Procédures légères
Développement Normal et Pathologique des Mélanocytes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour produire de nouveaux mélanomes chez la souris et y tester des molécules candidates, 4 833 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Des nouveau-nés reçoivent trois jours de suite une injection intra-gastrique d'un agent chimique déclenchant des mutations, d'autres souris reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou intraveineuse, d'autres encore se font implanter un fragment de tumeur sous la peau entre les omoplates, la plaie étant refermée par sutures ou agrafes. Le porteur décrit les tumeurs cutanées primaires comme n'engendrant "aucune douleur estimable" sauf ulcération, et réserve la douleur aux mélanomes métastatiques. Les expérimentations s'arrêtent à l'atteinte d'un point limite évalué par grille de score, la croissance tumorale étant suivie au pied à coulisse, par photographie ou par imagerie.
Objectifs
Les mélanocytes, cellules pigmentées de l’épiderme, synthétisent de la mélanine afin de protéger notre organisme des rayonnements ultra-violet (UV) du soleil. Mais quand ces mélanocytes sont endommagés, ils peuvent se transformer en mélanome. Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare mais aussi le plus grave car plus susceptible d'envahir les tissus voisins et de se propager à d'autres parties du corps. La plupart des décès dus au cancer de la peau sont causés par le mélanome. Il existe actuellement deux types de thérapies principales (thérapie ciblée et immunothérapie) dans le traitement contre le mélanome, malheureusement les patients rechutent dans 30-50% des cas en raison du développement de résistance à leur traitement. Des connaissances générées à partir de biopsies de mélanomes humains, de lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de réaliser des tests in silico, in vitro et in cellulo. Notre équipe a identifié des mécanismes qui seraient impliqués dans l’initiation et la progression des mélanomes, ainsi que des molécules ciblant ces mécanismes Néanmoins, malgré des résultats intéressants, il est possible que les modèles cellulaires, même très sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les évènements qui se produisent lors de la transformation des mélanocytes en mélanome ainsi que lors du processus de résistance aux traitements. L'expérimentation dans des modèles de cancer chez la souris est maintenant nécessire pour tester le potentiel thérapeutique de ces molécules. L’objectif général de ce projet est de produire de nouveaux mélanomes murins afin de mieux comprendre ces mécanismes dans l’initiation et la progression tumorale et de tester ces molécules nouvellement identfiiées à potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Il y a encore 20 ans, les patients atteints de mélanome cutanés métastatiques mouraient rapidement après le diagnostic. Grâce à des approches combinées impliquant notamment la génétique, la signalisation cellulaire, ainsi que l’utilisation de modèles murins et de lignées de cellules de mélanomes, il est aujourd’hui possible de traiter un grand nombre de patients atteints de ce cancer. Bien que des progrès considérables aient été réalisés, notamment avec des traitements augmentant la survie à 5 ans, seule une faible proportion des patients bénéficie d’une guérison définitive. Ce succès limité s’explique par l’apparition des résistances d’origine génétique, épigénétique (processus modulant l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN) et cellulaire. Il est donc indispensable de poursuivre ces recherches pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, identifier de nouvelles cibles thérapeutique et développer des approches innovantes permettant d’améliorer durablement le pronostic des patients. La première partie de cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de certaines gènes/protéines dans l’initiation des mélanomes à partir de mélanocytes, mais aussi leur rôle potentiel dans la progression des mélanomes et l’apparition de métastases. La seconde partie de l’étude se concentrera sur l’émergence de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les protéines étudiées dans la première partie de l’étude lors des différents processus, de l’initiation à la progression des mélanomes.
Procédures
Un lot d’animaux sera traité à la naissance par injection intra-gastrique 3 jours consécutifs (J1-J2-J3) par un agent chimique permettant l’expression de mutations spécifiques. Un autre lot d’animaux sera injecté avec de nouvelles molécules (la voie et la fréquence d’injection seront déterminées en fonction de la molécule) afin de déterminer la dose à utiliser en traitement Dans un autre lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutanées ou en intra-veineuse aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente). Pour certains de ces animaux, un suivi par imagerie sera réalisé afin de suivre la croissance tumorale interne. Pour cela, un marqueur sera injecté aux souris puis elles seront endormies par anesthésie gazeuse et placé dans l’imageur. Cela est réalisé une à deux fois par semaine. Dans un autre lot d’animaux, des fragments de tumeurs seront implantés aux souris. Le plan cutané des animaux sera ouvert sous anesthésie gazeuse et analgésie, puis le fragment sera positionné entre les omoplates et le plan cutané sera refermé soit par sutures soit à l’aide d’agrafes. Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente).
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiés développeront des mélanomes cutanés pouvant provoquer des irritations. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (douleur légère de courte durée). Suite à l’injection du de traitement, un retard de croissance peut être observé le premier mois de vie qui est compensé très rapidement sans séquelle. Les animaux greffés avec des cellules tumorales/ou des fragments de tumeurs par chirurgie développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de la chirurgie sont celles liées à l’ouverture du plan cutané (douleur de faible intensité). Aucune douleur de l’animal n’est observée lorsque le renouvellement des mélanocytes n’a pas lieu ; les souris deviennent blanches et ne subissent aucun ostracisme de la part de leurs congènères. Les seules douleurs qui sont possibles peuvent avoir lieu lorsque les souris développent des mélanomes métastatiques. Les tumeurs cutanées primaires n’engendrent pas de douleur estimable sauf éventuellement en cas d’ulcérations.
Devenir
A la fin de chaque expérience, les souris sont mises à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les connaissances générées à partir des biopsies de mélanomes humains, à partir des lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de tester in silico (modèles informatiques), in vitro et in cellulo (modèles cellulaires) les modifications au niveau des protéines et du fonctionnement des cellules ainsi que le métabolisme de ces cellules. L’utilisation de systèmes plus complexes mimant des stuctures en 3D constituées de cellules (systèmes 3D, sphéroïdes (cellules cultivées en suspension sous forme de sphère) ou peaux reconstituées) nous permet de mieux appréhender l’importance de certaines protéines ou de certaines mutations dans les processus sus-cités. Bien que les modèles cellulaires soient utilisés majoritairement comme paradigme pour étudier ces processus, il est possible que les modèles cellulaires, même sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les événements qui se produisent lors du développement embryonnaire, lors du renouvellement des mélanocytes, lors de la transformation des mélanocytes en mélanome. De plus, la recherche systématique de traitement contre le mélanome a révélé que l’hétérogénéité cellulaire au sein d’un mélanome engendre des résistances génétiques et épigénétiques qui ne sont pas reproductibles in vitro. En conséquence, l’utilisation de modèle physiologique sophistiqué proposé uniquement aujourd’hui le modèle mammifère est obligatoire dans un but cognitif et thérapeutique.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des souris qui présentent un bagage génétique identique et l’ensemble de nos souris mutés le sont pour un gène donné sur un fonds génétique connu. La conséquence est que la variabilité d’individu est réduite, et en conséquence nous avons besoin de moins d’animaux. Nous optimiserons les accouplements en utilisant dès que cela est possible des croisements avec des souris présentant des mutations à l’état homozygote afin de réduire le nombre de souris produites. L’étude ne se fera qu’avec des molécules qui auront été validées in vitro avant tout test sur animaux. Nous utiliserons un suivi d’imagerie longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
En cas de retard de croissance pour les nouveaux-nés génétiquement modifiés, injectés avec des traitements, nous introduirons dans la cage des aliments gélifiés et hyper calorique afin d’augmenter les apports caloriques pour ces petits. Nous raffinerons les mutations en ciblant uniquement les cellules d’intérêt sans affecter les autres cellules de l’organisme. Les souris sont suivies régulièrement afin d’assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point-limite(mise en place d’une grille de score) Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec utilisation d’analgésiques. Nous ajouterons dans la cage post-chirurgie des aliments gélifiés et de petites croquettes dans le fond de la cage afin que la souris n’ait pas à se redresser pour se nourrir et s’hydrater. Les animaux seront suivis trois fois par semaine à quotidiennement. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas d’atteinte d’un point-limite. Nous suivrons le devenir de la tumeur primaire ou des métastases en utilisant régulièrement (en fonction) un pied à coulisse, un appareil photo ou l'imagerie.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris car il s’agit de l’espèce de choix pour les expériences menées en cancérogénèse et de recherche en thérapeutique du cancer. De plus, la souris est un modèle reconnu pour étudier la robe chez les mammifères. Ce modèle animal nous permet (i) de générer des mutations spécifiques, conditionnelles ou non, dans le lignage mélanocytaire, (ii) de contrôler au mieux le la présence de mutation génétique ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car la variablité entre individus est plus faible. Nouveau-né et adulte, développement de tumeurs chez l’animal adulte @ Nous prendrons des nouveaux-nés lorsque nous les induirons à l’aide d’un agent chimique. L’induction est réalisée à la naissance avant la formation des poils, et les mélanocytes sont sensibles à cet agent chimique. @ Nous suivrons l’apparition des tumeurs au cours du temps chez l’adulte.
Propagation de l’information sonore le long des voies auditives chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Gerbilles de Mongolie : 630
Opérés de l'oreille ou du cerveau pendant une à quatre heures, maintenus la tête fixée deux à quatre heures pour enregistrer leur activité cérébrale, ou exposés une fois à 100 décibels pendant deux heures, 1 710 souris et 630 gerbilles de Mongolie vont être utilisés dans des procédures allant de la chirurgie sans réveil aux atteintes modérées. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'un animal transgénique, injecté d'un vecteur viral ou porteur d'un implant ne peut être ni réutilisé ni placé. L'objectif déclaré est de décrire la transformation des vibrations sonores en activité du nerf auditif et de tester un implant cochléaire à stimulation optique. La perte auditive provoquée par l'exposition sonore est présentée comme légère et réversible en une semaine, "ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans".
