Procédures légères

Gavées quotidiennement avec un retardateur de flamme pendant les 42 jours de leur gestation et de leur allaitement, douze rates mettent bas des portées dont les ratons surnuméraires sont déplacés vers d'autres portées ou tués. Les jeunes passent ensuite quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, destinés à repérer ceux qui présentent le phénotype autistique recherché. Les rats retenus subissent quatre séances d'imagerie cérébrale sous six anesthésies, pour mettre au point une mesure du métabolisme et de l'inflammation du cerveau. 148 rats sont utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 37 ayant été ajoutés après l'échec des premières gestations. Seuls 16 resteront en vie, réaffectés à d'autres projets ou "placés en retraite".

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet a pour objectif à court terme de valider une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin d’à plus long terme mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). L’EU1 sera en charge de la mise en place du modèle et l’EU2 de l’imagerie cérébrale. Un problème expérimental au cours du déroulement du projet nécessite l'ajout de 37 animaux par rapport à la demande initiale.

Bénéfices attendus

Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.

Procédures

Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids (EU1). Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie (EU1). Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point (EU2).

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA, d'une durée de quelques secondes, entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée (quelques secondes). Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (au nombre de 4, d'une durée de moins de 30 min chacun) entraine un stress physique mineur de courte de durée.

Devenir

Douze femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 120) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 16 rats (8 femelles et 8 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.

Réduction

Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie. Les première femelles n’ont pas permis d’obtenir des descendants pour réaliser les analyses d’imagerie. Trois femelles gestantes ainsi que de leurs descendants, c’est-à-dire 30 jeunes, seront donc ajoutées à ce projet afin de pouvoir obtenir le nombre final d’animaux nécessaire pour l’imagerie. Par ailleurs, en raison du décalage dans la réalisation des tests, les animaux nécessaires au test de sociabilité ne correspondront plus à l'âge idéal pour réaliser ce test, nécessitant l'ajout de 4 rats adultes. Au final, en sus des 111 déjà demandés et approuvés, nous souhaiterions ajoutés 37 animaux, soit un nouveau total de 148 animaux.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.

Choix des espèces

Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.

1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir quinze anesthésies générales, onze injections dont celles des cellules tumorales et un rasage du flanc droit, la tumeur greffée pouvant devenir douloureuse en grandissant. L'objectif immédiat reste de vérifier chez la souris un effet déjà observé en culture cellulaire, le bénéfice pour les malades étant renvoyé à la validation "à terme" de l'intérêt clinique d'un agent pharmacologique. Le porteur présente l'espèce comme "le modèle de choix et de référence", au motif que le développement tumoral et la réponse immunitaire y seraient proches de ceux de l'être humain.

Objectifs

Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes

Impact sur les animaux

- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.

Réduction

Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

Les cellules greffées proviennent de fœtus prélevés sur des femelles gestantes mises à mort trois à quatre jours avant la mise-bas. 1650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les receveuses, souvent des nouveau-nés de deux à quatre jours séparés de leur mère, sont irradiées éveillées pendant une à quatre minutes pour détruire leurs cellules immunitaires, puis reçoivent les cellules greffées et subissent jusqu'à vingt-quatre prises de sang dans la veine de la joue, sans anesthésie. Sur la réduction, le porteur se borne à écrire qu'il a utilisé "le minimum nécessaire et suffisant", sans avancer ni calcul ni effectif par groupe pour justifier ces 1650 souris.

