Procédures légères

Pour mesurer si une thérapie génique injectée dans le sang atteint le muscle, le cœur et la respiration, 1 120 souris issues d'une lignée reproduisant la maladie de Steinert vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement de queue pour génotypage, une injection du vecteur viral, des prises de sang répétées, puis une série de mesures qui totalisent plus de deux heures par animal, dont une épilation du thorax pour l'échographie cardiaque et la pose d'électrodes transcutanées. Le porteur signale un risque de blessures aux griffes lors du test d'agrippement et des irritations douloureuses après l'épilation. Une partie des souris nées de ces croisements n'a pas le génotype recherché, et le RNT indique qu'elles seront mises à mort sans jamais entrer dans l'expérience.

Objectifs

La Dystrophie Myotonique de type 1 ou maladie de Steinert est une maladie génétique rare sans traitement affectant tous les organes, mais caractérisée principalement par un problème de décontraction des muscles. Elle est causée par la perte d’activité d’une protéine, MBNL, dont le rôle est de régler les niveaux de dizaines de gènes. Son inactivation a donc des conséquences très importantes sur tous les organes (muscle, cœur, appareil respiratoire) et les patients les plus sévèrement atteints meurent prématurément des défaillances de ces organes. Des études réalisées sur des modèles cellulaires ou par injections locales dans des modèles de souris reproduisant la maladie ont permis de montrer que l’injection d’un traitement réactivant MBNL corrige les défauts de décontraction des cellules musculaires. Afin de vérifier l’efficacité du traitement au niveau du corps entier et de pouvoir traiter des patients humains, notre projet a pour objectif de tester l’efficacité du traitement donné par injection intraveineuse dans un modèle murin de la maladie. Cette approche devrait permettre au traitement d’atteindre tous les organes touchés et de corriger les défauts essentiels mortels (notamment les problèmes cardiaques et respiratoires). Dans un premier temps, le modèle murin de DM1 sera mis en reproduction et caractérisé au niveau des fonctions musculaire, cardiaque et respiratoire. Ensuite, deux études de recherche de la dose médicamenteuse seront réalisées : la première étude sera réalisée sur un temps court afin de déterminer la dose efficace, puis une seconde étude plus longue permettra de vérifier la persistance du traitement dans le temps.

Bénéfices attendus

La caractérisation du modèle de souris reproduisant la maladie de Steinert permettra de connaitre les symptômes, notamment au niveau des fonctions musculaires et cardiorespiratoires. Cette étude est nécessaire pour faire les meilleurs choix de tests et optimiser les temps de traitements et d’arrêt de l’étude thérapeutique qui sera faite dans un second temps. L’étude d’efficacité thérapeutique du traitement réactivant MBNL permettra de déterminer la meilleure dose pour le traitement de thérapie génique, ce qui servira à transposer la dose aux futurs essais cliniques qui seront réalisés chez les patients.

Procédures

Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection unique sur souris éveillée (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur souris éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésiée (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les souris seront soumises à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire et de la myotonie (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité globale (durée moyenne 15min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses des produits thérapeutiques, ce qui pourrait entrainer un stress et une douleur légère et passagère due à l’injection. Une douleur légère et passagère locale pourrait être ressentie au moment du prélèvement du petit morceau de queue réalisé à des fins de génotypage, ainsi qu’au moment des prélèvement de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisés pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les échocardiographies, par la pose d’électrodes transcutanées au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle (ENMG) ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire sur animal éveillé (pinch test, test d’agrippement) notamment si l’animal présente une blessure au bas du dos (pinch test) ou au niveau des griffes ou des pattes (test d’agrippement). L’ensemble de ces nuisances constitue pour l’animal un niveau global de contrainte léger à modérée.

