Procédures légères

Une biopsie de queue de dix secondes et moins de trois injections par animal : ce sont les seuls actes déclarés pour 1 098 souris, dont 366 en niveau de souffrance léger et 732 en niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever leur cerveau à différents âges. Ce qu'elles subissent vient d'abord de leur génome, modifié pour reproduire deux formes héréditaires de maladie des petits vaisseaux cérébraux, la mort subite par accident vasculaire cérébral figurant parmi les effets annoncés. Le porteur remplace le tatouage par un poinçon à l'oreille pour limiter ce risque d'accident vasculaire, tout en rangeant la mort subite du côté des caractéristiques du modèle plutôt que des nuisances du projet.

Objectifs

Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont une cause majeure d’accidents vasculaires cérébraux récurrents chez l’homme, et aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Ce projet vise à étudier les lésions cérébrovasculaires dans des modèles souris reproduisant les anomalies génétiques de deux formes héréditaires fréquentes de ces maladies. Des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques seront effectuées sur des cerveaux prélevés à différents âges après la mise à mort des animaux, afin d’examiner l’évolution des lésions aux divers stades de la maladie. Ces études sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour concevoir et évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Santé humaine : Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension et le traitement des maladies des petits vaisseaux cérébraux. À court terme : Valider la pertinence d’un modèle chez la souris pour évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant la protéine humaine mutée responsable de l’une de ces deux maladies. À moyen terme : Mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la seconde maladie afin de développer des approches thérapeutiques adaptées.

Procédures

Biopsie de queue, une fois, 10 seconde. Injections intrapéritonéales ou sous cutanées, moins de 3/animal, 10 secondes.

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors de la biopsie de queue. Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors des injections intrapéritonéales ou sous cutanées. Mort subite de l’animal en lien avec la survenue possible d’accidents vasculaires cérébraux dans le modèle chez la souris de l’une des deux maladies.

Devenir

Les animaux des lots expérimentaux et de génotype d'intérêt sont mis à mort afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques.

Remplacement

La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, un modèle in vitro ou computationnel ne peut pas être substitué au modèle animal

Réduction

Les âges auxquels les animaux seront analysés ainsi que la taille des échantillons ont été déterminés en se basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes. Ainsi il ressort que 15 animaux/ groupe seront nécessaires pour les études histologiques ou biochimiques ; 12 à 24 animaux/ groupe seront nécessaires pour les analyses moléculaires sur cellules uniques selon l’âge étudié. Des tests statistiques adaptés aux types de comparaison intergroupes seront utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Pour minimiser le risque d’accident vasculaire cérébral chez les souris mutées mimant une des 2 maladies, les souris sont identifiées par poinçon à l’oreille et non par tatouage/biopsie de queue. Une grille de score et une liste de points limites ont été établis. Les différents actes réalisés chez la souris sont réalisés par des expérimentateurs chevronnés. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nouveaux nés de 1 et 7 jours, prépubères, jeunes adultes et adultes de 2 mois à 9 mois pour étudier les différents stades de la maladie

Chercher la dose la plus forte qu'un animal peut recevoir avant que la toxicité devienne sévère : 760 souris et 210 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever organes et fluides. 45 études sont prévues sur cinq ans. Les animaux subissent des injections, un cathétérisme urétral qui peut enflammer la vessie, des administrations intranasales et des prélèvements sanguins répétés, avec pour effets annoncés une posture voûtée, un poil hérissé, des diarrhées, une gêne respiratoire et des hématomes. Le porteur présente le projet comme un moyen d'accélérer le développement de traitements contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et les délais des programmes de recherche et développement.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la concentration maximale tolérée et à caractériser les profils pharmacocinétiques de nouvelles molécules anti-infectieuses chez la souris et le rat. L’objectif principal de l’étude est de déterminer la dose la plus élevée d’un composé pouvant être administré sans provoquer d’effets toxiques sévères chez les animaux, et ce, selon une voie d’administration donnée. Cette étape est essentielle pour évaluer la tolérance aiguë ou subaiguë d’un composé chez l’animal. Les traitements évalués incluent des antibiotiques, des antifongiques, des antiviraux, ainsi que des biothérapies innovantes comme les anticorps. Des observations cliniques et des analyses biologiques permettront d’évaluer les éventuels signes de toxicité ou d’effets secondaires. Les études de pharmacocinétique visent à déterminer comment un composé anti-infectieux est absorbé, distribué, métabolisé et éliminé dans l’organisme. Elle permet de mesurer l’exposition systémique après administration, notamment dans les tissus ciblés. Ces données servent à optimiser la posologie et à établir la relation entre la concentration et l’efficacité. Elle est essentielle pour prédire les conditions dans lesquelles le traitement sera le plus efficace. 45 études sont prévues pour la totalité du projet de 5 ans

