Procédures légères

9 377 souris vont être utilisées, certaines recevant jusqu'à 105 administrations orales, une chaque jour pendant quinze semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 2 782 d'entre elles et modéré pour 6 595, et toutes sont tuées pour prélever plusieurs organes par animal. Une partie développe spontanément une inflammation de l'iléon proche de la maladie de Crohn, avec diarrhée et perte de poids, à quoi s'ajoutent des transferts de microbiote, des changements de régime et des prises de sang sur animal vigile. Le porteur justifie l'effectif par quinze ans d'expérience du modèle et par la variabilité entre individus, et prévoit de refaire chaque expérience deux à trois fois lorsque les résultats vont dans le sens de son hypothèse.

Objectifs

Le rôle du microbiote intestinal a été exploré dans la santé et dans un large éventail de pathologies. Il a été clairement démontré que le microbiote intestinal joue un rôle dans la pathogenèse des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) et constitue une cible thérapeutique potentielle dans ces maladies. Cependant, la grande majorité des données disponibles concerne le microbiome fécal ou colique, alors que le microbiome de l'intestin grêle joue probablement un rôle au moins aussi important. La composition et les fonctions du microbiote intestinal sont façonnées par son environnement, et il n'est donc pas surprenant que la composition, la biogéographie et la distribution du microbiote de l'intestin grêle soient différentes de celles du côlon. Dans des expériences préliminaires, nous avons montré chez l'Homme et chez la souris que les microbiomes de l'iléon et du côlon sont différents à la fois en termes de composition et de fonctions. Les objectifs du projet actuel sont de caractériser le microbiote de l'intestin grêle, l'influence de l'alimentation sur ce microbiote, son altération dans les MICI et son rôle dans la pathogenèse et en tant que cible/outil thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) touchent plus de 300 000 patients en France et elles sont en partie liées à une altération du microbiote intestinal. Les traitements actuels des MICI ne sont pas toujours efficaces ; ils ne sont que suspensifs et ne ciblent pratiquement que le système immunitaire en ignorant la composante du microbiote. D’autre part, l’atteinte de l’intestin grêle qui est présente chez deux tiers des patients avec maladie de Crohn est particulièrement difficile à traiter et représente un besoin médical encore plus important que les autres localisations inflammatoires. Notre projet vise à mieux comprendre comment les microbes qui vivent dans notre intestin interagissent avec notre organisme, en particulier au niveau de l’intestin grêle. Ces recherches nous aideront à découvrir comment ces échanges fonctionnent dans un corps en bonne santé, mais aussi dans certaines maladies. L’objectif est de trouver de nouvelles façons de soigner en agissant à la fois sur le microbiote (les microbes) et sur le corps humain. Ce projet réunit plusieurs domaines scientifiques pour étudier comment notre système immunitaire et notre métabolisme travaillent avec les microbes de l’intestin. Il nous permettra de mieux comprendre les causes de maladies comme les MICI, notamment lorsqu’elles touchent l’intestin grêle, et d’identifier de nouvelles pistes de traitement pour les patients.

Procédures

Au cours de ce projet, les souris pourront suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) un transfert de microbiote intestinal par administration orale pendant 2 jours (animal vigile, moins de 10 secondes) ii) une mise sous régime alimentaire spécifique durant 2 à 12 semaines (animal vigile, prise alimentaire spontanée) iii) un traitement quotidien à visée thérapeutique tous les jours durant 5, 10 ou 15 semaines soit un maximum de 105 administrations pour les temps les plus longs (animal vigile, moins de 30 secondes). Tous les groupes impliqués seront suivis grâce à une grille de score effectuée de manière hebdomadaire (ou plus si nécessaire) et impliquant une manipulation d’environ une minute par animal. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraîches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvement de sang sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le modèle murin utilisé développe spontanément et de manière très progressive une inflammation intestinale pouvant entraîner une diarrhée et une perte de poids. Certains animaux seront soumis à un changement de régime alimentaire ce qui pourrait induire une diminution transitoire de la prise alimentaire en raison de la néophobie de la souris. Le projet comprend différentes techniques d’administrations pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entraîner un risque de péritonite (très rare). De même, la répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraîches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également un prélèvement sanguin pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie (très rare).

