Procédures légères

Des femelles "réformées", déjà destinées à la mise à mort par l'animalerie, sont utilisées pour prélever les embryons qui servent à tester les stratégies d'édition génétique. 325 souris au total vont être utilisées, 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 200 un niveau modéré. Les donneuses reçoivent deux injections espacées de deux jours puis sont tuées pour qu'on prélève leurs embryons, et les porteuses subissent une chirurgie de réimplantation de dix minutes. Elles sont tuées après le sevrage de leurs petits, au motif qu'une femelle déjà opérée ne peut pas être réutilisée, tandis que les souriceaux génétiquement modifiés partent vers le projet du chercheur qui les a commandés.

Objectifs

Lorsque l’on veut étudier les mécanismes biologiques complexes qui régulent le développement et le fonctionnement des mammifères, la souris est un modèle privilégié, autant pour sa facilité d'élevage que pour sa proximité génétique avec l'homme. Les recherches scientifiques en biologie s'appuient depuis de nombreuses années sur les souris modifiées génétiquement. La technique que nous utilisons consiste à délivrer un ciseau moléculaire (CRISPR/Cas9) dans un embryon de souris au stade 1 cellule, ce qui va introduire une modification génétique spécifique dans le génome. Les souriceaux issus de la réimplantation dans une mère porteuse sont testés pour détecter la modification génétique. Les animaux porteur de la modification sont ensuite accouplés pour établir une lignée génétiquement modifiée. Par rapport aux techniques précédentes (transgénèse par cellules souches embryonnaires notamment), la technique de CRISPR/Cas9 permet de produire des modèles expérimentaux plus rapidement, en utilisant moins d’animaux. Notre Institut a mis en place un plateau commun pour développer ces modèles de souris transgéniques. La mise à disposition de ce plateau équipé et de personnels expérimentés permet d’augmenter de façon importante les taux de réussite et donc à la fois de réduire le nombre d’animaux utilisés et de raffiner la mise en œuvre des procédures.

Bénéfices attendus

La souris est un modèle privilégié pour la recherche fondamentale en biologie, notamment lorsqu'il faut étudier les mécanismes complexes du développement, de la neurogénèse, etc... Les modèles transgéniques murins que nous réalisons sont indispensables pour mieux comprendre ces mécanismes. Les bénéfices attendus de ce projet sont de maintenir un niveau de compétence élevé du plateau commun, tant sur le plan matériel qu’humain, grâce à la prise en charge régulière de projets d’obtention de lignées transgéniques.

Procédures

Les animaux seront soit soumis à 2 injections d’une durée de 10 secondes chacune (espacées de 46-48 heures), soit soumis à une unique chirurgie d’un maximum de 10 minutes.

Impact sur les animaux

La réimplantation est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. Les signes de douleurs ne sont plus normalement présents le lendemain de la chirurgie. Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 10 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum. Les animaux génétiquement modifiés peuvent éventuellement présenter un phénotype dommageable.

Devenir

Toutes les femelles donneuses seront mises à mort afin de pouvoir obtenir les embryons zygotes. Toutes les femelles porteuses seront mises à mort lorsque leurs petits auront été sevrés. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser une femelle qui a déjà subi une chirurgie. Les animaux générés par le plateau technique seront transférés dans le projet du chercheur qui les utilisera.

Remplacement

Le modèle souris est un modèle d’étude indispensable pour les recherches qui sont menées dans notre institut, notamment pour les thématiques de biologie du développement. Même si des modèles in vitro de remplacement sont largement utilisés (modèles in silico, cultures cellulaires 2D, cultures de neurosphères, d’organoides), seuls les modèles animaux (la souris dans notre cas) permettent des études intégrées, reflétant la complexité d’un organisme entier. Les possibilités de remplacement seront aussi évaluées en amont par chaque responsable de projet accepté par la plateforme.

Réduction

La technique d’édition du génome CRISPR/Cas9 est très efficace. Grâce aux performants outils de bio-informatique disponible, il est possible d’optimiser les résultats, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour générer les souris fondatrices modifiées génétiquement. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires, nous avons mis en place une expérience test in vitro pour vérifier/comparer les stratégies d’édition et ainsi choisir les outils les plus performants. Pour cette expérience, nous utilisons des femelles donneuses d’embryons issus de notre animalerie et qui sont réformées (et donc normalement destinées à la mise à mort). En sélectionnant la meilleure stratégie d’édition, nous pouvons limiter le nombre de femelles à réimplanter.