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de sélectionner les doses maximales tolérées et les schémas d’administration optimaux des candidats thérapeutiques, afin de sécuriser leur usage dans les modèles infectieux. La concentration maximale tolérée constitue une étape fondatrice de la caractérisation préclinique ; elle assure à la fois la sécurité des animaux, la pertinence des doses testées, et la robustesse des données biologiques qui en découleront. Ce projet génèrera également des données de pharmacocinétiques robustes permettant de modéliser précisément la relation dose-exposition-efficacité. Ces informations orienteront le choix des molécules à prioriser et réduiront le recours inutile à des expérimentations ultérieures inefficaces. À moyen terme, les résultats obtenus renforceront la prédictibilité des études précliniques et amélioreront la transposabilité des données vers l’Homme ou l’animal. Cela contribuera à accélérer le développement de traitements innovants contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et délais des programmes de recherche et développement.

Procédures

Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections et les douleurs liés au traitement. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). L'administration par voie urétrale nécessite l'installation d’un cathéter et peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre des études de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, les composés anti-infectieux testés peuvent induire certains effets indésirables transitoires chez la souris et le rat. Des réactions légères sont attendues, telles qu'une diminution temporaire de l’activité, une perte de poids modérée ou une légère réaction inflammatoire au point d’injection. En fonction des doses et de la voie d’administration, des signes de toxicité plus marqués peuvent apparaître, comme un poil hérissé, une posture voûtée, une réduction de la mobilité, ou une altération de la respiration. Des troubles digestifs (comme une diarrhée), une irritation locale ou des complications liées aux prélèvements sanguins (hématome, saignement) peuvent également survenir. Tous les animaux seront suivis au moins quotidiennement, et en cas de signes cliniques sévères, des soins adaptés seront appliqués par le responsable du projet (sur avis du vétérinaire).

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers.

Remplacement

Plusieurs approches alternatives sont utilisées en amont pour limiter le recours à l’expérimentation animale pour l'évaluation des effets secondaires ou de la biodistribution. Les tests ex vivo, comme les coupes de poumon ou les explants intestinaux, permettent de tester localement des anticorps monoclonaux ou des peptides antimicrobiens, mais ne reflètent pas les effets systémiques, ni la diffusion du traitement. Les organoïdes intestinaux ou pulmonaires humains, ou les organes sur puce permettent d’étudier les effets localisés d’un traitement, mais ne modélisent pas la pharmacocinétique, la biodistribution ou l’immunité adaptative. Les modélisations informatiques, comme les simulations de liaison médicament-récepteur, ou les réseaux d’interactions immunitaires, sont utilisées pour affiner les posologies ou prédire des toxicités, mais nécessitent toujours une validation expérimentale. Seule l’expérimentation animale permet d’intégrer la complexité de la réponse immunitaire, de la clairance, de la toxicité systémique et de l’efficacité dans un organisme complet. Ces approches non animales sont néanmoins systématiquement mobilisées en phase précoce pour sélectionner les meilleurs candidats et optimiser les doses.

Réduction

Nous utilisons systématiquement des tests alternatifs comme le test de viabilité cellulaire, l’essai de cytotoxicité, l’analyse de paramètres inflammatoires, ou encore des modèles d’organoïdes humains pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant toute phase expérimentale chez l'animal. Des modèles d'explant de poumon et de peau humaine reconstituée sont également utilisés pour évaluer la diffusion et l’irritation locale des produits candidats. Grâce à cette combinaison d’approches, nous réduisons significativement le nombre d’animaux utilisés tout en sécurisant la progression des thérapies testées.

Raffinement

Dans les études pharmacocinétiques, le raffinement repose sur des prélèvements sanguins peu invasifs (comme le micro-échantillonnage) et la réduction du stress par contention douce et habituation des animaux. L'utilisation de plans expérimentaux optimisés et de modèles bio-informatique permettent de raffiner nos protocoles. Le choix judicieux des temps de prélèvement et l'exploration de matrices alternatives (urine, salive) réduisent les interventions tout en assurant la qualité des données. Pour la détermination de la dose maximale tolérée, des protocoles adaptatifs avec escalade progressive des doses permettent de mieux contrôler l’apparition de toxicités. Des grilles d’évaluation clinique précises assurent l’arrêt rapide du traitement en cas de signes de souffrance. L’inclusion de biomarqueurs précoces permet d’anticiper les effets délétères avant qu’ils ne deviennent irréversibles. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. Par exemple, l’apparition de signes cliniques graves tels qu'une respiration difficile, ou une perte de réponse à un stimulus conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqûre...).