Devenir

Les animaux sans génotype d’intérêt issue de la procedure de la caractérisation genetique seront mises à mort. Les animaux, avec génotype d’intérêt, utilisés pour la caractérisation du modèle et les études de recherche de la dose du produit thérapeutique seront euthanasiés à la fin du protocole pour récolter les tissus et les organes pour les analyses moléculaires, hématologique et histologique.

Remplacement

La maladie de Steinert est causée par la perte de fonction d’une protéine, MBNL, qui entraine des défauts dans les fonctions de nombreux organes, donc le cœur et la fonction respiratoire. Notre projet consiste à mesurer l'efficacité d’un médicament permettant d’activer à nouveau la protéine MBNL et de corriger ces pertes de fonction. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées dans des modèles de cellules car il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques). Il est également impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de notre médicament peut entrainer une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre le traitement, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 8 souris) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) et 3) l’obtention des souris non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant les tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles de la respiration. Lors de certains tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante et quand nécessaire, une application de gel oculaire sera réalisée pour augmenter le confort des animaux anesthésiés. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Les sites d’insertion des aiguilles seront désinfectés et en cas de signes d’infections ou d’inflammation, un traitement anti-inflammatoire et/ou antibiotique sera administré dans l’eau des biberons. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les souris étant des animaux grégaires, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements médicamenteux administrés dans l’eau de biberon s’avéraient nécessaires : dans ce cas, la période d’isolement serait réduite au maximum.

Choix des espèces

La maladie de Steinert affecte le bon fonctionnement des muscles, du cœur et de la respiration. A ce jour, des modèles murins, drosophiles et poisson-zèbres portant cette maladie ont été décrits. De ces trois modèles, la souris est le modèle le plus utile, car il est le seul modèle de mammifère et il développe des symptômes similaires à ceux observés chez les patients (atteinte des muscles, du cœur et de la respiration). Il permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la maladie. La caractérisation préalable du modèle entre les âges de 2 à 12 mois permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de bien choisir le temps de démarrage du traitement, afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.

802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune enchaînant des jeûnes de six heures, des incisions au bout de la queue et des séjours seule en cage de calorimétrie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un régime gras les rend obèses et hyperglycémiques avant de recevoir des analogues d'hormones digestives, une sonde télémétrique étant implantée sous anesthésie chez une partie d'entre elles au cours d'une chirurgie d'une heure. La mise à mort sert à prélever les organes pour l'histologie. Le porteur indique avoir écarté deux molécules sur cellules bêta-pancréatiques avant de passer à la souris, puis affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives non-animales appropriées" pour la suite.