Objectifs
Répondre à certaines interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore le long des voies auditives. : a)Au niveau périphérique, la cochlée traite les informations sonores avant même que le cerveau n’entre en action. Le premier objectif est d'obtenir une description précise de la transformation des vibrations sonores en activité électrique du nerf auditif. Au-delà de son intérêt pour la recherche fondamentale, cette approche sera importante pour améliorer les aides auditives et les implants cochléaires actuels et développer de nouvelles stratégies de stimulation. b)Un son peut être entièrement caractérisé par sa fréquence et son intensité. Cependant, au niveau perceptif ces 2 dimensions interagissent (un son fort parait plus aigu par exemple). Cette interaction apparait dès la cochlée, c’est-à-dire au niveau le plus précoce du traitement de l’information sonore. Afin de pouvoir contrôler précisément l’information envoyée par la cochlée au cerveau, nous allons développer une méthode de stimulation optique du système auditif périphérique. Ceci nous permettra de déterminer qu’elle est l’information nécessaire et suffisante pour identifier les sons. c)Au niveau du circuit auditif, l’information auditive est relayée à différents noyaux avant d’atteindre le centre auditif. De façon remarquable, certaines informations comme l’information fréquentielle est propagée le long des voies auditives grâce au contrôle précis de la connectivité entre les différents noyaux. Ici, nous utiliserons des approches de marquage de certains types cellulaires afin de caractériser finement les connexions neuronales le long réseau auditif. d)Au niveau central, les 2 hémisphères du cerveau traitent les informations fréquentielles et temporelles différemment. Chez l’humain, la latéralisation du traitement du langage en constitue un exemple qui a été amplement décrit. Notre objectif est ici de tester l’hypothèse que le centre auditif gauche répond de manière sélective aux attributs temporels de vocalisations conspécifiques, alors que le centre auditif droit répond préférentiellement aux attributs de fréquence. 2)Proposer un nouveau type de traitement de surdités profondes en déterminant les avantages et les inconvénients d’un nouveau type d’implant basé sur la stimulation optique de la cochlée. Nous réaliserons dans ce projet nos expériences sur le rongeur mais transféré à l’humain.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de répondre à des interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore à la fois au niveau périphérie (oreille interne) et au niveau central (voies auditives). Il permettra de caractériser finement comment les sons complexes sont analysé par le système auditif et quel est le réseau neuronal qui permet à l’information sonore de se propager efficacement le long des voies auditives. A la fin du projet, nous aurons une meilleure compréhension de ces phénomènes fondamentaux de codage de l’information sensorielle et du circuit neuronal permettant de véhiculer efficacement l’information auditive.
Procédures
Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 des interventions chirurgicales de l’oreille ou du cerveau, sous anesthésie générale et durant de 1 à 4 heures. Les animaux transgéniques seront génotypés afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, un prélèvement à l’oreille sera fait au moment du sevrage. L’intervention est brève (1 minute par animal) et ponctuelle (le prélèvement ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la durée de vie de l’animal). Certains animaux seront maintenus en contention pendant 2-4 heures pour mesurer leur activité cérébrale sur animal éveillé en réponse à des stimuli auditifs. Chaque animal effectuera 5-8 séances d’habituation qui seront suivies par au maximum 5 séances d’expérimentation. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures.
Impact sur les animaux
L’injection de vecteurs viraux (chez le nouveau-né ou chez l’animal adulte) nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 30 minutes chez le nouveau-né et jusqu’à 2 heures chez l’adulte. Cela peut donner lieu à des douleurs contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire de courte durée. L’implantation chirurgicale d’implant cochléaire ou de fenêtre crânienne chez l’animal adulte nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 3 heures. Cela peut donner lieu à des douleurs modérées contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire pendant une semaine. Les séances d’enregistrements de l’activité cérébrale sur animal éveillé nécessitent une contention par fixation de tête. Ceci est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin que l’animal se familiarise avec l’expérimentateur et l’environnement et pour pouvoir réaliser des séances d’enregistrement d’une durée de 3 heures, une période d’habituation progressive sera mise en place. A la fin de cette période, un maximum de 5 séances en contention avec un minimum de deux jours de repos entre séances consécutives seront réalisées. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures. Ceci génèrera une perte auditive légère (environ 30 décibels, ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans) qui sera réversible et durera environ 1 semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés pour au moins l’une des raisons suivantes : - Nous utiliserons certains animaux pour le prélèvement d’organes. - Certaines chirurgies seront sans réveil. - Nous utiliserons des animaux transgéniques ou subissant une injection de vecteur viral ou étant appareil avec un implant, lesquels ne peuvent pas être réutilisés ou placé.
Remplacement
L’organe auditif est le fruit de millions d’années d’évolution et il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux qui permettraient de reproduire le circuit auditif. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement naturel du système. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative pour remplacer l’expérimentation animale par des expériences purement in vitro ou in silico car nous avons besoin d’étudier le système auditif périphérique dans son ensemble. Afin de comprendre le fonctionnement cochléaire sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme la souris ou la gerbille chez qui l’architecture du système auditif périphérique (la cochlée) est similaire à celle de l’Homme. Notre stratégie expérimentale implique l’expression de protéines exogènes dans la cochlée ou le cerveau de la souris ou de la gerbille. Ceci est permis grâce aux outils génétiques dont nous disposons. La production de ces protéines nécessite un organisme vivant.
Réduction
Ce projet impliquera sur une durée de 5 ans un total de 1710 souris et de 630 gerbilles qui entreront dans des procédures sans réveil, légères ou modérées. Des méthodes d’analyse statistique ont été utilisées afin de déterminer la taille optimale des groupes expérimentaux pour répondre aux questions scientifiques posées. Ce chiffre a été estimé avec l’aide d’une équipe de biostatisticiens afin de calculer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les animaux transgéniques seront systématiquement génotypés pour garder uniquement les génotypes souhaitables. Des expériences pilotes sur un nombre réduit d’animaux seront réalisées afin d’éviter des pertes dues aux difficultés techniques. Toutes les procédures utiliseront mâles ou femelles confondus. Cependant, si un des sexes ne s’engage pas de la même façon dans les tests comportementaux, nous privilégierons le sexe le plus réceptif aux tâches comportementales. L’utilisation de nouvelles technologies d’enregistrement neuronal à haute densité permettant d’enregistrer en parallèle plusieurs dizaines de neurones à partir de différentes zones d’intérêt signifie que la quantité de données obtenue par séance d’enregistrement sera maximisée. Dans le cas d’enregistrements sur animal éveillé, la réutilisation de chaque animal pour plusieurs séances d’enregistrement augmentera encore davantage la taille de l’échantillon de neurones obtenues par animal et contribuera à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes.
Raffinement
Les animaux impliqués dans le projet seront suivis régulièrement et seront anesthésiés, lorsque c’est nécessaire, pour éviter toute forme de souffrance. Des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés à l’âge des animaux en préopératoire et postopératoire pour obtenir une analgésie idéale pour chaque procédure. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un chauffage de la cage et d’un gel hydrique spécialisé. La plaie sera examinée tous les jours pendant une semaine pour repérer des signes d’infection ou toute autre anomalie physique, comportementale ou développementale (chez le nouveau-né). Un traitement analgésique post-opératoire sera observé pour réduire ces effets indésirables à leur minimum. Une perte de poids dans les premiers jours suivant la chirurgie peut se manifester. La pesée régulière des animaux au cours de la première semaine post-opératoire permettra de surveiller que cette perte reste transitoire et ne dépasse pas les 15% du poids initial de l’animal. Dans de très rares cas, des infections au niveau de l’implant ou de la fenêtre crânienne peuvent survenir. Si l’infection persiste malgré un traitement antibiotique, l’animal sera mis à mort. La contention par fixation de tête est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin de réduire ce stress autant que possible, des séances de maniement permettront aux animaux de se familiariser avec l’expérimentateur. De plus, l’habituation à la fixation de tête se fera de façon progressive sur plusieurs séances, tout en prenant en compte la vitesse de progression de chaque animal individuellement. Les expériences comportementales auront lieu dans les cages d’hébergement et sans restriction hydrique. Comme les souris sont hébergées dans ce dispositif expérimental, elles ne seront pas effrayées par un nouvel environnement et pourront réaliser la tâche selon leur volonté. L’état général de santé des souris et des gerbilles sera caractérisé par un score d’état corporel qui prend en compte différent facteur (perte de poids, changement de posture, yeux plissés, manque de toilettage etc.) et qui nous permettra d’évaluer l’état de l’animal tout au long de la procédure et de déterminer des points limites spécifiques et précoces. En fin de procédure ou si nous observions un comportement anormal l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Afin de comprendre le fonctionnement périphérique et central du traitement de l’information sonore sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme les rongeurs chez qui l’architecture du système auditif est similaire à celle de l’Homme. En effet, la cochlée est seulement présente chez les mammifères. Au niveau cérébral, les différents centres neuronaux du traitement auditif sont largement conservés et chaque noyau possède son homologue chez l’espèce humaine. Il est également démontré que la souris et la gerbille possèdent un répertoire considérable de vocalisations qui peuvent servir de modèle au langage humain. La souris étant parmi les espèces le plus couramment utilisés en biologie, il existe de nombreux modèles de surdité génétique ayant un équivalent chez l’Homme. La gerbille présente l’avantage par rapport à la souris d’être sensible à une gamme de fréquences très proche de l’humain et représente donc une étape importante pour en vue d’applications translationnelles. Dans le cas d’injection virale pour exprimer les molécules d’intérêt dans les cellules de l’oreille interne, l’administration est plus efficace à un stade précoce du développement. Nous utiliserons des animaux juvéniles (de 1 à 3 jours) qui seront ensuite soit mis à mort pour en extraire les tissus soit soumis à l’expérimentation électrophysiologique ou comportementale à l’âge adulte. Ensuite, chaque procédure du projet impliquera des animaux à un stade de développement où le système auditif périphérique et central est totalement mature (>6 semaines). Cependant, les souris qui sont largement utilisées en laboratoire commencent à présenter des pertes auditives à partir de 15 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des souris plutôt jeunes (6 à 10 semaines) pour les expériences d’exploration de la fonction auditive. Les expériences comportementales durent plus longtemps et seront réalisées sur des souris entre 4 et 14 semaines. Les expériences sur les gerbilles seront réalisées à des âges identiques car les trajectoires de développement sont similaires.