Choix des espèces

L’utilisation de la souris et du rat pour les procédures de détermination de la dose maximale tolérée et d’études pharmacocinétiques repose sur des considérations scientifiques, réglementaires et techniques. D’une part, la souris est l’espèce de référence en infectiologie préclinique, en raison de sa petite taille, de sa sensibilité bien documentée à de nombreux agents infectieux, et de la disponibilité de lignées standardisées. Elle permet une évaluation rapide de la tolérance aiguë d’un composé et de ses premiers paramètres pharmacocinétiques dans un modèle robuste, avec un nombre limité d’animaux et un faible volume de substance requis. D’autre part, le rat est utilisé en complément ou en seconde intention, car il permet des prélèvements sanguins en série plus volumineux, offrant une meilleure résolution temporelle dans l’analyse pharmacocinétique, et il est plus adapté à certaines voies d’administration. La complémentarité entre ces deux espèces permet donc d’obtenir des données fiables et conformes aux exigences des agences réglementaires. Dans le cadre des procédures de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, seuls des animaux adultes sexuellement matures ou jeunes adultes seront utilisés. Il s’agit d’un choix visant à garantir une réponse pharmacologique homogène, une tolérance physiologique suffisante, et une réduction des variables liées au développement ou au vieillissement. Chez la souris, les animaux seront âgés de 6 à 10 semaines, un stade où la croissance est stabilisée, la physiologie métabolique est mature, et le volume des fluides corporels est adapté aux manipulations et aux prélèvements sans risque excessif. Chez le rat, les animaux seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel les volumes sanguins autorisent des prélèvements sériels et où les capacités d’absorption, de métabolisme et d’élimination sont représentatives de l’âge adulte.

Pour vérifier qu'un procédé de fabrication n'a pas rendu un vaccin contre la fièvre jaune plus virulent, 4 000 souris de quatre semaines reçoivent une injection directement dans le cerveau, sous anesthésie gazeuse de cinq minutes, puis sont observées trois semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour un examen histologique de leurs organes. Le porteur attend comme effets des signes de neurovirulence, paralysie et incapacité à se déplacer et à se nourrir, et écarte l'analgésie au motif qu'elle ajouterait une piqûre ou fausserait l'inflammation observée. Il cite une méthode in vitro publiée, "BBB-Minibrain", qu'il juge trop variable, et conclut que le test sur des animaux non-humains reste exigé par les lignes directrices de l'OMS pour libérer les lots.

Objectifs

Afin de répondre aux exigences de la réglementation, la neurovirulence de nouveaux vaccins en développement qui ont un tropisme pour le système nerveux central doit être comparée avec un vaccin de référence pour assurer et documenter le maintien de l’atténuation au cours de la multiplication virale lors du processus de fabrication. Le vaccin contre la fièvre jaune est un vaccin vivant atténué ayant un tropisme pour le système nerveux. Le caractère vivant atténué de ce vaccin implique un risque potentiel, lors du processus de fabrication, de réversion vers un phénotype plus virulent. Administré chez l’homme, un vaccin avec une virulence excessive pourrait entrainer des signes adverses graves tels qu’une encéphalite et une paralysie des nerfs crâniens. La réglementation demande donc que la stabilité du vaccin au cours du processus de fabrication soit évaluée en amont afin de garantir la sécurité des personnes qui recevront une injection vaccinale. Le projet vise donc à administrer des dilutions de vaccin contre la fièvre jaune à des souris, hébergées pendant une durée adaptée pour observer l’apparition éventuelle de symptômes cliniques neurologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : Valider le processus de fabrication de vaccins contre la fièvre jaune Contribuer in fine au développement de vaccins sûrs pour l’Homme et conformes aux spécifications et aux textes de référence en vigueur

Procédures

Administration unique de moins d’une minute sous anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes, pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Signes cliniques caractéristiques de la neurovirulence du virus étudié (paralysie, incapacité à se déplacer et à se nourrir…). Effets secondaires transitoires liés à l’anesthésie (étourdissement et perte d'équilibre brefs suite à l’anesthésie).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes et faire une évaluation histologique.