Raffinement

Pour la réimplantation, les souris porteuses reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié. En fin de chirurgie, les souris reçoivent une injection d’analgésique. Après la chirurgie, la surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d’expérimentation et la détection de l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Les femelles donneuses seront utilisées entre 4 et 7 semaines car c’est à cet âge qu’on obtient le plus grand nombre d'embryons au stade 1 cellule. Les femelles porteuses réimplantées seront mises à mort après le sevrage de leurs petits (on ne peut pas réutiliser un animal ayant déjà subi une chirurgie).

Irradiées sous anesthésie pendant trente minutes puis greffées avec des cellules de moelle osseuse et des cellules tumorales, 200 souris receveuses subissent ensuite trois prélèvements sanguins à une semaine d'intervalle. Avec les 40 donneuses de moelle, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 40 d'entre elles et modéré pour les 200 autres, toutes tuées pour le prélèvement de la rate, du foie et de la moelle. L'objet est de tester le rôle de gènes exprimés par les cellules Natural Killer, repérés lors d'un criblage in vitro que le porteur juge trop éloigné des conditions réelles. Il écrit que les prises de sang sont douloureuses, tout en concluant qu'il n'attend le développement d'aucun phénotype susceptible d'induire une souffrance.

Objectifs

Les cellules Natural Killer (NK) ont des propriétés anti-tumorales. Lors d'un cancer, la persistance de la tumeur tue les cellules NK, ce qui conduit à une perte du contrôle de la tumeur par ces cellules. L'objectif de ce projet est de tester le rôle (positive ou négatif) dans ce processus de certains gènes exprimés par les cellules NK et identifiés comme potentiellement impliqués lors d'expériences préliminaires in vitro. Nous modifierons in vitro des cellules NK que nous réintroduirons dans des souris receveuses afin de remplacer leur population de cellules NK. L'impact de ces gènes sur la survie de cellules NK sera ensuite mesuré dans ces souris après transfert de cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir l'impact de la pousse tumorale sur la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules NK. Etant donné le rôle des cellules NK dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.

Procédures

Les souris donneuses de moelle subiront une injection après anesthésie gazeuse (40 souris, 1 injection par souris, 2 minutes). Les souris receveuses seront anesthésiées (200 souris, 1 injection par souris, 1 minute) puis irradiées (200 souris, 30 minutes, transport compris). Elles seront ensuite transférées sous anesthésie gazeuse (200 souris, 1 injection par souris, 2 minutes). Les animaux receveurs seront greffés avec les cellules tumorales (200 souris, 1 injection par souris, 2 minutes). Après anesthésie gazeuse, 3 prélèvements de sang seront ensuite effectués à une semaine d'intervalle (200 souris, 3 prélèvements par souris, 3 minutes).

Impact sur les animaux

L'injection d'une molécule permettant de conditionner les cellules hématopoiétiques est en elle-même peu douloureuse. Nous n’attendons pas le développement de phénotype dommageable, les animaux étant mis à mort rapidement après le traitement. L'opération d'irradiation aux rayons X provoque peu de stress ou de douleur à l'animal, anesthésié durant l'irradiation. L'anesthésie peut provoquer un déssèchement des yeux qui sera prévenu par application d'un produit protecteur. L'injection des cellules de la moelle osseuse et les prélèvements sanguins ne provoquent initialement pas de douleur ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Nous n’attendons pas le développement de phénotype pouvant induire une souffrance suite à la greffe. En effet, la prise de greffe se déroule bien dans >90% des cas, d'autre part, les cellules NK modifiés au cours de ce protocole sont redondantes d'autres types cellulaires et ne sont pas connues pour induire de phénotype préjudiciable. Le risque est de voir se développer une infection opportuniste avant que le système immunitaire ne se reconstitue. Les prises de sang (avant et après transfert des cellules tumorales) sont douloureuses. L'injection des cellules tumorales est faiblement douloureuse, mais ces cellules forment des métastases disséminées, les animaux seront mis à mort avant que ces métastases ne soient source de souffrance pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des prélèvements d'organe post-mortem (rate, foie, moelle) afin d'effectuer des analyses phénotypiques et fonctionnelles des cellules Natural Killer.