Objectifs

Face au défi majeur que constitue la prise en charge de l’obésité et de ses nombreuses comorbidités, dont le diabète de type 2 (DT2), il devient crucial de développer des stratégies thérapeutiques innovantes et efficaces. Le diabète de type 2, largement associé à l’obésité, représente une véritable urgence de santé publique en raison de sa prévalence croissante. À ce jour, les traitements classiques ne permettent pas toujours un contrôle optimal de la maladie, soulignant ainsi la nécessité de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, l’émergence récente de molécules multi-agonistes, tels que les doubles agonistes et, plus récemment, les triples agonistes combinant les actions sur les récepteurs des incrétines ouvre de larges perspectives thérapeutiques. Ces nouvelles molécules permettent de cibler simultanément plusieurs voies métaboliques impliquées dans la régulation de la glycémie, de la sécrétion d'insuline et du métabolisme lipidique, en s’appuyant sur l’axe entéro-insulaire. Cette approche pluri-hormonale est ainsi particulièrement prometteuse pour améliorer la gestion du DT2, en optimisant la régulation métabolique. Plusieurs peptides aux propriétés métaboliques intéressantes ont été identifiés et étudiés. Parmi eux, un neuropeptide découvert pour ses effets incrétiniques, s’intègre parfaitement dans ce nouveau paradigme thérapeutique. En effet, il présente des effets bénéfiques sur la sécrétion d'insuline et la régulation de la glycémie, faisant de lui un candidat de choix pour être combiné à d’autres hormones dans le cadre de traitements pluri-hormonaux. Le projet s’inscrit pleinement dans cette dynamique et vise à concevoir, caractériser et évaluer, à la fois in vitro et in vivo, une première génération de molécules chimériques combinant les effets d'une incrétine traditionnelle et de cette nouvelle. L’objectif est de développer des molécules capables de potentialiser les effets thérapeutiques des agonistes actuels tout en explorant de nouvelles voies de régulation du métabolisme glucidique et lipidique, afin d'offrir une alternative prometteuse et plus efficace pour le traitement du diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient permettre des avancées majeures dans les domaines de la recherche fondamentale et biomédicale, avec des répercussions importantes pour la compréhension et le traitement des maladies métaboliques. Tout d'abord, il s'agit de concevoir de nouveaux doubles analogues, qui combinent les actions de différentes hormones impliquées dans la régulation du métabolisme glucidique. Ces molécules innovantes feront l'objet d'une caractérisation approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels elles interviennent dans le maintien de l'homéostasie du glucose, tant dans des conditions normales que dans des contextes physiopathologiques. Une attention particulière sera portée à l'analyse de leur impact sur les cellules β-pancréatiques, les tissus cibles de l'insuline, ainsi que sur les mécanismes de signalisation associés à la sécrétion et à l'action de l'insuline. Ce volet permettra d'élucider comment ces analogues peuvent corriger les perturbations métaboliques observées dans des états pathologiques comme l’obésité et le diabète de type 2. Ensuite, en nous basant sur les résultats obtenus lors de ces investigations, nous envisageons de proposer ces nouveaux analogues comme molécules prometteuses pour le développement de traitements pharmacologiques innovants. En effet, l'identification de telles cibles ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques complexes comme l’obésité et le diabète de type 2. Ces traitements viseront non seulement à restaurer une régulation efficace de la glycémie, mais aussi à corriger d’autres déséquilibres métaboliques associés à ces pathologies, en améliorant possiblement la sensibilité à l'insuline, la gestion des lipides et la réduction de l'inflammation systémique. Ce projet permettra d’évaluer le rôle potentiel thérapeutique d'une nouvelle classe de molécules incrétinomimétiques, en contribuant à la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées pour les patients souffrant d’obésité et de diabète de type 2.

Procédures

Les animaux subiront diverses expérimentations et prélèvements, sous anesthésie ou en état de veille. Pour le suivi glycémique, des prélèvements sanguins seront effectués à l’extrémité de la queue. Une semaine de repos sera respectée entre chaque expérimentation pour la récupération sanguine. Une chirurgie d’une heure sous anesthésie permettra d’implanter une sonde télémétrique pour un suivi continu de la glycémie. Pour l’analyse tissulaire, les animaux seront placés sous anesthésie profonde en vue d’une chirurgie sans réveil. Enfin, pour le suivi métabolique, ils seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte avant d’être regroupés avec leurs congénères.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par le peptide seul n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures. Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Afin de suivre la glycémie, un implant télémétrique sera introduit au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par l’utilisation d‘analgésiques adaptés. Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6h avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : Perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux. Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique. Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : isolement des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à morts afin de prélever les organes pour permettre une étude histologique.