Remplacement

A ce jour, Il existe une méthode in vitro « BBB-Minibrain », décrite mais cette approche repose sur l’utilisation de cellules primaires nécessitant plusieurs jours de différenciation. À l’issue de ce processus, il a été observé une forte variabilité, ce qui limite considérablement la fiabilité de la méthode. Ainsi, même si un développement a été réalisé et publié, cette méthode ne permet pas une comparaison robuste et reproductible des vaccins à tester selon les exigences règlementaires des lignes directrices. Dans ce projet, l’évaluation de la neurovirulence se fait en évaluant les signes cliniques et les points limites, dans l’engagement à respecter les exigences réglementaires et à garantir la qualité et la sécurité du vaccin requis par les lignes directrices en vigueur (WHO TRS872 annexe 2, Appendix 3). Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par la ligne directrice. Il n'existe pas des méthodes in vitro validés et acceptés par les autorités pour évaluer la sécurité de lots de vaccin de la fièvre jaune obtenus par culture sur œuf.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés au total est calculé au plus juste de façon à répondre aux exigences réglementaires afin d’obtenir des résultats robustes et exploitables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, bâtonnet et matériel de nidification) et dans des conditions environnementales appropriées pour cette espèce. L’injection intracérébrale par voie transcutanée consiste en une simple injection avec une aiguille de 27G très rapide (30 secondes), sans résistance, sans chirurgie (pas d’incision) ni utilisation de cadre stéréotaxique, sur un animal sous anesthésie (moins de 5 minutes) à des concentrations d'Isoflurane assurant l’inconscience de l’animal et donc l’absence de douleur ressentie pendant l’injection. La voie d’injection utilisée n’induit pas plus de douleur qu’une injection intrapéritonéale et moins qu’une injection intraveineuse ou intramusculaire et l’administration d’un analgésique (par exemple la lidocaïne pour éviter tout biais sur l’inflammation attendue) n’est pas pertinente car cela nécessiterait la réalisation d’une deuxième injection avant l’anesthésie donc une douleur et un stress pour l’animal (analgésique systémique) ou alors allongerait la durée de la procédure (analgésique local). L’administration d’un anti-inflammatoire n’est pas nécessaire et interfèrerait avec l’objectif de l’étude (évaluation de la neurovirulence). L’observation clinique des animaux témoins immédiatement après l’injection et lors du retour dans la cage après le réveil dans des études réalisées précédemment n’a pas montré de signes de douleur visible (absence de piloérection, prostration, abattement, posture voutée...). De plus le protocole d’étude doit être 100% comparable aux études antérieures pour ne pas apporter de biais dans les comparaisons de résultats. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués : En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire y compris l'euthanasie. En cas de de signes cliniques entrainant des difficultés pour accéder à la nourriture, des gels hydratants avec ou sans aliments pourront être rajoutés dans les cages des animaux afin qu'ils puissent se nourrir plus facilement, ainsi que des croquettes à même la litière.

Choix des espèces

L'espèce murine est largement décrite dans la littérature pour l'évaluation de la neurovirulence de virus neurotropiques. Les souris seront âgées de 4 semaines au moment de l’injection et seront observées pendant 3 semaines, tel que préconisé dans les lignes directrices.

Un son intense déclenche chez ces souris une crise d'épilepsie réflexe souvent suivie de la mort, et c'est cette mort que le projet mesure. 676 souris issues d'une sélection génétique pour leur sensibilité aux crises audiogènes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 638 recevant une injection d'antiépileptique avant une stimulation sonore de soixante secondes au plus, 38 la stimulation seule, celles qui survivent étant mises à mort ensuite. Un laboratoire pharmaceutique cherche à savoir si son médicament, déjà autorisé, protège de la mort subite qui suit une crise, seul ou associé à un autre. Le porteur annonce comme nuisances un stress sonore et la douleur d'une piqûre, et écrit que la convulsion "n'engendre pas de souffrance intrinsèquement", tout en retenant la létalité comme critère de mesure.

Objectifs

Le risque de mort subite chez un patient épileptique (SUDEP) est en moyenne trois fois plus élevé que dans la population saine. Aujourd'hui, on n'en connait pas la raison et beaucoup d'énergie est déployée pour mieux comprendre ce phénomène, chez l'Homme comme chez l'animal. Il existe un modèle de SUDEP chez la souris qui correspond à la présentation d'un son intense qui va déclencher une crise réflexe souvent suivie de la mort. Le bénéfice de ce modèle repose sur le fait qu'il n'est pas invasif et qu'il ne repose pas sur une stimulation électrique ou chimique. Un laboratoire pharmaceutique a développé un médicament ayant reçu une AMM (autorisation de mise sur le marché) dans le cas des formes d'épilepsie à haut risque de décès. Ce laboratoire cherche à savoir si ce médicament, au-delà de ses effets pour empêcher les crises d'épilepsie, pourrait s'avérer être aussi capable d'éviter un décès en cas de crise d'épilepsie. Le laboratoire cherche aussi à savoir si ce médicament, associé à un autre médicament ayant aussi une AMM, pourrait apporter un gain d'efficacité supplémentaire pour éviter les décès. Ce projet vise à répondre à ces questions sur un modèle souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'envisager l'emploi de médicaments anti-crises pour les patients épileptiques pour réduire le risque de mort subite qui peut succéder une crise d'épilepsie.

Procédures

638 souris aurons une injection (3 sec) et une stimulation auditive de 60 sec maximum. 38 souris aurons une stimulation auditive de 60 sec maximum.