Remplacement

Les gènes dont l'importance sera testée au cours de cette procédure ont été sélectionnés lors d'un screen in vitro. Ce screen a mis en évidence leur implication dans la régulation de la survie des cellules NK mises face à des tumeurs in vitro. Ce modèle expérimental est cependant limité, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées in vivo. Il nous est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.

Réduction

L'âge des souris donneuses produites par notre établissement utilisateurs et utilisées dans ce protocole étant assez étendu et leur sexe indifférent, tous les animaux produits dans notre établissement seront utilisés, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles. Nous utiliserons des méthodes d'analyses de pointe permettant de réaliser de multiples analyses et cela sur les cellules d’un même animal. D'autre part, nous pouvons comparer dans une même expérience jusqu'à 5 gènes d'intérêt et, au sein d'un même animal receveur, des cellules NK exprimant ou non notre gène d'intérêt. Cette capacité permet de réduire la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes. Tout cela nous permettra ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

L'irradiation des animaux ainsi que les injections intraveineuses se feront sous anesthésie gazeuse, la douleur liée aux injections ou prélèvements sera combattue à l'aide d'un anesthésique local. La mesure d'un marqueur circulant permet de mesurer précisément la pousse tumorale. Cette connaissance nous permet de prédire le moment auquel les cellules tumorales auront affecté les cellules NK et ainsi de mettre à mort les animaux avant l'apparition de signes cliniques liés à la pousse tumorale, ce qui limite la souffrance des animaux. Cependant, afin de parer à toute éventualité, les expérimentateurs se tiendront prêts à réaliser l'expérience les jours précédant la date prédite en cas de dégradation inattendue de l'état des animaux. Les animaux seront suivis tous les jours pendant les trois jours qui suivront l'irradiation et la reconstitution puis une fois par semaine jusqu'à la mise à mort. En ce qui concerne les analyses que nous ferons, nous utiliserons des méthodes permettant de recueillir un maximum d'informations tout en minimisant le nombre de cellules (et donc d'animaux) nécessaires.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permettent une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous utiliserons de cette façon tous les animaux produits, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.

Provoquer une encéphalopathie hépatique en quatre à sept jours par intoxication au thioacétamide, puis y tester des composés quelle que soit la voie d'administration, per os, intraveineuse, intrapéritonéale ou par dialyse péritonéale. 1 760 rats vont être utilisés, 1 360 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'évaluation histologique du foie, des reins et du cerveau. Ils subissent jusqu'à sept administrations intrapéritonéales pendant l'induction, jusqu'à vingt administrations de traitement, quatre drainages de dialysat de quinze minutes sous anesthésie générale et jusqu'à six prélèvements sanguins. Le porteur qualifie ses modèles de "modérés" tout en énumérant les signes attendus, vocalises spontanées, dyspnée, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement et œdème cérébral.

Objectifs

L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. Bien que l’encéphalopathie hépatique ne soit pas entièrement comprise, il est admis qu’elle est liée à la présence de médiateurs inflammatoires et de neurotoxines circulantes, notamment l’ammoniaque. L’une des principales sources d’ammoniaque est par le métabolisme des acides aminées issus de l’alimentation par les bactéries du microbiote. Chez un patient sain, le foie le métabolise en urée, qui est ensuite éliminée dans les urines. Lors d’une défaillance hépatique qu’elle soit fulgurante, chronique ou associée à une cholestase (diminution ou un arrêt de l'écoulement de la bile produite par le foie), la transformation de l’ammoniaque par le foie en urée pour être éliminée dans les urines est profondément altérée. Outre la transplantation hépatique, il existe certains traitements tels la lactulose ou la rifaximine, avec certains effets secondaires et des pathologies réfractaires au traitement. Le but de ce projet est de non seulement reproduire la pathologie humaine dans différents modèles expérimentaux d’atteintes hépatiques et de démontrer l’activité de nos composés et ce quelle que soit la voie d’administration : Per os, intraveineuse, intrapéritonéale ou par voie de dialyse péritonéale.