Offre de prestation pour évaluer les candidats médicaments : étude de l’audition et de la réponse immunitaire sur des modèles pathologiques inflammatoires chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
L'évaluation de candidats médicaments pour des clients extérieurs est ici vendue comme une prestation. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte des tissus. Elles reçoivent des composés pro-inflammatoires, parfois directement dans l'oreille sous anesthésie, puis des candidats médicaments jusqu'à sept jours de suite, avec une mesure de l'audition sous anesthésie générale de deux heures chaque semaine. Le porteur attend des gonflements articulaires, des boiteries, une altération de l'état général à partir du troisième jour et une perte d'audition moyenne, et qualifie le recours aux animaux non-humains d'"indispensable" faute de méthode validée pour reproduire une inflammation systémique. La prestation est adossée à une thèse financée par un contrat industriel, qui doit aboutir à au moins une publication.
Objectifs
Les maladies auto-immunes touchent environ 4% de la population. Ces maladies se produisent lorsque le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres tissus sains. Parmi ces maladies, la polyarthrite rhumatoïde est particulièrement répandue. Elle provoque principalement une inflammation des articulations, mais peut aussi affecter d'autres parties du corps, y compris l'audition. Des études récentes ont montré que les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde ont un risque plus élevé de souffrir de perte auditive que la population générale. Cette perte d'audition peut toucher jusqu'à 40% des patients, ce qui en fait un problème de santé important mais souvent négligé. L'inflammation générale du corps causée par la polyarthrite rhumatoïde pourrait être responsable de ces problèmes auditifs. Elle pourrait affecter les vaisseaux sanguins et le fonctionnement de l'oreille interne. De plus, certains médicaments utilisés pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent avoir des effets négatifs sur l'audition. Pour mieux comprendre ce lien entre inflammation et perte auditive, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Ces modèles permettent d'étudier comment l'inflammation affecte l'oreille et l'audition. Ils montrent que l'inflammation peut endommager les cellules de l'oreille interne responsables de la perception des sons. Comprendre cette relation entre la polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive pourrait aider à améliorer la qualité de vie des patients. Cela pourrait conduire à de meilleurs traitements et à une prise en charge plus complète de la santé des personnes atteintes de maladies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant les maladies inflammatoires et la perte auditive. Ces connaissances pourraient guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter efficacement ces troubles, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les impacts sur le système de santé. Une thèse CIFRE vient de débuter afin de mettre au point les 2 premiers modèles décrits dans ce projet et pourra aboutir à au moins 1 publication dans un journal international.
Procédures
L'administration de composés à tester ou de produits de référence suivent les bonnes pratiques vétérinaires et sont des gestes nécessitant quelques dizaines de secondes à moins de 5 minutes. Les composés pro-inflammatoires seront administrés 1 à 3 fois dans l'étude, sur animal anesthésié lorsque l'administration est réalisée directement dans l'oreille (phase de 30 minutes maximum), et sur animal vigile lorsqu'il s'agit des autres voies d'administration. Les candidats médicaments seront administrés tous les jours, au maximum pendant 7 jours, directement dans l'oreille (animal anesthésié, au maximum 30 minutes) ou par voie orale (animal vigile) La mesure de l'audition sera réalisée sous anesthésie générale (2 h) 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables incluent des douleurs, des gonflements des articulations pouvant se traduire par des boiteries, des difficultés locomotrices et une altération de l’état général des animaux à partir du 3ème jour après l’injection et le temps de la durée de l’étude. Une perte d’audition moyenne est attendue.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des différents tissus pour analyse histologique requiert l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complémentaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux. Dans ce but, nous envisageons, en collaboration avec notre partenaire, le développement d’organoïdes lymphoïdes (des modèles in vitro de culture cellulaire complexes) pour approfondir l’étude des mécanismes immunitaires liés au processus d’induction d’auto-immunité. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement de maladies inflammatoires Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer l’inflammation systémique Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction d’une inflammation systémique et ces effets sur la perte auditive, afin de développer à terme, des nouvelles thérapies pour traiter ces pertes d’auditions. Ceci nécessite des modèles expérimentaux dotés d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour assurer que les résultats soient statistiquement significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En ce qui concerne les modèles de polyarthrite rhumatoïde, le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrite chez la souris et le degré de variabilité expérimentale liée à la magnitude de la réponse immunitaire. En ce qui concerne les autres modèles inflammatoires, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’études publiées dans la bibliographie et le degré de variabilité expérimentale liée à la réponse immunitaire.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique aux rongeurs mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment (gel Diet) sera mis sur le sol des cages après l’administration des composés si nécessaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15 minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet. Le choix de la souche est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer les modèles inflammatoires d’intérêt. Ces souches de souris sont aussi adaptées pour le suivi des mesures de leurs capacités auditives. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte.
Le rôle des macrophages dans les défenses immunitaires dirigées contre le cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, des injections intrapéritonéales et intraveineuses de traitements, puis deux mesures de tumeur par semaine au pied à coulisse. Le porteur annonce une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, l'objectif restant de comprendre comment un type de macrophage récemment décrit participe aux défenses contre le cancer du sein. Sur le remplacement, il affirme que la complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires rend l'expérimentation animale "indispensable", après des modélisations informatiques et des cultures cellulaires menées en amont.
Objectifs
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à se défendre. On en trouve en grande quantité dans les tumeurs. Notre équipe a découvert un nouveau type de macrophages dans les cancers du sein. Au début du cancer du sein, ces macrophages aident d'autres cellules de notre système de défense (les lymphocytes) à détruire les cellules cancéreuses. Mais si la tumeur continue de se développer, les macrophages peuvent arrêter de fonctionner correctement, ce qui rend nos défenses moins capable de combattre la tumeur. Nos buts sont : 1. Comprendre comment ces macrophages aident à combattre le cancer. 2. Étudier ce qui les empêche de bien fonctionner.
Bénéfices attendus
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à combattre le cancer. Les scientifiques les voient comme des cibles importantes pour les traitements contre le cancer. Notre projet vise à comprendre comment ces cellules aident à lutter contre le cancer pour trouver de meilleurs traitements.
Procédures
1- biopsie de la queue (5 secondes/souris). 2- Injection sous-cutanée de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (5 secondes/souris). 3- Injection intrapéritoneale de différents traitements (5 secondes/souris). 4- Injection intraveineuse de différents traitements (5 secondes/souris). 5- Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse 2 fois par semaines (20 secondes/souris)
Impact sur les animaux
- biopsie au niveau de la queue induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - injection intrapéritonéale de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Injection intraveineuse de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Anesthésie générale lors de la greffe de tumeur entraînerant un léger stress de courte durée. - Injection sous-cutanée de tumeurs entraînerant une douleur légère de courte durée. - La croissance des tumeurs entraînerant une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque expériences pour analyser les tissus cancéreux et pour analyser les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à l'issue de leur période reproductive.
Remplacement
La complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires ne peut être modélisée de manière complète in vitro, rendant l’expérimentation animale indispensable. Toutefois, des modélisations informatiques et des cultures cellulaires ont été réalisées en amont afin de limiter autant que possible l’usage d’animaux.
Réduction
Nous utilisons des tests statistiques adaptés pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour mener à bien ce projet tout en assurant des résultats interprétables. Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques sur chaque animal permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences.
Raffinement
Afin de minimiser l'impact des procédures sur le bien-être animal, nous anesthésions les souris dans tous les protocoles incluant des injections susceptibles de causer des douleurs. Nous réalisons une surveillance rapprochée des animaux et nous avons établis des points limites adaptés pour réduire leur souffrance. Des points limites intermédiaires sont aussi mis en place lorsque les animaux présentent des premiers signes de douleur ou de détresse: nous placerons si nécessaire de la nourriture gélifiée dans les cages. Enfin si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour la recherche en immunologie et en thérapeutique du cancer. Sa grande homologie avec l’humain permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes pour étudier un système immunitaire mature et une croissance tumorale adaptée.
Etude de l’origine des malformations cardiaques induites par la perte d’expression du gène Zic3 au cours du développement cardiaque précoce.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées pour le prélèvement de leurs organes, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les atteintes viennent de la lignée elle-même : presque tous les mâles reproducteurs présentent des déformations de la queue, environ 44 % une asymétrie des organes et environ 50 % des malformations cardiaques, que le porteur qualifie de sans impact sur leur physiologie et leur comportement. Aucun acte n'est pratiqué sur l'animal vivant, les embryons et les fœtus étant analysés à des stades successifs pour situer l'origine de ces malformations. Le porteur indique bâtir son projet autour de gastruloïdes cultivés in vitro, et conclut malgré tout que le recours au modèle vivant lui est "indispensable" pour caractériser les défauts anatomiques.
Objectifs
Les anomalies de notre gène d'intérêt sont associées à des anomalies du développement embryonnaire avec une asymétrie des organes. Les souris déficientes pour ce gène présentent des défauts similaires à ceux des patients et dans certains cas des défauts cardiaques particuliers. Le but du projet est de comprendre le role de ce gène au cours du développement cardiaque et particulièrement l’impact de sa perte dans l’apparition des défauts cardiaques. Le premier objectif est d’analyser l’anatomie cardiaque des embryons de souris déficientes dans ce gène afin de caractériser précisément le phénotype clinique. Le second objectif est d’identifier le stade et l’origine de ces malformations au cours du développement cardiaque précoce en analysant (moléculairement, cellulairement et anatomiquement) les embryons de façon temporelle en complément des études qui seront effectuées sur un modèle in vitro.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’améliorer nos connaissances sur l’origine physiopathologique des malformations cardiaques liées à la perte de fonction du gène afin de mieux appréhender l’importance de ce gène au cours du développement cardiaque, notamment lors du déploiement des différentes cellules progénitrices cardiaques. A plus long terme, les résultats issus du projet permettront d’améliorer nos connaisances, le diagnostique et la prise en charge des patients atteints de défauts cardiaques.
