le projet ne vise aucune production de connaissance. Le porteur décrit un travail pratique destiné à illustrer devant les étudiants la relation dose-effet, et invoque le programme pédagogique national qui prévoit d'apprendre à "participer à des activités d'expérimentation sur des animaux de laboratoire".

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier chez le rat anesthésié les effets de diverses substances pharmacologiques sur la pression artérielle mesurée à l’aide d’un capteur de pression. L’étudiant sera formé aux diverses étapes de mise en œuvre de procédures expérimentales in vivo chez le rat anesthésié dans le respect de la réglementation relative à l’expérimentation animale : la contention, l’administration de substances, l’induction et le contrôle de l’anesthésie. Le projet permettra d’illustrer par la pratique les notions fondamentales de pharmacologie que sont les effets de substances en fonction de la dose et l’antagonisme. Enfin, l’étudiant sera formé à l’exploitation et interprétation les résultats obtenus.

Bénéfices attendus

Le projet proposé est à visée pédagogique. Les bénéfices attendus sont ceux de permettre l'acquisition un savoir-faire fondamental en pharmacologie tant théorique que pratique ainsi qu’une formation à l’application des bonnes pratiques en expérimentation animale et au respect de la réglementation. La maîtrise de l’approche expérimentale in vivo garantit ainsi l’adéquation entre la formation et les exigences du milieu professionnel et favorise l’insertion professionnelle de nos diplômés. Voici les compétences en lien avec l’expérimentation animale qui seront acquises par les étudiants à l’issue de ce projet : -Maîtrise de divers gestes techniques chez le rat vigile : préhension, contention et techniques d’injections (intrapéritonéale, sous cutanée) -Observation de la réalisation de cathétérismes veineux et artériel chez le rat anesthésié réalisés par l'équipe pédagogique -Formation aux techniques d’induction et contrôle de l’anesthésie ainsi qu’à la gestion de la douleur. -Quantification et interprétation des effets biologiques de diverses substances pharmacologiques in vivo chez le rat anesthésié.

Procédures

2 injections par animal d'une durée de 15 secondes chacune pour induire l'analgésie et l'anesthésie. Réalisation des cathétérismes de l’artère fémorale (durée 30 min) et de la veine pénienne (durée 10 min) 6 injections par animal sous anesthésie : Durée de chaque injection : 15 secondes

Impact sur les animaux

L’acquisition de la maîtrise de la contention du rat vigile nécessaire à la bonne réalisation des administrations chez le rat vigile peut nécessiter la répétition des gestes de la part de l’étudiant ce qui est susceptible de générer un inconfort chez l’animal. Cet inconfort est réduit a minima en raison de la mise en place préalable d'un protocole d'habituation de l’animal à la manipulation les jours précédents la réalisation de la procédure. L’administration des diverses substances pharmacologiques par voie iv au cours de la procédure réalisée sous anesthésie peut conduire à une insuffisance respiratoire.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à la fin de la procédure 2 en raison de la mise en place d’un type de cathéters vasculaires qui n’autorisent pas le réveil.

Remplacement

L'utilisation d'animaux à des fins expérimentales reste nécessaire dans le BUT Génie Biologique, comme le prévoit le programme pédagogique national. Les étudiants doivent en effet apprendre à « participer à des activités d’expérimentation sur des animaux de laboratoire ». Cette compétence est essentielle, car les diplômés travailleront souvent dans des secteurs comme la pharmacologie, la physiologie pharmaceutique ou la toxicologie, où l’expérimentation animale est courante. Savoir utiliser cette méthode in vivo est donc indispensable pour répondre aux attentes du monde professionnel.

Réduction

Nous limiterons le nombre de rats à un par binôme. Le nombre d'étudiants formés s'élevant au maximum à 54 soit 27 binômes, 27 rats + 4 supplémentaires (en cas de mort à l'anesthésie) seront nécessaires soit 31 par an soit 155 en 5 ans.

Raffinement

Avant de débuter l’apprentissage pratique, un enseignement spécifique consacré au bien-être animal, au respect des règles d’éthique et à la réglementation relative à l’expérimentation animale est dispensé aux étudiants. De plus, la mise en œuvre de chaque procédure fait au préalable l’objet d’une séance d’enseignement préparatoire (3 h Travaux Dirigés – commentaires des différentes étapes pratiques à partir de photos et vidéos) pour assurer la bonne prise en charge de l’animal (réduction de l’inconfort / du stress / de la douleur) au cours de la procédure (Raffinement). Les animaux sont hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et sont suivis chaque jour. Une période d’acclimatation d’une semaine est respectée après leur arrivée dans l’animalerie de l’établissement. Pendant la période d’acclimatation, un protocole d'habituation des animaux est pratiqué pendant les 4 jours qui précèdent la première séance de TP par le personnel technique de l’animalerie. Les rats sont alors tout particulièrement habitués à la manipulation de l’homme ce qui réduit très fortement leur stress et/ou inconfort lorsqu’ils sont manipulés par les étudiants. L’enseignement est dispensé par demi-groupe de TP (6-7 étudiants) en présence d'un ou deux enseignants selon la procédure pour optimiser l’encadrement. Cette approche progressive et individuelle de l'apprentissage de la contention et des administrations chez l'animal vigile est essentielle car elle favorise l’acquisition des compétences pratiques. Par ailleurs, une analgésie est pratiquée avant l’induction de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie, le contrôle de la température de l’animal est contrôlée et maintenue en plaçant l'animal sur un tapis chauffant. La profondeur de l’anesthésie est également contrôlée tout au long du TP. Tout signe révélant une réduction de sa profondeur s'accompagne sans délai d'une injection d'anesthésique pour maintenir la profondeur de l'anesthésie à un stade compatible avec la procédure opératoire. En cas de troubles respiratoires, une trachéotomie est pratiquée par l’enseignant. En absence d'amélioration de ces troubles ou en cas de perte sanguine trop importante, l'animal est mis à mort.

Choix des espèces

Les rats présentent des caractéristiques physiologiques et anatomiques qui permettent un apprentissage rapide des diverses techniques d’administration et une démonstration plus aisée des cathétérisations vasculaires. De plus, le rat est une des espèces les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche recrutant nos étudiants futurs techniciens. En effet, de très nombreux modèles expérimentaux animaux sont développés chez cette espèce. Rats adultes : Les vaisseaux sont de taille suffisamment importante ce qui augmente la vitesse de réalisation des cathétérisations par les enseignants et facilite l'observation par les étudiants. La taille des animaux adultes rend également leur manipulation plus aisée par les étudiants.