Objectifs

Le système immunitaire est un ensemble des mécanismes de défense qui permet de lutter contre des agents pathogènes (virus, bactéries cellules cancéreuses). Néanmoins dans le cas de cancers ces mécanismes n’arrivent plus à jouer leur rôle de défense et sont débordés par la multiplication rapide de ces cellules. Les mécanismes qui régulent la production des différentes cellules du système immunitaire restent mal connus, mais il a été montré que dans les cancers du sang (leucémies) les cellules du système immunitaire avaient de fréquentes modifications. Ces modifications semblent avoir un impact majeur sur l’activité des cellules immunitaires dans des conditions naturelles (sans pathologie) et dans des conditions de maladie (pathologie) Ces fréquentes modifications sont observées sur des éléments appelés « protéines ». Les protéines sont des molécules qui agissent dans le développement des cellules de l’organisme. Il existe de nombreuses protéines dans l’organisme et leur production est différente en fonction de la cellule. La protéine Ets-1 est l’une des protéines essentielles pour le développement normal de différentes populations de cellules du système immunitaire. Elle joue également un rôle dans le développement anormal des cellules sanguines dans le cadre de pathologies telles que les leucémies. Notre projet de recherche vise donc à comprendre plus précisément le rôle de cette protéine dans le développement normal mais également lors de la production des cellules tumorales. Il permettra de caractériser les processus qui contrôlent la mise en place du système immunitaire et de définir de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies du système immunitaire et en particulier dans les leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les processus qui contrôlent la mise en place du système immunitaire en présence ou en absence de notre protéine d’intérêt et de mettre en évidence les acteurs moléculaires qui sont influencés par son activité au cours du développement des cellules immunitaires. Ces nouveaux acteurs moléculaires pourront ensuite être des candidats intéressants pour le développement de nouvelles thérapies dans les maladies du système immunitaire et en particulier dans les leucémies.

Procédures

La première partie du projet consiste à obtenir les cellules utilisées pour la mise en place du modèle d'étude. Pour cela, nous réalisons des croisements entre nos lignées de souris génétiquement modifiées (n'exprimant pas la molécule Ets-1). Afin d'éviter la mort quelques jours après la naissance des souris d'intérêt, nous euthanasions les femelles gestantes (3 à 4 jours avant la mise-bas) afin de pouvoir récupérer les fœtus et le foie. Les cellules souches hématopoïétiques (cellules qui vont se développer pour générer l'ensemble des cellules du système immunitaire) sont obtenues à partir de ces foies fœtaux et injectées à des souris receveuses afin de s'y multiplier. Avant l'étape d'injection, les souris receveuses subissent une étape d'irradiation qui consiste à détruire les cellules immunitaires déjà présentes dans la souris afin de faciliter la prolifération des cellules injectées (réalisée sur souris éveillées, durée entre 1min30 et 4 min). L’administration (10s) des cellules, faite moins de 24h après l'étape d'irradiation, est non douloureuse et est réalisée sur souris éveillées. Des prélèvements de sang (au maximum 24 sur la durée totale de l'expérience) sont réalisées au plus toutes les 2 semaines (au niveau de la veine de la joue, sans anesthésie; durée: 30 s). Le premier prélèvement a lieu 3 semaines post-injection pour les expériences faites sur les souris nouveau-nés et 4 semaines post-injection pour les expériences réalisées sur les adultes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont un stress et un inconfort ressentis au cours de l’étape d'irradiation avec le changement d’environnement de l’animal (changement de cage et transport dans la pièce pour l'irradiation), pendant l’injection des cellules et les prélèvements sanguins. Un stress supplémentaire est ajouté aux animaux (mère et nouveau-nés) lors de leurs séparations pour l’étape de conditionnement et des injections. L'étape d'irradiation peut également entrainer des diarrhées et une déshydratation. En cas, d'absence de prise de greffe des cellules injectées, la mort de l'animal est possible.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure, les organes du système immunitaire seront prélevés (moelle osseuse, thymus, rate, ganglions mésentériques) en vue de la réalisation analyse génétique.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum de tests in vitro. En effet, le développement de nouvelles techniques d’analyses génétiques ainsi que la bibliographie nous permettent aujourd’hui de faire une présélection des potentiels acteurs moléculaires qui pourraient influencer le développement des cellules immunitaire. Ils sont alors testés in vitro (sur des cellules que nous cultivons en dehors de l’animal) et seulement ceux qui auront prouvé une efficacité seront testés sur l’animal. Le modèle animal reste nécessaire afin d'analyser ces processus complexes de développement cellulaire dans un système naturel qui tient compte de l’environnement dans lequel ces cellules se développent.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour la validité scientifique de notre étude.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, un suivi quotidien des animaux est réalisé en s’attachant tout particulièrement au comportement des souris (apparence, posture, toilettage). Nous réaliserons une fois par semaine un suivi clinique à l'aide d'une grille de score, permettant la mise en place de points limites. Nous nous attacherons à faire une surveillance accrue au cours de la première semaine de la procédure afin de s’assurer que les mères acceptent bien le retour des nouveau-nés dans le nid après leur manipulation. Les injections et prélèvements sanguins réalisé par un personnel compétent, ne sont pas douloureux et ne nécessitent pas d’administration anesthésie/analgésie. Tout au long de la procédure, les souris seront hébergées dans des cages avec un enrichissement adapté (buchette en bois ainsi que du coton pour le nid). Elles auront accès à la nourriture et à l'eau de boisson en continu. En cas d'altération du comportement des animaux des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent y accéder plus facilement. Si aucune amélioration n'est observée, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique et le comportement sont bien connus. L'évaluation du bien-être et de la possible douleur chez la souris peut être réalisée facilement (en observant certains critères) ce qui permet une prise en charge adaptée. Les cellules d’intérêt sont recueillies sur des embryons de souris à 17,5 jours de développement in utéro. Pour le reste du projet nous privilégierons l’utilisation de souris nouveau-nés âgées de 2 à 4 jours. Cette utilisation a pour principal avantage de pouvoir étudier les animaux plus précocement (à partir de 3 semaines post-greffe) et le développement du système immunitaire à partir des cellules injectées est de meilleure qualité ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, dans le cas où il serait difficile de faire coïncider l'obtention de foie fœtal, la modification de ces cellules in vitro et la disponibilité de souris receveuses âgées de 2 à 4 jours, nous utiliserons des souris adultes pour les expériences de greffe.