Procédures
Aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux en dehors de prélèvements d'organes en post mortem.
Impact sur les animaux
Chez les mâles reproducteurs, certains individus présentant des déformations de la queue (presque 100%), une asymétrie des organes (~44%), des malformations cardiaques (~50%) ainsi que variablement des malformations du cerveau sans impact sur la physiologie et le comportement des animaux. La sévérité et l’impact de ces défauts peuvent être variables. Chez les fœtus, nous nous attendons à des phénotypes proches de ceux rencontrés chez les mâles reproducteurs.
Devenir
A l'issue du projet, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Le point central du projet consiste à utiliser le modèle in vitro appelé « gastruloïde » qui mime les premières étapes du développement embryonnaire, afin de répondre au maximum aux questions biologiques à l’échelle moléculaire et cellulaire pouvant être adressées par un modèle simplifié en culture. Les gastruloïdes sont issus de l’aggrégat de cellules souches murines qui seront dérivées de souris controles ou mutantes. Malheureusement, les défauts physiopathologiques et anatomiques ne peuvent pas être modélisés avec les modèles in vitro. D’autant plus que la morphogénèse du cœur est étroitement liée à celles des autres organes et dépend de facteurs physiologiques. Ainsi, l’utilisation de modèle in vivo nous est indispensable pour la caractérisation des défauts et la validation des données qui seront obtenues in vitro.
Réduction
Pour le maintien de la colonie, un nombre minimal de souris mâles sera généré. Dans un but de réduction, ces mêmes mâles serviront à la deuxième procédure afin de générer des embryons qui seront étudiés par une approche séquentielle aux différents stades du développement embryonnaires, avant la naissance.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La structure en charge du bien-être animal (SBEA)sera sollicitée pour des conseils pour limiter ces situations d’hébergement isolé. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). Les individus mâles que nous allons générer pour le projet peuvent présenter des phénotypes connus et plus ou moins dommageables. Nous allons donc procéder à des observations quotidiennes très méticuleuses des animaux dès leur naissance, en utilisant une méthode de scoring pour évaluer les aspects physiques et comportementaux, de façon à identifier le plus tôt possible l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. Seuls les mâles présentant le moins d’effets indésirables et sans aucuns signes de détresse et de souffrance seront maintenus pour le projet.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques Afin de réaliser une analyse précise des défauts nous utiliserons les stades embryonnaires qui correspondent aux stades précoces du développement cardiaque lorsque les premiers progéniteurs sont déployés et lors de la mise en place des axes de symétrie embryonnaire. Les stades plus tardifs seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la progression des malformations cardiaque lors de l’embryogénèse des 4 chambres et des gros vaisseaux. Enfin le stade fœtal sera utilisé afin de caractériser les défauts morphologiques lorsque le cœur est complétement formé. Les mâles reproducteurs seront utilisés comme reproducteurs entre 8 semaines et 8 mois.
CATT : Cinétique Appliquée à la Toxicité Thyroïdienne
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
Nourris pendant l'étude avec un aliment mélangé à un composé qui blanchit et érode leurs dents, 210 rats subissent quatre prises de sang sur animal vigile, la dernière le jour de leur mise à mort. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et tous les rats sont tués, sous analgésie et anesthésie, pour que leur thyroïde et d'autres organes cibles soient prélevés. Le porteur indique que les doses ont été choisies pour ne pas casser les dents au point de gêner la prise alimentaire, et qu'une perte de gain de poids est attendue en début d'étude par refus de l'aliment. L'objet du travail est méthodologique, extrapoler un effet observé in vitro sur la synthèse des hormones thyroïdiennes vers des seuils d'exposition acceptables pour les autorités, sur un composé dont le développement a été arrêté et qui n'est jamais nommé.
Objectifs
Le projet vise à caractériser les relations quantitatives et dynamiques entre l’exposition à un composé et son métabolite principal et les effets induits par ce métabolite sur la thyroide, après la démonstration de l’inhibition d’une enzyme de la synthèse des hormones thyroïdiennes par le métabolite dans un test in vitro. Ce projet soutient la mise en place d’une évaluation toxicologique au-delà du danger, prenant en considération le risque et la corrélation entre la démonstration d’une activité in vitro et le potentiel adverse de cette activité in vivo. Ce projet concerne le cas d’un composé arrêté (bénéficiant de nombreuses données vitro et vivo) pour soutenir par des données expérimentales, une méthodologie visant à identifier un seuil d’exposition d’administration acceptable prenant en considération l’accumulation potentielle du métabolite toxique au niveau du tissu thyroïdien (exposition) et la diminution des hormones thyroïdiennes induite au cours du temps (effet). Cette approche a pour but d’être potentiellement appliquée dans le futur à des composés en développement dont le parent ou un de ses métabolites aurait un effet in vitro, et ainsi établir une extrapolation vitro vivo des résultats contribuant à l’évaluation du risque pour les autorités réglementaires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude est de caractériser la relation quantitative et dynamique entre exposition (dose administrée, exposition plasmatique, exposition tissulaire) et effets (diminution des hormones thyroïdiennes dans le serum, dans la glande thyroïdienne et aux niveaux de certains de leurs organes cibles) liée à l’administration d’un composé dont le métabolite inhibe une enzyme de la synthèse des hormones thyroïdienne documentée in vitro qui mène à une adversité in vivo (diminution de la synthèse des hormones thyroïdiennes). Cette étude apportera des informations sur la méthodologie à avoir pour extrapoler des résultats vitro à des effets vivo et ainsi évaluer la toxicité du produit en prenant en compte l’exposition dans le cas d’un composé présentant des effets toxiques vitro (c’est-à-dire : quelle concentration de composé administré mène à une concentration dans le tissu cible qui est responsable d’un effet considéré adverse par les autorités règlementaires ?). Ce travail confirmera ou infirmera les résultats des modélisations quantitatives de toxicocinétique. L'objectif est de partager avec la communauté scientifique les résultats à travers des publications ou communications scientifiques.
Procédures
- 4 prises de sang chacune sur animaux vigiles au cours de l'étude, pendant environ 2 minutes par prise de sang - 3 prises de sang (en respectant une période d’au moins 1 semaine de récupération entre chaque prélèvement) la dernière aura lieu le jour de la mise à mort de l’animal - Mise à mort précédée par administration d’un analgésique et d’une anesthésie
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet. La sélection des doses est fondée sur les résultats des études précédentes. La forte dose choisie ne doit pas excéder la dose bien tolérée chez l’animal (et définie au préalable dans une étude 90 jours en mélange nourriture). Au début d’étude, une perte de gain de poids peut être observée liée à la perte d’appétence pour la nourriture mélangée au composé. En cours d’étude, les prélèvements d’échantillons de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement ainsi qu’une perte de sang un peu plus importante que prévue. L'administration du produit induit des effets dentaires avec blanchiment et érosion. Les doses sont choisies pour ne pas atteindre une toxicité dentaire avec cassure des dents affectant la prise alimentaire. Aucun effet toxique n'est attendu suite à l'administration d'une alimentation riche en iode.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre la collecte d'organes pour quantifier l'exposition interne du produit et du métabolite au niveau des organes cibles, principalement la thyroide.
Remplacement
La compréhension actuelle de la cinétique au niveau de la thyroïde des composés parents et de leurs métabolites est limitée. Ainsi, les outils de modélisation cinétique émergeant présentent des limitations pour prédire convenablement les résultats expérimentaux observés, en particulier pour les composés avec des cinétiques dont le mécanisme de potentielle accumulation dans le tissu thyroïdien n’est pas caractérisé. Ce projet a pour but de contribuer à l’établissement d’une meilleure connaissance de la cinétique des composés ayant une toxicité thyroïdienne vitro documentée, comme publié par l’agence américaine de protection de l’environnement. L’emploi d’un modèle complexe type organoïde de thyroïde pour identifier les composés qui s’accumulent dans la thyroïde est à l’étude dans notre unité de recherche et les potentiels premiers essais seront vis en regard de résultats expérimentaux d’études vivo.
Réduction
Un total d’environ 210 rats est estimé nécessaire en se fondant sur l’expérience des tests réalisés récemment avec la molécule et sur le site, et sur le design d’étude disponible dans la littérature scientifique. Ce nombre d’animaux doit permettre de tirer des conclusions pour lier exposition et effet en mitigeant les variabilités interindividuelles liées à l’exposition en mélange nourriture (utilisée dans les études réglementaires long-terme ; le processus potentiel d’accumulation tissulaire pouvant différer en cas d’administration par gavage) et à des valeurs hormonales (qui définissent l’adversité pour les autorités).
Raffinement
Le composé sera administré à des doses maximales n’excédant pas les doses bien tolérées durant l’étude 90 jours, ainsi il n’est pas attendu de signes de toxicité devant générer de la souffrance chez les animaux. Toutefois, une attention particulière sera portée aux points limites suivants : à la perte du gain de poids en début d’étude due à la perte d’appétence pour la nourriture mélangée avec le composé d’essai, aux effets secondaires aux prises de sang pouvant induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement, et aux effets sur les dents (blanchiment, érosion par exemple). La mise à mort sera précédée d’une analgésie et d’une anesthésie.
Choix des espèces
Les études sont réalisées chez le rat pour permettre d’avoir le bon niveau d’information sur la cinétique du produit. Le rat est l’espèce la plus appropriée pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées notamment sur le rat permettant un volume sanguin compatible avec plusieurs investigations et des données expérimentales documentées au cours des études précédentes (exposition plasmatique au parent et métabolites, hormonologie). Le composé sera administré à des animaux adultes dont l’âge minimal au début de l’étude sera de 6-7 semaines. L’âge maximal au début de l’étude sera de 45 semaines dans l’optique d'éviter les variations liées à la croissance de jeunes animaux.