Devenir

Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproduction sans prélèvement. Les souris impliquées dans les procédures seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés pour l’analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera un maximum de 9377 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée au développement d’une iléite spontanée (inflammation de l’iléon) dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie de Crohn chez l'homme. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associés à un scoring hebdomadaire de la sévérité de l’inflammation permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique permettant de réduire également les risques de poussées inflammatoires en conditions standard. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire au maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont effectués par un personnel formé et autorisé. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maîtrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris commerciales et une souche mutante qui développent spontanément une inflammation dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie de Crohn chez l'homme. Justification des stades : Les souris seront utilisées entre l’âge 3 et 15 semaines. En effet, il existe dans ce modèle une phase d’induction de l’inflammation entre 3 et 7 semaines, puis une phase de chronicité entre 7 et 30 semaines. Nous commencerons à le projet à 3 semaines (révolues) car cela correspond au sevrage des animaux et donc à une étape clé dans le développement de leur microbiote intestinal et de leur système immunitaire qui sont deux acteurs majeurs du processus d’inflammation intestinale.

Déplacées d'un établissement utilisateur à un autre au cours du protocole, 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 2 458 d'entre elles et modéré pour 456, toutes tuées pour collecte d'organes. Les mâles sont rendus obèses par un régime riche en graisses, avec hyperglycémie à jeun et résistance à l'insuline, et subissent jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, un jeûne de vingt-quatre heures, des gavages de glucose et des injections d'insuline. Les femelles gestantes passent trois échographies sous anesthésie et sont contenues jusqu'à dix minutes chaque jour de leur gestation pour la mesure de la pression artérielle, les fœtus étant analysés en fin de gestation. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni aucun organoïde ne permet d'étudier l'effet d'un régime alimentaire sur les spermatozoïdes, et qu'un mammifère est requis pour transposer les résultats à l'humain.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'EU050: - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'EU053: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.

1 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 192 d'entre elles et modéré pour 1 216. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau ou dans le côlon sous anesthésie, jusqu'à cinq coloscopies, une dizaine de mesures de tumeur sous isoflurane, de l'oxaliplatine, et pour certaines une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitale. Le but déclaré est de comprendre pourquoi cette chimiothérapie provoque chez les patients des douleurs des mains et des pieds assez fortes pour leur faire arrêter le traitement. Le porteur écrit surveiller quotidiennement la douleur des souris et exclut du protocole les anti-inflammatoires, la morphine, les gabapentinoïdes et les corticoïdes, ces molécules interférant avec les mécanismes qu'il étudie.

Objectifs

Le traitement de certains cancers, comme celui du côlon,repose en partie sur l’utilisation de chimiothérapie.. Ce traitement peut être efficace, mais il provoque fréquemment des douleurs aux mains et aux pieds, avec une sensibilité accrue au froid ou au toucher. Ces douleurs peuvent devenir très gênantes et forcer certains patients à arrêter leur traitement, même s’il est efficace. On pense que ces douleurs sont causées par une réaction du système immunitaire autour des nerfs. Certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Ce projet vise à mieux comprendre ce phénomène chez la souris, en identifiant les facteurs qui favorisent l'apparition ou le maintien de la douleur. Ce projet vise à mieux comprendre ce phénomène chez la souris, en identifiant les facteurs qui favorisent l'apparition ou le maintien de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour réduire les douleurs liées à la chimiothérapie. Les médicaments actuels sont souvent peu efficaces dans ce contexte. Mieux connaître les mécanismes en cause permettrait d'améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancer.

Procédures

Les souris recevront des cellules qui provoqueront une tumeur, ce qui pourrait entraîner des douleurs abdominales modérées. Certaines recevront aussi un traitement anticancéreux pouvant provoquer temporairement une sensibilité accrue au toucher ou au froid. Dans d'autres expériences, certaines cellules du système immunitaire seront supprimées, ce qui peut entraîner une légère perte de poids. L'état de santé des animaux sera vérifié chaque jour pour détecter toute souffrance et intervenir si besoin. Les animaux seront soumis à diverses interventions expérimentales, avec les nombres et durées suivants : l'induction tumorale consiste en une injection unique : pour les tumeurs sous-cutanées (Procédures 1, 7) sous anesthésie (kétamine/xylazine) durant 10-20 minutes ; pour les tumeurs orthotopiques (Procédures 2, 8) sous anesthésie (kétamine/xylazine/atropine) durant 10-20 minutes incluant une endoscopie de 3 minutes. Le suivi tumoral comprend des mesures sous-cutanées (Procédures 1, 5, 7) sous isoflurane (

