Procédures légères

106 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées puis disséquées pour analyser leurs organes. Une partie reçoit une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, toutes passent cinq séances d'imagerie nucléaire sous anesthésie et une injection dans la veine de la queue, avec un transport de deux heures trente à trois heures entre deux établissements. Le projet teste trois revêtements polymères censés rendre des nanoparticules d'imagerie invisibles aux défenses de l'organisme, pour qu'elles atteignent la tumeur avant d'être captées par le foie. Le porteur décrit ces séances d'imagerie comme non invasives et ne causant "ni douleur ni traumatisme", et affirme dans le même texte que des tests sur de petits animaux sont "indispensables" pour savoir où les nanoparticules se répartissent.

Objectifs

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale qui permet d'obtenir des vues en deux ou trois dimensions de l'intérieur du corps avec une très grande précision anatomique. Elle n'utilise pas de rayons X, mais un champ magnétique puissant et des ondes radio pour créer des images détaillées des organes et des tissus mous. Ce projet se déroule entre deux EU différentes. Après avoir mené une première étude en laboratoire sur des cellules, ce projet a pour but de tester, sur des animaux vivants, de nouvelles substances issues des nanotechnologies. Ces substances pourraient améliorer les images médicales utilisées pour détecter et suivre l’efficacité du traitment du cancer. Elles combinent les avantages de deux techniques d'imagerie : la précision de l’IRM et la sensibilité de l’imagerie nucléaire. Cependant, un gros obstacle est que notre corps élimine ces substances très rapidement, en quelques minutes seulement. Le foie et le système immunitaire les repèrent et les capturent avant qu’elles n’aient le temps d’atteindre la tumeur. Pour éviter cela, on modifie leur surface avec des polymères (une sorte de revêtement spécial) pour qu’elles deviennent invisibles aux défenses du corps. Cela leur permet de rester plus longtemps dans le sang et d’avoir plus de chances d’atteindre la tumeur. Dans ce projet, nous allons d'abord tester trois types de ces revêtements et choisir ceux qui rendent les substances les plus « invisibles » pour le corps. Le but est qu’elles restent plusieurs heures dans le sang. Ensuite, sur des souris porteuses de tumeurs, nous testerons les deux meilleures versions. L’imagerie se fera avec un appareil spécialement conçu pour les petits animaux, sous anesthésie, afin d’éviter qu’ils ne bougent pendant la prise des images.

Bénéfices attendus

Ces nouvelles substances sont conçues pour que l’on puisse injecter des doses plus faibles et obtenir de meilleures images médicales. En effet, une seule méthode d’imagerie ne suffit pas toujours pour poser un diagnostic précis. C’est pourquoi il devient important de créer des produits capables de combiner deux techniques d’imagerie différentes et de viser précisément la zone malade. Ces produits "bimodaux" permettraient d’obtenir plus rapidement un diagnostic fiable et de choisir un traitement mieux adapté. Cela réduirait les effets secondaires, améliorerait la qualité des soins pour les patients et ferait aussi baisser les coûts pour le système de santé. Des études montrent que les professionnels de santé sont particulièrement intéressés par des substances qui combinent la précision des images IRM avec la sensibilité de l’imagerie nucléaire, car ces deux méthodes se complètent bien. Il existe d’ailleurs déjà des machines capables de faire ces deux types d’images en même temps. Pourtant, même si plusieurs études ont proposé des solutions, aucun produit de ce type n’est encore disponible pour un usage médical. Les nanomatériaux représentent de bons candidats pour développer ces outils, car ils peuvent être facilement modifiés pour mieux cibler les zones malades et combiner plusieurs fonctions.

Procédures

Suivant les procédures les animaux serons soumis à : Une Injection de cellules cancéreuses sous la peau (réalisé dans un EU) : Cette étape dure environ 20 secondes. Elle est réalisée pendant que l’animal est endormi (sous anesthésie) afin de garantir un geste précis et sans douleur. Cinq séances d’imagerie nucléaire (réalisé dans le second EU) : Ces examens permettent d’observer ce qui se passe à l’intérieur du corps sans chirurgie. Ils sont réalisés sur des animaux anesthésiés pour qu’ils restent immobiles. Chaque séance dure environ 10 minutes et ne cause ni douleur ni traumatisme. Une injection intraveineuse sous anesthésie : L’injection se fait dans la veine de la queue de l’animal, sous anesthésie. Elle permet d’administrer le produit radioactif nécessaire à l’imagerie. La procédure complète, incluant la préparation, dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

L’imagerie nucléaire utilisée est non invasive et ne provoque que très peu de gêne pour les animaux. Le modèle de cancer, de sévérité modérée, ne sera utilisé qu’après une première phase de sélection des nanoparticules les plus prometteuses, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des antidouleurs seront administrés après la chirurgie si besoin.

Devenir

Tous les animaux sont sacrifiés en fin de procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu injection des nano-sondes seront disséqués post-mortem pour analyse de leurs organes.

Remplacement

Certaines étapes, comme la vérification de la stabilité et de la toxicité des nanoparticules, seront réalisées entièrement en laboratoire, sans animaux. En revanche, pour comprendre comment ces nanoparticules se répartissent dans le corps, sont éliminées (par les urines ou le foie) et ciblent les tumeurs, des tests sur de petits animaux sont indispensables. Ces études commenceront chez l’animal sain, pour évaluer leur comportement, avant de les tester sur un modèle tumoral afin de mesurer leur capacité à atteindre la tumeur.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, une méthode d’imagerie sera utilisée pour suivre les mêmes souris à différents moments (4h et 24h après l’injection). Cela réduit la variabilité entre les animaux et permet d’en limiter le nombre pour des temps différents. L’imagerie permettra de mesurer la répartition de nos nanoparticules dans les organes. Les analyses sur organes après mise à mort ne seront réalisées que pour les deux nanoparticules les plus prometteuses et aux moments les plus pertinents, identifiés grâce aux images, ce qui permet de réduire significativement le nombre total d’animaux.