Modulation du système sérotoninergique pour le traitement des douleurs neuropathiques traumatiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 984 rats vont être utilisés, 1 780 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun passant jusqu'à trois heures dans un compartiment de test avec une mesure du seuil de douleur toutes les trente minutes. Un nerf est lésé chirurgicalement pour reproduire une neuropathie traumatique, la douleur post-opératoire est déclarée sévère et traitée pendant vingt-quatre heures, puis la patte est stimulée au toucher ou plongée dans l'eau froide, gestes que le porteur classe eux aussi comme sévèrement douloureux. La veille du test de reconnaissance sociale, chaque rat passe moins de vingt-quatre heures isolé. Les rats qui ne deviennent pas douloureux après la chirurgie, environ un sur cinq, sont écartés de l'étude, et 96 rats juvéniles sans traitement partent vers d'autres expériences de l'animalerie, tous les autres étant tués pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les douleurs neuropathiques touchent en France 5.6–7.3% de la population générale adulte. Ce sont des douleurs chroniques car persistantes ou récurrentes qui ne sont généralement pas améliorées par le traitement de la maladie sous-jacente ou même par sa guérison. Elles se caractérisent par une perception aberrante de douleur et sont souvent associées à des troubles cognitifs. Le traitement de ces douleurs est difficile, par manque d’efficacité des médicaments de référence et par leurs nombreux effets indésirables.. La sérotonine est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de la douleur et dans de nombreuses autres fonctions, comme le contrôle de l’appétit, du sommeil, de l’humeur…. L'objectif principal de ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales chez le rat présentant une neuropathie traumatique similaire à celle causée par un accident de la voie publique ou par la lésion d’un nerf au cours d’une chirurgie, est d'étudier le rôle de la sérotonine dans ce contexte douloureux afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorant les symptômes douloureux et les comorbidités cognitives.
Bénéfices attendus
Si les agents pharmacologiques testés permettent de soulager la douleur et les comorbidités associées, alors on peut espérer i) soit leur utilisation dans de nouvelles indications (la douleur neuropathique), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu de la sévérité des douleurs neuropathiques, de leur impact sur la qualité de vie des patients et du manque d’efficacité des traitements existants, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces est fortement attendu.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à un test de détection de seuil de douleur (14 jours après la chirurgie) et à un test de cognition (21 jours après l'induction de la neuropathie). Les rats ne sont soumis qu'à un seul test de détection de seuil de douleur (stimulation tactile ou froide). Les tests détection de seuil de douleur sont réalisés chez l'animal vigile à raison d'une mesure avant la chirugie puis une mesure 2 semaines après, puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé chez l'animal vigile, une seule fois, il dure 10 minutes. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux ont subi: 2 injections intrapéritonéales d'agent pharmacologique (rat vigile) OU: 1 injection intrapéritonéale d'agent pharmacologique (rat vigile) et 1 injection intrathécale (rat anesthésié).
Impact sur les animaux
Stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur pour l'injection. Douleur (légère) de l’injection intrapéritonéale . La durée totale de la nuisance (immobilisation + injection) est de 10 secondes. Stress (modéré) dû au changement de salle. Stress (modéré) lors de l’immersion de la patte dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’expérimentateur (durée: 20 sec). Stress (modéré) lors de la mise du rats dans un compartiment pour la stimulation tactile (durée: 180 min). Stress (modéré) dû à l’isolement de l’animal la veille (pendant moins de 24 h) du test de reconnaissance sociale. Douleur post-opératoire (sévère) traitée avec un anti-inflammatoire (pendant 24 h). Douleur (sévère) à la stimulation tactile (durée 6 sec) et à la stimulation thermique (durée 14 sec maxi). Difficultés à se mouvoir (modérées) et à atteindre la mangeoire pendant 24 h après la chirurgie.
Devenir
A l'exception des 96 rats juvéniles issus de la procédure 3, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d'organes ou fixation de tissus.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender les mécanismes intégrés de la douleur et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les comorbidités associées. Le modèle de neuropathie traumatique fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux agents pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les comorbidités cognitives associées. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus douloureux et cognitifs ne peuvent être entièrement élucidés par des études cliniques.
Réduction
n= 8 rats/condition (traitement), taille de l’échantillon définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés et par la puissance des tests statistiques; une analyse de variance à une ou deux voies est réalisée,suivie d'un test post-hoc. Une partie des rats neuropathiques ayant subi la stimulation tactile ou l'immersion de la patte seront réutilisés pour le test de cognition. Ainsi, 288 rats pourront être réutilisés pour le test de cognition. Les rats non douloureux après la chirurgie seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceux-ci représentent environ 20% de la proportion des rats opérés. Pour écarter les biais méthodologiques les traitements sont randomisés, les expériences réalisées en « aveugle » et selon la méthode des blocs. 96 rats juvéniles n'ayant subi aucun traitement pourront être intégrés dans d'autres expérimentations autorisées se déroulant au sein de l'animalerie.
Raffinement
Les rats sont stabulés à raison de 4 par cage. Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins pré et post-opératoires : enrichissemnt du milieu avec des tunnels en plastique, du coton, d'un bloc de bois; change avec soin, utilisation d’un tapis chauffant, protection de la cornée par du gel oculaire, traitement antalgique en fin de chirurgie et 24 h après. En raison de la réduction de leur mobilité pendant les 24 h suivant la chirurgie, les granulés d’aliments sont placés sur le sol de la cage pendant 24 h. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide de la grille de score spécifique au modèle.
Choix des espèces
Des rats jeunes adultes (âgés de 6-7 semaines) et juvéniles (âgés de 4-5 semaines), mâles et femelles sont utilisés. Le choix du rat est justifié par: i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations pertinentes ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie qui peut perdurer plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité dedévelopper des modèles de maladies humaines, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain.
Essai de toxicité aux premiers stades de la vie sur le poisson zèbre Danio rerio
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Nage en tire-bouchon, convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème, hémorragie : ces signes déclenchent la mise à mort du poisson concerné. 8 640 poissons zèbres vont être utilisés, 4 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 880 un niveau modéré et 1 440 un niveau léger, tous tués à l'issue. Des œufs fraîchement fécondés sont exposés à cinq concentrations d'un produit chimique pendant environ trente jours après l'éclosion, la gamme étant calée pour que la plus faible concentration produise environ 10 % d'effet et la plus forte environ 90 %. Le test répond à l'obligation réglementaire REACH pesant sur des monomères que l'entreprise produit et qu'elle ne pourrait plus vendre en Europe sans lui.
Objectifs
Le test OCDE 210 est destiné à déterminer les effets létaux et sub-léthaux des produits chimiques sur les stades de développement de l'espèce étudiée (ici le poisson zèbre) et consiste à exposer des poissons aux premiers stades de leur vie à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 210 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. En absence de réponse à cette exigence, ces substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Procédures
Le test consiste à exposer des oeufs fraichement fécondés à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau, pendant environ 30 jours après l’éclosion. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés : - Éclosion et survie : dénombrement quotidien des éclosions et des survivants. Les oeufs moisis, embryons et larves morts seront retirés dès qu’ils sont repérés. - Apparence anormale : dénombrement (à minima 3 fois par semaine) des larves et juvéniles présentant une anomalie corporelle. En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. - Comportement anormal : hyperventilation, nage mal coordonnée, immobilité ou comportement alimentaire atypiques seront notées à minima 3 fois par semaine. - Poids & longueur totale : après euthanasie des poissons ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai.- Paramètres physico-chimiques pH, oxygène dissous et température : mesure quotidienne. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Impact sur les animaux
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d'essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d'invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés ne peut pas être réutilisés et doit être euthanasiés.
Remplacement
Ce test est une exigence réglementaire imposé par les autorités compétentes. Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 210 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées. De même, il n'existe pas de modélisation validée pour remplacer l'utilisation d'animaux.
Réduction
Pour chaque test, le nombre d'animaux utilisé est défini par le protocole d'essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pé-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, , nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment) mais également sur des poissons adultes de la même espèce. Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligé de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
Raffinement
Les organismes géniteurs sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 210 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (sans visuel de gravier) et maintenus dans les mêmes conditions environnementales que les géniteurs, de sorte que seule la concentration de la substance testée peut avoir un impact. Les comportements et anomalies suivants ont été définis comme des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité) : nage « en tire-bouchon », convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème et hémorragie. Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (rotifère et artémies) est privilégiée.
Choix des espèces
Cette espèce est l'une de celles recommandées par la ligne directrice. Elle est employée par le laboratoire depuis plus de 20 ans pour d'autres projets (dont le test de toxicité aiguë sur adultes). La ligne directrice impose d'exposer les organsimes au produit chimique depuis le stade oeuf fécondé jusqu'au stade juvénile (soit environ 30 jours après l'éclosion).
Maintien de l’élevage de souris obèses – souche Ob/Ob
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Nées de croisements entre porteurs hétérozygotes organisés pour entretenir la lignée, 1 000 souris ob/ob vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La mutation qu'elles portent dérègle le contrôle de l'appétit et provoque dès quatre semaines une obésité sévère accompagnée de troubles métaboliques, phénotype que le porteur qualifie lui-même de dommageable. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet, dont l'objet se limite à fournir aux autres protocoles un stock d'animaux obèses disponible en continu. L'obésité y est décrite comme n'induisant ni traumatisme ni douleur, quelques lignes avant l'énoncé des aménagements qu'impose la mobilité réduite de ces souris, deux par cage et tétines de biberon rallongées.