Impact sur les animaux

La formation de tumeurs peut provoquer des douleurs modérées, surtout au niveau de l’abdomen. Le traitement anticancéreux peut entraîner des douleurs passagères, comme une sensibilité accrue au toucher ou au froid. La perte de certaines cellules immunitaires peut aussi provoquer une perte de poids. Dans certains cas, un inconfort temporaire peut apparaître au niveau des zones d’injection. Cependant, les souris sont généralement euthanasiées 24 heures après l’injection d’oxaliplatine, ce qui limite la durée de ces effets. Le bien-être des animaux sera contrôlé chaque jour à l’aide d’une grille d’observation, et des mesures adaptées seront prises si un signe de souffrance est détecté.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience pour réaliser les prélèvements de tissus nécessaires à l'étude des mécanismes inflammatoires et douloureux.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour ce projet, car les symptômes étudiés résultent d’interactions complexes entre les nerfs et certaines cellules immunitaires, qu’il n’est pas possible de reproduire en laboratoire sans organisme vivant. De plus, ces effets secondaires sont liés à des réactions physiques (comme une hypersensibilité au froid ou au toucher), qui ne peuvent être observées qu’à l’échelle de l’organisme. Le modèle inclut une induction tumorale afin de reproduire les conditions proches des patients atteints de cancer. Aucune méthode alternative actuelle ne permettrait de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la validité statistique des résultats. Les groupes seront composés de 6 à 8 souris, sur la base de données préliminaires et de précédents résultats publiés. Deux types de modèles de tumeur seront utilisés, permettant d’ajuster les doses d’oxaliplatine au fur et à mesure. Dans la mesure du possible, les groupes “sans tumeur” seront mutualisés au sein d’une même expérience, c’est-à-dire utilisés comme contrôles communs pour plusieurs conditions testées simultanément. Cette approche expérimentale permettra de réduire d’environ 20 % le nombre total de souris prévues.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées par du personnel formé dans des conditions limitant le stress. Au maximum, deux manipulateurs différents s'occuperont des animaux tout au long du protocole. Afin de minimiser la douleur, la souffrance et le stress, les animaux seront surveillés quotidiennement selon plusieurs critères, tels que l’apparence physique, les changements comportementaux, la consommation d’eau et de nourriture, ainsi que l’apparition de signes cliniques mesurables. Si besoin, de la gelée nutritive et hydratante sera mise à disposition des animaux pour prévenir tout défaut d’alimentation ou d’hydratation.L’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou d’antalgiques opioïdes comme la morphine est exclue, car ces molécules interfèrent directement avec les mécanismes étudiés. Les AINS modifient la neuroinflammation et les profils de cytokines, tandis que la morphine altère l’immunité innée, notamment l’activité macrophagique. D’autres agents à action centrale ou immunomodulatrice (ex : gabapentinoïdes, corticoïdes) sont également exclus pour les mêmes raisons. Les procédures invasives (injections tumorales, greffe de moelle, injections intraplantaires) seront réalisées sous anesthésie générale kétamine/xylazine pour minimiser la douleur via les propriétés analgésiques de la xylazine

Choix des espèces

Les souris utilisées sont choisies pour leur large disponibilité en lignées transgéniques ainsi que pour leur utilisation courante en recherche sur la douleur et l’immunologie. Leur physiologie est bien connue, ce qui facilite l’interprétation et la comparaison des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8–12 semaines), âge auquel leur flore intestinale est stabilisée et leur système immunitaire mature. Les deux sexes seront utilisés au départ pour évaluer d’éventuelles différences entre mâles et femelles. Par la suite, le sexe retenu dépendra des résultats initiaux : si des différences importantes sont observées, les deux sexes seront maintenus ; sinon, le choix se fera selon la disponibilité des animaux produits et les contraintes expérimentales.