Raffinement

La première phase de tests sera réalisée sur des souris saines afin de limiter l’utilisation d’animaux porteurs de tumeurs. Tous les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur. Ceux montrant des signes de souffrance (perte de poids importante, léthargie, tumeur trop grosse) seront retirés de l’étude et mis à mort. Un enrichissement adapté sera prévu dans chaque cage (igloo, tunnel, etc.). Pour les souris recevant une greffe de cellules tumorales, un antidouleur sera injecté avant l’intervention. Les animaux seront gardés au chaud et surveillés jusqu’à leur réveil. Si des signes de douleur apparaissent une nouvelle dose d’antidouleur sera administrée chaque jour jusqu’à amélioration. Un transport des animaux entre 2 EU sera fait par un transporteur agréé pour une durée de 2h30-3h.

Choix des espèces

Le modèle de souris est bien adapté pour évaluer les agents de contraste en imagerie. Comme chez l’humain, la souris possède une vésicule biliaire, ce qui permet d’observer une possible élimination par le foie. Le modèle de tumeur sous la peau est bien maîtrisé. Les souris utilisées seront jeunes adultes (entre 7 et 16 semaines), ayant atteint leur maturité. Pour étudier un effet spécifique tumoral des souris plus jeunes (6 semaines) recevront une greffe de cellules cancéreuses, et seront ensuite examinées par imagerie entre 7 et 10 semaines.

Issus d'un élevage sélectif poursuivi sur huit générations, 1868 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal du groupe résistant subit une plongée simulée d'une heure quarante en caisson hyperbare avant de se reproduire pour former la génération suivante, les témoins passant le même temps à pression atmosphérique. Le porteur indique que les symptômes de l'accident de décompression provoquent chez ces rats une douleur qu'il qualifie de modérée et de moins de deux minutes, et que seul l'élevage sélectif permet de séparer les individus résistants de ceux qui sont à risque. 1410 rats seront tués pour prélever leurs organes, 248 proposés à l'adoption et 210 réutilisés.

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques. L’objectif de ce projet est de mettre en œuvre un programme d’élevage sélectif chez le rat basé sur la résistance à l’ADD afin d’identifier les mécanismes associés à la résistance à cette pathologie.

Bénéfices attendus

Les études précédentes ont clairement montré l’existence d’une composante héréditaire dans la résistance à l’accident de décompression, mais sans en révéler les mécanismes. Les résultats de ce projet représenteront les premières données concernant les gènes impliqués ou leur régulation dans le cadre de l’accident de décompression et, plus largement, de la plongée. A court terme, les bénéfices portent donc sur une meilleure caractérisation des gènes et des voies métaboliques et de signalisation qui modulent la résistance à l’ADD. A moyen terme, L’utilisation d’un modèle murin présentant une grande variabilité génétique favorisera le transfert à l’Humain. A plus long terme, l’identification des déterminants génétique permettrait alors une détection plus précise du risque individuel d’ADD et ouvrirait la voie à une approche de type médecine de précision pour adapter les procédures de décompression en fonction du risque individuel. La sécurité des plongeurs s’en trouverait ainsi améliorée en évitant les accidents avec respect des tables.

Procédures

Les animaux faisant partie de la souche résistante à l'accident de décompression subiront une seule plongée simulée dans un caisson hyperbare adapté d'une durée de 1 heure 40 minutes avant de se reproduire pour former la génération suivante jusqu'à atteindre 8 générations. Les animaux contrôles suivent le même processus mais sans l’exposition hyperbare, remplacée par un séjour de même durée à pression atmosphérique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - pour les animaux des groupes "contrôles" et "résistants" : - Le stress, d’intensité légère à modérée, généré par le transport entre les deux établissements utilisateurs (d’une durée de 15 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Elle dure 1h40 min mais son intensité reste légère – -Uniquement pour les animaux du groupe "résistants" : la douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD pendant la période d’observation à l’issue de l’exposition hyperbare. Cette nuisance est modérée et dure moins de 2 minutes.

Devenir

•1410 animaux reproducteurs et issus des élevages seront mis à mort pour prélever les organes et permettre les analyses biologiques. •Sur les 458 animaux restants, en accord avec la structure chargée du bien-être animal : - 38 reproducteurs initiaux et 210 animaux issus des générations suivantes seront proposés à l’adoption, soit un total de 248 rats. - Les 210 animaux issus des générations successives non adoptés seront réutilisés.

Remplacement

Bien que l’existence d’une importante variabilité interindividuelle de la résistance à l’accident de décompression soit largement démontrée, son origine est encore quasiment inconnue. Il est donc encore impossible de distinguer dans une population « normale » quel individu est à risque élevé et quel autre est résistant. L’élevage sélectif est donc la seule stratégie permettant de séparer deux populations d’individus dont la résistance à l’accident de décompression est connue a priori ; Or, ce type d’expérimentation n’est possible ni chez l’Humain, ni sur des modèles cellulaires.

Réduction

Le nombre d’animaux soumis protocole hyperbare correspond au minimum nécessaire pour obtenir 15 couples reproducteurs dans le groupe Résistants, afin de prévenir une éventuelle morbidité ou mortalité indépendante des conditions expérimentales ; cet effectif a été déterminé lors de projets précédents. Le nombre d'animaux obtenus lors des accouplements, (entre 50 et 70 rats de chaque sexe) permet également d’éviter les croisements consanguins. Nous avons besoin d'une différence de 20% du taux d’ADD entre les groupes pour détecter un effet de la sélection sur la résistance à l’accident de décompression.

Raffinement

Tous les animaux seront suivis en appliquant des points limites stricts et spécifiques du projet. Le transport entre les deux établissements utilisateurs peut générer un stress (visible dès le changement de cage), les animaux seront laissés au calme 1 heure avant l’exposition hyperbare. Cette dernière sera étroitement surveillée par les concepteurs. Avant chaque exposition, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson ouvert afin de réduire le stress induit par le changement d’environnement. Entre deux plongées simulées consécutives, le caisson est aéré à l’aide d’air comprimé pour éliminer toute odeur laissée par les animaux précédents.