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique causée par un excès de graisse dans le corps, entraînant des problèmes de santé, notamment au niveau du métabolisme, du système vasculaire et du cœur, et réduisant l’espérance de vie. Son développement est influencé par plusieurs facteurs, tels que l’alimentation, la génétique et l’environnement. Dans ce contexte, la souris Ob/Ob, porteuse d’une mutation génétique affectant un gène important pour le contrôle de l'appétit, est un modèle essentiel pour étudier les maladies liées à l’obésité. Cette mutation provoque une obésité sévère et des troubles métaboliques similaires à ceux observés chez l'Homme. Maintenir cette lignée de souris permet de mieux comprendre les causes de l’obésité et ses complications, et d’évaluer de nouvelles solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le maintien de cette lignée à mutation spontanée permet de fournir un modèle stable et reproductible pour de nombreux projets de recherche, facilitant ainsi les études comparatives et assurant une disponibilité continue d’animaux adaptés aux besoins expérimentaux.
Procédures
Les souris ob/ob présentent une obésité due à une mutation génétique spontanée qui altère le fonctionnement d'un récepteur à une hormone contrôlant l'appétit, cette mutation induit un phénotype dommageable visible dès l'âge de 4 semaines.
Impact sur les animaux
L’obésité, qu’elle soit induite par un régime riche en graisses ou par une mutation spontanée (Ob) n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. Avec l’installation de l’obésité, les souris pourraient présenter une mobilité réduite.
Devenir
Les animaux seront garder en vie et utilisés dans des projets nécessitant des souris Ob/Ob.
Remplacement
En l’absence de modèles alternatifs permettant de développer une obésité à l’échelle de l’organisme, nous utilisons des modèles murins bien caractérisés comme les souris Ob/Ob. Ces modèles ont l’avantage de reproduire des altérations biologiques similaires à celles observées chez l’Homme..
Réduction
Ce projet vise à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant un maintien efficace de la lignée. Les souris Ob/Ob sont obtenues par croisement d’hétérozygotes (Ob/+ × Ob/+), et toutes les souris issues de ces accouplements seront utilisées pour éviter toute mise à mort inutile. Les souris hétérozygotes excédentaires seront intégrées au programme d’élevage pour assurer la pérennité de la colonie ou utilisées comme contrôles. De plus, une planification rigoureuse des accouplements sera mise en place pour ajuster la production aux besoins réels des projets, évitant ainsi un surnombre d’animaux. L’utilisation de méthodes standardisées pour le suivi et la gestion des lignées contribuera à optimiser les effectifs et à limiter les manipulations superflues.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à leur espèce, avec un enrichissement du milieu comprenant des cabanes, du papier, des tubes en carton et des morceaux de bois. Un suivi quotidien des animaux sera assuré, incluant l’évaluation de critères comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé), ainsi qu’un suivi du poids de façon hebdomadaire. Ces observations permettront d’identifier d’éventuels signes de détresse et de déterminer les points limites de l’expérience pouvant conduire à la mise à mort de l’animal, conformément à la grille d’évaluation des points limites. Les souris obèses, qu’elles soient mâles ou femelles, seront hébergées par deux par cage pour tenir compte de leur poids et de la taille de leur environnement. Leur mobilité réduite nécessitera une attention particulière lors des manipulations et des transferts, des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Elle est utilisée depuis longtemps pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnue pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, elle offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix privilégié pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d’obtenir des données fiables. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines pour les protocoles expérimentaux, un âge couramment choisi dans la plupart des études car il correspond à un stade de développement suffisamment mature. Toutefois, cette fenêtre peut varier en fonction des objectifs spécifiques de chaque projet, certaines études nécessitant des animaux plus jeunes ou plus âgés. En ce qui concerne la reproduction, les femelles seront mises à la reproduction entre 8 et 10 semaines, un stade où elles sont physiquement prêtes et capables de donner des descendants viables.
Projet de maintien et acquisistion de compétences
- Formation professionnelle
Des prélèvements de sang, des injections de sérum physiologique et des chirurgies menées sans réveil : ces gestes sont répétés sur des souris pour que le personnel d'un institut apprenne ou révise sa technique. 4 485 souris vont être utilisées, 2 625 dans des procédures menées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience et 1 860 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'aucun animal ne subira plus d'une seule intervention, puis annonce que personne ne dépassera cinq essais par animal. Les souris déjà utilisées dans un protocole ou réformées de l'élevage passent d'abord par les gestes sur animal vigile, avant d'être versées dans les procédures sans réveil, qui se terminent toutes par leur mise à mort.
Objectifs
Certains gestes techniques, bien qu'étant réalisés régulièrement par le personnel de notre institut, nécessitent d'être appris par les nouveaux arrivants ou d'être révisés par les experts avant leur mise en œuvre dans le cadre d'un protocole expérimental. Cela permet d'éviter les erreurs et de garantir que ces gestes sont réalisés conformément aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale, tant pour la qualité des résultats scientifiques que pour le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Cette approche présente plusieurs avantages, notamment le maintien des compétences du personnel. Elle permet d’effectuer des gestes sûrs et efficaces au cours des expérimentations, tout en réduisant la marge d'erreur associée à certains gestes délicats. Par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation peut être calculé en tenant compte d'une marge d'erreur plus faible, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés au fil des projets. De plus, les entraînements seront réalisés sur des animaux ayant déjà participé à un protocole ou sur des animaux reproducteurs réformés, ce qui garantit que le nombre total d'animaux utilisés dans notre animalerie ne sera pas augmenté.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang, des injections de sérum physiologique, ainsi qu’à une chirurgie réalisée sans réveil. Chaque animal ne sera soumis qu'à une seule intervention sous anesthésie ou à une intervention sur animal vigile. De plus, aucun animal ne participera à plus de 5 essais au total. Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, à des injections de sérum physiologique, ou à des chirurgies réalisées sous anesthésie générale sans réveil. Chaque individu ne participera qu’à une seule intervention sous anesthésie ou à une seule manipulation sur animal vigile. Aucun animal ne sera utilisé pour plus de cinq essais au total. Les gestes réalisés sur animaux vigiles seront brefs, d’une durée inférieure à 30 secondes, afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort.
Impact sur les animaux
La douleur maximale ressentie par les animaux sera équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille lors des injections ou des prélèvements sur animal vigile. En ce qui concerne les chirurgies sous anesthésie générale ou les prélèvements réalisés sous anesthésie volatile, il existe un risque d’hémorragie, suivie, si nécessaire, d’une euthanasie immédiate pour éviter toute souffrance supplémentaire.
Devenir
Les animaux vigiles ne subiront que des interventions classées comme légères (telles que des piqûres d'aiguille). Après ces interventions, ils pourront être réutilisés dans des procédures sans réveil. Par définition, toutes les procédures sans réveil se terminent par l’euthanasie de l'animal afin d’éviter toute souffrance post-intervention.
Remplacement
Étant donné qu'il s'agit de maintenir ou d'acquérir des compétences techniques spécifiques, il n'est pas possible de substituer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives.
Réduction
Les animaux utilisés auront d'abord été impliqués dans des procédures scientifiques ou proviendront d'élevages. Le nombre d'animaux calculé représente un maximum théorique, qui pourra être réduit en fonction du nombre de personnes à former ou du niveau de maîtrise des agents, si l'acquisition des compétences s'avère plus rapide que prévu.
Raffinement
Les animaux proviendront exclusivement de notre propre animalerie, évitant ainsi tout transport ou changement d’environnement, ce qui contribue à réduire les facteurs de stress. Ils seront hébergés dans le strict respect des bonnes pratiques d’animalerie. La majorité des gestes techniques décrits seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil, minimisant significativement la douleur et l’inconfort. La principale source potentielle de nuisance reste liée aux gestes imparfaits susceptibles d’être commis lors des premières manipulations par les personnes en formation. Afin de limiter le stress pour les animaux, en particulier dans le cadre des ponctions ou gestes similaires, nous nous engageons à ne pas dépasser cinq essais par animal. Chaque individu ne sera soumis qu’à un seul type de geste.
Choix des espèces
La souris est l'espèce sur laquelle nous réalisons plus de 95% de nos expérimentations. Il est donc naturel que nous nous exercions sur cette espèce. Les animaux utilisés seront des souris adultes, de tout âge, car c'est à ce stade que nous effectuons ces gestes dans nos DAPs.
IGUANA : Suivi et conservation d’Iguana delicatissima, l’iguane des Petites Antilles en danger critique d’extinction
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés au lasso dans leur milieu naturel, immobilisés sans anesthésie ni analgésie pendant dix minutes au maximum, 210 iguanes des Petites Antilles subissent une biométrie, un marquage sous-cutané, une prise de sang à la veine caudale et un écouvillonnage de la bouche ou de la peau. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, le rythme respiratoire et la tonicité musculaire étant contrôlés toutes les deux minutes pour décider d'interrompre. Le porteur reconnaît des griffes arrachées chaque année sur les terrains rocailleux et de rares autotomies de la queue, sur moins de 1 % des individus capturés. Tous sont gardés vivants et relâchés à l'endroit exact de leur capture, parfois après deux heures de repos dans un sac de coton.