Impact sur les animaux

Nous attendons deux types de nuisances : 1/ un stress induit par l'application d'un stimulus sonore intense et 2/ une douleur légère liée à la l'acte de la piqûre.

Devenir

Les animaux ne présentant pas de létalité après le test seront mis à mort. Ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude du fait qu'ils auront été sujets à une injection d'un médicament anti-crise.

Remplacement

Les crises d’épilepsie impliquent un grand nombre de modifications biologiques intégrées. L’animal ne peut pas être remplacé pour la compréhension de ces mécanismes biologiques intégrés.

Réduction

Notre modèle souris que nous emploierons dans ce projet, est issu d'une sélection génétique. Sa réponse optimale au test à la crise audiogène permet de réduire en moyenne par 3 le nombre de souris nécessaires si nous avions établi un protocole avec des lignées de souris classiques.

Raffinement

Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser toute souffrance des animaux. Ceci se traduit par une durée limitée du stress auditif (max 60 sec), une utilisation d'une cuve circulaire pour éviter les angles dans lesquels la souris pourrait se cogner. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle- même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas et qu'elle n'engendre pas de souffrance intrinsèquement. Néanmoins, si une souris présentait une convulsion qui ne s'arrêtait pas (status epilepticus), considérable comme un point limite, nous euthanasierons instantanément la souris par une dislocation cervicale et elle serait exclue du protocole. Cet événement ne nous est cependant jamais arrivé.

Choix des espèces

Seule la souris présente des crises audiogènes létales. Les animaux ne seront testés qu'une seule fois à l'âge de 33±3 jours ; ce qui correspond à un âge jeune de la souris (elle devient adulte à 8-10 semaines) et au pic de la sensibilité à la crise audiogène.

Les rats utilisés appartiennent à une lignée dont le système immunitaire est altéré et dont la rétine dégénère, choisie pour que la greffe de cellules humaines ne soit pas rejetée sans recourir à des traitements antirejet. 325 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit une chirurgie de quinze à vingt minutes pour recevoir dans l'espace sous-rétinien des photorécepteurs dérivés de cellules souches humaines, puis jusqu'à six séances mensuelles d'imagerie et d'électrorétinogramme sous anesthésie générale, un électrorétinogramme durant environ trente minutes. Tous sont tués en fin de procédure pour examiner la rétine et vérifier la survie des cellules greffées, le porteur affirmant par ailleurs qu'une injection dans le second œil reste sans impact parce que la rétine ne possède pas de récepteurs de la douleur.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendues artificiellement sensibles à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle. L’ajout d’une injection intraoculaire chez les animaux nécessite une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

Les travaux de thérapie cellulaire développées ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’obtenir un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d'édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.

Procédures

Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection de cellules (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et est réalisée une seule fois. l'anesthésie s'accompagne d'un traitement analgésique délivré avant le début de l'acte et en post-opératoire. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). [MODIFICATION] Une injection d’un indicateur d’activité cellulaire est réalisé sous anesthésie/analgésie. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure par des méthodes règlementaires pour des explorations post-mortem.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire et un risque accru d’infection en raison de l’immunité réduite. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. L’animal étant déjà anesthésié pour la procédure chirurgicale, par conséquent il n’y aura pas d’impact significativement négatif sur le fait de pratiquer une injection intra-oculaire dans chaque œil. La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur et, par conséquent, une injection dans l’œil contralatéral n'aura pas d'impact significatif sur la santé globale de l'animal. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.

Devenir

A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal. La capacité des cellules transplantées à répondre de manière intrinsèque à la lumière est entièrement évaluée et validée en amont par des approches in vitro permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans les deux yeux. Par ailleurs, la majorité des actes peut être réalisée sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 325 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importante des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à environ un quart des expérimentations (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.

Raffinement

Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux d’évaluation de la fonction visuelle, qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Les deux gestes chirurgicaux, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires. En raison du caractère immunodéficient des animaux, ces derniers sont hébergés dans des cages stérilisées et dans un portoir ventilé distinct avec étiquetage spécifique. Les manipulateurs changent de gants entre chaque animal lors du change ou des différents examens/gestes.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.

Capturées en nature pour les gambusies, issues d'une lignée élevée à 30 °C pour les médakas, 96 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié d'entre eux subit une montée rapide de température jusqu'à la perte d'équilibre, une fois, pendant quatre-vingts minutes, isolés par paires dans un aquarium nu. L'objet déclaré est de mettre au point un dosage d'enzymes qui permettrait ensuite d'estimer la limite thermique d'un poisson à partir d'un prélèvement de tissu. Le texte annonce 80 poissons tués pour les analyses et 16 replacés dans une bassine extérieure jusqu'à la fin de leur vie, alors que la fiche structurée du même projet n'en déclare que 8 gardés vivants.

