Procédures légères
Impact des différentes répétitions génétiques sur le phénotype des modèles murins de la dystrophie myotonique de Steinert
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Issues d'un élevage maintenu sur place, 14 580 souris porteuses de la mutation de la dystrophie de Steinert vont être utilisées, 10 935 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 3 645 un niveau sévère. Une partie porte un phénotype dommageable, retard de croissance, anomalies musculaires, pousse anormale des dents gênant l'alimentation et espérance de vie réduite. Chaque nouveau-né subit une biopsie pour génotypage, les adultes passant des tests de force musculaire, de mémoire et d'anxiété, et une partie une chirurgie sans réveil. Les reproducteurs sont tués quand ils cessent d'être fertiles, des femelles gestantes sont expédiées vers un autre site, et les souris non utilisées ici partent vers d'autres projets au titre de l'utilisation continue.
Objectifs
La dystrophie myotonique de Steinert appelée aussi dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie rare et multisystémique, avec un large éventail de symptômes cliniques affectant des patients de tous âges et des deux sexes. La DM1 est l'une des formes les plus courantes de dystrophie musculaire. Bien qu'elle ait été initialement caractérisée par des symptômes musculaires tels que la faiblesse musculaire, la myotonie, les défauts de conduction cardiaque ; elle est hautement multisystémique (c’est-à-dire qu’elle peut aussi affecter d’autres organes). Les manifestations neuropsychologiques sont très invalidantes et particulièrement prononcées dans les formes précoces de la DM1. Cette maladie est causée par des répétitions anormales (plus de 50) dans un gène, entraînant l'accumulation de protéines toxiques dans le noyau des cellules. Les symptômes sont corrélés avec la taille des répétitions. Afin d'étudier cette maladie au cours du développement et dans différents tissus, nous avons développé un modèle de souris transgéniques porteuses du gène muté responsable de la DM1. Ces souris transgéniques reproduisent certaines caractéristiques de la maladie. Nous avons différents modèles murins avec un nombre plus ou moins important de répétitions. Ainsi, l’objectifs de ce projet est de comparer ces différents modèles pour étudier l’impact des différentes répétitions et l’endroit où elles s’intègrent dans le génome sur le phénotype des animaux.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la forme la plus fréquente de dystrophie musculaire chez l'adulte. Sa prévalence mondiale est estimée à 1 personne sur 8000, avec des variations selon les régions. Une étude récente suggère une prévalence globale pouvant atteindre 1 cas sur 2400 individus. La DM1 est une maladie chronique, évolutive et multisystémique (touchant plusieurs tissus), ainsi la prise en charge mobilise de nombreuses ressources médicales, sociales et familiales. Les soins de santé actuels se concentrent sur la réduction des incapacités grâce à des approches médicales multidisciplinaires, entraînant des coûts atteignant en moyenne 50 000 euros par patient par an. Ces dépenses peuvent s’élever à 1,5 million d’euros au cours des deux premières années de vie dans les cas congénitaux les plus sévères. Un modèle murin est particulièrement utilisé depuis plusieurs années pour étudier les conséquences de la mutation DM1 dans différents tissus et au cours du développement. Il est utilisé par de nombreux laboratoires académiques et pharmaceutiques pour des études précliniques afin de tester différentes approches thérapeutiques. Il est donc indispensable de continuer d'étudier ce modèle et les autres modèles émergents afin de déterminer l’impact du type de mutation sur la maladie. Ceci favorisera la compréhension du fonctionnement de la maladie et favorisera la recherche préclinique. A long terme : les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre d’autres affections humaines ayant des mécanismes similaires (la dystrophie myotonique de type 2, l’ataxie spinocérébelleuse de type 8, l’ataxie de Friedreich et d’autres formes) pour lesquelles les études sur la DM1 sont des références.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, une biopsie sera réalisé pour génotypage. La biopsie est réalisée sur animal vigile, 1 seule fois et l'acte dure moins de 1minute. Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie sans réveil. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés, l'acte dure environ 10 minute. Une autre partie suivra des tests comportementaux simples permettant d'évaluer la force musculaire, la réaction à la nouveauté, l'exploration, l'anxiété et la mémoire. Les tests sont réalisés sur animal vigile. Ils sont réalisés une fois par animal et durent de 5 à 30 minutes. Enfin, un dernier test sera réalisé pour évaluer la capacité à ressentir des émotions positives et agréables. Ce test sera réalisé sur animal vigile, il sera réalisé 1 fois et durera 5 jours.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux utilisés lors de ce projet présentent un phénotype dommageable qui induira un retard de croissance, des anomalies musculaires et des anomalies du comportement. Le phénotype pourra induire également une réduction de l'espérance de vie des animaux. Le phénotype pourra aussi induire une pousse anormale des dents qui peut géner la prise alimentaire et qui peut nécessiter une taille des dents qui pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Une biopsie pour génotypage sera également réalisée chez les nouveaux-nés, elle pourra induire une douleur légère de courte durée. A l'âge adulte les animaux réaliseront des tests comportementaux simples qui pourront induire un léger stress à cause de l'environnement nouveau ainsi qu'une fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.
Devenir
Dans le cadre de ce projet, des femelles gestantes seront exportées vers un autre site afin de réaliser des mesures de respiration chez les nouveeaux-nés. Une partie des animaux sera euthanasiée au cours de ce projet afin de réaliser des prélèvements pour effectuer des analyses moléculaires et histologiques sur les tissus. Les reproducteurs seront euthanasiés lorsqu'ils ne seront plus fertiles. Enfin, les animaux issus des accouplements qui ne seront pas utilisés dans ce projet seront utilisés dans le cadre d'autres projets de recherche autorisés dans le cadre d'une utilisation continue.
Remplacement
Le projet se concentre sur une maladie humaine rare (DM1). Bien que certains mécanismes cellulaires puissent être étudiés dans des modèles de culture cellulaire artificiels, l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes spécifiques aux tissus et aux cellules. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour tester de nouvelles thérapies dans la maladie cérébrale de la DM1. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients.
Réduction
14 580 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les accouplements seront toujours adaptés aux besoins pour les projets en cours autorisés afin de ne produire que les animaux nécessaires. En cas d'arrêt des projets sur une longue période, la lignée pourra être cryoconservée. Les souris n’ayant pas le génotype d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de ré́sultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum (nidification et mastication) et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux sont déjà acclimatés à l'environnement car l'élevage est dans l'établissement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. En effet, tout sera mis en place pour limiter l'expression du phénotype dommageable (vérification de la dentition, ajout d'aliment hydraté facilement accessible). Les souriceaux seront délicatement manipulés et ils seront séparés de leur mère sur une courte durée (quelques minutes) pour limiter leur stress. Pour les tests comportementaux les animaux seront manipulés dans une pièce dédiée au calme et un délai de récupération sera toujours respecté. Une anesthésie et une analgésie est mise en place dès que nécessaire (chirurgie sans réveil). Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients. Nous utilisons un modèle murin car nous disposons d'un modèle, que nous avons développé, de la dystrophie myotonique de type 1. Ce modèle développe des phénotypes comme chez l'Homme et est donc un modèle de choix dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de 7 jours de vie et jusqu'à 8 mois. Les analyses seront réalisées à l'âge de 7 jours car c'est un âge important à étudier pour comprendre les mécanismes de la pathologie. Les animaux seront également utilisés à 2 mois car à cet âge le phénotype des animaux est bien présent. Enfin les animaux seront utilisés jusqu'à 8 mois pour le maintien de la lignée car les animaux sont fertiles jusqu'à cet âge.
Etude cinétique de deux antibiotiques chez les lapins et poulets de chair
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Poules : 40
32 lapins et 40 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun recevant deux administrations d'antibiotique et subissant douze à dix-huit prélèvements sanguins sur animal vigile, répartis sur deux périodes de 48 heures. La contention doit être ferme, une crème analgésique étant appliquée à l'endroit de l'aiguille. L'objectif est de mesurer la vitesse d'élimination de deux vieux antibiotiques vétérinaires, dont les autorisations de mise sur le marché prescrivent la même dose quelle que soit l'espèce traitée. Lapins et poulets sont tués à l'issue pour le prélèvement de tissus, à un âge, 70 jours et 3 à 4 semaines, choisi pour correspondre à celui des animaux traités en élevage conventionnel.