Remplacement

Pour mieux comprendre la fonction des doubles analogues, nous caractérisons leurs effets en sélectionnant les deux molécules les plus prometteuses sur des lignées de cellules bêta-pancréatiques, ainsi que sur des lignées cellulaires préalablement transfectées avec les récepteurs d'intérêt. Cette méthode permet de réduire considérablement l'utilisation d'animaux dans les premières phases de l'étude. Toutefois, pour appréhender pleinement le rôle physiologique et physiopathologique de ces doubles analogues dans l'ensemble des systèmes de l'organisme, des études in vivo sont indispensables, car il n'existe pas d'alternatives non-animales appropriées à ce stade. Dans ce contexte, la grenouille a déjà été utilisée dans des recherches antérieures, ayant conduit à l'identification du peptide d'intérêt. Les études ultérieures menées chez les mammifères ont confirmé son rôle crucial dans la régulation du métabolisme énergétique et glucidique, ce qui en fait un candidat de choix pour un développement thérapeutique visant les maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2. Une approche physiologique complète ne peut être réalisée que grâce à des études sur des modèles mammifères, qui offrent la meilleure approximation des processus physiologiques humains. Ces modèles sont essentiels pour évaluer les effets des doubles analogues dans un contexte proche de la physiologie humaine et pour envisager leur potentiel en tant que traitement innovant contre le diabète et l’obésité.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistiques. Ceci permet de réduire au plus juste le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Ces calculs ont été réalisé avec EDA (Experimental Design Assistant), ils prennent en compte l’« effect size » prévu (estimé par nos précédentes études et adapté selon la significativité scientifique de la différence, c’est-à-dire la différence minimale ayant une conséquence scientifique significative), la déviation standard prenant en compte la variabilité inter-individuelle, le type de test statistique prévu, la puissance statistique et le risque alpha. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à minimum trois individus par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. Pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle des doubles analogues dans la régulation de l’homéostasie glucidique et de comprendre les mécanismes d’actions de ces peptides. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

6025 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 5950 d'entre elles, toutes tuées à l'issue pour prélever tissus, sang et organes. Elles sont épilées à la crème dépilatoire puis rasées chaque semaine, reçoivent des composés quotidiennement, subissent jusqu'à trois prises de sang en sept jours, des mesures d'inflammation répétées, des prises de température par voie rectale et jusqu'à quatre imageries sous anesthésie gazeuse en une semaine. Le porteur décrit des rougeurs, des gonflements, une desquamation, des démangeaisons et un comportement de grattage, et pour les modèles humanisés une réaction du greffon contre l'hôte avec diarrhées, alopécie et perte de poids. Les traitements espérés visent les 20 à 30 % de patients atteints de dermatite atopique ou de psoriasis qui ne répondent pas aux thérapies existantes, et le porteur conclut que les tests in vitro et in silico ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées telles que la dermatite atopique et le psoriasis touchent environ de 4% de la population mondiale. Ces pathologies inflammatoires chroniques de la peau se manifestent par des plaques rouges, et des démangeaisons. Il s'agit le plus souvent d'une maladie