Objectifs

Les effets du changement climatique sur les écosystèmes sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est d’identifier ses impacts sur la survie des espèces et la biodiversité. Pour cela, il est important de développer des indicateurs de vulnérabilité de la faune et la flore face au changement climatique. L'objectif de ce projet est d’examiner comment la température influence les réponses physiologiques du poisson médaka Oryzias latipes et de la gambusie Gambusia holbrooki et de développer un outil opérationnel pour l’évaluation des tolérances thermiques des poissons. Pour ce projet nous voulons utiliser les médakas issus d'une lignée élevée à 30°C ainsi que des gambusies que nous allons collecter en nature et que nous élèverons au laboratoire à 20°C. Il s'agira de réaliser des mesures de tolérance thermique et des dosages d'enzymes (qui régulent les dégats dans les cellules) sur les tissus de ces poissons pour déterminer si ces dernières peuvent servir de bioindicateur de la tolérance thermique des poissons. Si c’est le cas, cela permettrait de développer une nouvelle méthode qui permettrait d’estimer la limite thermique des poissons à partir d’un prélèvement de tissu et donc de limiter le recours à l’expérimentation animale. Nous testons deux espèces afin d’évaluer la généralité de l’approche.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances essentielles sur les limites thermiques des poissons afin d'apporter des réponses à la question de l’adaptation au changement climatique. Ainsi, pour chaque espèce nous définissons des gammes de températures tolérées et une valeur de température critique à partir de laquelle l'individu présente des performances fortement réduites. Dans un contexte de changement climatique, la valeur de tolérance thermique est cruciale puisqu’elle donne des informations concernant les températures maximales que peuvent tolérer un organisme. Néanmoins, on ne dispose pas encore de méthodes pour l'établir sans faire subir des chocs thermiques aux animaux. L’objectif de ce projet est donc de développer un outil de mesure logistiquement et éthiquement pertinent des tolérances thermiques individuelles en se basant sur l’analyse des concentrations des enzymes responsables de la régulation des dégats dans les cellules. Ce projet est novateur puisque la plupart des études de tolérance thermique utilisent des organismes élevés en laboratoire et ne considèrent pas les mécanismes moléculaires sous-jacents.

Procédures

Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre : 1 seule fois pendant 80 minutes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables potentiels pour les animaux incluent le stress lié à la capture, au transport et à la manipulation, ainsi que l’angoisse et la douleur pouvant survenir lors des tests de tolérance thermique. Ces dernières sont associées à la fois à l’élévation rapide de la température et à l’isolement temporaire des individus, placés par deux dans des aquariums expérimentaux, séparément de leur groupe. Les poissons seront exposés à une montée de température jusqu’à la perte d’équilibre. Toutefois, seuls 50 % d’entre eux seront soumis à cette procédure, et ce, une seule fois.

Devenir

A l'issu de cette procédure tous les poissons seront stabulés pendant 2 semaines. Ensuite 80 poissons seront euthanasiés pour les analyses à posteriori et les 16 poissons restants seront replacés dans une bassine de 1000L en extérieur, enrichie avec un écosystème complet (comme un mini-lac) jusqu'à la fin de leur vie.

Remplacement

L'écologie a pour objet l'étude de la dynamique des peuplements et des écosystèmes. Les recherches en écologie nécessitent donc d'intégrer des niveaux d'organisation du vivant allant jusqu'à l'écosystème, et il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses physiologiques des poissons. Nous utilisons les poissons car ils sont souvent les « top » prédateurs dans les écosystèmes aquatiques et jouent un rôle fonctionnel unique. De plus il y a très peu d’étude chez les vertébrés à "sang froid" concernant l’adaptation au changement climatique. Utiliser un modèle vertébré (le poisson) est donc très intéressant dans ce contexte et ce modèle ne peut pas être remplacé par un modèle invertébré car la physiologie et donc probablement l’adaptation physiologique thermique diffère entre ces deux groupes.

Réduction

Nous avons besoin au minimum de 40 poissons par espèce pour pouvoir statistiquement détecter une différence dans l'activité des enzymes entre températures. Nous prendrons 48 poissons par groupe, soit 8 poissons supplémentaires pour assurer une bonne puissance statistique et avoir une marge en cas de perte de marquage de plusieurs individus.