Choix des espèces

Le Rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression pour cette espèce. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. De plus, l’utilisation de la souche murine « génétiquement hétérogène » devrait faciliter le futur transfert de connaissances à l’Humain. Chez le Rat, en plus de dépendre du sexe, le risque d’accident de décompression augmente avec la masse corporelle, le pourcentage de masse grasse et l’âge. 11 semaines au moment de l’expérimentation hyperbare permet à la fois d’être certain que les animaux, mâles et femelles, ont atteints le stade de « jeunes adultes », matures sexuellement, tout en conservant une masse et un pourcentage de masse grasse suffisamment modérés pour masquer le moins possible les facteurs génétiques qui déterminent la résistance à l’ADD.

Jusqu'à dix examens d'imagerie sous anesthésie générale le premier jour, trois par jour les trois jours suivants, puis un par jour jusqu'au dixième jour et deux par semaine jusqu'à la fin de l'étude : 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent le produit testé en une ou plusieurs injections, le porteur annonçant "un effort" pour ne pas en dépasser cinq, parfois dans le coussinet d'une patte, ce qui peut gêner la marche, ou dans l'œil, avec un risque de glaucome ou de perte de vision. Le seul bénéfice annoncé est de contribuer "à la mise sur le marché de nouveaux produits". La souris est retenue pour sa petite taille, qui permet l'imagerie du corps entier. Les souris dont les organes sont prélevés sont tuées, et les autres pourront être gardées en vie pour la formation du personnel, 30 étant déclarées réutilisées.

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché d’un produit ou d'un médicament nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique permet d'améliorer les dosages et la posologie du produit ou du médicament. Elle permet également de déterminer les voies d'administrations optimales. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez la souris. Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents.. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de déterminer les dosages, la posologie, la voie d'administration et les effets sur l'organisme d'un produit ou d'un médicament sans un organisme vivantLe recours à lexpérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), soit environ 5 minutes avec l’anesthésie. Des examens d'imagerie pourront également être réalisés, avec parfois injection d’un produit de révélation, sous anesthésie générale pendant une durée de 5 à 20 minutes. la fréquence des examens sera au maximum de 10 acquisitions par jour le premier jour puis, de 3 acquisitions par jour pour les 3 jours suivants, 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour et de 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 3 fois par semaine la première semaine puis 1 fois par semaine. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : sous-cutanée dans le coussinet du pied qui peut gêner la locomotion de l’animal et donc l’accès à l’eau et la nourriture et les injections intravitréennes pouvant altérer la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.

Devenir

Les animaux dont un prélèvement d’organe est nécessaire seront euthanasiés. Il sera possible de réaliser une quantification des produits ex-vivo par organe grâce à de l’imagerie optique ex-vivo ou par d’autres techniques in-vitro. Les souris dont les organes ne doivent pas être prélevés pourront soit être gardés en vie et réutilisés pour la formation du personnel.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 6 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 minimum sera respectée (7 jours minimum en cas de transport par avion). Les animaux seront tous hébergés collectivement en cage sauf en cas particuliers scientifiquement justifiés (comme par exemple l'animal contrôle pourrait être isolé pour ne pas être contaminé par ses congénères). En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre un contact visuel et olfactif avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire sera apporté à l’animal isolé. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre, le plus rapidement possible, les mesures nécessaires soit de traitement (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux dont l’état clinique serait jugé irréversible. Le poids des animaux sera mesuré tout au long des études et pourra être complété par un score clinique basé sur l’état général de l’animal (comportement de l’animal, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou non), la présence d’écoulement nasaux et oculaires, des difficultés respiratoires) et en lien avec l’injections du produit testé (inflammation, lésion, nécrose, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture, œil-mi-clos, fermé ou glaucome). Des examens cliniques plus approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (mise en place de traitements, injection de solutions réhydratantes, etc…) à condition qu’ils n’interfèrent pas avec les produits test injectés.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi : - Pour sa taille réduite et parce qu’il permet l’utilisation de technique d’imagerie du corps entier, - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des souris de plus de 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g.

849 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 809 tuées pour les prélèvements et 40 reproducteurs réutilisés. À l'âge de zéro à deux jours, des nouveau-nés reçoivent sous anesthésie une injection d'outils génétiques dans la moelle épinière, séparés trois heures de leur mère avec un risque de cannibalisme maternel au retour. D'autres subissent le gavage de leur mère gestante, cinq injections quotidiennes dans l'abdomen entre cinq et sept jours de vie, une biopsie de la queue, puis cinq tests comportementaux à l'âge adulte que le porteur ne nomme pas. Les retombées annoncées, restaurer la marche après une lésion de la moelle épinière, sont renvoyées au long terme, tandis que l'objectif immédiat est de décrire le dialogue entre cellules gliales et neurones, ce que le porteur affirme ne pouvoir faire qu'en étudiant l'animal dans son ensemble.

Objectifs

La locomotion repose sur une activation précise des muscles pour produire des mouvements rythmiques efficaces. La moelle épinière régule les fonctions locomotrices de base via un réseau de cellules spécifiques, appelées neurones. Ce réseau de neurones, localisé dans la région ventromédiane de la moelle épinière est appelé générateur central de patrons (CPG). Bien que de nombreuses études aient exploré l’organisation cellulaire et le fonctionnement du CPG, on ignore encore comment ce réseau de neurones se forme au cours du développement et quelles cellules y participent. Répondre à cette question est essentiel pour concevoir des thérapies visant à restaurer les fonctions locomotrices chez les patients atteints de pathologies de la moelle épinière. Des découvertes récentes ont mis en évidence le rôle d’un autre type de cellules, appelées cellules gliales, dans le CPG. Notre projet propose d’explorer comment ces cellules gliales interagissent entre-elles et avec le réseau de neurones constituant le CPG. Notre étude vise donc à déterminer (1) le rôle des cellules gliales dans la modulation des rythmes locomoteurs et (2) comment l’activité de ces cellules influence la maturation de la posture et de la locomotion.

Bénéfices attendus

Notre projet représentera une avancée majeure dans la compréhension du rôle des cellules gliales dans la génération des rythmes locomoteurs au sein du CPG. Étant donné que les troubles cérébraux et les maladies neurodégénératives sont associés à des altérations des fonctions des cellules gliales, une meilleure compréhension du dialogue entre les neurones et les cellules gliales de la moelle épinière est nécessaire. Notre projet ouvrira de nouvelles perspectives sur le rôle des cellules gliales et élargira le champ des cibles thérapeutiques pour restaurer le bon fonctionnement du CPG lorsqu’il est compromis, favorisant ainsi la récupération des fonctions locomotrices après une lésion de la moelle épinière ou dans les maladies motrices dégénératives.