bénigne, mais il existe des formes sévères. L’approche envisagée n’est pas spécifique d’une pathologie donnée mais plutôt des voies mécanistiques conduisant à des pathologies liées à l’exacerbation de l’immunité locale chez le patient. Le projet vise à caractériser les modifications de la réponse immunitaire et à identifier les voies de signalisation cellulaire impliquées dans ces pathologies. Ce projet a également pour but d’évaluer l'efficacité et la sécurité de nouvelles molécules thérapeutiques sur les facteurs et voies contribuant aux symptômes des maladies inflammatoires de la peau (évaluation de l’impact de ces molécules sur la modulation des réponses immunitaires, détermination des doses optimales et des profils de sécurité). Environ 20 à 30 % des patients ne répondent pas aux thérapeutiques existants ou n’entrent pas en rémission totale. Il est donc nécessaire de développer des nouvelles thérapies pour ces patients et d’améliorer les modalités vers des traitements par voie orale.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer des modèles de souris pour mieux comprendre les inflammations de la peau, comme celles qu’on retrouve dans l’eczéma, la dermatite atopique ou le psoriasis. Ces modèles permettront aux chercheurs d’étudier en détail comment le système immunitaire réagit, comment les cellules interagissent entre elles, et de tester de nouvelles pistes de traitement. À court terme, cela aidera à identifier des molécules capables de calmer les inflammations, qu’elles soient soudaines ou chroniques. L’objectif est de trouver des traitements efficaces, sûrs et adaptés à plusieurs maladies de peau. L’approche choisie ne se limite pas à une seule maladie, mais s’intéresse aux mécanismes communs à plusieurs troubles liés à une réaction excessive du système immunitaire. Nous utiliserons aussi des techniques d’imagerie avancées pour suivre, sans intervention invasive, comment les traitements se diffusent dans le corps et sont éliminés. Cela permettra de mieux comprendre leur fonctionnement et leur efficacité. À plus long terme, les résultats de ce projet enrichiront les connaissances scientifiques sur les maladies inflammatoires et immunitaires. Ces données seront partagées avec la communauté scientifique et pourront servir à faire avancer les essais cliniques et à obtenir les autorisations nécessaires pour mettre de nouveaux médicaments sur le marché. L’imagerie pourrait même, à terme, aider au diagnostic ou au suivi de ces maladies chez les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : -Une épilation à la crème dépilatoire et entretien par rasage : intervention optionnelle (seulement en cas d’application de composé sur la peau du dos) : 5 minutes maximum, 1 fois et entretien 1 fois par semaine (Imagerie). -Des administrations de composés: 1 minute maximum, quotidiennement ou de manière plus espacée dans le temps. -L’administrations de cellules immunitaires recombinantes ou non pour un traceur d’imagerie (pour le suivi en imagerie en particulier): intervention optionnelle, 1 minute maximum, 1 seule fois. -Des prises de sang : environ 15 secondes, au plus 3 fois sur une durée de 7 jours. -Des mesures de l’inflammation : environ 15 secondes, quotidiennement ou de manière plus espacée dans le temps. -Des analyses par imagerie : 5-25 minutes maximum sous anesthésie gazeuse, au plus 4 fois sur une durée de 7 jours puis deux fois par semaine. L’ensemble des interventions serons réalisées préférentiellement les unes à la suite des autres (réduction du nombre de contention) et pendant les anesthésies gazeuses (imagerie) pour réduire le plus possible la douleur et/ou le stress qui pourraient être engendrés chez les souris.