Raffinement

Les aquariums de stabulation seront enrichis avec des rochers, des plantes en aquaponie et des refuges fabriqués avec des briques. Ils seront très grands afin de favoriser des zones de repli et réduire le stress. Les aquariums expérimentaux (non enrichis, pour observer le "retournement" du poisson lors de la procédure) seront munis d’un fond opaque sur 3 côtés afin de limiter les stimuli visuels liés à la présence humaine. La présence des manipulateurs au-dessus des aquariums sera restreinte grâce à un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront équipés d’un bulleur pour assurer une concentration en oxygène dissous proche de 100 %. L’eau, issue de la rivière locale, est potabilisée (filtres mécaniques et UV). La température, le pH et l’oxygène dissous seront mesurés deux fois par semaine dans les aquariums de stabulation et au début/fin d’expérimentation. Les deux espèces, grégaires, seront maintenues en groupe (sans mâles pour éviter les gestations). Dans les aquariums expérimentaux, les poissons seront placés par deux pour limiter l’isolement. Les transferts se feront dans un bac de 2 L à fond noir pour limiter le stress. Les poissons seront capturés un par un avec une épuisette transparente, de couleur proche de l’environnement. L’éclairage des pièces sera tamisé pour protéger les poissons de la lumière directe. Des points limites prédéfinis sont pris en compte pour surveiller le bien-être animal et garantir l'intervention rapide en cas de souffrance. Un arbre décisionnel est appliqué afin de guider les actions à prendre selon l’état clinique observé. En cas de détérioration de l’état des poissons, des critères d’arrêt permettront la fin anticipée de l’expérimentation, dans le respect de la réglementation en vigueur. La retraite au sein de l’établissement est prévue pour les poissons surnuméraires.

Choix des espèces

Le médaka, par sa tolérance à une large gamme de température (0-40°C) nous permet d’étudier les mécanismes écologiques de réponse à la température depuis le gène (évolution rapide au laboratoire où les conditions optimales de croissances réduisent le temps de génération) jusqu'à l’écosystème entier (par exemple : mésocosmes aquatiques extérieurs). De plus son génome est connu (séquencé et assemblé) et il se reproduit en continu avec des temps de générations courts. Finalement il a une petite taille et il est tolérant à la manipulation. La gambusie et une espèce exotique envahissante que l'on retrouve sur le territoire français. Malgré une ecologie proche du médaka, son mode de reproduction est différent et donc a potentiellement un fonctionnement hormonal et enzymatique différent. La gambusie est une espèce récemment introduite sur le territoire, envahissante (favorisé par le réchauffement climatique) et avec un fort impat ecologique. Nous n'utiliserons que des adultes car nous avons besoin d'une quantité de tissu minimum

Pour savoir si des nanoparticules radiomarquées échappent assez longtemps au foie et aux défenses immunitaires pour atteindre une tumeur, 106 souris vont être utilisées, toutes tuées puis disséquées. Trente-six d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance légère et soixante-dix d'un niveau modéré, ces dernières recevant une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Chaque animal passe cinq séances d'imagerie nucléaire de dix minutes sous anesthésie, après injection d'un produit radioactif dans la veine de la queue, et un transport de deux heures trente à trois heures entre deux établissements. Les souris qui perdent trop de poids, deviennent léthargiques ou développent une tumeur jugée trop grosse sont retirées de l'étude et tuées.

Objectifs

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale qui permet d'obtenir des vues en deux ou trois dimensions de l'intérieur du corps avec une très grande précision anatomique. Elle n'utilise pas de rayons X, mais un champ magnétique puissant et des ondes radio pour créer des images détaillées des organes et des tissus mous. Ce projet se déroule entre deux EU différentes. Après avoir mené une première étude en laboratoire sur des cellules, ce projet a pour but de tester, sur des animaux vivants, de nouvelles substances issues des nanotechnologies. Ces substances pourraient améliorer les images médicales utilisées pour détecter et suivre l’efficacité du traitment du cancer. Elles combinent les avantages de deux techniques d'imagerie : la précision de l’IRM et la sensibilité de l’imagerie nucléaire. Cependant, un gros obstacle est que notre corps élimine ces substances très rapidement, en quelques minutes seulement. Le foie et le système immunitaire les repèrent et les capturent avant qu’elles n’aient le temps d’atteindre la tumeur. Pour éviter cela, on modifie leur surface avec des polymères (une sorte de revêtement spécial) pour qu’elles deviennent invisibles aux défenses du corps. Cela leur permet de rester plus longtemps dans le sang et d’avoir plus de chances d’atteindre la tumeur. Dans ce projet, nous allons d'abord tester trois types de ces revêtements et choisir ceux qui rendent les substances les plus « invisibles » pour le corps. Le but est qu’elles restent plusieurs heures dans le sang. Ensuite, sur des souris porteuses de tumeurs, nous testerons les deux meilleures versions. L’imagerie se fera avec un appareil spécialement conçu pour les petits animaux, sous anesthésie, afin d’éviter qu’ils ne bougent pendant la prise des images.