Objectifs
Certains antibiotiques dits "anciens" utilisés en médeciné vétérinaire font partie des traitements dits de « premier recours » pour les praticiens dans toutes les espèces animales de production. Pour ces anciennes molécules, les autorisations de mise sur le marché indiquent d’utiliser la même dose quelle que soit l’espèce animale concernée. Or ces doses ne sont probablement pas bien adaptées car les vitesses d'élimination (et donc la durée d'action) peuvent être très variables d'une espèce à l'autre. Ces différences peuvent aboutir à des expositions à l’antibiotique bien différentes d’une espèce animale à l’autre et notamment à un risque d’exposition insuffisante in vivo (sur animaux vivants), diminuant les chances d’efficacité du traitement. L’objectif principal des procédures expérimentales est de générer des données pharmacocinétiques (à savoir le suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo pour deux anciennes molécules antibiotiques courament utilisées chez le poulet et le lapin. Par la suite et à l’aide de la modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) (correspondant à un outil mathématique permettant de relier les concentrations sanguines à l’effet observé soit ici la diminution du nombre de bactéries pathogènes), les modalités optimales d’administration de ces deux molécules seront déterminées (ajustement des doses et fréquence d'administration).
Bénéfices attendus
La révision des posologies des anciens antibiotiques passe par une caractérisation adéquate des profils pharmacocinétiques de chaque molécule pour chaque espèce animale cible de ces traitements, les poulets et les lapins. Ainsi, les études pharmacocinétiques in vivo prévues dans ce projet couplé à des études pharmacodynamiques in vitro sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées vont, à terme, permettre d’optimiser l’usage de ces antibiotiques (doses, fréquence d'administration) chez le lapin et la volaille. Une utilisation plus optimale des antibiotiques permettra de : (i) augmenter les chances de succès du premier recours à l’antibiothérapie, et ainsi réduire la probabilité d’un éventuel recours à un antibiotique supplémentaire ; (ii) minimiser l’exposition à des concentrations sub-optimales, qui favorisent la sélection et l’émergence de bactéries résistantes aux antimicrobiens.
Procédures
Durant l'expérimentation une source de stress viendra de l'administration des antibiotiques et des prélèvements sanguins qui seront faits sur animal vigile et nécessitent donc une contention ferme (2 administrations par animal au total espacé de 7 jours au minimum), mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Pour l’administration par voie orale, une durée de 2min est nécessaire avec une contention. Pour l'administration par voie veineuse, un cathéter sera utilisé sur la veine le temps de l’administration puis retiré dès l’injection terminée, pour une durée de 2 à 3 min. Des prélèvements sanguins répétés (8 à 9 pour les lapins et 6 à 8 pour les poulets) chacun seront effectués sur animal vigile sur une période de 48h après chaque administration. Une crème analgésique sera appliquée sur la zone d'introduction de l'aiguille. Chaque prélèvement ne durera que 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
L'administration d'antibiotiques et les prises de sang sont des sources d’angoisse et de douleur légère pour l’animal mais d'une durée très brève (inférieure à 2-3 min).
Devenir
A l’issue de l’expérimentation, les lapins et poulets seront mis à mort pour obtenir des échantillons de tissus.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (Tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche Pharmacocinetique/pharmacodynamique envisagée.
Réduction
L’utilisation de 16 à 20 animaux par molécule antibiotique (soit 32 lapins et 40 poulets au total) est un nombre optimal afin d’estimer correctement les variations inter-individuelles des paramètres cinétiques (clairance, etc.), tout en limitant le nombre de prises de sang pour chaque individu. De plus, chaque animal sera utilisé pour deux administrations pour chaque molécule d'antibiotique (2 molécules au total) ce qui permet de limiter le nombre total d'animaux. Une période de repos adaptée entre les 2 administrations permet de garantir la fiabilité des résultats et de laisser les animaux récupérer. Les résultats seront analysés grâce à une modélisation mathématique qui permettra par la suite d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine. Les lapins seront hébergés par 2 par cage tout en respectant les normes du bien-être animal. Des enrichissements appropriés (des petits ballots de foin et bâtons à ronger) seront également présents dans l’environnement des lapins. Les poulets seront hébergés par groupe de 5, avec de l’enrichissement (perchoirs, zone de grattage avec sciure, cordelette suspendue). Les gestes relatifs à l’administration des antibiotiques étudiés et aux prises de sang seront effectués dans une pièce isolée des autres animaux afin de réduire le stress de ces derniers. La contention lors de ces gestes se fera avec l’aide d’une grande serviette pour minimiser les gestes parasites de l’animal et risquer des blessures involontaires. Une phase de training à la manipulation sera réalisée (1 semaine) afin de diminuer le stress de la contention. Un analgésique local (pommade) sera utilisé avant l'administration et les prises de sang. Pour les lapins des points limites seront définis en fonction de la grille d’évaluation des expressions faciales du lapin . Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids. Ces points clefs vont déterminer les points limites qui seront appliqués dès l'apparition d'éventuels signes précoces de la douleur. Si l’usage d’analgésique par voie systémique est nécessaire, l’animal sera retiré de l’étude.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces cibles pour l’étude pharmacocinétique de ces deux molécules en médecine vétérinaire Au début de l’expérimentation, les lapins seront âgés de 70 jours (soit entre 2kg et 2.5kg à l'arrivée des animaux) et les poulets seront âgés 3 à 4 semaines (soit entre 1kg et 1.5 kg à l'arrivée des animaux). Ce stade correspond à l'âge standard des animaux traités en élevage conventionnel.
Apprentissage du chant chez les oscines: intéractions oiseaux-robots
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Placés seuls dans des caissons insonorisés dès l'âge de 35 à 40 jours, des canaris et des diamants mandarins mâles y passent 60 à 85 jours, exposés une heure par jour, cinq jours par semaine, à un robot-oiseau qui leur sert de tuteur de chant. 72 oiseaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie à l'issue et réutilisables selon le porteur. L'objectif est de mesurer comment la variabilité d'un modèle sonore influence l'apprentissage du chant, avec un parallèle revendiqué avec l'acquisition du langage humain. Le porteur affirme que ces deux espèces domestiquées supportent bien l'isolement social et qu'aucune étude ne montre d'effet à long terme, avant d'ajouter que la situation constitue potentiellement un stress social.
Objectifs
L'objectif de ce programme de recherches est de mieux comprendre le rôle de la variabilité sur l'apprentissage développemental avec le chant des oscines (oiseaux chanteurs) comme modèle biologique, en utilisant une approche transdisciplinaire impliquant l'éthologie, l'analyse du signal et la neurorobotique développementale. La variabilité d’un essai à l’autre est inhérente à l’apprentissage. La variabilité motrice est particulièrement élevée lorsqu'une nouvelle compétence est acquise (par exemple faire du vélo), et un apprentissage réussi est généralement associé à une diminution de variabilité. De tels changements de variabilité sont observés au cours de l'acquisition de la parole chez l'humain. Il existe des analogies entre le développement du langage chez l'humain et l'apprentissage du chant chez les oscines. Par exemple, les deux processus vocaux dépendent d'un apprentissage sensorimoteur au cours de périodes sensibles du développement et présentent de nombreux parallèles au niveau comportemental, cellulaire (neurone) et moléculaire (génétique). Les objectifs de ce projet sont de documenter le rôle de la variabilité dans le développement du chant de jeunes oscines exposés à des modèles de chant, dont la variabilité est contrôlée, en utilisant des robots oiseaux comme tuteurs de chant.
Bénéfices attendus
L'apprentissage du chant chez les oscines est le modèle le plus utilisés pour étudier les aspects biologiques de l'apprentissage vocal, une composante importante du langage chez l'humain. Nous allons, pour la première fois, révéler comment la variabilité du modèle à imiter impacte les compétences d'apprentissage du chant. Chez le Diamant mandarin, la meilleure façon d'obtenir une copie presque parfaite du chant est d'élever un jeune mâle avec un mâle adulte. Ce type d’apprentissage constitue une base de référence dans la recherche sur le chant des oiseaux. Pourtant, optimiser le les méthodes utilisées pour entraîner les jeunes oiseaux chanteurs à apprendre un chant, afin de pouvoir prédire le succès de l'imitation, améliorera notre compréhension de la dynamique de l’apprentissage de la production vocale.