Bénéfices attendus

L'encéphalopathie hépatique fulgurante (EHF) est observée dans environ 50 à 70 % des cas d'insuffisance hépatique aiguë (IHA), surtout en présence de certaines étiologies comme l'hépatite virale aiguë, la toxicité médicamenteuse ou l'intoxication alcoolique. Le pronostic de l'EHF est souvent très grave, et le risque de mortalité est élevé, particulièrement si la prise en charge est tardive. Le taux de mortalité associé à l'encéphalopathie hépatique fulgurante peut atteindre 50 % ou plus dans les cas graves, surtout si une transplantation hépatique n'est pas disponible ou si elle est retardée. Le degré de gravité de l’EH (score de West Haven) reste un facteur de pronostic important. Les deux modèles proposés sont de type aiguë, l’un par intoxication par un produit nocif pour le foie (Thioacétamide) et l’autre par saturation de l’organisme et déséquilibre du système enzymatique à l’origine de l’élimination de l’ammoniaque. Ce projet vise par un traitement à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et dans le cas d’une atteinte cirrhotique de pouvoir avoir accès à une transplantation hépatique.

Procédures

Les animaux subiront 7 administrations intrapéritonéales pour les procédures 1 à 3, 4 administrations intrapéritonéales pour les procédures 4 à 6 d’une durée d’une minute pendant la phase d’induction de la pathologie. Un prélèvement de sang (durée 1 minute) avant début des traitements sous anesthésie à l'isoflurane (durée 3 minutes). Cas de la dialyse : 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes) et 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. Autres types de traitement : au maximum 20 administrations par gavage, en sous-cutanée, en intraveineuse, en intranasale (durée une minute) ou en administration intraveineuse lente (durée 30 minutes). 4 prélèvements de sang intermédiaires (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes) . Un prélèvement de sang final (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation « spontanée » peut inéluctablement conduire à la mort. Les modèles étudiés s’apparentent davantage à des modèles d’hyperammoniémie soi de type ALF (atteinte hépatique aigue) soi par perturbation métabolique. La forme la plus grave de la pathologie humaine est le coma et les parties développement de modèle nous permettront un ajustement de façon à ne pas l’atteindre dans le cadre d’étude de produits. Sur les deux procédures de développement de modèle, des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés. Des effets indésirables spécifiques aux administrations massives répétées de thioacétamide sont décrits dans la littérature comme l’hypoglycémie, l’hypotension, la chute des globules rouges et les troubles de la coagulation. Une observation plus approfondie de la couleur de la peau des animaux (pâleur) sera à effectuer le lendemain.

Devenir

L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux

Remplacement

Les modèles développés et décrits dans ce projet reproduisent un déséquilibre de l’ammoniémie avec atteinte cérébrale. Il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro permettant de reproduire cette pathologie qui se base entre autres sur des anomalies comportementales. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatique et métabolique. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. Les administrations de produits toxiques pour le foie sont décrites dans la littérature afin d’induire une encéphalopathie en très peu de temps (4 jours ou 7 jours) . Nous nous baserons sur ces données scientifiques afin de définir le nombre d’animaux nécessaire à la caractérisation de ce modèle.

Raffinement

L’encéphalopathie hépatique à son stade terminale est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Nos modèles expérimentaux sont des modèles d’encéphalopathie fulgurante qui ne devrait pas atteindre les stades les plus tardifs de la pathologie humaine, ils visent à induire en quatre ou sept jours à amener un taux d’ammoniaque suffisamment élevé pour causer des séquelles cérébrales. Nos modèles, tels que décrits dans la littérature, restent néanmoins modérés et ne devrait causer que d’un point de vue comportementale des troubles de la mémoire et de la confusion et d’un point de vue physiologique un œdème cérébrale et une hyperammoniémie. Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. Ceux-ci sont spécifiques des séquelles neurologiques et nous serviront le cas échéant à réajuster notre modèle. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent non seulement les administrations de thioacétamide (hypoglycémie possible) mais également les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux. Une partie des observations étant de nature comportementale, les études requiert l’utilisation d’animaux et ne peuvent être remplacées par des expérience in vitro.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de développer une encéphalopathie associée à une atteinte hépatique et donc de valider l’efficacité d’un traitement dans cette pathologie. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Pour se faire, nous utiliserons des animaux de 6 semaines (250-275 gr) à l'arrivage.