2 750 souris et 70 cobayes vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 420 d'entre eux et modéré pour 2 400. Les souris reçoivent des injections, dont des injections intracérébrales qui provoquent des morts dans les quarante-huit heures suivantes, que le porteur qualifie de mortalités non spécifiques liées au geste technique. Les 70 cobayes sont les seuls animaux du protocole dont l'adoption est envisagée, les souris étant tuées. Ces tests contrôlent l'inactivation de vaccins antirabiques et l'absence de toxicité anormale de lots destinés à la vente au Japon et en Chine, et le porteur indique que l'effectif comme la méthode répondent à ce qu'exigent les autorités de ces pays, aucune méthode in vitro n'y étant reconnue.

Objectifs

Dans le cadre du processus de libération pharmaceutique des lots à commercialiser, l'objectif de ce projet est d'évaluer l’innocuité des produits immunologiques chez les rongeurs. Procédure n°1 contrôle de l’inactivation d’un vaccin antirabique et des suspensions rabiques (CI) d’une part et contrôle de l’absence de virus étrangers (VE), conformément à la monographie de la Pharmacopée Européenne. Procédure n°2 Contrôle de l’absence de toxicité anormale sur les vaccins CRPviv Japon et Rage Chine

Bénéfices attendus

Garantir l'innocuité des lots de vaccins à usage vétérinaire (CRP, Rage et Lepto-Rage), ceci en vue de leur commercialisation.

Procédures

Les nuisances attendues sont : - Gêne à la contention : elle dure quelques secondes. Le personnel est formé afin de manipuler les animaux dans les meilleures conditions et de réduire le stress engendré. - Contention pour l’anesthésie, d’une durée de 5 secondes environ - Contention pour l'injection, d’une durée de 30 secondes environ - Injection : sa durée est de 5 à 10 secondes au maximum

Impact sur les animaux

- Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux incluent un stress bref lié à la contention et une douleur transitoire lors des injections de vaccination. - Des mortalités (non spécifiques) liées au geste technique de l’injection intracérébrale peuvent survenir dans les 48 heures après l’administration

Devenir

À l'issue de chaque procédure, une réflexion sera systématiquement menée pour statuer sur le devenir des animaux. Dans ce cadre, la possibilité de les proposer à l'adoption sera étudiée et favorisée.

Remplacement

La demande émane des autorités des pays où sont commercialisés les produits. Aucune méthode alternative in vitro n’est reconnue par les autorités des pays où sont commercialisés les produits.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque essai est conforme à la Réglementation des pays où les vaccins sont commercialisés.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement, une observation biquotidienne sera organisée si l’état de santé d’un animal l’exige. Au cours de la procédure, une anesthésie présentant une composante analgésique est prévue afin de limiter le stress des animaux. Des points limites précis et spécifiques ont été définis et sont d’application. Toute anomalie sur les installations est directement remontée à un poste de garde (24h/24h) permettant une intervention rapide y compris la nuit et les weekend.

Choix des espèces

La souris et le cobaye sont les modèles qui ont été utilisés pour développer les tests de référence. Ces espèces sont demandées par les Autorités Les souris et les cobayes utilisés sont des adultes, conformément aux demandes des différentes réglementations.

Pour mesurer les suites neurologiques d'une infection au SARS-CoV-2 et tester des pistes contre le Covid long, 1 344 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent le virus par voie intranasale sous anesthésie, jusqu'à deux fois, subissent quatre prélèvements sanguins et passent trois fois chacun une batterie de tests d'anxiété, de dépression, de mémoire, d'apprentissage et d'effort physique. Le porteur décrit une perte de poids et une apathie pendant la phase aiguë, et signale que certains tests placent les hamsters dans des situations anxiogènes. Aucun animal ne sort vivant du dispositif, y compris les non-infectés, faute de pouvoir quitter une animalerie de confinement de niveau 3. Les retombées annoncées restent une contribution au développement de futures approches thérapeutiques.

Objectifs

Ce projet a quatre objectifs : 1) Évaluation des conséquences à long terme de l'infection par le SARS-CoV-2 2) Analyse des répercussions sur le comportement en cas de réinfection par le SARS-CoV 3) Mise au point de nouvelles approches thérapeutiques du Covid long 4) Évaluation de la capacité d’invasion du système nerveux central par de nouveaux variants du SARS-CoV-2

Bénéfices attendus

1) Progression des connaissances des mécanismes infectieux du SARS-CoV-2, notamment liés aux facteurs de virulence, les voies de neuroinvasion et la capacité à induire des effets persistants après l’infection. 2) Contribution au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre le Covid long 3) Contribution à la surveillance de l’apparition de nouveaux variants du SARS-CoV-2 à potentiel neurotrope.