Procédures
Un premier lors d’oiseaux (canaris mâles) seront placés individuellement dans des caissons insonorisés à l’âge de 35-40 jours (durant 80-85 jours) et seront exposés 1h par jour, 5 jours par semaine pendant 5 semaines à un robot-oiseau (interactif ou non). Ils seront ensuite replacés en volière commune avant d’être à nouveau replacés en isolement pour la seconde étape qui impliquera l’exposition des animaux à des congénères de manière quotidienne à raison de 20 minutes/jour (contacts visuels et vocaux uniquement). L’activité vocale des animaux sera enregistrée tout au long de la procédure. Un second lot d’oiseaux (diamants mandarins juvéniles mâles) seront placés en isolement social pendant 60 à 65 jours (entre l'âge de 35-40 jours et 100 jours). Ils seront exposés 1h par jour, 5 jours par semaine pendant 5 semaines à un robot-oiseau. Ils seront ensuite replacés en volière commune. L’activité vocale des animaux sera enregistrée tout au long de la procédure. Enfin, un dernier lot d’oiseaux (diamants mandarins adultes) seront placés en isolement social pendant 60 jours. Ils seront exposés 1h par jour, 5 jours par semaine pendant 5 semaines à un robot-oiseau. L’activité vocale des animaux sera enregistrée tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
Le Diamant Mandarin et le Canari sont deux espèces domestiquées qui ont été largement utilisées dans les études sur les aspects sensorimoteurs de la production vocale. Ils supportent généralement bien les conditions d'isolement social; aucune étude à ce jour ne montre d'effets à court, moyen ou long terme sur la survie ou le succès reproducteur des oiseaux ayant subi des périodes prolongées d'isolement social. A la fin de l'expérience, les oiseaux seront placés en volières avec des congénères de leur espèce. Si des signes indicateurs d'inconfort ou de souffrance sont observés lors de l'inspection quotidienne réalisée par les chercheurs ou les animaliers, l'oiseau sera retiré de l'expérience. Néanmoins, ceci constitue potentiellement un stress social pour ces animaux.
Devenir
Les animaux peuvent être gardés en vie à l'issue de chaque procédure expérimentale. Ils pourront éventuellement être réutilisés voire replacés ou adoptés.
Remplacement
Ce programme de recherches a pour but d’étudier l’apprentissage vocal chez deux espèces domestiquées d'oiseaux: le Diamant Mandarin (Taeniopygia guttata) et le Canari domestique (Serinus canaria). Ces deux espèces sont des modèles de référence pour l'étude des aspects comportementaux, cellulaires et moléculaires de l'apprentissage vocal. Les recherches en éthologie sur ces aspects ne sont pas envisageables sans organismes vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés (72 au total) permettra une analyse statistique fiable des résultats obtenus. Afin de garantir la robustesse statistique de nos résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés, nous avons effectué un calcul de puissance a priori pour déterminer la taille de nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Un miroir sera placé dans la cage des oiseaux. Cette procédure permet de limiter les effets du stress lors de l'isolement social chez les oscines. Les oiseaux seront exposés de manière hebdomadaire à des enregistrements vidéos de congénères. Cette procédure induit souvent la production de chants (dirigés) indiquant que l'individu perçoit cette stimulation vidéo comme la mise en présence d'un congénère. Le Diamant Mandarin et le Canari sont deux espèces domestiquées qui ont été largement utilisées dans les études sur les aspects sensorimoteurs de la production vocale. Ils supportent généralement bien les conditions d'isolement social; aucune étude à ce jour ne montre d'effets à court, moyen ou long terme sur la survie ou le succès reproducteur des oiseaux ayant subi des périodes prolongées d'isolement social. Néanmoins, si des signes indicateurs d'inconfort ou de souffrance sont observés lors de l'inspection quotidienne réalisée par les chercheurs ou les animaliers, l'oiseau sera retiré de l'expérience. Ces signes peuvent être divers: oiseau ébouriffé, qui ne s'alimente plus et/ou dont la production vocale enregistrée en continu baisse drastiquement au cours de l'expérience.
Choix des espèces
Les deux espèces (Diamant mandarin et Canari) ont été choisies en raison de leurs différences en terme d'apprentissage vocal. Les mâles de Diamant Mandarin et de Canari domestique sont capables d’apprentissage vocal : ils apprennent à chanter en écoutant leurs conspécifiques adultes. Le Diamant Mandarin apprend à chanter pendant une période sensible de la vie précoce et ne peut plus changer son chant à l’âge adulte. Au contraire, le Canari a la capacité de changer de chant tout au long de la vie. C’est pourquoi nous étudierons chez les deux espèces l’apprentissage du chant pendant le stade juvénile, et que nous étudierons également l’apprentissage du chant au cours de la deuxième année de vie chez les canaris adultes. Nous utiliserons aussi des mâles adultes (âge supérieur à 200 jours) de Diamant mandarin qui serviront de tuteurs de chant pour des robots apprenants.
Evaluation de la robustesse des poussins vis-à-vis de la bactérie E. coli selon différentes conditions d’alimentation post natales
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
475 poussins de deux à quatre jours vont être utilisés, 290 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 185 un niveau léger. Ils reçoivent une inoculation d'E. coli sous la peau, un geste de quinze secondes qui peut freiner leur croissance, les rendre léthargiques et provoquer une septicémie mortelle. Tous sont tués pour autopsie et réisolement bactérien, y compris ceux qui, prostrés et incapables de se déplacer après sollicitation, seront mis à mort avant terme. L'étude vise à mesurer si un accès plus rapide à l'eau et à l'aliment rend les poussins plus résistants, et le porteur écrit que pour cette question l'utilisation des animaux est "indispensable".
Objectifs
Dans les conditions commerciales, les œufs fertiles provenant des élevages reproducteurs sont acheminés au couvoir (entreprise d’accouvage). Ces œufs sont mis dans des incubateurs pendant 18 jours puis transférés en éclosoirs pendant 3 jours pour faire naître les poussins. Dans l’éclosoir, l’écart entre le premier et le dernier poussin éclos peut atteindre 36 h. Ils sont ensuite sortis, parfois sexés, triés, vaccinés et transportés vers l'élevage. Considérant ces étapes, certains poussins attendent jusqu’à 72 h avant de s’abreuver et s’alimenter. Or, selon la littérature, cette privation, dès 36 h, altère le développement des organes, l’immunité, la thermorégulation et la réponse au stress. Pour améliorer les conditions post-éclosion et répondre à des attentes sociétales d’amélioration du bien-être animal en élevage, des solutions techniques sont en cours de développement pour apporter de l’eau et de l’aliment directement dans l’éclosoir ou d’installer les œufs à couver (à 18 jours) directement à l’élevage permettant aux poussins de naitre à leur rythme dans leur milieu de vie, sans manipulation et avec accès immédiat à l’eau et à l’aliment. Ce projet vise à objectiver, de façon contrôlée, les bénéfices de ces pratiques, en évaluant la robustesse des poussins en les soumettant à une inoculation par une bactérie appelée Escherichia coli (E. coli). La souche de E. coli choisie présente une pathogénicité modérée chez le poussin. Nous avons choisi le modèle E. coli car la colibacillose aviaire est la maladie bactérienne la plus fréquente en élevage de volailles avec de la mortalité fréquente à 3-4 jours après la mise en place en élevage. Les évaluations seront faites d'une part sur des poussins issus de poules reproductrices jeunes et d'autre part sur des poussins issus de poules âgées. Ces deux âges représentent des périodes à risque d'apparition de la colibacillose et correspondent à des périodes de fragilité pour le poussin.
Bénéfices attendus
La colibacillose aviaire est la maladie bactérienne la plus fréquente chez les volailles. Elle entraine une utilisation fréquente d’antibiotiques, contribuant ainsi à la sélection et à la diffusion de gènes de résistance chez l’animal et dans l’environnement. Renforcer la robustesse des poussins nouvellement éclos en leur permettant un accès le plus rapide possible à l’aliment et à l’eau permettrait de lutter contre la colibacillose et, de fait, diminuer le taux de mortalité et l’utilisation des antibiotiques pendant la première semaine de vie.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront : - Inoculations d’E. coli par voie sous cutanée (poussins) qui durent environ 15 secondes par animal, contention comprise - Pesée des animaux avant inoculation d’E. coli et en fin de période de suivi pour la procédure 3
Impact sur les animaux
Les inoculations d’E. coli aux poussins sont susceptibles de les rendre malades. Les symptômes peuvent se manifester par un retard de croissance, un abattement de l’animal (léthargie) et, dans les cas les plus graves, par une septicémie entrainant la mort.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort parce que des autopsies doivent être pratiquées pour constater des lésions et effectuer des réisolements bactériens
Remplacement
La colibacillose aviaire est la maladie bactérienne la plus fréquente chez les volailles. Elle entraine une utilisation fréquente d’antibiotiques, contribuant ainsi à l’aggravation de la résistance aux antibiotiques. Lorsque l’on cherche à évaluer si des stratégies d’alimentation très précoce pourraient aider les poussins à être plus résistants, l’utilisation des animaux est indispensable.