Procédures

1- Selon les cas, les souris nouveau-nées (âge : 0-2 jours) recevront une injection dans la moelle épinière d’outils génétiques sous anesthésie. (Chirurgie : 20 min ; séparation de la mère : 3h) 2- Selon les cas, les souris recevront un produit pharmacologique à différentes périodes précises : # prénatale (stade embryonnaire : 10 et 11 jours) : les femelles gestantes recevront une administration orale du produit pharmacologique dissout dans une solution appétente. Si cette méthode s’avère inefficace, un gavage sera nécessaire. (Gavage : 5 min ; surveillance : 30 min) # périnatale (âge : 5-7jours) et post-sevrage (âge : 25-30 jours) : les souris recevront des injections quotidiennes dans la cavité abdominale du produit pharmacologique pendant cinq jours consécutifs. (Injection : 1 min ; surveillance : 10 min) 3- Une partie des animaux passera également un ensemble de tests comportementaux à l’âge adulte (âge : 50-60 jours). Les souris seront soumises à 5 tests répartis sur 1 à 2 jours (Sortie de l’animalerie : 4h/jour). 4- L’utilisation d’animaux transgéniques nous amènera à effectuer des biopsies de la queue en vue du génotypage. (Biopsie : 1 min; Taille de la biopsie : 1 mm).

Impact sur les animaux

1- L’injection dans la moelle épinière d’outils génétiques est associée à un stress lié à la séparation temporaire de la mère et à un risque de cannibalisme maternel. 2- Selon les cas, les souris recevront un produit pharmacologique à différentes périodes précises : # prénatale (stade embryonnaire : 10 et 11 jours) : Si l’administration orale volontaire de ce produit aux femelles gestantes s’avère inefficace, le gavage sera nécessaire. Cette méthode génèrera du stress et de l’inconfort liés à la manipulation, avec un risque d’irritation ou de lésions des muqueuses buccales, pharyngées ou œsophagiennes si la procédure est mal exécutée. # périnatale (âge : 5-7jours) et post-sevrage (âge : 25-30 jours) : Les injections quotidiennes du produit pharmacologique dans la cavité abdominale pendant cinq jours consécutifs provoqueront du stress et de l’inconfort en raison des manipulations répétées. De plus, l'administration de ce produit pourrait altérer la fonction locomotrice des animaux. Dans ce cas, les animaux nécessiteront une surveillance accrue afin de détecter toute anomalie. Si des altérations trop importantes sont observées, un changement de modèle sera envisagé. Dans le cas où les animaux injectés présenteraient des déficits locomoteurs les empêchant d’accéder à la nourriture, des croquettes seront déposées dans le fond de la cage. 3- Les tests peuvent induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. 4- Les biopsies de la queue engendreront un stress et une douleur au niveau de la queue des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour les prélèvements, à l'exception des animaux reproducteurs réalisant la biopsie de la queue qui seront réutilisés dans la mesure du possible.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions entre les cellules gliales de la moelle épinière lors de l'initiation d'un rythme locomoteur. Cet objectif ne peut être atteint qu’en étudiant l’animal dans son ensemble et il ne peut être réalisé sur le sujet humain.

Réduction

Les animaux qui effectueront les tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses post-mortem. Les données seront normalisées par rapport aux contrôles de la même portée afin d’éviter tout biais lié à la portée. Lorsqu’il nous restera des échantillons, ils seront mis à disposition d’autres membres de l’équipe ou du laboratoire travaillant sur des thématiques similaires ou ils seront utilisés pour des formations. Lorsque les nouveau-nés ne peuvent rentrer dans ce projet car la mise-bas a eu lieu un week-end ou un jour où nous ne pouvons pas expérimenter, les autres groupes de recherche du laboratoire expérimentant sur cette souche sont prévenus afin qu’ils puissent rentrer ces animaux dans leurs projets.

Raffinement

Lors de l’injection dans la moelle épinière d’outils génétiques, les animaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Tout au long de l’acte et de la phase de réveil, nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Afin de limiter le cannibalisme maternel, nous essayons de réduire le stress des mères (1) en leur fournissant une grande quantité de matériel de nidification, (2) en ne les manipulant qu’avec des tunnels et (3) en essayant au maximum que les petits gardent leur odeur initiale quand on les sépare de la mère (litière de la cage d’origine). Nous favoriserons l'administration orale du produit pharmacologique dissout dans une solution appétente, une approche douce qui devrait minimiser le stress des animaux. Le personnel sera formé à la réalisation de cette méthode, qui sera ensuite soigneusement contrôlée pour minimiser tout risque de douleur, de souffrance ou de stress supplémentaire. Pour minimiser le stress et l'inconfort liés aux injections dans la cavité abdominale du produit pharmacologique, nous veillons à utiliser des aiguilles de petite taille pour réduire au maximum la douleur au site d'injection. Après chaque injection, les animaux sont surveillés attentivement pendant 10 minutes pour détecter tout signe de détresse ou de complications. Il est probable que l'administration du produit pharmacologique altère la fonction locomotrice des animaux. Dans ce cas, une surveillance accrue sera réalisée afin de détecter toute anomalie. Si des altérations trop importantes sont observées, un changement de modèle sera envisagé. Dans le cas où les animaux injectés présenteraient des déficits locomoteurs les empêchant d’accéder à la nourriture, des croquettes seront déposées dans le fond de la cage. Pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Une période d’habituation de 15 minutes par jour pendant 4 jours est respectée dans la pièce d’expérimentation avant le début de passages d’essai qui seront réalisés durant 10 min pour familiariser les animaux avec chaque dispositif, réduisant ainsi l’impact du stress lié à la nouveauté et à la manipulation.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus pertinente pour notre étude car (1) ce modèle est très bien maitrisé dans notre équipe de recherche et (2) notre projet implique l'utilisation de souris transgéniques. Les injections d’outils génétiques dans la moelle épinière des souris seront réalisées à la naissance (âge : 0-2 jours). Les souris seront ensuite mises à mort à trois stades clés du développement : prénatal (âge : 5-7 jours), post-sevrage (âge : 25-30 jours) et adulte (âge : 50- 60 jours) afin de suivre l’évolution des interactions entre les cellules gliales au cours du développement à l’aide d’une technique d’imagerie. Selon les cas, les animaux recevront des administrations d'un produit pharmacologique à trois stades de développement distincts : stade embryonnaire 10 et 11 jours, de 5 jours à 10 jours après la naissance (périnatal) ou de 25 jours à 30 jours après la naissance (post-sevrage). Ce produit aura pour effet d’inactiver les cellules gliales. Nous pourrons alors explorer l’effet de l’inactivation des cellules gliales à des périodes clés du développement sur le schéma locomoteur (tests comportementaux) et l’organisation anatomique du CPG (analyses tissulaires de la moelle épinière). Les tests comportementaux seront réalisés sur souris adultes (âge : 50-60 jours).