Objectifs
L’iguane des Petites Antilles, Iguana delicatissima, espèce en danger critique d'extinction (UICN), a disparu de >80% de son aire de répartition originelle et est limité à 6 îles des Petites Antilles. Elle est menacée par la perte d'habitat, la prédation, le braconnage, les maladies, la concurrence et l'hybridation avec l’iguane commun, I. iguana, invasif sur l’ensemble de l’arc antillais. Actuellement, seules 5 îles inhabitées abritent l’iguane des Petites Antilles en l'absence d’iguane commun, avec des effectifs extrêmement faibles, menaçant la survie de cette espèce endémique des Antilles. Ce projet, programmé sur 3 ans, a pour but d’acquérir des connaissances pour répondre à 2 objectifs de conservation de cette espèce : ● Rétablir l’iguane des Petites Antilles dans un état favorable par des actions de conservation adaptées (conserver sa diversité génétique et augmenter ses populations) ● Suivre l’évolution des populations d’iguanes des Petites Antilles et de leurs habitats (particulièrement leur état sanitaire et écologique). 1) Collecter des échantillons d’ADN pour évaluer la diversité génétique de l’espèce sur l’ensemble de son aire de répartition et prévoir sa conservation. Dans le but de conservation, il est impératif d’estimer le niveau de diversité génétique et d’hybridation actuel des populations. Il est donc prévu de réaliser une campagne de prélèvements de sang sur l’ensemble des populations de l’espèce. Une telle collection biologique de référence a pour intérêt de regrouper des échantillons de grande qualité qui peuvent être préservés pendant une longue période de temps et permettre de réaliser les analyses génétique et de séquençage de génomes prévus dans le cadre de ce projet ainsi que de prévoir de réaliser de futures analyses sans avoir besoin de réaliser de nouveaux prélèvements sur animaux. 2) Collecter des échantillons microbiologiques pour évaluer la distribution de la bactérie Devriesea agamarum causant de graves lésions cutanées chez les iguanes des Petites Antilles. Le projet prévoit de réaliser un état des lieux de référence de la distribution de cette maladie sur l’ensemble des populations d'I. delicatissima, afin de pouvoir (1) suivre son évolution sur l’ensemble des îles et (2) détecter la bactérie sur les individus avant l’apparition de symptôme. Au final, ce projet vise à améliorer sur le long terme l'état de conservation des populations de l'une des espèces de vertébrés les plus menacées et emblématiques de la Caraïbe.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet visent tout d’abord à acquérir des connaissances afin de réaliser un état des lieux de référence sur l’ensemble de l’aire de répartition de l’iguane des Petites Antilles concernant : - L’évaluation de la diversité génétique de l’espèce, en estimant le patrimoine génétique des différentes populations reliques, mesurant la différenciation et la migration entre populations, évaluant la perte de diversité due à la consanguinité ainsi qu’en quantifiant le niveau d’hybridation avec l’iguane commun. Pour cela il sera utilisé une combinaison de marqueurs génétiques classiques (microsatellites - permettant la comparaison directe avec les données génétiques antérieures, précédemment publiées) et de séquençage génomique, permettant une analyse à plus haute résolution (RADseq). - L’évaluation de l’état sanitaire des populations, pour vérifier la répartition et le taux de contamination par la bactérie Devriesea agamarum au sein de l’ensemble de l’aire de distribution de l’espèce, afin de pouvoir prévoir et surveiller l’expansion de cette maladie. Ce projet contribue à combler les lacunes de connaissances sur l’iguane des Petites Antilles à l’échelle régionale, de renforcer la collaboration internationale entre l’ensemble des partenaires de la Caraïbes, en réalisant des suivis et collectant des échantillons et les données qui en découlent, afin de faciliter les futures analyses et suivis temporels. Il vise ainsi à pallier aux soucis d’échantillons biologiques précédemment rencontrés (e.g. échantillons dégradés, inadaptés, épuisés et/ou indisponibles), en permettant de constituer à la fois (i) une collection biologique de référence, qui sera disponible au niveau local/régional et pourra être utilisée et complétée sur le long terme, et (ii) un état des lieux génétiques des populations en vue de leur conservation et de leur suivi dans le temps. Sur le plus long terme, ce projet vise à sensibiliser à la protection de la biodiversité endémique de la Caraïbe et à ses menaces, notamment les impacts des espèces exotiques envahissantes et des pathogènes, tout en renforçant les capacités des gestionnaires des ressources naturelles en matière de conservation des espèces menacées à l’échelle régionale.
Procédures
La procédure prévoit la capture d’individus d’iguane des Petites Antilles dans le milieu naturel, en privilégiant les adultes, avec 30 individus par population (afin d’obtenir une précision suffisante des paramètres biologiques étudiés), soit au total 210 individus provenant de 7 populations. Cette procédure sera réalisée une seule fois par individu, grâce au marquage individuel. Au regard de l’environnement d’intervention, de la biologie et physiologie de l’espèce étudiée, le raffinement et la rapidité d’exécution de la procédure, réalisée exclusivement par des personnes formées, seront privilégiés par rapport aux contraintes et risques anesthésiques. Ainsi aucune médication, anesthésie ou analgésie n’est envisagée dans la procédure. La durée de contention pour la réalisation de la procédure sera réduite au minimum (maximum 10min au total). De plus, tout au long de la procédure, l’évaluation de la douleurs et du niveau de stress de l’individu seront suivis par rapport au rythme respiratoire et la tonicité musculaire, toutes les 2 minutes, afin de les minimiser ou le cas échéant interrompre la procédure (au regard des points limites définis – voir section 5.10.3 Raffinement). 1. Biométrie et marquage : Après la capture, l'iguane est immobilisé pour réaliser les mesures en minimisant l’impact sur l’animal : observation générale (recherche de signes d'hybridation, détermination du sexe, stade de vie, état général et sanitaire), mesures morphométriques standardisées et marquage individuel sous-cutané des individus non-marqués. 2. Prélèvements d’échantillons génétiques : Ceux-ci seront réalisés par prise de sang (prélèvement de 0,35 à 0,6% du poids vif) , au niveau de la veine caudale, pour obtenir des échantillons biologiques permettant l’extraction d’ADN de haute qualité, en vue de réaliser des analyses de séquençage génomiques. 3. Prélèvements d’échantillons microbiologiques : Ils seront effectués par écouvillonnage simple, au niveau buccal ou cutané, pour évaluer l’état sanitaire des individus. 4. Relâcher des individus : Une fois la procédure réalisée, la condition de stress de l’individu est évaluée. S’il ne présente pas de signe de stress particulier, l’iguane est relâché immédiatement à l’endroit exact de sa capture. Si l’individus présente certaines conditions de stress, il est placé pour récupérer dans un endroit ombragé et calme (éventuellement dans un sac en toile de coton), pour une durée maximum 2 heures, avant d’être relâché.
Impact sur les animaux
Le projet nécessite la capture temporaire de spécimens vivants, leur contention, leur marquage individuel et la réalisation de prélèvements simples et sanguins, sur des individus adultes d’iguane des Petites Antilles du milieu naturel. Ces procédures ont fait l’objet de monitoring sur de nombreuses années de suivi de l’espèce, permettant d’avoir un certain recul sur l’impact de ces activités sur le bien-être animal individuel. Elles ont de plus été discutées par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) de l’Établissement Utilisateur. Les effets indésirables possibles à envisager sur les individus lors de ces procédures sont principalement de 3 types : - Les effets de stress, principalement liés à la capture et la contention des individus ; - Les blessures éventuelles, liées à la capture et contention ou lors des prélèvements buccaux ; - Les risques septiques lors du marquage individuel et/ou du prélèvement sanguin. Concernant les blessures pour l’espèce cible, trois cas principaux ont été identifiés. Lors de la capture et de la contention, il s’agit de griffes arrachées notamment dans les habitats les plus rocailleux (quelques individus tous les ans), et des autotomies au niveau de la queue. Ces dernières sont très rares et concernent moins de 1% des individus capturés sur l’ensemble des missions opérées. Lors des prélèvements buccaux, les individus de grandes tailles peuvent vouloir mordre l’écouvillon : un animal cassant l’écouvillon en fermant la bouche risque d’avaler la partie mordue, ce qui peut entraîner des lésions internes, toutefois ce risque est totalement annulé dès lors qu’un ouvre-bouche est utilisé. Enfin, un soin tout particulier sera pris pour réduire tout risque potentiel de transmission/propagation d’infection (y compris par la bactérie Devriesea agamarum) entre individus. Pour cela, un protocole de désinfection stricte, impliquant utilisation de matériel à usage unique et de gants ainsi que la désinfection des zones de prélèvements chez les iguanes capturés à la bétadine, des manipulateurs au gel-hydroalcoolique ainsi que du lasso et de la zone de travail à l’alcool, sera mis en place.
Devenir
Le projet étudie une espèce protégée dans son milieu naturel. Tous les animaux capturés pour l’étude seront gardés en vie et, dès la fin de la procédure, relâchés dans le milieu naturel à l’endroit exact de la capture.
Remplacement
Le projet portant sur l’acquisition de données scientifiques génétiques des populations de l’espèce Iguana delicatissima en vue de développer un projet de conservation sur celle-ci et directement basé sur les paramètres biologiques, génétiques et microbiologiques propres, il apparaît donc impossible de remplacer le modèle biologique par une autre espèce, ni un équivalent cellulaire ou in silico. De plus, il est ici considéré de constituer une banque d’échantillons biologiques de références, incluant des échantillons de grande qualité qui pourront être préservés et continuer d’être utilisés pendant une longue période, pour de futures analyses. Pour cela, seront préférés les prélèvements de sang, qui correspondent à la méthode conseillée pour les iguanes en bon état de santé et permet de collecter une grande quantité d’ADN avec un impact réduit pour l’animal.
Réduction
Le protocole d’échantillonnage est prévu ici pour permettre d’estimer de manière optimale à la fois (i) les paramètres de diversité génétique et (ii) l’état sanitaire des différentes populations d’iguane des Petites Antilles, actuellement afin de constituer un état de référence pour l’évolution de ces populations et les programmes de conservation à venir. Un échantillonnage de 30 individus par population est couramment recommandé pour assurer une bonne représentativité des variations génétiques au sein de la population, et obtenir des estimations suffisamment fiables des paramètres génétiques. De la même manière, l'évaluation de l'état sanitaire des populations d'iguanes des Petites Antilles, incluant une estimation robuste de la présence/absence de la bactérie pathogène Devriesea agamarum ainsi que de sa prévalence au sein des populations nécessite également un échantillonnage approprié et optimal de 30 individus par population. Compte tenu d’une taille d’échantillonnage optimale identique entre les deux volets du projet, les deux types échantillons seront collectés autant que possible sur les mêmes individus, afin de minimiser le nombre total d’individus sauvages capturés, manipulés et prélevés. Par ailleurs, bien que les écouvillons buccaux puissent constituer une source d’ADN pour réaliser des génotypages simples, ceux-ci ne permettent pas de constituer une collection d’échantillons biologiques de qualité suffisante pour être utilisables sur le long terme et avec des analyses génomiques haut-débit. C’est pour cela qu’il est prévu de réaliser dans ce projet des prélèvements sanguins, qui restent pour les iguanes le type de prélèvement le moins impactant permettant d’obtenir une quantité importante d’ADN nécessaire aux analyses génomiques.