Réduction
Au total, 475 animaux seront utilisés dans les trois procédures du projet. Le nombre de poulets a été fixé au minimum acceptable pour atteindre les objectifs du projet, à partir de données obtenues de précédents projets.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animaleries (au sol, sur litière) ou en isolateurs. Dans les deux cas, ils bénéficieront d’enrichissements appropriés (plateformes et éléments de perchage et de picorage). Les inoculations aux poussins sont susceptibles de les rendre malades. Pour détecter une éventuelle souffrance des animaux, ils seront surveillés de près (4 à 5 passages par jour en plus d’observations par caméra) pour détecter des comportements anormaux (abattement ou prostration par exemple) par une évaluation de leur état clinique (normal, abattu, prostré). Tout animal prostré ne pouvant se déplacer après sollicitation sera mis à mort.
Choix des espèces
Poussins de 2 à 4 jours d’âge qui sont concernés en premier lieu par la colibacillose précoce. le but du projet est de développer des stratégies d'alimentation précoce pour améliorer la robustesse des poussins.
Optimisation des procédures d’immunothérapie en utilisant des modèles souris de croissance tumorale in vivo. [EU 1/2]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées en fin de procédure pour le prélèvement de leurs tissus et organes, 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections, un rasage du ventre, jusqu'à seize séances d'imagerie sous anesthésie et treize mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur reconnaît que certaines pourraient souffrir de voir disparaître leurs congénères jusqu'à se retrouver seules en cage. Il indique avoir déjà obtenu en culture cellulaire une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines modifiées, et juge malgré tout le recours à l'animal "incontournable".
Objectifs
Les traitements anticancéreux utilisant les propres cellules immunitaires du patient ont révolutionné le traitement des tumeurs. Cependant, une partie des patients ne répond toujours pas efficacement à ces thérapies. De plus ces traitements sont pour l'instant moins efficaces contre les tumeurs solides. Une des raisons peut être la faible capacité migratoire de ces cellules immunitaires. L’objectif de ce projet est de trouver les meilleures modifications à apporter à ces cellules pour leur permettre de mieux pénétrer dans les tumeurs et en limiter la croissance. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes responsables de l’efficacité de thérapies cellulaires anticancéreuses utilisant des cellules immunitaires. Des bénéfices thérapeutiques sont attendus concernant le traitement de certaines tumeurs solides.
Procédures
Les animaux de ce projet seront élevés dans l’établissement EU1 et les expériences se dérouleront dans les établissements EU1 et EU2. Les animaux auront une partie de peau ventrale rasée (1 à 2 minutes). Les animaux subiront des injections (1-2 minutes, 2 injections maximum par souris). Les animaux seront anesthésiés et soumis à des séances d’imagerie (15 minutes maximum; 16 séances maximum). La taille de la tumeur chez certains animaux sera mesurée avec un pied à coulisse (1 minute, 13 séances maximum).
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger consécutif à leur manipulation hebdomadaire et au transport. Elles subiront un stress et une douleur légère lors du rasage des poils et des injections. Elles pourront éprouver un stress lors des anesthésies. Elles pourront éprouver une gêne et une douleur lors du développement de la tumeur. Enfin, certains animaux pourraient subir un stress de voir disparaitre leurs congénères en particulier en fin d’expérience jusqu’au point de se retrouver eux-mêmes isolés dans la cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale (afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'analyses) ou si les points limites seront atteintes.
Remplacement
Un grand nombre d’expériences de culture cellulaire a été realisé, montrant une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines modifiées par plusieurs stratégies. En effet, ces stratégies améliorent les capacités de migration de ces cellules immunitaires. Le recours aux modèles animaux est maintenant incontournable car ils permettront de valider nos différentes observations dans des modèles précliniques de tumeur pertinents et reconnus par la communauté scientifique.
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d’animaux contrôles sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre de souris utilisées a été estimé de façon à obtenir des résultats exploitables statistiquement.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe social avec de l’enrichissement. Les interventions pouvant susciter de la douleur seront effectuées sous anesthésie. Les animaux seront régulièrement surveillés. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place, leur atteinte éventuelle entrainera la mise à mort anticipée de l’animal souffrant. Lors du transfert entre les 2 établissements, les souris seront dans des boites de transport avec de la nourriture et de l’enrichissement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix et de référence pour les études in vivo des réponses immunitaires antitumorales car le développement de la tumeur et les infiltrats immunitaires sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Les souris utilisées pour la reproduction seront mis en accouplement à partir de 8 semaines. Les souris utilisées pour les expériences d’étude de la réponse immunitaire contre la tumeur seront âgées de 7 à 12 semaines, une tranche d’âge correspondant au jeune adulte adapté pour ce genre d’études en vertu de l’absence de biais éventuels dûs aux changements physiques et hormonaux liés au développement autant qu’au vieillissement.
Implication du métabolisme mitochondrial sur l’évolution de la maladie métabolique du foie d’origine nutritionnelle et génétique chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Les souris qui ne servent pas à la reproduction et celles qui n'ont pas le bon génotype sont tuées au sevrage. 29 400 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 15 264 d'entre elles et modéré pour 14 136, les autres étant tuées pour analyse. Chaque animal subit trois injections dans l'abdomen, six coupures de l'extrémité de la queue, six prises de sang par microcoupure de la queue, un gavage, et jusqu'à seize semaines de régime gras. Le projet cherche à comprendre l'évolution de la maladie du foie gras d'origine nutritionnelle et génétique, sans que cet effectif de 29 400 souris reçoive de justification chiffrée au-delà d'un renvoi à des études précédentes.
Objectifs
La maladie du foie gras non alcoolique est définie par une accumulation de graisse dans le foie et généralement associée à des maladies comme le diabète et l’obésité. L’accumulation progressive de graisse est responsable de la dégradation du foie et de sa capacité à fonctionner normalement. Il n’existe aujourd’hui aucun marqueur biologique non invasif validé pour la détection de cette maladie ni aucun traitement médical approuvé. Notre objectif est donc d'utiliser des modèles murins pour comprendre comment le foie s'adapte aux perturbations portées par différents régimes afin de favoriser la progression de la maladie du foie ou d'influencer la guérison.
Bénéfices attendus
Ce projet explorera un biomarqueur non invasif de la gravité de l’état du foie et changements longitudinaux dans la maladie du foie suite à une intervention thérapeutique (modifications du mode de vie, des médicaments antidiabétiques, immunothérapies). Grâce à ce projet, nous pourrons identifier et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies du foie.
Procédures
1. Injection abdominale, 30s, 3 fois par animal 2. Coupure de l'extrémité de la queue, 30s, 6 fois par animal 3. Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 1 minute, 6 fois par animal 4. Gavage, 30s, une fois par animal 5. Régime gras, 16 semaines maximum.
Impact sur les animaux
1. Injection abdominale : douleur légère de courte durée. 2. Coupure de l'extrémité de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. 3. Régime riche en graisses : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actifs. 4. Régime alimentaire induisant une perte de poids : les animaux vont perdre du poids au fur et à mesure des semaines. 5. Mise à jeun : Les animaux pourront subir une gêne due à la sensation de faim. 6. Stress dû à la contention et à la sonde de gavage.
Devenir
Les souris non utilisées pour l’accouplement et les souris n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort au moment du sevrage. Tous les autres animaux en expérimentations seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Avant de recourir à des animaux, nous avons mené des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ainsi que des analyses de données déjà disponibles. Ces approches ont permis d’identifier les cibles à étudier. Toutefois, les effets systémiques et certaines interactions entre les cellules immunitaires et le foie, notamment celles influencées par l’alimentation, ne peuvent être reproduites qu’au sein d’un organisme vivant. À ce jour, aucun modèle alternatif (comme la modélisation informatique, ou les cultures de tissus) ne permet de reproduire toute cette complexité.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé pour atteindre les objectifs scientifiques tout en limitant au maximum leur utilisation. Chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses, afin d’optimiser leur contribution à la recherche. Ces calculs sont basés sur les résultats d’études précédentes, ce qui permet de garantir que le nombre d’animaux est justifié et proportionné. Par ailleurs, le projet exclut l’utilisation de femelles dans les groupes expérimentaux, afin de réduire la variabilité due à la protection hormonale. Cela permet également de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé, avec du matériel adapté, afin de limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Par exemple, les injections et les prélèvements seront effectués avec des outils spécifiques et dans le respect des bonnes pratiques. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel animalier qualifié, et une grille d’évaluation du bien-être des animaux sera utilisée tout au long de l’étude pour ajuster les soins si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des maladies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et maladie du foie. Les animaux seront inclus à partir de l’âge de 8 à 10 semaines, ce qui correspond à l’âge jeune adulte chez la souris.