Réduire le nombre de souris maintenues dans les élevages passe ici par l'utilisation de 4440 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent réimplantation chirurgicale d'embryons, greffe d'ovaire, vasectomie ou injection d'hormone provoquant une superovulation, chaque chirurgie durant de dix à quinze minutes. Le porteur décrit ensuite des douleurs de déplacement, une prostration, une piloérection et parfois une perte de poids. 1000 souris seront réutilisées, dont des femelles porteuses transformées en "femelles de compagnie" pour les animaux laissés seuls, tandis que les femelles superovulées sont tuées et les mâles vasectomisés le sont une fois devenus, au bout de six mois, "beaucoup moins performants pour s'accoupler".

Objectifs

La finalité est le raffinement dans l’utilisation des animaux et la réduction du maintien de lignées sous forme respirantess. Le but est de permettre un élevage ou une congélation pour le maintien simple des lignées d’animaux génétiquement modifiés et d’expérimentation scientifique par différentes techniques connues et développées dans les animaleries. L’autre aspect est la réduction des animaux utilisé pour entretenir les lignées d’animaux génétiquement modifiés pour cela nous proposons plusieurs méthodes afin de parvenir à raffiner et /ou à réduire le nombre d’animaux dans les élevages, mais aussi pour d’autres fins tel que l ‘expérimentation ou la sauvegarde de lignées d’animaux en perdition. Pour cela, nous utilisons plusieurs méthodes dont la finalité est la sauvegarde de souches sous forme respirante ou congelée dans un but d’expérimentation scientifique mais aussi dans le maintien des élevages au plus bas nombre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont multiples: 1- éviter de produire des animaux qui ne sont plus utilisés (la cryoconservation permet de les conserver sous forme d'embryons, spermes, ovaires) 2- éviter de transporter des animaux vivants entre les animaleries (paillettes ou tubes congelés) 3- éliminer les pathogènes que peuvent porter les animaux qui leur nuiraient et nuiraient aux expérimentations ( décontamination des lignées) 4- sauvegarder le patrimoine génétique dans le temps 5- sauvegarder les lignées en cas de contamination de l'animalerie.

Procédures

La réimplantation chirurgicale d'embryons et la greffe ovarienne sont des chirurgies qui durent 15 min et qui ne sont réalisées qu'une seule fois dans la vie de la souris. La vasectomie est une chirurgie qui dure moins de 10 min et n'est pratiquée qu'une seule fois sur la souris. L'injection d'hormone est faite en 5 min et une seule fois.