Une chirurgie cérébrale de quarante-cinq minutes à une heure, puis une injection dont le porteur attend une douleur, un gonflement, une proptose et un traumatisme oculaire : 54 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Certaines sont imagées éveillées, la tête maintenue immobile. L'objectif reste exploratoire, vérifier qu'une sonde fluorescente permet de suivre le réseau mitochondrial dans le cortex vivant, et le porteur indique qu'aucune approche statistique n'a été retenue puisque l'étude fonctionne en go/no-go. Il justifie le choix de la souris par la proximité de son système nerveux central avec celui de l'être humain et par la facilité à obtenir des animaux génétiquement modifiés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester si une technique d'imagerie (microscopie 2 photons) nous permettrait de visualiser et de quantifier la activité mitochrondrial in vivo

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre l’activité de l’ensemble du réseau mitochondrial dans le cortex cérébral in vivo. Elle fournira de nouvelles pistes d’exploration pour l’étude du métabolisme cellulaire in vivo. Les maladies mitochondriales constituent un ensemble de maladies génétiques, souvent héréditaires. Elles peuvent avoir un impact majeur sur le pronostic vital des patients, et il n’existe actuellement aucun traitement curatif. La mise au point d’une sonde fluorescente permettant d’étudier la dynamique du réseau mitochondrial contribuera, à long terme, à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies mitochondriales et, par la suite, à l’élaboration de nouvelles pistes thérapeutiques pour leur traitement.

Procédures

- Les souris recevront, une injection (3 minutes maximum). 1 heure, 24 heures ou 48 heures plus tard, les souris suivront une chirurgie terminale sans réveil (5 minutes). - Les souris suivront une chirurgie cérébrale (entre 45 minutes et 1 heure). Deux semaines plus tard, ils recevront une injection unique (3 minutes maximum). 1 heure, 24 heures ou 48 heures plus tard, les souris suivront une séance d’imagerie sous analgésie et anesthésie générale pour certains et pour d’autres à l’état vigile avec séances d’habitation aux séances d’imagerie.

Impact sur les animaux

- Injection sous anesthésie gazeuse, qui entraînera un stress léger lié à l’anesthésie. Suite à l’injection, les effets indésirables attendus sont une douleur, un gonflement autour du site d'injection, une proptose et un traumatisme oculaire. - Injection sans anesthésie: Stress léger lié à la contention (moins d’une minute), douleur légère (moins d’une minute) due à l’injection, gonflement autour du site d'injection. - Chirurgie cérébrale : Stress léger lié à l’anesthésie, douleur, hypothermie, faible perte de poids, déshydratation, faible risque d’infection au site d’incision, immobilité, diminution de l’interaction avec les congénères. - Imagerie sous anesthésie : Stress léger lié à l’anesthésie, hypothermie. - Imagerie chez les animaux éveillés : stress léger lié à la contention de la tête.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.

Remplacement

Plusieurs phases de ce projet ont été effectuées in vitro sur différentes lignées cellulaires . Actuellement, nous souhaitons analyser si cette sonde fluorescente est également adaptée à l’étude de l’ensemble du réseau mitochondrial in vivo, en temps réel. Cela nous permettra de mieux comprendre la physiologie de ce réseau dans les circuits neuronaux du cortex cérébral. L'utilisation d'animaux est donc inévitable.

Réduction

Dans le cadre de cette étude pilote, plusieurs mesures sont mises en place afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. L'absence d’approche statistique se justifie par la nature exploratoire de l’étude, évitant ainsi d’inclure un grand nombre d’animaux pour des analyses quantitatives prématurées. De plus, l’approche "go/no-go" permet d’arrêter les expérimentations dès l’obtention de résultats concluants, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, l’utilisation de la microscopie sur des animaux imagés à plusieurs reprises dans des études longitudinales optimise la collecte de données et diminue le besoin d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les mesures que nous avons mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales incluent l’utilisation d’anesthésie et d’analgésie, ainsi que des mesures de raffinement, notamment un contrôle continu de la température tout au long des procédures chirurgicales. Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur, avec une surveillance renforcée pendant les phases expérimentales. L’évaluation des points limites, adaptés aux procédures, se fera selon une grille d’évaluation spécifique. En fonction des signes cliniques observés, des mesures conservatoires sont prévues, telles que des soins appropriés et l’administration de traitements antalgiques. Si la récupération ne s’effectue pas, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Cela contribue à mieux comprendre les mécanismes à une échelle cellulaire ainsi qu’au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modèle souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité́ des procédures chirurgicales.

Produire par élevage sélectif, sur huit générations, une lignée de rats résistants à l'accident de décompression : 1 868 rats vont être utilisés, 1 170 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 698 un niveau léger. Chaque animal de la lignée résistante subit une plongée simulée d'une heure quarante dans un caisson hyperbare, précédée d'un transport entre deux établissements, avant d'être mis à la reproduction. Le porteur décrit la douleur des symptômes de l'accident de décompression, qui apparaissent après la sortie du caisson, comme modérée et durant moins de deux minutes. La finalité déclarée touche la sécurité des plongeurs, avec l'espoir lointain d'un dépistage individuel du risque. Sur les 1 868 rats, 1 410 sont tués pour prélever leurs organes, 248 proposés à l'adoption et 210 réutilisés.