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Certaines souris sont infectées par des virus humains pathogènes ou par le parasite du paludisme murin, une infection qui peut provoquer fièvre, prostration, perte de poids et paralysie. 4 622 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. D'autres sont greffées de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et reçoivent des injections de virus de la rougeole modifiés une à deux fois par semaine pendant dix semaines. Le porteur écrit que la souffrance liée à l'infection "précédera la mort de l'animal" et, quelques lignes plus loin, que la mort comme point limite est strictement évitée.
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
Impact de l’hypergravité sur la mise en place du système immunitaire de l’amphibien Xenopus laevis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
294 têtards de Xenopus laevis passent deux mois dans les aquariums d'un rotor qui les soumet à une gravité augmentée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les 18 femelles adultes dont les œufs ont fourni ces têtards reçoivent deux injections d'hormones à trois jours d'intervalle et restent en vie, réutilisables. Les têtards sont tués pour prélever leurs organes immunitaires et mesurer l'effet de l'hypergravité sur leur immunité. Le bénéfice avancé, préserver le système immunitaire des spationautes lors de futures missions habitées de longue durée, reste une hypothèse, quand l'exposition à l'hypergravité est immédiate.
Objectifs
Une expérience réalisée à bord de la Station Spatiale Internationale avec des têtards d’amphibien a montré que l’apesanteur modifie la production d’anticorps et affaiblit le développement des cellules responsables de la production des anticorps au cours du développement animal. Ici, nous souhaitons déterminer si l’hypergravité (augmentation de la gravité terrestre) a des effets opposés : nous étudierons l'expression de gènes requis pour le développement des cellules immunitaires et la répartition des cellules immunitaires au sein de têtards de grenouille ayant grandi sous différents niveaux d’hypergravité. Ces données permettront de déterminer si l’exposition à l’hypergravité permet de contrer les effets de l’apesanteur sur le développement des cellules immunitaires. L’exposition à l’hypergravité pourrait alors être utilisée pour préserver le système immunitaire des spationautes qui seront impliqués dans les futures missions spatiales de longues durées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’avoir une meilleure connaissance des effets de changements de la force gravitaire sur le développement des cellules immunitaires, assurant la protection de l’hôte, dans le cadre de la préparation des futures missions spatiales habitées de longues durées. La conservation des principaux éléments du système immunitaire des amphibiens aux mammifères permettra d’extrapoler à l’homme les données obtenues chez l’amphibien.
Procédures
Deux injections (1 minute par injection) d’hormones espacées de 3 jours pour les 18 grenouilles femelles adultes utilisées afin d’induire la production d’oeufs. Modification des conditions d’hébergement durant 2 mois pour 294 têtards de grenouille (exposition à l’hypergravité grâce à un rotor dont les nacelles sont équipées d'aquariums).
Impact sur les animaux
Les deux injections (1 minute par injection) d’hormones espacées de 3 jours chez les grenouilles femelles adultes induiront un stress léger et bref. La modification des conditions d’hébergement durant 2 mois pour les têtards de grenouille (exposition à différents niveaux d’hypergravité) induira un stress modéré.
Devenir
Les grenouilles femelles adultes ayant produit les œufs seront gardées en vie. Les têtards seront mis à mort après exposition à l’hypergravité afin de prélever leurs organes immunitaires et déterminer comment l’hypergravité a affecté leur immunité aux niveaux moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Des études in vitro ont analysé l'impact de changements de la gravité terrestre sur le développement des cellules immunitaires. Il a ainsi, par exemple, été montré que l’apesanteur a un effet négatif sur la différenciation in vitro de globules rouges humains. De même, la culture d'un organe immunitaire de souris en apesanteur a mis en évidence une altération du développement de certaines cellules immunitaires. Cependant, la mise en place du système immunitaire implique des liens physiologiques avec d’autres systèmes tels que les systèmes nerveux et endocrinien. En effet, les cellules immunitaires sont sensibles à de nombreuses molécules de stress et hormones. Il est donc indispensable, afin de s’assurer d’une réponse physiologiquement pertinente, de prendre en compte la réponse globale de l’animal. Ce projet implique donc de devoir travailler sur animaux entiers.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum déterminé grâce à une étude statistique en utilisant un logiciel approprié et les données issues d’expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont manipulés par du personnel formé. Grenouilles et têtards bénéficient d’enrichissement (tubes dans lesquels ils peuvent se cacher). Les têtards de grenouille qui seront placés en hypergravité seront surveillés tous les jours ainsi que les conditions environnementales (température (20°C), éclairage (alternance classique jour/nuit de 12h/24h)), leur prise alimentaire, leur comportement et leur aspect.
Choix des espèces
Les amphibiens sont classiquement utilisés pour les expérimentations portant sur le développement animal. De plus, leurs têtards répondent à de nombreuses exigences techniques associées à l'expérimentation spatiale (poids et taille faibles). C’est pourquoi des habitacles permettant leur développement à bord de la Station Spatiale Internationale ont été développés. Enfin, la conservation des principaux éléments du système immunitaire des amphibiens aux mammifères permet d’extrapoler raisonnablement à l’homme les données obtenues chez l’amphibien.
Étude de la dynamique du couplage cœur-cerveau : recherche de biomarqueurs et innovation thérapeutique dans les troubles anxieux.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Implantées de fibres optiques dans le cerveau au cours d'une chirurgie stéréotaxique d'environ vingt-cinq minutes, puis d'une sonde de télémétrie sous la peau, puis d'une électrode de stimulation du nerf vague, 3 440 souris vont être utilisées, dont 3 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit dix jours de confrontations sociales quotidiennes, avec des blessures possibles et un état anxieux que le porteur dit ne pas pouvoir soulager parce qu'ils font partie du phénotype recherché. Suivent un hébergement isolé de treize à dix-huit jours, un test de prise de risque sous restriction alimentaire de huit jours, un champ ouvert de dix minutes et un labyrinthe en O de cinq minutes. Les souris sont ensuite tuées pour prélever leur cerveau, et celles écartées au génotypage partent vers les autres projets de l'équipe.
Objectifs
Les troubles anxieux sont les problèmes de santé mentale les plus répandus dans le monde. Ils se traduisent par des inquiétudes excessives ou par l'évitement de situations jugées menaçantes, ce qui complique la vie quotidienne des personnes concernées. Ces troubles peuvent aussi augmenter le risque de développer des problèmes cardiaques. C’est pourquoi il est important de comprendre comment le cerveau et le cœur interagissent, car cela pourrait nous aider à mieux comprendre et traiter l'anxiété. Notre recherche se concentre sur cette interaction entre le cerveau et le cœur, en étudiant plus précisément deux zones cérébrales : l'une est impliquée dans les réponses émotionnelles négatives (Zone A), et l'autre contrôle le rythme cardiaque (Zone R). Pour cela, dans un premier temps, nous étudierons le dialogue de la zone A vers la zone R. Puis, nous élaborerons un modèle murin avec un comportement de type anxieux sur lequel nous étudierons leur comportement lors de plusieurs tests comportementaux ainsi que leurs paramètres cardiaques. Nos premiers résultats montrent que la zone A envoie des signaux vers diverses zones cérébrales régulant le rythme cardiaque, dont majoritairement la zone R. L’objectif principal de notre projet est donc d’explorer comment cette connexion entre la Zone A et R influence l’apparition et le maintien des troubles anxieux, en jouant un rôle clé dans l’interaction entre le cœur et le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication de la connexion A-R dans l’expression et le maintien des symptômes d’anxiété au sein de l’axe cœur-cerveau. Il permettra d’obtenir des informations sur les modifications cellulaires et moléculaires à long terme provoquées par un protocole de défaite sociale chronique (CSD). Une meilleure compréhension des circuits impliqués nous permettra d’évaluer de nouvelles approches pour le traitement des troubles anxieux
Procédures
Dans le cadre de nos recherches, différentes techniques sont utilisées pour étudier le fonctionnement cérébral des souris. Pour enregistrer l’activité neuronale ou activer certaines zones du cerveau à l’aide de la lumière, les souris reçoivent une implantation de fibres optiques ainsi que l’injection de vecteurs spécifiques via une intervention chirurgicale précise (durée de la chirurgie : environ 25 min). Pour les études du rythme cardiaque, des implants sont également placés pour permettre un suivi continu de certains paramètres, (durée de la chirurgie : environ 20 min). Les animaux réalisent des tests comportementaux afin d’étudier l’anxiété (test durant 5 à 10 minutes), la prise de risque avec restriction alimentaire (8 jours). Pour notre modèle de stress social, les souris seront hébergées individuellement durant 13 à 18 jours selon le type de tests effectués. Lorsque la fin de vie des animaux est nécessaire, celle-ci est réalisée sous anesthésie générale, suivie d’une procédure strictement encadrée pour garantir l’absence de souffrance (durée de la chirurgie : environ 15 min). Les souris seront également soumises à 3 tests comportementaux : a) prise de risque avec restriction alimentaire d'une durée de 8 jours, b) test du champ ouvert d'une durée de 10 minutes et c) test du labyrinthe en O d'une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Tous les animaux seront génotypés et identifiés par poinçonnage d’oreille. Certains animaux seront exposés à des confrontations sociales, d’une durée maximale de 5 minutes par jour sur une période de 10 jours consécutifs. Ces souris seront hébergées 2 par 2 avec un séparateur en plexiglas pendant le protocole de défaite. Cette procédure amènera à de possibles blessures ou à l’état anxieux. Ces éléments ne peuvent pas être soulagés, car ils font partie du phénotype recherché. De potentielles blessures peuvent arriver lors de la défaite sociale. Une chirurgie stéréotaxique sera également pratiquée sur une partie des animaux avec implantation de fibre optique et/ou injection de vecteurs viraux. Une partie des souris subiront une chirurgie avec implantation d’une sonde de télémétrie en sous-cutané. Enfin, pour la dernière étape, les souris subiront une chirurgie pour l’implantation d’une électrode vouée à la stimulation du nerf vague. Ces diverses chirurgies peuvent entraîner des effets indésirables tels que des inflammations locales, un stress postopératoire et un inconfort temporaire pour les animaux. Certains animaux passeront des tests comportementaux (tels que le labyrinthe en 0 surélevés, le test de champs ouvert et le conditionnement de prise de risque) pouvant augmenter leurs niveaux de stress. Afin de diminuer ce stress les animaux seront habitués à l’expérimentateur et aux appareillages au préalable.