Des souris de réforme servent à l'apprentissage du gavage. Au total 892 souris vont être utilisées, 872 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Les souris de l'étude développent une inflammation intestinale proche de la maladie de Crohn après neuf jours d'anti-inflammatoires, puis reçoivent six gavages d'un nanosystème à ARN et un prélèvement sanguin sous anesthésie. Le porteur reconnaît que des modèles in vitro d'inflammation intestinale ont été développés et optimisés ces dernières années, mais affirme qu'aucun ne reproduit la complexité de la maladie humaine.

Objectifs

Dans ce projet, nous voulons tester un nouveau traitement utilisant des nanoparticules avec du matériel génétique pour soigner les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Les MICI, comme la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, sont des maladies auto-immunes où le système immunitaire attaque par erreur certaines parties du système digestif. La maladie de Crohn peut toucher tout le système digestif, alors que la colite ulcéreuse se limite au côlon et au rectum. Actuellement, environ 300 000 personnes en France sont atteintes de MICI, dont une majorité de femmes. Les traitements existants ne fonctionnent pas bien à long terme et causent souvent des effets secondaires importants. C’est pourquoi nous cherchons une approche nouvelle avec des nanoparticules d’ARN, encapsulées dans un gel spécial qui facilite leur transport et permet une libération prolongée. Notre système de nanoparticules est conçu pour moduler la réponse inflammatoire altérée lors de cette pathologie. Pour confirmer leur efficacité thérapeutique, nous allons utiliser des souris capables de développer spontanément une inflammation intestinale semblable aux MICI humaines. Ce modèle nous permettra de vérifier si notre traitement par nanoparticules peut efficacement réduire cette inflammation et apporter une solution durable contre les MICI.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier la biodistribution et l'efficacité thérapeutique de nanoparticules chargées en ARNs dans un modèle de souris pathologique. Les MICI se caractérisent par une réponse inflammatoire exacerbée. L'administration de nanoparticules de ce type de nanoparticules pourrait offrir un moyen ciblé et modulé de restaurer l'équilibre immunitaire, en réduisant l'inflammation excessive tout en favorisant une réponse immunitaire régulée. Les bénéfices attendus incluent une meilleure biodistribution de l’agent thérapeutique, une réduction des effets secondaires, et l'amélioration des symptômes pathologiques, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques

Procédures

Le sang sera prélevé sous anesthésie une fois par animal pour le modèle MICI. La durée du prélèvement est estimée à moins d’une minute. Notre nanosystème sera administré six fois par souris par gavage. On estime que la procédure de gavage sera environ de 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Ce type de souris développent des MICI semblables à la pathologie humaine. En conséquence, elles peuvent développer des douleurs abdominales. Le traitement des souris par gavage (introduction d’un tube dans la gorge) peut aussi causer du stress, des douleurs au niveau de l’œsophage. Enfin, le suivi du poids des souris tout au long de l’étude, bien qu’important, est une autre source potentielle de stress pour elles.

Devenir

Après chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse de l’induction de la pathologie mais aussi pour évaluer l’efficacité thérapeutique de notre nanosystème.

Remplacement

Ces dernières années, différents modèles in vitro ont été développés et optimisés afin de mimer au mieux l’environnement intestinal en condition d’inflammation pour tester l’efficacité thérapeutique de futurs traitements potentiels. En revanche, aucun de ces modèles ne représentent complètement la complexité de la physiopathologie des MICI humaines. Ainsi, il n’existe pas d’alternative non animale pour mimer l’environnement cellulaire complexe et l’état d’inflammation intestinale présente dans la pathologie MICI.

Réduction

Les effectifs d'animaux ont été calculés à partir d'outil statistiques. De plus, si nous n’observons pas d’induction de la pathologie chez les souris, les procédures définies dans la demande de projet ne seront pas effectuées.

Raffinement

Afin d’augmenter la tolérance à l’administration orale par gavage pour la souris, nous utiliserons une canule trempée dans une solution appétissante pour la souris, par exemple une eau sucrée. Des visites journalières des souris seront effectuées pour détecter la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Les souris seront observées quotidiennement pendant chaque pesée afin de détecter l’éventuelle apparition de signes de souffrance (points limites). Un traitement anti-douleur sera administrée par voie sous-cutanée dès lors un signe de souffrance détecté.