Impact sur les animaux

Réactions inflammatoires (rougeurs, gonflements, desquamation) et systémiques (perte de poids, allopecie, léthargie). Démangeaisons et comportement de grattage suite à la réponse immunitaire allergique induite par une sensibilisation de la peau . Réponse de greffe contre l’hôte dans le cas des modèles humanisés et qui se traduit perte de poids, baisse activité, diarrhées, alopécie. Les prises de températures (par voie rectale) peuvent engendrer un inconfort de courte durée.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant participé à l’étude sera mis à mort à la fin de celle-ci car des prélèvements post-mortem de tissus, de sang et d’organes seront nécessaires à l’études des mécanismes immunitaires impliqués dans les pathologies inflammatoires cutanées.

Remplacement

L'utilisation de modèle d’inflammation cutanée est cruciale pour le développement et l'évaluation de nouvelles thérapies pour les maladies d’hypersensibilité cutanée complexes. Ces modèles permettent d'étudier les réponses cellulaires de l’immunité dans un environnement contrôlé, offrant ainsi une approche unique pour comprendre les interactions cellulaires responsables des symptômes et des mécanismes physiopathologiques spécifiques de chaque maladie. Ils surmontent les limitations des systèmes in vitro et in silico, qui ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier. Les tests in vitro, bien qu'utiles pour étudier les réponses cellulaires, ne peuvent pas reproduire les interactions dynamiques dans les organes lymphoïdes secondaires ou entre le système immunitaire et d'autres systèmes. Les modèles in silico, limités par la complexité biologique et la qualité des données, ne peuvent pas remplacer complètement les études in vivo. Par conséquent, les modèles animaux restent nécessaires pour obtenir des données pertinentes et transposables à l'humain. En intégrant des phases aigues et chroniques de chaque hypersensibilité cutanée, ces modèles offrent une vue d'ensemble des réponses immunitaires et des effets des traitements dans un contexte physiologique complet, essentiel pour développer des thérapies efficaces et sûres. Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe car, aucune méthode substitutive fiable d’évaluation in vitro ou in silico d’une molécule ne permet de répondre à toutes les interactions in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétition des mesures dans le temps), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés en fonction de la méthode d’imagerie employée et de l’importance des effets mis en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. De manière générale, seules les molécules thérapeutiques ayant préalablement démontré une activité inhibitrice/modulatrice de la réponse inflammatoire in vitro dans des essais fonctionnels pourront faire l’objet d’une évaluation in vivo dans nos modèles. Enfin, ces modèles permettent de maximiser les données obtenues à partir d’un nombre minimal d’animaux en utilisant des techniques de mesure précises et des protocoles optimisés. Par exemple, l’utilisation de techniques avancées permet de recueillir des données détaillées sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires à partir de petits échantillons. Le recours aux méthodes de suivi des études par imagerie non invasive, longitudinales permettent de limiter le nombre d’animaux en autorisant un suivi dynamique et multi-paramètrique de la réponse d’un même animal à un traitement, l’imagerie permet de recueillir des données détaillées sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires à partir de petits échantillons. Les paramètres de distribution du composé ou de l’évolution de la réponse inflammatoire au traitement sont mesurés pour chaque souris de façon non invasive en fonction du temps pour le même animal. Et plusieurs paramètres sont suivis en simultané à chaque session d’imagerie permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans l’étude.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions garantissant l’absence de contamination. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse et un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris (abri, enfouissement, nidification…). Un apport nutritif (gel hydrique, gel boost…) pourra être mis en place dans la cage, jusqu’à la fin de l’étude, pour y faciliter l’accès des animaux. Les techniques de manipulation douce comme la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages spéciales permettent de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux et permettant de mettre en place rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites pour chaque procédure, une fréquence accrue des observations et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. Dans certains cas comme l’injection intradermique ou intramusculaires, les animaux seront anesthésiés afin de limiter le stress ou la douleur. Les prises d’images sont réalisées sous anesthésie gazeuse permettant une réduction des temps d’anesthésie et une meilleure récupération qu’avec une anesthésie par voie injectable. Les appareils d’imagerie sont thermostatés à environ 37°C. Après chaque anesthésie, les souris sont suivies jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou chauffées à 23°C. De plus les études d’imagerie permettent de documenter le devenir du composé testé dans le corps d’un animal vivant et de valider les propriétés thérapeutiques des composés à l’échelle du corps entier, pour préparer le protocole d’évaluation des composés sélectionnés dans les phases cliniques en vue de l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau traitement chez l’homme. Le recours aux techniques d’imagerie non invasive permet d’envisager dans certain cas de transposer la méthode au diagnostic de la pathologie ou au suivi de l’activité thérapeutique chez le patient.

Choix des espèces

La souris est un modèle privilégié en pharmacologie grâce à son génome similaire à celui des humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. La facilité d’utilisation (petite taille, cycle de reproduction), la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives, la disponibilité des modèles et la faible variabilité de réponse permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets robustes et reproductibles. Les souris adultes sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines d’âge, pour leur poids relativement stable en fin de croissance et un système immunitaire mature.

Produire et génotyper des rats porteurs d'une myopathie myotubulaire, pour alimenter d'autres projets du laboratoire : 3000 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2250 d'entre eux et modéré pour 750. L'acte infligé se limite à un prélèvement de tissu de la queue sur animal vigile, en même temps que l'identification, une seule fois dans leur vie et en moins de deux minutes. La part modérée vient de la maladie elle-même, une faiblesse musculaire et une atteinte locomotrice que la lignée reproduit, et le porteur indique tuer les animaux avant l'apparition des symptômes quand aucun projet ne les attend. Les autres sont gardés en vie pour la reproduction ou une utilisation continue. Les 600 rats par an annoncés reposent sur l'historique de production de l'établissement, et le porteur ajoute que ce chiffre pourra évoluer selon de nouvelles orientations scientifiques.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux afin de maintenir une souche de rats génétiquement altérée nécessaire à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie de la myopathie myotubulaire dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour une maladie génétique humaine grave, rare et orpheline de médicaments à partir d'un modèle murin mimant cette maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de myopathie myotubulaire.