Devenir
Après les tests comportementaux, les souris seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réaliser des mesures électrophysiologiques ou afin de vérifier la justesse des injections intracérébrales et du placement des fibres optiques/d’enregistrements/implants. Après le génotypage, les animaux vont aller dans des groupes expérimentaux pour la réalisation de ce projet ou pour les autres projets de l'équipe.
Remplacement
Notre projet repose sur des études visant à mieux comprendre le fonctionnement de certaines régions du cerveau, qui jouent un rôle clé dans les troubles anxieux. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’obtenir des résultats aussi précis sans avoir recours à des modèles animaux. Nous utilisons des souris, car leur cerveau partage de nombreuses similitudes avec celui des humains, ce qui en fait un modèle pertinent pour nos recherches. Grâce à des techniques avancées, nous pouvons cibler de manière très précise des zones spécifiques du cerveau. Cela nous aide à mieux comprendre comment ces zones fonctionnent et comment elles sont impliquées dans les troubles anxieux, en vue de développer des approches thérapeutiques adaptées.
Réduction
Nous faisons tout notre possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches tout en assurant que les résultats obtenus soient fiables et significatifs. Pour cela, nous calculons avec soin le nombre minimum d’animaux nécessaires. Notre projet inclut des mâles et des femelles afin de représenter au mieux l’ensemble de la population et d’éviter des biais liés au sexe. Cela nous permet également de valoriser au maximum les animaux disponibles dans les élevages. Dans certains cas, les mêmes souris peuvent servir à plusieurs étapes de l’étude, ce qui réduit encore le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la qualité de nos résultats.
Raffinement
Dans nos recherches, chaque animal est identifié et suivi grâce à des mesures spécifiques, comme une petite biopsie de l’oreille. Bien que ces pratiques puissent entraîner un léger inconfort temporaire, elles sont indispensables pour assurer un suivi précis et rigoureux de chaque animal. Malgré la rigueur des protocoles, comme ceux impliquant la défaite sociale chronique (CSD), le bien-être animal reste une priorité absolue. Pour cela, nous veillons à enrichir les cages et à minimiser le stress des animaux. Chaque animal est suivi de manière adaptée à sa situation, notamment pour prévenir des risques comme les blessures ou la déshydratation, qui peuvent survenir lors de certaines étapes, comme les chirurgies. Par exemple, dans le cas d’une opération, les souris sont anesthésiées et analgésiée, elles reçoivent une hydratation sous-cutanée avant et après la chirurgie, ainsi que des analgésiques et des anti-inflammatoires pendant cinq jours. Un tapis chauffant, contrôlé par une sonde, est utilisé pour maintenir leur température durant l’opération et le réveil, afin d’éviter l’hypothermie. Les animaux ont toujours accès à de la nourriture et de l’eau, et chaque cage est équipée de bois à ronger, d’un abri et de matériaux pour construire un nid. Nous surveillons régulièrement les signes de souffrance pour réagir rapidement si besoin. Des points limites ont également été établis pour intervenir à chaque étape. Nos recherches utilisent des techniques avancées qui permettent de réduire l’inconfort des animaux. Par exemple : Nous pouvons mesurer et moduler l’activité cérébrale chez des souris éveillées et en mouvement, permettant d’étudier leur comportement sur le long terme et sur les mêmes animaux. Ces outils permettent des interventions très ciblées. Enfin, pour certaines chirurgies, bien que réalisables sur des souris légères (17g), nous attendons que les animaux atteignent un poids de 22 à 30 g pour que ces opérations soient mieux tolérées par les animaux.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix pour notre projet en raison de leur proximité évolutive avec l’Homme, de leur cycle de vie court et de l’abondance de connaissances scientifiques disponibles à leur sujet. Leur élevage dans des conditions standardisées assure la reproductibilité des résultats. Les mécanismes du stress et les propriétés neuronales des souris, notamment dans les structures cérébrales étudiées, présentent des similitudes notables avec ceux des humains. Cela permet de réaliser des avancées majeures dans la compréhension et le traitement des troubles anxieux. Enfin, notre laboratoire dispose des techniques appropriées pour travailler avec cette espèce. Dans nos protocoles expérimentaux, les souris, dès l’âge de six-huit semaines, sont soumises à différentes combinaisons d’interventions (injections de vecteurs, implantation de fibres optiques, dispositifs d’enregistrement de l’activité neuronale, du rythme cardiaque ou encore stimulation du nerf vague). Des périodes de récupération post-opératoire de plusieurs semaines sont systématiquement respectées avant de réaliser des analyses comportementales ou d’exposer les animaux à des paradigmes de stress social chronique. Certaines étapes incluent également des procédures spécifiques en fonction du génotype des souris (réalisé entre 21 et 28 jours après la naissance), adaptées aux objectifs expérimentaux. PS : Souris 6 semaines pour injections stéréotaxiques car les régions cérébrales sont bien développées à partir de cet âge, et les virus nécessitent une expression de 3 à 6 semaines. Souris 8 semaines ou plus pour la télémétrie et stimulation du nerf vague car plus tôt, les animaux sont trop petits pour être soumis à ce type de chirurgie. Souris 21-28 jours, comme période la plus jeune pour pouvoir être sevrées/ génotypées.
Dégénérescence rétinienne induite par exposition à la lumière
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Exposés à la lumière bleue jusqu'à détruire une partie de leurs photorécepteurs, 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées au niveau de souffrance le plus faible, léger. Ils reçoivent des collyres jusqu'à six à huit fois par jour, des injections dans l'œil sous anesthésie locale une à deux fois par semaine, des examens ophtalmologiques sous anesthésie et des prises de sang sur animal vigile. La quasi-totalité est tuée pour analyse histologique de la rétine, le porteur estimant que 10 % des rats, écartés après l'électrorétinographie initiale, pourront être réutilisés dans d'autres procédures. La durée d'exposition à la lumière bleue, qui produit la lésion, n'est indiquée que comme "une certaine période", et le porteur écrit que le développement de ces maladies de la rétine n'est pas douloureux.
Objectifs
Le but de ce projet est d’utiliser un modèle de dégénérescence rétinienne induit par exposition à la lumière chez le rat afin de tester l'efficacité de substances à protéger les photorécepteurs. La rétine assure la conversion d'un signal lumineux en un influx nerveux, elle est composée de deux tissus : la rétine neurale (neurorétine) et l'épithélium pigmentaire de la rétine. La neurorétine est un tissu composé de six types de cellules neuronales (deux types de photorécepteurs : cônes et bâtonnets, des cellules horizontales, bipolaires, amacrines et ganglionnaires) et de trois types de cellules gliales (cellules gliales de Müller, astrocytes et cellules microgliales). Les dégénérescences de la rétine, dont la dégénérescence maculaire liée à l’âge sous sa forme sèche (DMLA sèche) ou la rétinite pigmentaire, font partie des causes de cécité les plus fréquentes dans les pays industrialisés. Ces atteintes conduisent à une atrophie progressive des photorécepteurs et à la perte de la vision centrale et peuvent entrainer un handicap chez les patients. Ce modèle consiste à exposer des rats à la lumière bleue pendant une certaine période, et à produire des altérations de la rétine au niveau des photorécepteurs et de l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces lésions sont dues à l’activation du stress oxydatif, à la mort cellulaires par apoptose et par nécrose, elles sont comparables à celle observées dans les pathologies humaines telles que la DMLA sèche ou la rétinite pigmentaire. Le projet s'étale sur 5 ans nous estimons pouvoir réaliser 4 études de test d'efficacité de molécules par an, ces études comporteront au maximum 6 groupes de 15 animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA sèche, qui n’a actuellement pas de traitement, ou toute autre maladie entrainant la perte des photorécepteurs (rétinite pigmentaire, maladie de Leber, dystrophie rétinienne ou encore certains cas de glaucome ou de rétinopathie diabétique). La DMLA sèche concernerait environ 5 millions de personnes dans le monde et potentiellement 10 millions d’ici 2040 avec le vieillissement de la population.