Impact sur les animaux

Pour l'injection d'hormone, la nuisance n'a lieu qu'au point de pénétration. Pour la vasectomie, la réimplantation d'embryons et la greffe ovarienne, les nuisances sont celles de réactions post-opératoires douleurs de déplacement, prostration, piloérection et parfois une faible perte de poids

Devenir

Les femelles porteuses ayant servi à la réimplantation chirurgicale des embryons, après sevrage des petits sont gardées pour servir de femelles de compagnie pour les femelles réimplantées seules ou les mâles vasectomisés seuls. Seules les femelles super ovulées et les mâles vasectomisés ne peuvent pas être réutilisés aprés expérimentation, car les femelles sont mises à mort après super ovulation et les mâles vasectomisés après 6 mois sont beaucoup moins performants pour s'accoupler et donc produire des femelles pseudo gestantes.

Remplacement

Il n'existe pas de stratégie alternative à l'heure actuelle. La cryoconservation pemet de remplacer les animaux vivants par des banques de sperme, embryons, ovaires. Le remplacement se situe surtout sur le transport où l'on évite le transport d'animaux vivants qui risquent d'être stressés.

Réduction

Les techniques employées dans ce projet permettent une réduction du nombre d'animaux. La cryoconservation permet d'arrêter la production d'animaux qui ne sont plus utilisés et de les conserver sous forme de paillette de sperme, d'embryons ou ovaires. La fécondation in vitro et la réimplantation d'embryons permettent également une réduction car elles permettent d'obtenir directement des pools d'animaux utilisables sans passer par l'élevage classique.

Raffinement

Les animaux sont surveillés lors de leur réveil post-opératoire dans une cage individuelle avec tapis chauffant. Dès leur réveil complet, ils sont placés en portoir ventilé avec un enrichissement constitué d'une maison, de coton et de kraft. Des aliments humidifiés sont disposés dans le fond de cage afin de faciliter l'accès. Une injection d'analgésique est faite en préventif en amont de la chirurgie par voie sous-cutanée au pli de l'aine. En cas de besoin en fonction des signes de douleur ( prostration, poils hérissés, perte de poids) lors du suivi post-opératoire, une autre injection d'analgésique est prévue. Notre expérience nous permet de signaler qu'il n'a jamais été nécessaire d'aller au delà. la cryoconservation permet de ne plus faire voyager d'animaux vivants qui stressent très souvent. On envoie des paillettes de sperme, d'embryons ou ovaires.

Choix des espèces

Le projet est basé sur la décontamination ou la préservation de souris. Les animaux seront utilisés à maturité sexuelle, vers 7 à 8 semaines sur toutes les procédures du projet.

1560 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit une injection de cellules de mélanome de l'œil dans le sillon rétro-orbital, 576 d'entre elles subissent trente injections de traitement anticancéreux en dix semaines, et le suivi par imagerie impose jusqu'à vingt anesthésies et vingt injections de luciférine. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant provoquer poils hérissés, dos voûté, perte de poids, prostration et nécroses cutanées, les souris perdant plus de 10 % de leur poids maximal étant mises à mort. Il conclut que ces validations chez la souris sont "indispensables" pour envisager un développement clinique, alors que le projet vise d'abord à construire un modèle de métastases hépatiques qui n'existe pas encore.

Objectifs

Le mélanome oculaire se développe à partir des mélanocytes de l'œil. Il est le cancer primitif intra-oculaire le plus fréquent dans la population adulte. Malgré un traitement réussi des lésions primitives, 50% des patients développent des métastases, dans 90% des cas au foie. Actuellement, un seul traitement permet d’améliorer la survie de 10% des patients avec un mélanome oculaire métastatique hépatique. La majorité des patients reste en impasse thérapeutique. Il faut continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisé des travaux qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. L’objectif de ce projet est d’une part de développer des modèles précliniques de métastases hépatiques pour identifier les acteurs de la dissémination métastatique au foie dans le but de lutter contre la formation de métastases hépatiques. De nos jours, il n'existe pas de lignées de cellules de mélanome oculaire qui métastasent efficacement dans le foie après injection sous cutanée ou intraveineuse. La seule alternative possible est l’injection dans la rate ou dans le sillon rétro-orbital. D’autre part, l’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’inhibiteurs pharmacologiques pour le traitement du mélanome uvéal métastatique une fois établi pour proposer des solutions plus rationnelles à des patients en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo des observations faites in vitro, montrant qu’un changement d’expression de gènes candidats est capable de resensibiliser les cellules de mélanome résistantes aux thérapies ciblées. Ces validations sont indispensables pour envisager, in fine, un développement clinique de nos approches thérapeutiques.