Procédures

Les prélèvements de tissus de queue se font sur animaux vigiles. Cet acte se fait en même temps que l'identification individuelle des animaux et n’est pratiqué qu’une seule fois au cours de la vie des animaux. Au total, moins de 2 minutes sont nécessaires pour réaliser ce double geste. A considérer comme étant de gravité légère.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu (queue) sur jeunes animaux vigiles. La contention d’animaux jeunes peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs de la pathologie étudiée dans notre laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux ou gardé en vie pour la reproduction ou une utilisation continue.

Remplacement

Un effort de remplacement est réalisé en amont et en parallèle de ce projet. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions scientifiques dans des modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études scientifiques ne se fait que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions. Par exemple lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des maladies neuromusculaires, ou la distribution d’un traitement dans l’ensemble d’un organisme.

Réduction

Nous avons prévu d’utiliser un total de 3000 rats pour satisfaire les besoins de l'ensemble des études pour les 5 années à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 600 rats par année pour la lignée de rat objet de ce dossier, soit un total de 3000 rats sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.

Raffinement

Dans ce projet, les rats mimant la myopathie myotubulaire seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (igloo en cellulose, bâtonnets de bois pour ronger, éléments pour la confection des nids, copeaux, tunnel, etc. et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe (sexage). De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice, aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et apétant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour transférer les animaux d'une cage à l'autre lors du change des litières, les zootechniciens soulèvent délicatement les animaux par le corps et utilisent leurs des tubes-maisons pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l’identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie post-natale par prélèvement d’un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore différenciés.

Choix des espèces

Le rat a été choisi comme animal modèle car cet animal a pu être modifié génétiquement afin de présenter une altération génétique responsable de l’apparition de la myopathie myotubulaire qui est l'un des axes de recherche de notre Equipe de recherche. Ce modèle reproduit les signes cliniques et pathologiques de la maladie connue chez les patients, ce qui inclus une faiblesse musculaire et une insuffisance respiratoire. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce afin de réaliser l’identification et le prélèvement pour génotypage (biopsie), et aux stades sexuellement matures pour la reproduction.

Pour savoir si un réseau de neurones de l'hypothalamus peut devenir une cible de traitement contre l'obésité et le diabète de type 2, 733 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le protocole alimentaire provoque un surpoids et une hyperglycémie chronique. Jusqu'à six fois, à une semaine d'intervalle, chaque souris peut être mise à jeun de 6 à 16 heures, puis subir une incision au bout de la queue et une prise de sang toutes les 15 minutes pendant deux heures. Le porteur annonce un isolement en cage d'enregistrement pour le suivi métabolique "avant d'être réunis avec leurs congénères préalablement connus", puis écrit que cet hébergement individuel est "minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test".

Objectifs

Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations de ce réseau de neurones, ainsi que son fonctionnement. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.

Bénéfices attendus

De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles et anatomiques de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.

Procédures

- Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6 à 16 heures avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test. Une semaine de repos minimum leur sera donnée entre chaque expérimentation. - Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés dans des cages d’enregistrement permettant d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : hébergement individuel inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, de caractériser les altérations neuroanatomiques ainsi que du fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec un site en ligne qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort.

Choix des espèces

Seul un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète. Nous pourrons ainsi explorer dans un contexte d’obésité/diabète, les altérations des réseaux de neurones hypothalamiques, des systèmes moléculaires d’intérêts, et de leurs répercussions sur leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.