Procédures
Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles causées lors de l’induction de la pathologie, comme le maintien des animaux dans un environnement différent des conditions normales d’hébergement pendant quelques heures (exposition à une lumière bleue). Les examens pratiqués pour évaluer les signes cliniques de la maladie ne sont pas invasifs. Ils sont semblables à ceux pratiqués chez l’animal en clinique vétérinaire ou chez l'homme en cabinet ophtalmologique où ces examens sont d’ailleurs pratiqués sans anesthésie. Ici la gêne occasionnée sera le maintien de l’animal ou l’administration de l’anesthésie dans le cas où l’immobilisation est nécessaire. L'administration topique des produits notamment des traitements devrait engendrer une gêne transitoire de et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration par injection intraoculaire, en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation transitoire avec l'apparition de rougeurs sans conséquence. Une administration d’anesthésiant locale dans le cas des injections intraoculaires réduira la gêne à son maximum. Les animaux vont avoir une baisse de la vision, mais leur comportement, déplacement dans leur cage, prise de poids n’est pas altéré. Le développement de ces maladies de la rétine n’est pas douloureux.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale : examens, induction de la pathologie et traitements, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais nous estimons qu’une proportion de 10% animaux ne suivra pas la totalité de la procédure. Ces animaux seront potentiellement exclus de l’étude après l’électrorétinographie pratiquée en baseline qui sert à révéler un défaut anatomique ou physiologique. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie. Ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins, avec notamment l’influence du système immunitaire. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Les animaux seront des jeunes adultes âgés au minimum de 6 semaines pour les rats correspondant à la maturité de la rétine.
EquitExpo2 : Caractérisation des bioaérosols en milieu équin et évaluation de leurs impacts sanitaires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Chaque cheval subit deux prélèvements nasopharyngés, deux lavages trachéaux et deux lavages bronchoalvéolaires sous sédation, avec le passage d'une sonde dans les voies respiratoires. Onze équidés adultes sont utilisés dans des procédures déclarées au niveau de souffrance le plus faible, léger. Parmi les effets possibles, le porteur liste des saignements lorsque l'ethmoïde est heurté, des tremblements, une sudation excessive, une hyperthermie, un malaise et un choc allergique lié aux sédatifs, ce qui cadre mal avec la gravité annoncée. Tous les chevaux restent en vie à l'issue et sont réutilisés, l'étude cherchant à établir si le cheval peut servir d'animal sentinelle de l'exposition aux bioaérosols en écurie.
Objectifs
L’environnement a un rôle primordial dans le développement des affections respiratoires qui représentent chez le cheval la deuxième cause de contre-performance après les affections locomotrices. Les bioaérosols peuvent être à l’origine d’affections pulmonaires telles que l’asthme ou d’infections dont l’aspergillose des poches gutturales causée par Aspergillus fumigatus. Il a été décrit une contamination fongique différente entre les écuries où des cas d’aspergillose ont été rapportés par rapport à celles n’ayant jamais hébergé de chevaux atteints. Rhodococcus, bactérie responsable de bronchopneumopathies mortelles chez le poulain, est régulièrement identifié en aérosol dans les élevages équins. De plus, chez le cheval, certains constitutants des bioaérosols (aéroallergènes) peuvent représenter des facteurs externes de stress responsables d’asthme équin. Ainsi, notre projet vise à : - Décrire sur deux années selon les activités (curage, affouragement, paillage, balayage) la composition microbienne des bioaérosols (nature et concentrations des contaminants fongiques et bactériens) - Recenser grâce à des questionnaires les ressentis des soigneurs (empoussièrement, gêne respiratoire) et du comportement des chevaux. Ces questionnaires permettront aussi de renseigner l’environnement des écuries et les conditions de réalisation des prélèvements (activité) - Evaluer la présence des contaminants aériens ayant un potentiel oestrogénique et cytotoxique (bioaérosols, souches fongiques, mycotoxines) - Evaluer la possible utilisation du cheval comme animal sentinelle de l’exposition aux bioaérosols grâce à des prélèvements nasopharyngés, lavages trachéaux et des lavages bronchoalvéolaires. A notre connaissance, très peu d'études se sont intéressées à la caractérisation de ces prélèvements chez le cheval en dehors de recherche de pathologies (thèse vétérinaire de Charles Desson). La caractérisation de ces prélèvements est justifiée par le fait que chez les humains en bonne santé le microbiote nasal semble peu contribuer à la composition du microbiote pulmonaire et qu’il a été aussi montré chez le cheval sain que la composition du microbiote évolue selon le site de prélèvement le long des voies respiratoires supérieures et inférieures. Il s’inscrit dans une approche « One Health » en s’intéressant à l’impact de l’environnement intérieur (écurie) sur la santé et le bien être du cheval et de l’Homme (soigneurs).
Bénéfices attendus
La vérification de l’hypothèse de l’utilisation du cheval comme animal sentinelle de l’exposition aux bioaérosols grâce à la caractérisation fongique et bactérienne des prélèvements d’air (prélèvements d’ambiance), des prélèvements nasopharyngés, des lavages trachéaux et des LBA de chevaux exposés à deux types d’environnements (écurie ou extérieur) pourrait alors permettre à la filière équine une évaluation plus simple et plus directe des risques encourus par les chevaux en termes d’affections respiratoires et pulmonaires (santé) et de bien-être mais aussi par les soigneurs qui évoluent dans les mêmes environnements.
Procédures
Pour chaque équidé , deux prélèvements nasopharyngés, deux lavages trachéaux et deux lavages bronchoalvéolaire seront réalisés sur l’ensemble de l’étude (1 par condition/période). L’ensemble de ces interventions durera une 30aine de minutes par période (=condition exposés ou non exposés) .
Impact sur les animaux
Du stress peut être induit par les différents actes. Une gêne peut être ressentie par le cheval au moment du passage de la sonde / endoscope et du liquide dans les voies respiratoires pouvant occassioner de la toux qui sera limitée par les effets de la sédation. Des saignements, lors de prélèvements respiratoires, peuvent survenir lorsqu’il y a une irritation des cavités nasales ou que l’ethmoïde est choqué (ce qui peut arriver lorsque le cheval bouge ou qu’il lève la tête brusquement). Une réaction à l’administration de sédatifs peut également survenir (tremblements, sudation excessive, hyperthermie, malaise, choc allergique).
Devenir
Tous les animaux sont maintenus en vie à l’issue de la procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle permettant de reproduire l’environnement aérien des chevaux sachant que les taux de microorganismes varient selon les saisons et selon les types d’environnement : fermé (écurie) ou ouvert (extérieur). De plus, l’exposition in vitro de cellules ou organoides d’origine équine à des prélèvements réalisés en écurie ou en extérieur grâce à des collecteurs d’air d’ambiance ne permettrait pas par ailleurs de prendre en compte l’influence d’une exposition de l’organisme entier et de l’impact du site de prélèvement sur la composition microbienne.
Réduction
Il a été défini pour le projet et afin de disposer d’un effectif suffisant, un total de 11 chevaux présents sur un même site et prélevés deux fois c'est à dire dans deux conditions différentes. 1ère condition : les 11 chevaux dans cette condition seront dits naïfs c'est à dire chevaux non exposés aux bioaérosols générés par les quatre activités suivies : affouragement, balayage, curage et paillage c’est-à-dire hébergés en extérieur. 2ème condition : les 11 chevaux dans cette condition seront dits exposés (chevaux en écurie fermée). Si on considère qu'il y au plus de 25% de faux positifs chez les "naïfs" et qu’il y a des vrais positifs dans 90% de cas chez les exposés, en utilisant le test exact de Fisher, cela conduit à 11 chevaux par condition.