Raffinement
La capture temporaire de spécimens vivants, leur manipulation, le prélèvement de matériel biologique ont déjà fait l’objet d’autorisations administratives dans le cadre des programmes de protection de l’Iguane des Petites Antilles, sur l’ensemble de l’aire de distribution. Un recul a été accumulé sur l’impact de ces activités sur le maintien d’un état de conservation favorable des populations et le bien-être animal individuel. L’ensemble des opérateurs impliqués sont formés et titulaires d’agréments individuels. Ces opérations de captures et biométries, éventuellement marquages individuels et prélèvements biologiques génèrent de facto un stress individuel. Ce dernier est réduit en : - diminuant le temps d’attente entre la capture et le relâché d’un individu, - réduisant le nombre de personnes présentes lors de la manipulation, - garantissant la qualification des opérateurs pour l’ensemble des gestes de procédure expérimentale. À ce jour et après plusieurs milliers de captures dans les Antilles Françaises, aucune mortalité directe n’est à déplorer. Par ailleurs, y compris dans le cadre de suivi de type CMR (Capture-Marquage-Recapture), aucun effet de captures répétées n’a pu être mis en évidence quant au comportement de l’espèce. Afin de réduire cet impact au maximum, la qualification des opérateurs, la vigilance tout au long des procédures et la définition de points-limites (cf. ci-dessous) permettent de s’assurer que la santé de l’animal est primordiale, et passe avant le protocole. Ainsi, afin d’assurer la sécurité des animaux entrant en procédure, des points-limites adaptés sont définis : - Occurrence d’une blessure superficielle : Si localisation hors d’une zone de manipulation et n'entraînant pas de comportement de stress, poursuite de la procédure avec une surveillance accrue ; dans le cas contraire, arrêt de la procédure, désinfection locale, surveillance et relâché. - Apparition d’un comportement de stress : arrêt de la procédure, surveillance et relâché. - Occurrence blessure lourde : arrêt de la procédure, évaluation vétérinaire et procédure adaptée au diagnostic. - Occurrence blessure engageant le pronostic vital : arrêt de la procédure, évaluation vétérinaire et selon diagnostic mise à mort selon méthode réglementaire.
Choix des espèces
Le projet porte directement sur l’acquisition de connaissances sur les populations naturelles de l’iguane des Petites Antilles, Iguana delicatissima, en vue de développer un projet de conservation de cette espèce au niveau de l’ensemble des Petites Antilles. Dans ce cadre, pour avoir un intérêt scientifique les paramètres biologiques étudiés doivent être mesurés sur cette espèce et non une autre. Le protocole d’étude vise à estimer à la fois la diversité génétique au sein de cette espèce et la prévalence de la bactérie Devriesea agamarum au sein de ses populations. Ceci requiert un échantillonnage aléatoire des populations, ciblé principalement sur les individus adultes ou à défaut sub-adultes (i.e. d’un poids supérieur à 200g), afin de caractériser les populations de géniteurs et de minimiser l’impact des manipulations sur les individus étudiés.
Renforcer l’immunité des poulets grâce aux plantes dans leur alimentation
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Pour vérifier si des plantes ajoutées à l'aliment renforcent l'immunité des poussins, 120 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit trois prises de sang à la veine de l'aile, à 7, 21 et 28 jours, sur animal vigile maintenu couché sur le côté, deux tentatives au maximum par prélèvement. Les poussins arrivent des mêmes couvoirs que ceux destinés à la consommation et sont élevés dans les conditions standard de l'élevage de chair. À 35 jours, tous sont tués pour une dernière prise de sang et pour prélever le microbiote de leur intestin, geste qui exige leur mise à mort.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment certaines plantes peuvent aider les poulets à mieux développer leurs défenses immunitaires dès leur naissance. Le microbiote intestinal (ensemble des bactéries de l'intestin) joue un rôle clé dans la santé des animaux, mais son lien avec l'immunité est encore peu étudié chez la volaille. Un microbiote déséquilibré peut rendre les poulets plus vulnérables à certaines maladies, comme des infections respiratoires ou articulaires. Des recherches ont montré que certaines plantes pouvaient améliorer la santé intestinale et protéger certains organes. Ce projet teste donc l'effet d'une alimentation enrichie en plantes sélectionnées sur le microbiote intestinal et l'immunité des poulets. Pour mesurer cette réponse immunitaire, des prises de sang seront réalisées après la vaccination, à raison d'une prise par semaine pendant trois semaines. Les résultats permettront d'évaluer si ces plantes peuvent renforcer l'immunité des poulets, améliorer leur santé globale et limiter l'utilisation de médicaments, favorisant ainsi une production avicole plus durable et respectueuse du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Cette étude cherche à vérifier si l'ajout de plantes dans l'alimentation des poussins dès les premiers jours de vie aide à bien orienter leur flore intestinale et à renforcer leur système immunitaire. Une bonne flore intestinale dès le départ pourrait améliorer leur santé, leur résistance face aux maladies et leur efficacité à répondre aux vaccins. Des poussins avec une meilleure immunité sont plus résistants au stress lié aux conditions d'élevage (chaleur, bactéries, virus), ce qui améliore leur bien-être. Si ces plantes montrent aussi des effets protecteurs sur d'autres organes, cela pourrait réduire l'usage de médicaments, contribuant ainsi à une approche plus durable pour la santé animale, humaine et environnementale.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins au niveau de l'aile, espacés d'au moins une semaine : à 7 jours d’âge, à 21 jours d’âge et à 28 jours. Ces prélèvements sont réalisés sous contention d’animaux vigiles. La contention et la réalisation du prélèvement dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
La procédure de prise de sang est classée comme légère. Le sang veineux périphérique est prélevé au niveau de la veine alaire avec une contention légère. Le poulet est maintenu par un animalier habilité, allongé sur le côté avec l’aile bien à plat. L’oiseau pourra ressentir un stress dû à cette contention, le geste sera réalisé de la manière la plus douce par un animalier habitué à manipuler les oiseaux. Une deuxième personne également habilitée à l’expérimentation réalise le prélèvement sanguin qui dure moins de 30 secondes. L’animal pourra ressentir une douleur légère égale à l’introduction d’une aiguille. Seules 2 tentatives de prélèvement sont réalisées. Si une anomalie est détectée sur le point de ponction, le prélèvement sera alors réalisé sur l’autre aile. Au-delà de 2 tentatives, en cas d’échec, la prise de sang n’est pas réalisée afin de limiter le stress des animaux. Aucune anesthésie ni antidouleur n'est nécessaire, car la procédure est rapide et peu invasive, avec une très petite quantité de sang prélevée.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront élevés jusqu'à 35 jours d'âge comme dans un élevage standard de poulets. Les 120 poulets ayant été prélevés en sang au cours du projet seront euthanasiés à la station expérimentale afin de réaliser un dernier prélèvement de sang, ainsi qu’un prélèvement de flore intestinale (microbiote caecal) qui nécessite l’euthanasie de l’animal.
Remplacement
Ce projet s’intéresse au lien entre l’alimentation, la flore intestinale et le système immunitaire du poulet. Comme ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites en laboratoire par des méthodes in vitro, l’étude doit être réalisées sur des animaux.
Réduction
Pour évaluer l'effet des plantes sur la réponse immunitaire, il est nécessaire de suivre au moins 30 poulets par groupe. Chaque poulet est prélevé 3 fois car le niveau d'anticorps peut varier d'un animal à l'autre et évoluer dans le temps. Le nombre d'animaux a été calculé à partir de données scientifiques pour garantir des résultats fiables à partir d’un nombre d’animaux le plus faible
Raffinement
Plusieurs mesures sont intégrées dans la mise en place de la procédure afin de réduire les nuisances sur le bienêtre des poulets. D’abord, le premier prélèvement n’a lieu qu’après une période d’adaptation du poussin à son nouvel environnement d’une durée de 7 jours. Si il est constaté que des animaux à prélever présentent un état de santé affaibli alors ils sont retirés de la procédure et ne sont pas prélevés. Afin de réduire ou supprimer la douleur, des points limites sont mis en place et seules 2 tentatives de prélèvement sanguins sont réalisées. De plus, une surveillance accrue des animaux est réalisée dans les heures et le jour suivant la procédure afin de détecter tout signe de douleur et assurer la prise en charge (mise hors essai de l’animal par exemple). La procédure de prise de sang est réalisée en condition de lumière réduite afin que les animaux soient calmes. Par ailleurs les autres manipulations des animaux sont réduites afin de réduire les autres sources potentielles de stress. Les oiseaux sont élevés dans les conditions d’élevage standard de 1 jour à 35 jours. Un apport supplémentaire d’aliment est réalisé directement sur la surface du module (en plus de la mangeoire) pendant les 3 premiers jours pour faciliter l’accès à l’aliment. Les conditions de température et d’hygrométrie respectent les besoins de l’espèce et sont contrôlées quotidiennement afin de préserver leur bien-être.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le poulet de chair car il s’agit de l’espèce cible. Les poussins utilisés dans cette étude sont issus des mêmes élevages que ceux destinés à la consommation. Ils arrivent à l'âge d'un jour, comme dans les élevages classiques. Le premier prélèvement sanguin est réalisé à 7 jours pour leur laisser le temps de s'habituer à leur nouvel environnement. À cet âge, les poussins ont grandi (environ 213 g contre 42 g à la naissance) et peuvent donner une petite quantité de sang sans impact sur leur santé. L'objectif du projet est d'étudier comment leur système immunitaire se développe, notamment après la vaccination. En élevage, les poulets sont vaccinés très tôt car ils sont sensibles aux maladies dès les premières semaines. Le suivi à J7, J21 et J28 permet de comprendre comment leur organisme réagit avant et pendant cette période critique. Les oiseaux seront gardés jusqu'à 35 jours, ce qui correspond à la durée d'élevage habituelle des poulets de chair.