Bénéfices attendus

Ces nouvelles substances sont conçues pour que l’on puisse injecter des doses plus faibles et obtenir de meilleures images médicales. En effet, une seule méthode d’imagerie ne suffit pas toujours pour poser un diagnostic précis. C’est pourquoi il devient important de créer des produits capables de combiner deux techniques d’imagerie différentes et de viser précisément la zone malade. Ces produits "bimodaux" permettraient d’obtenir plus rapidement un diagnostic fiable et de choisir un traitement mieux adapté. Cela réduirait les effets secondaires, améliorerait la qualité des soins pour les patients et ferait aussi baisser les coûts pour le système de santé. Des études montrent que les professionnels de santé sont particulièrement intéressés par des substances qui combinent la précision des images IRM avec la sensibilité de l’imagerie nucléaire, car ces deux méthodes se complètent bien. Il existe d’ailleurs déjà des machines capables de faire ces deux types d’images en même temps. Pourtant, même si plusieurs études ont proposé des solutions, aucun produit de ce type n’est encore disponible pour un usage médical. Les nanomatériaux représentent de bons candidats pour développer ces outils, car ils peuvent être facilement modifiés pour mieux cibler les zones malades et combiner plusieurs fonctions.

Procédures

Suivant les procédures les animaux serons soumis : dans l'UE1 à une Injection de cellules cancéreuses sous la peau, cette étape dure environ 20 secondes. Elle est réalisée pendant que l’animal est endormi (sous anesthésie) afin de garantir un geste précis et sans douleur; et dans l'EU2 à cinq séances d’imagerie nucléaire, ces examens permettent d’observer ce qui se passe à l’intérieur du corps sans chirurgie. Ils sont réalisés sur des animaux anesthésiés pour qu’ils restent immobiles. Chaque séance dure environ 10 minutes et ne cause ni douleur ni traumatisme. Il y aura une injection intraveineuse sous anesthésie dans la veine de la queue de l’animal, sous anesthésie (procédure complète, incluant la préparation nécessite 10 minutes) qui permet d’administrer le produit radioactif nécessaire à l’imagerie.

Impact sur les animaux

L’imagerie nucléaire utilisée est non invasive et ne provoque que très peu de gêne pour les animaux. Le modèle de cancer, de sévérité modérée, ne sera utilisé qu’après une première phase de sélection des nanoparticules les plus prometteuses, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des antidouleurs seront administrés après la chirurgie si besoin.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu injection des nanoparticules seront disséqués post-mortem pour analyse de leurs organes.

Remplacement

Certaines étapes, comme la vérification de la stabilité et de la toxicité des nanoparticules, seront réalisées entièrement en laboratoire, sans animaux. En revanche, pour comprendre comment ces nanoparticules se répartissent dans le corps, sont éliminées (par les urines ou le foie) et ciblent les tumeurs, des tests sur de petits animaux sont indispensables. Ces études commenceront chez l’animal sain, pour évaluer leur comportement, avant de les tester sur un modèle tumoral afin de mesurer leur capacité à atteindre la tumeur.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, une méthode d’imagerie sera utilisée pour suivre les mêmes souris à différents moments (4h et 24h après l’injection). Cela réduit la variabilité entre les animaux et permet d’en limiter le nombre pour des temps différents. L’imagerie permettra de mesurer la répartition de nos nanoparticules dans les organes. Les analyses sur organes après mise à mort ne seront réalisées que pour les deux nanoparticules les plus prometteuses et aux moments les plus pertinents, identifiés grâce aux images, ce qui permet de réduire significativement le nombre total d’animaux.

Raffinement

La première phase de tests sera réalisée sur des souris saines afin de limiter l’utilisation d’animaux porteurs de tumeurs. Tous les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur. Ceux montrant des signes de souffrance (perte de poids importante, léthargie, tumeur trop grosse) seront retirés de l’étude et mis à mort. Un enrichissement adapté sera prévu dans chaque cage (igloo, tunnel, etc.). Pour les souris recevant une greffe de cellules tumorales, un antidouleur sera injecté avant l’intervention. Les animaux seront gardés au chaud et surveillés jusqu’à leur réveil. Si des signes de douleur apparaissent une nouvelle dose d’antidouleur sera administrée chaque jour jusqu’à amélioration. Un transport des animaux entre 2 EU sera fait par un transporteur agréé avec enrichissement dans les cages pour une durée de 2h30-3h.

Choix des espèces

Le modèle de souris est bien adapté pour évaluer les agents de contraste en imagerie. Comme chez l’humain, la souris possède une vésicule biliaire, ce qui permet d’observer une possible élimination par le foie. Le modèle de tumeur sous la peau est bien maîtrisé. Les souris utilisées seront jeunes adultes (entre 7 et 16 semaines), ayant atteint leur maturité. Pour étudier un effet spécifique tumoral des souris plus jeunes (6 semaines) recevront une greffe de cellules cancéreuses, et seront ensuite examinées par imagerie entre 7 et 10 semaines.