Raffinement
Les procédures sont réalisées selon un protocole standardisé par un vétérinaire. La gêne (et/ou douleur) et le stress induits par ces actes seront contrôlés par la sédation. Si des saignements apparaissent, une évaluation initiale permettra de qualifier la quantité de sang visible. Si elle est minime (stries ou petites gouttes), la situation est souvent bénigne. En revanche, si celle-ci est modérée à abondante (c’est-à-dire un flux continu ou une accumulation dans les voies respiratoires), cela signale une complication et nécessite l’intervention immédiate du vétérinaire. A la fin de chaque lavage bronchoalvéolaire, les équidés seront placés dans un paddock en sable ou un box paillée (à proximité d’un autre congénère) avec un panier de jeûn évitant tout risque de fausse déglutition, et ce jusqu’à l’absence d’effets visibles de la sédation. Les chevaux ne recevront pas de ration alimentaire dans les 2 heures suivant le prélèvemement. Les chevaux seront manipulés par des personnes familières ayant en charge les soins quotidiens.
Choix des espèces
Les animaux prélevés seront des animaux adultes de même tranche d’âge (5 -10 ans) ayant passé un temps suffisant dans les conditions choisies (fermé : écurie ou ouvert : extérieur) afin que les prélèvements puissent refléter l’environnement (air ambiant) des chevaux.
Etude des effets de mutations d’un gène neuronal sur le développement du cerveau et ses cellules immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une césarienne de quarante-cinq à soixante minutes est pratiquée sur des femelles à 12,5 jours de gestation pour électroporer un gène dans le cerveau de leurs embryons. 2 547 souris vont être utilisées, 2 196 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 351 un niveau modéré. Le porteur indique que les femelles opérées peuvent ressentir une douleur modérée limitant leur mobilité pendant sept à dix jours, et que les souris porteuses de deux copies de la mutation étudiée meurent une dizaine de jours après la naissance. Tous les animaux électroporés sont tués pour analyse de leurs tissus, les femelles césarisées le sont au moment où l'on récupère leurs embryons ou leurs souriceaux, et seuls les mâles reproducteurs peuvent servir à d'autres accouplements.
Objectifs
Le Syndrome d’Atrophie Optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui affecte le développement du cerveau. Elle est causée par des mutations au niveau d’un gène particulier, qui est essentiel pour la formation et l'organisation des cellules du cerveau. Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, qui vont porter des mutations retrouvées chez les patients, pour étudier cette maladie. Nos recherches montrent que certaines mutations provoquent une réduction de la taille d'une partie du cerveau appelée septum qui joue un rôle important dans la motivation, la mémoire ou encore l’apprentissage. En parallèle, les cellules immunitaires du cerveau, appelées microglie, ne semblent pas se déplacer correctement. La microglie est cruciale pour le développement normal du cerveau, aidant à la croissance des cellules nerveuses et à la formation de leurs connexions. Très tôt au cours du développement embryonnaire, des cellules précurseurs se déplacent et se développent pour former le septum. Au même moment, la microglie est recrutée dans le cerveau. Nous pensons que les cellules précurseurs, qui donnent naissance aux cellules du septum, jouent aussi un rôle dans le recrutement précoce de la microglie. Dans notre projet, nous utilisons une technique appelée électroporation in utero, qui permet d’introduire des gènes dans les cellules d’un embryon. Nous ciblerons les cellules précurseurs que nous pourrons suivre grâce à un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d'étudier leur développement et de tester des molécules qui pourraient corriger les défauts observés chez les souris atteintes de BBSOAS. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et d'identifier des cibles potentielles pour des traitements futurs.
Bénéfices attendus
L'étude de modèle de souris mimant le BBSOAS a révélé des anomalies dans le cerveau, comme une réduction de la taille d'une partie appelée septum et un problème de recrutement des cellules immunitaires du cerveau. Ces différences dépendent des mutations portées et nous permettent de mieux comprendre leur implication dans le développement du cerveau. À moyen terme, en reliant les symptômes des patients atteints de BBSOAS à la mutation qu’ils portent, nous pourrons améliorer le diagnostic précoce et les soins, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. À long terme, nous espérons identifier des cibles pour des traitements qui pourraient contrer les effets négatifs de ces mutations sur le développement du système nerveux.
Procédures
La césarienne est effectuée sur des femelle à 12.5 jours de gestation. Elle dure entre 45 et 60 minutes en fonction du nombre d'embryons portés à électroporer. Le poinçonnage au niveau des oreilles pour identification et génotypage des animaux servant aux accouplements se fera en une seule fois sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes par animal. La chirurgie terminale sera réalisée sur animaux ayant reçu une dose léthale d'anesthésique en une seule injection. Cette injection se fera sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes ayant subi une cesarienne pour l’électroporation de leurs embryons pourront présenter une douleur ou une gêne de niveau modéré au niveau de l’incision pouvant réduire leur mobilité. Cette gêne est temporaire et devrait disparaitre après cicatrisation, entre 7 à 10 jours. Les souris porteuses d’une seule copie de nos mutations ne présentent aucun phénotype dommageable. Les souris porteuses de deux copies mutées meurent environ 10 jours après la naissance. Les mutations étudiées n’induisent donc pas effets indésirables avant la naissance, les embryons étant de taille comparable aux sauvages. Pour cette procédure nous prélèverons systématiquement avant la naissance les portées pouvant comporter des embryons présentant deux copies mutées évitant ainsi l’apparition de tout problème de santé sur nos souris. Chaque souris arrivant à terme ne sera porteuse que d’une seule mutation.
Devenir
L’ensemble des animaux électroporés sera mis à mort pour récupération et analyse des tissus post mortem. Les femelles gestantes ayant subi une césarienne ne pourront être réutilisées dans aucune autre procédure et seront donc mises à mort systématiquement au moment de la récupération de leurs embryons ou au moment de la mise à mort de leurs souriceaux. Les males ayant servi pour les accouplements pourront servir à d'autres accouplements.
Remplacement
Nous utilisons des cultures cellulaires in vitro, notamment des organoides de tissus cérébraux afin de remplacer autant que possible les expériences sur animaux vivants. Cependant, étudier le développement du système nerveux requiert un système biologique dynamique intégré tel qu’un organisme vivant. En effet, la microglie ne se forme pas dans le cerveau : elle tire son origine d’une structure extra-embryonnaire et colonise le cerveau en développement grâce au développement parallèle du système sanguin et à la vascularisation. Ainsi des facteurs spatiaux et temporels sont indispensables au bon développement du cerveau et impossibles à recréer à l’identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes qui mènent aux symptômes variés et complexes observés chez les patients.
Réduction
Nous avons estimé avec un outil statistique prédictif le nombre de souris nécessaire par groupe (9 souris) pour obtenir des résultats avec une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses de nos précédents résultats. En considérant une perte potentielle de 10% d'animaux, incompressible et classique dans le cadre d'une chirurgie, 10 échantillons de chaque mutation étudiée seront analysés pour chaque lot expérimental. Pour obtenir cette taille d'effectif de 10 échantillons, il nous faudra 4 portées pour chaque stade de développement étudié. Les échantillons seront analysés au fil de l'eau et si le bon effectif d’embryons/souriceaux est obtenu avant d’atteindre le nombre de portées prévues, nous ne génèrerons pas de portée supplémentaire. Enfin, nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés que nous analyserons en parallèle.
Raffinement
Les conditions de réalisation de la chirurgie ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et antiinflammatoire (pendant et après la chirurgie). Chaque femelle gestante ayant subi une césarienne sera suivie avec une évaluation de leur état réalisée selon une grille de score qui prévoit des critères d’arrêt précoce et des points limites adaptés. Pour la collecte d’animaux après la naissance, nous prévoyons d'utiliser des stratégies de croisement nous assurant de ne générer aucun animal porteur de deux copies de nos mutations. Chaque souris ne sera porteuse que d'un seul type de mutation. Les animaux électroporés seront tous génotypés post mortem.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme. De plus, le développement d’un embryon de souris est très similaire à celui d’un embryon humain et les mécanismes neurodeveloppementaux que nous souhaitons étudier sont les mêmes. Enfin, il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations retrouvées chez les patients BBSOAS que nous possédons déjà au laboratoire et qui sont d’excellents modèles validés de cette maladie génétique. Pour cela, nous électroporerons les précurseurs neuronaux à 12,5 jours de gestation embryonnaire qui est un stade précoce où ces cellules précurseurs vont commencer à se différencier et à migrer pour aller former le futur septum. Le pic de recrutement des cellules immunitaires commence au même moment. Pour laisser le temps aux cellules électroporées de migrer et au gène électroporé de s’exprimer, nous analyserons les cerveaux embryonnaires 2, 4 ou 6 jours post électroporation ainsi qu'après la naissance.