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques. L’objectif de ce projet est de mettre en œuvre un programme d’élevage sélectif chez le rat basé sur la résistance à l’ADD afin d’identifier les mécanismes associés à la résistance à cette pathologie.

Bénéfices attendus

Les études précédentes ont clairement montré l’existence d’une composante héréditaire dans la résistance à l’accident de décompression, mais sans en révéler les mécanismes. Les résultats de ce projet représenteront les premières données concernant les gènes impliqués ou leur régulation dans le cadre de l’accident de décompression et, plus largement, de la plongée. A court terme, les bénéfices portent donc sur une meilleure caractérisation des gènes et des voies métaboliques et de signalisation qui modulent la résistance à l’ADD. A moyen terme, L’utilisation d’un modèle murin présentant une grande variabilité génétique favorisera le transfert à l’Humain. A plus long terme, l’identification des déterminants génétique permettrait alors une détection plus précise du risque individuel d’ADD et ouvrirait la voie à une approche de type médecine de précision pour adapter les procédures de décompression en fonction du risque individuel. La sécurité des plongeurs s’en trouverait ainsi améliorée en évitant les accidents avec respect des tables.

Procédures

Les animaux faisant partie de la souche résistante à l'accident de décompression subiront une seule plongée simulée dans un caisson hyperbare adapté d'une durée de 1 heure 40 minutes avant de se reproduire pour former la génération suivante jusqu'à atteindre 8 générations. Les animaux contrôles suivent le même processus mais sans l’exposition hyperbare, remplacée par un séjour de même durée à pression atmosphérique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - pour les animaux des groupes "contrôles" et "résistants" : - Le stress, d’intensité légère à modérée, généré par le transport entre les deux établissements utilisateurs (d’une durée de 15 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée d'intensité légère et d'une durée de 1h40 min. -Uniquement pour les animaux du groupe "résistants" : la douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD pendant la période d’observation à l’issue de l’exposition hyperbare. Cette nuisance est modérée et dure moins de 2 minutes.

Devenir

•1410 animaux reproducteurs et issus des élevages seront mis à mort pour prélever les organes et permettre les analyses biologiques. •Sur les 458 animaux restants, en accord avec la structure chargée du bien-être animal : - 38 reproducteurs initiaux et 210 animaux issus des générations suivantes seront proposés à l’adoption, soit un total de 248 rats. - Les 210 animaux issus des générations successives non adoptés seront réutilisés.

Remplacement

Bien que l’existence d’une importante variabilité interindividuelle de la résistance à l’accident de décompression soit largement démontrée, son origine est encore quasiment inconnue. Il est donc encore impossible de distinguer dans une population « normale » quel individu est à risque élevé et quel autre est résistant. L’élevage sélectif est donc la seule stratégie permettant de séparer deux populations d’individus dont la résistance à l’accident de décompression est connue a priori ; Or, ce type d’expérimentation n’est possible ni chez l’Humain, ni sur des modèles cellulaires.

Réduction

Le nombre d’animaux soumis protocole hyperbare correspond au minimum nécessaire pour obtenir 15 couples reproducteurs dans le groupe Résistants, afin de prévenir une éventuelle morbidité ou mortalité indépendante des conditions expérimentales ; cet effectif a été déterminé lors de projets précédents. Le nombre d'animaux obtenus lors des accouplements, (entre 50 et 70 rats de chaque sexe) permet également d’éviter les croisements consanguins. Nous avons besoin d'une différence de 20% du taux d’ADD entre les groupes pour détecter un effet de la sélection sur la résistance à l’accident de décompression.

Raffinement

Tous les animaux seront suivis en appliquant des points limites stricts et spécifiques du projet. Le transport entre les deux établissements utilisateurs peut générer un stress (visible dès le changement de cage), les animaux seront laissés au calme 1 heure avant l’exposition hyperbare. Cette dernière sera étroitement surveillée par les concepteurs. Avant chaque exposition, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson ouvert afin de réduire le stress induit par le changement d’environnement. Entre deux plongées simulées consécutives, le caisson est aéré à l’aide d’air comprimé pour éliminer toute odeur laissée par les animaux précédents.

Choix des espèces

Le Rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression pour cette espèce. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. De plus, l’utilisation de la souche murine « génétiquement hétérogène » devrait faciliter le futur transfert de connaissances à l’Humain. Chez le Rat, en plus de dépendre du sexe, le risque d’accident de décompression augmente avec la masse corporelle, le pourcentage de masse grasse et l’âge. 11 semaines au moment de l’expérimentation hyperbare permet à la fois d’être certain que les animaux, mâles et femelles, ont atteints le stade de « jeunes adultes », matures sexuellement, tout en conservant une masse et un pourcentage de masse grasse suffisamment modérés pour masquer le moins possible les facteurs génétiques qui déterminent la résistance à l’ADD.

À un à trois jours de vie, des souriceaux reçoivent une injection de 10 à 20 microlitres d'anticorps humains qui provoquent le pemphigus, une maladie auto-immune qui décolle la peau. Des cloques et des érosions apparaissent, avec une sensibilité accrue, une mobilité réduite et une perte de poids attendues, sous observation clinique plusieurs fois par jour. Trois jours plus tard au maximum, les souriceaux sont tués pour prélever leur sang total. 388 souris sont concernées, 312 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 76 en souffrance légère, les mères gestantes étant incluses parce qu'elles restent avec leur portée. Le porteur retient ce stade nouveau-né parce qu'il rend le modèle "plus rapide (3 jours maximum) et plus simple à mettre en œuvre" que le même protocole chez des souris adultes.