Procédures

Interventions uniques - Inoculation virale intranasale sous anesthésie. Durée de l’intervention : de 5 à 30 minutes en fonction du type d’anesthésie. Interventions répétées - - Pour certains animaux : 2 inoculations intranasales. Chaque inoculation intranasale sous anesthésie a une durée entre 5 et 10 minutes. - Prélèvement sanguin sous anesthésie. Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 4 - Tests de comportement non-invasifs pour mensuration de signes d’anxiété et de dépression, de la mémoire et de l’apprentissage, et de la performance physique. Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes par test. Nombre d’interventions des tests de comportement : chaque test est répété 3 fois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des conséquences directes de l’infection par le SARS-CoV-2, à savoir perte de poids et apathie pendant la phase aiguë du processus infectieux (entre 2 et 4 jours post-infection). Également, douleur et inconfort légers de courte durée liés à l’inoculation intranasal ou prélèvement sanguin. Certains tests de comportement peuvent générer du stress aux animaux (ex : exposition dans des situations anxiogènes pour mensuration de l’anxiété, induction à l’exercice physique pour test d’effort), cependant ces tests sont réalisés en phase post-aigue, quand les animaux ne présentent plus de signes cliniques de maladie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectés par un pathogène. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergés dans une animalerie de confinement niveau 3.

Remplacement

Les expériences proposées dans ce projet font suite et viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture cellulaire et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. Dans ce contexte, l’utilisation d’animaux sera nécessaire dans 3 cas, notamment (i) pour vérifier l’impact de l’infection sur le comportement ; (ii) pour la validation in vivo de molécules candidates pour la thérapie contre le Covid long ayant montré une efficacité in vitro ; et (iii) pour comprendre la pathogénie (les mécanismes utilisés par les virus pour envahir le système nerveux central) de nouveaux variants.

Réduction

Les résultats de notre projet précédant nous ont permis de définir à 8 le nombre minimal d’individus/groupe pour obtenir des résultats significatifs dans les tests de comportement. Les tests statistiques portant sur les caractéristiques moléculaires observées et sur les mesures d’analyse d’image seront effectués par un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test d’analyse de variance pour comparer plusieurs groupes. Pour le comportement, d’autres tests statistiques permettront de prendre en considération l’effet sexe, l’effet temps et l’effet variant. A la fin de chaque procédure les organes des animaux seront prélevés pour des analyses de biologie moléculaire et histologiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis de façon quotidienne pour analyse de leur poids et des éventuelles signes cliniques liés à l’infection. Des mesures seront prises pour réduire la douleur et la souffrance (anesthésie, analgésie, support nutritionnel et hydrique). L’enrichissement environnemental sera aussi renforcé par l’ajout dans les cages de boules ou cylindres, et du coton ou du carton déchiré.

Choix des espèces

Le hamster doré syrien (Mesocricetus auratus) est le meilleur modèle animal pour l’étude d’une infection par le SARS-CoV-2 en raison de la capacité de son récepteur ACE2 à se lier au SARS-CoV-2 avec une affinité de liaison élevée. De plus, ce modèle animal recapitule des caractéristiques du long Covid chez l’humain, notamment des changements de comportement à la suite de l’infection, et la persistance virale dans le cerveau. Ce projet utilise des hamsters adultes. Nous utiliserons des animaux adultes car ces animaux présentent des signes d’infection plus proche de ce qui est observé chez l’humain.

Comprendre pourquoi les hommes obèses sont moins fertiles, et ce que leurs spermatozoïdes transmettent à leur descendance, sert de cadre à ce projet. 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour collecte d'organes. Rendues obèses, hyperglycémiques et résistantes à l'insuline par un régime riche en lipides suivi jusqu'à vingt-quatre semaines, elles subissent des jeûnes de vingt-quatre heures, des gavages de glucose, des injections d'insuline et d'hormones, jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, et pour les femelles gestantes une mesure quotidienne de pression artérielle sous contention de dix minutes. Sur les effectifs, le porteur écrit s'assurer d'utiliser "le nombre d'animaux minimal", sans donner ni calcul ni détail des groupes derrière ces 2 914 souris.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'établissement 1 : - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'etablissement 2: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.