Choix des espèces

Les souris utilisées pour l’étude est privilégiée pour mimer les maladies inflammatoires intestinales humaines. Ce modèle présente un phénotype inflammatoire spontané par la prise d’anti inflammatoire non stéroïdien pendant neuf jours. Les souris femelles et mâles seront utilisées pour l’ensemble de cette étude. Les souris seront âgées de 9 semaines, car ce sont les souris âgées de moins de 3 mois qui sont le plus susceptibles de développer une inflammation intestinale. Pour la procédure « apprentissage gavage » des souris de réformes seront utilisées.  

Toutes tuées pour la collecte de leurs organes, 412 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 112 d'entre elles et modéré pour les 300 autres. Elles reçoivent une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie, certaines une seconde dix semaines plus tard, et une partie subit une irradiation totale du corps suivie d'une greffe de moelle osseuse. D'autres ingèrent pendant sept jours une molécule qui déclenche une inflammation intestinale, avec diarrhées et perte de poids, puis reçoivent des bactéries. Le porteur reconnaît que des données humaines et des expériences in vitro existent déjà, mais conclut que le modèle animal reste "nécessaire" à ce stade pour établir le rôle des lymphocytes T du foie.

Objectifs

Les lymphocytes T sont des cellules immunitaires qui jouent des rôles centraux dans les défenses contre les agents pathogènes, mais aussi dans les interactions symbiotiques avec les bactéries commensales colonisant les muqueuses et la surface du corps. Dans ce projet de recherche fondamentale, nous nous intéressons à une population de lymphocytes T reconnaissant des composés (aussi appelés antigènes) bactériens fabriqués par de nombreuses bactéries intestinales. Ces lymphocytes présentent un fort interet car ils sont très abondants chez l'humain et sont impliqués dans de nombreuses maladies telles que les infections, l’obésité, la sclérose en plaque, le diabète, les maladies inflammatoires de l’intestin et le syndrome métabolique. Leur rôle dans le foie, où ils représentent jusqu'à 40% des lymphocytes T, reste inconnu à ce jour. Le foie a notamment comme fonction d'éliminer les bactéries commensales qui ont atteint le système sanguin, en particulier lors d'une rupture de la barrière intestinale. Ce projet vise à tester l'hypothèse que les lymphocytes T du foie contribuent à cette fonction pare-feu en éliminant les bactéries commensales présentes dans la circulation sanguine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le role dans le foie de lymphocytes T très abondants chez l'humain et impliqués dans de nombreuses pathologies. Le projet peut donc conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques pour améliorer le traitement de pathologies telles que le diabete, l'inflammation intestinale chronique ou encore l'obésité.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-veineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute, 1 fois au cours de l'expérience). Certains animaux recevront une irradiation totale suivie d'une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute). Certaines souris recevront une deuxième injection rétro-orbitaire après anesthésie par inhalation (1 minute environ) 10 semaines après la première injection. Certains animaux recevront une molécule dans l’eau de boisson pendant 7 jours, suivi d'une administration orale sur animaux vigiles (geste d'environ 10 secondes réalisé une fois au cours de l'expérience).

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Le développement d'une immunodépression induite par l'irradiation peut engendrer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 1 semaine après administration de moelle osseuse. L'administration de E. coli non-pathogène peut entrainer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 4 jours plus tard. Le développement de suppurations des yeux peut apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. En cas d'apparition, un gel anti-septique sera immédiatement appliqué.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses.

Remplacement

Les données obtenues chez l'humain montrent une fréquence élevée de lymphocytes T dans le foie. In vitro, les lymphocytes T sont activés par différentes lignées de cellules du foie en présence d'E. coli. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant à la réponse des lymphocytes T et quant à l'identité des cellules qui les activent in vivo en présence de E. coli. Le rôle des lymphocytes T dans la clairance de bactéries commensales ne peut pas non plus être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal reste donc nécessaire à ce stade.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique (t-test de student). Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases: certaines procédures ne seront réalisées qu'en fonction des résultats obtenus, de façon à réduire le nombre d'animaux au minimum. Enfin, une étude pilote est prévue pour s'assurer de la bonne re-constitution du compartiment hématopoeitique (et notamment des lymphocytes T dans les tissus) après greffe de moelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et non isolés. Ils bénéficieront de matériel d’enrichissement (igloos, tunnels). L’inflammation intestinale est induite par administration de produits chimiques et peut causer des diarrhées. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes MAIT ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale et des réponses immunes associées, du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. -Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 14 semaines). -Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.