Objectifs

Le pemphigus est une maladie auto-immune rare et sévère dans laquelle le système immunitaire attaque par erreur certaines parties de la peau. Cela provoque la formation de cloques et d’érosions douloureuses. Les traitements actuels reposent surtout sur des médicaments qui affaiblissent le système immunitaire, ce qui peut entraîner des effets secondaires importants et ne permet pas toujours de bien contrôler la maladie. Il est donc important de développer de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. L’objectif de cette étude est de tester de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle de pemphigus développé chez la souris nouveau-née. Ce modèle est plus rapide (3 jours maximum) et plus simple à mettre en œuvre que celui utilisé chez les souris adultes (plus complexes et longs à mettre à place). Il permet d’évaluer si des traitements peuvent limiter ou empêcher l’apparition des lésions bulleuses provoquées par l’injection d’anticorps responsables de la maladie. L’étude comprendra une observation des signes visibles sur la peau, un examen des tissus affectés au microscope, ainsi qu’une analyse de la réaction immunitaire. Ces méthodes permettront de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’identifier des signes précoces de gravité. Les effets de plusieurs molécules candidates seront testés à différents moments du développement de la maladie. Leur efficacité sera évaluée en fonction de la gravité des lésions, de la réponse inflammatoire et de la présence des anticorps responsables dans le sang. Ce projet vise à établir un cadre expérimental fiable et reproductible pour aider à identifier de nouvelles pistes de traitement contre cette maladie encore difficile à soigner car dépourvue de traitements ciblés spécifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter des avancées majeures dans la prise en charge du pemphigus en explorant de nouvelles molécules et formulations thérapeutiques. L’approche adoptée permettra d’optimiser l’efficacité des traitements tout en réduisant les effets secondaires associés aux stratégies immunosuppressives actuelles. À court terme, la mise en place d’un modèle expérimental rigoureux permettra d’identifier des cibles thérapeutiques prometteuses et d’évaluer précisément l’impact de différentes doses et formulations. L’étude des interactions entre molécules testées et mécanismes immunopathologiques du pemphigus fournira des données essentielles pour orienter les futurs essais précliniques. L’optimisation des protocoles expérimentaux garantira également une meilleure prédictibilité des résultats et facilitera la sélection des stratégies thérapeutiques les plus pertinentes. À long terme, les découvertes issues de ce projet pourraient conduire au développement de traitements innovants capables de bloquer efficacement la pathogénicité des auto-anticorps impliqués dans le pemphigus. La mise en évidence de synergies entre différentes molécules pourrait permettre de réduire les doses nécessaires, limitant ainsi les risques d’effets indésirables tout en améliorant l’efficacité globale des traitements. De plus, l’établissement d’un protocole de dosage précis et reproductible pourrait bénéficier à d’autres pathologies auto-immunes partageant des mécanismes similaires. En favorisant l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques ciblées et mieux tolérées, ce projet contribuera à améliorer significativement la qualité de vie des jeunes patients atteints de pemphigus et ouvrira la voie à des stratégies médicales plus personnalisées et sécurisées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions brèves, non chirurgicales, au cours de trois types d’études : pilote, détermination de dose et confirmation de dose. Les souriceaux, âgés de un à trois jours, recevront une ou deux injections de petit volume (10 à 20 µL), par voie topique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, contenant soit des anticorps pathogènes humains, soit un traitement à tester. L’injection durera quelques secondes. Les animaux seront ensuite replacés auprès de leur mère. Des observations cliniques seront réalisées plusieurs fois par jour, sans contention ni prélèvement. Pour certaines études, une prise de vue sera effectuée après une anesthésie par hypothermie légère (2–3 minutes), rapidement réversible. La durée totale de participation de chaque souriceau ne dépassera pas trois jours. Aucune procédure chirurgicale, ni contention prolongée, ne sera pratiquée. Toutes les manipulations seront effectuées par du personnel formé dans des conditions adaptées au bien-être animal.

Impact sur les animaux

La mise en place de ce modèle expérimental implique l’induction d’un état pathologique chez les souris néonatales, susceptible d’entraîner divers effets indésirables. L’administration d’auto-anticorps pathogènes peut provoquer des lésions cutanées caractéristiques du pemphigus, se traduisant par l’apparition de bulles et d’érosions épidermiques. Ces atteintes peuvent induire une gêne locale, une sensibilité accrue et un risque accru d’infections secondaires. En raison de la souffrance cutanée, les souriceaux pourraient présenter une mobilité réduite ou un comportement moins actif, traduisant un état de faiblesse. Ceci pourrait entraîner une altération de la prise alimentaire, donc une diminution du poids corporel est attendue. Un stress physiologique et comportemental, manifesté par une agitation, une léthargie ou une altération de l’interaction avec la mère, est également envisageable. Ces effets indésirables devraient être transitoires, leur durée dépendant de la sévérité des lésions et de l’efficacité des traitements testés. L’état des animaux sera surveillé en continu afin d’adapter les conditions expérimentales et de limiter toute souffrance excessive. Des mesures seront mises en place pour réduire l’impact de ces effets, notamment en optimisant la dose des agents administrés, en assurant un suivi clinique rigoureux et en définissant des critères d’arrêt pour garantir le bien-être animal. De plus, il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules en cours de développement dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique régulier permettra de les détecter le plus précocement possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence. Enfin, les injections par voie sous-cutanée et intrapéritonéale sont des piqûres qui entraînent une légère douleur.