Procédures

1560 souris seront soumises à une injection de cellules au niveau du sillon retro orbital sous anesthésie gazeuse -durée du geste moins d'une minute pour l'injection et moins de 5 minutes pour l'anesthésie. 576 souris recevront par injection sous-cutanée un traitement anticancéreux 3 fois par semaine jusqu’à 10 semaines maximum après l'injection des cellules -durée du geste moins d'une minute pour l'injection avec au total 30 injections. Le suivi par imagerie nécessite des anesthésies répétées (maximum de 20 anesthésies, durée 15 minutes chacune) et une injection intrapéritonéale de luciférine (maximum de 20 injections, durée du geste moins d'une minute ).

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites adaptés, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par le phénotype immunodéprimé, soit par l'injection des cellules dans le sillon rétro-orbital, soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des molécules ou encore les anesthésies répétées. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des molécules pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose…).

Devenir

À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome uvéal humaine et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimées mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Une perte de poids supérieure à 10% de la pesée la plus élevée de toutes les pesées (depuis le début de l’expérimentation) entraînera une mise à mort des souris. Si une observation est faite au niveau de l'apparence physique des souris (absence de toilettage, dommages corporels importants, prostration, yeux mi-clos), le comportement des souris (dos vouté, essoufflement), les souris seront mises à mort. Le suivi est fait par imagerie via la mesure de l’intensité de fluorescence et ou de luminescence. Ceci permet: -un suivi non invasif fait sous anesthésie -un suivi du développement tumorale au cours du temps et permet d'agir dès un développement tumorale et donc une prise en charge rapide -un suivi longitudinale précis ce qui permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux Le site d’injection (sous cutanée) des drogues sera surveillé. De plus, dans le cas de combinaison de drogues, nous ferons en sorte que les molécules puissent être mélangées afin de les injecter en une seule manipulation (diminution du stress). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Etant immunodéprimés, les animaux seront dans des conditions d'hébergement stérile.

Choix des espèces

Les connaissances scientifiques actuelles montrent que les modèles de souris sont très largement utilisés pour étudier le développement des cancers et leur évolution en réponse à des molécules. La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons des souris immunodéficientes agées de 7 semaines pour une prise tumorale optimale, comme un modèle préclinique qui permet l’étude in vivo de candidats sur la prise tumorale et de tester l’effet de traitements sur la progression des tumeurs humaines.

Greffées avec des cellules de foie humain injectées dans la rate, 98 souris chimériques vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Environ une greffe sur dix échoue, et ces souris développent en deux à trois semaines une insuffisance hépatique aiguë avec perte de poids rapide. Les autres sont infectées par les virus des hépatites B et D, reçoivent un traitement quotidien par injection ou gavage, et passent huit prélèvements sanguins en seize semaines, le porteur signalant que ces prélèvements peuvent provoquer une inflammation et une cécité et que le gavage peut perforer l'œsophage ou l'estomac. Les deux animaux d'un couple reproducteur sont tués dès qu'aucune portée n'arrive depuis plus de trois mois, et celles dont la greffe a échoué sont tuées parce qu'elles ne pourront pas être utilisées ailleurs.

Objectifs

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib. Il s'agit d'un projet multisites.

Bénéfices attendus

La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.

Procédures

Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 16 semaines, soit un total de 8 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes. Les animaux seront transportés d'un site à l'autre.

Impact sur les animaux

Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral peut également entrainer une inflammation et des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang. Le transport d'un site à un autre peut générer du stress.

Devenir

Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables. Pour réduire le stress engendrer par le transport des animaux, les cages de transport seront enrichies avec un baton et du coton ou de la frisure pour que les animaux puissent faire un nid. La température sera maintenue suffisamment élevée pour que les souris puissent maintenir leur température corporelle. Les cages seront équipées de couvercles filtrants afin de garantir leur protection des pathogènes extérieurs. A leur arrivée, une période d'acclimatation de 2 semaines serra respectée afin de permettre aux animaux de s'habituer au nouvel environnement.

Choix des espèces

Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.