Devenir

A l'issu du protocole, les souriceaux seront mis à mort pour prélever le sang total.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal dans ce projet est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques du pemphigus et tester l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant. Le pemphigus est une maladie auto-immune affectant l’intégrité de la peau, impliquant des interactions complexes entre les auto-anticorps, les kératinocytes et les cellules immunitaires. Ces interactions ne peuvent être pleinement reproduites in vitro ou à l’aide de modèles alternatifs. Les alternatives non animales, telles que les cultures cellulaires en 2D ou en 3D et les modèles in silico, apportent des informations précieuses sur certaines étapes du processus pathologique. Par exemple, les cultures de kératinocytes humains permettent d’étudier l’effet des auto-anticorps sur l’adhésion cellulaire, tandis que les organoïdes cutanés offrent une meilleure représentation de l’épiderme. Cependant, ces modèles restent limités dans leur capacité à reproduire la réponse immunitaire globale, la pharmacocinétique des traitements ou les effets systémiques de la pathologie et de son traitement. L’induction du pemphigus dans un organisme vivant est essentielle pour évaluer l’efficacité et la tolérance des nouvelles molécules et formulations dans des conditions physiologiques réalistes. Un modèle murin permet d’analyser rapidement l’impact du traitement sur l’ensemble de l’organisme, d’évaluer l’évolution des lésions cutanées sur le temps et d’étudier les réactions inflammatoires associées. De plus, la validation de doses optimales ne peut se faire sans un modèle intégratif permettant de tester la biodistribution et la pharmacocinétique des candidats thérapeutiques. Bien que les modèles in vitro et in silico soient utilisés en complément pour affiner les hypothèses et réduire le nombre d’animaux nécessaires, ils ne peuvent se substituer totalement aux expérimentations in vivo pour atteindre les objectifs de ce projet. L’utilisation des animaux sera donc limitée au strict nécessaire, avec des procédures optimisées pour minimiser leur souffrance et garantir des résultats scientifiquement robustes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé selon une approche rigoureuse garantissant à la fois la pertinence scientifique des résultats et l’application du principe de réduction. Une estimation statistique préalable a été réalisée afin d’optimiser la taille des échantillons en limitant le nombre d’animaux utilisés tout en assurant une puissance statistique suffisante. L’utilisation de tests statistiques appropriés permettra de maximiser l’exploitation des données et d’éviter tout usage excessif d’animaux. Une étude pilote est d’abord réalisée afin d’affiner les conditions expérimentales et d’identifier les paramètres les plus pertinents à mesurer. Cette phase exploratoire permet d’ajuster la méthodologie et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux dans les phases ultérieures. L’imagerie in vivo joue un rôle clé dans l’optimisation du protocole. L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive telles que la bioluminescence permet de suivre l’évolution des lésions et l’effet des traitements sur les mêmes animaux au fil du temps, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires en limitant les prélèvements destructifs. La modélisation informatique et des études in vitro sont également intégrées pour affiner les hypothèses avant la mise en œuvre des expérimentations in vivo. Ces approches permettent de réduire les groupes expérimentaux en ciblant plus précisément les doses et conditions optimales avant de procéder aux tests sur les animaux. Un partage et une réutilisation des tissus seront réalisés autant que possible pour limiter le nombre d’animaux mis à mort. Les prélèvements de peau et d’organes permettront d’exploiter pleinement chaque individu pour plusieurs analyses complémentaires telles que l’histologie, la biologie moléculaire et l’immunohistochimie. Tout au long du projet, une évaluation continue des résultats sera effectuée pour ajuster les effectifs en fonction des données obtenues, évitant ainsi l’utilisation superflue d’animaux. Ces mesures garantissent que chaque animal utilisé contribue de manière optimale aux avancées scientifiques tout en respectant les principes éthiques et réglementaires en vigueur.

Raffinement

Le principe de raffinement est appliqué à chaque étape du projet afin de minimiser la souffrance et l’inconfort des animaux, en tenant particulièrement compte du bien-être des mères gestantes et des souriceaux. Une surveillance accrue sera mise en place pour détecter précocement tout signe de douleur, de stress ou de détérioration de l’état général chez la mère et la portée. Des grilles d’évaluation spécifiques seront utilisées pour suivre l’apparition de lésions cutanées, la prise de poids, l’activité locomotrice et le comportement maternel. Des mesures adaptées seront mises en œuvre pour préserver l’intégrité de la relation mère-souriceaux, essentielle au développement des petits et à la réduction du stress maternel. L’environnement des cages sera enrichi avec des matériaux de nidification pour permettre aux mères de construire un nid optimal, limitant ainsi l’anxiété et favorisant un comportement maternel naturel. La manipulation des animaux sera réalisée avec précaution afin d’éviter toute perturbation excessive de l’interaction mère-souriceaux. Les voies d’administration des substances expérimentales seront sélectionnées pour réduire au maximum l’inconfort des souriceaux. La température (20-24°C) et l’humidité (40-60%) seront contrôlées pour éviter le stress thermique chez les souriceaux. L’exposition aux stimuli externes sera limitée afin de réduire le stress maternel et éviter tout risque d’abandon de la portée pendant les études. Les équipes en charge des manipulations seront formées aux techniques les plus récentes permettant une prise en charge douce et efficace des mères et de leurs petits. Un suivi régulier sera assuré pour ajuster les protocoles en fonction des observations et intégrer de nouvelles stratégies de raffinement. Des suivis longitudinaux par imagerie (technologies utilisant la fluorescence ou la tomographie optique cohérente (OCT)) permettront des approches non invasives. Approches de fin d’étude respectueuses : Utilisation de méthodes approuvées (dislocation cervicale sous anesthésie) pour garantir une euthanasie rapide et sans douleur avec vérification systématique de l’absence de conscience avant toute analyse post-mortem. Maximisation des données par animal : Réalisation de multiples analyses (histologie, transcriptomique, etc.) sur les tissus collectés pour limiter le recours à des animaux supplémentaires.

Choix des espèces

La souris néonatale est le modèle de choix pour étudier le pemphigus en raison de sa capacité à reproduire fidèlement les mécanismes pathogéniques de la maladie. Son épiderme présente des similitudes avec celui des humains, et l’administration passive d’auto-anticorps permet une induction rapide et homogène des lésions cutanées. La petite taille des souriceaux et leur développement rapide facilitent l’évaluation précoce de l’efficacité et de la tolérance des traitements testés. De plus, l’existence d’outils génétiques et immunologiques bien caractérisés chez la souris améliore la reproductibilité et la transposabilité des résultats. L’élevage maîtrisé et la possibilité d’un suivi non invasif limitent le nombre d’animaux utilisés. Ce modèle offre ainsi un équilibre optimal entre pertinence scientifique, faisabilité expérimentale et respect des principes éthiques en recherche animale. Les stades de développement concernés par ce projet, selon l’article R.214-87, sont les suivants : nouveau-nés (âgés de moins de 7 jours) et des femelles gestantes au dernier tiers de gestation. Les mères sont incluses en raison de leur présence avec la portée pendant les manipulations expérimentales. Les mères adultes ne sont pas directement utilisées comme sujets d’étude, mais sont nécessaires pour la reproduction. Le choix scientifique de ces stades repose sur la robustesse du modèle néonatal dans l’étude du pemphigus : l’injection passive d’auto-anticorps humains induit efficacement les lésions cutanées caractéristiques chez le souriceau dans les tout premiers jours de vie, avec une expression phénotypique rapide et homogène. Ce modèle permet également une évaluation précoce de l’effet des traitements dans un contexte immunologiquement naïf, ce qui est essentiel pour comparer l’activité des formulations testées dans des conditions standardisées et sensibles.